Examen3 Techniques Danalyses Biologique
Examen3 Techniques Danalyses Biologique
Examen3 Techniques Danalyses Biologique
Durée : 1h30
Exercice 1
On veut préparer 5 litres d'une solution à 0,5 mol/L de tampon formiate à pH= 3. On dispose d'une
solution d'acide formique (HCOOH) à 5 mol/L et d'une solution de potasse (KOH) à 10 mol/L. Comment
prépare-t-on cette solution? On donne pKa= 3,7 pour l'acide formique (7p).
Exercice2 (13 p)
Une souche de Bacillus subtilis se développe à 28°C pendant 24h dans un fermenteur contenant un
milieu de culture composé principalement de l’amidon, des sels minéraux, de l’extrait de levure , des
produits à effet tampon comme le KH2PO4 et le K2HPO4, la souche produit plusieurs protéines et
enzymes dont une amylase extracellulaire, une fois la fermentation terminée :
2- Citez une technique pour l’élimination des sels minéraux et des petites molécules comme le glucose
(1 P) et donnez son principe (2p).
5-Citez une méthode pour vérifier la pureté enzymatique et donnez son principe (2p).
Réponse 2 :
L’élimination des sels minéraux et des petites molécules comme le glucose fait appel à
Réponse 3 :
Il s’agit de la chromatographie échangeuse d’anions (1p).
La méthodologie (3 points)
L'échange ionique est en rapport avec la charge électrique nette des protéines et qui dépend de
leurs compositions en acides aminés. - La charge nette d'une protéine est influencée par le pH
du solvant (tampon) dans lequel elle est dissoute (échange des ions d'hydrogène avec les
protéines). Le point isoélectrique (pI) d'une protéine est le pH auquel la protéine a une charge
globale nette égale à zéro. A un pH supérieur au pI, une protéine aura une charge nette négative.
Un pH inférieur au pI rend la protéine chargée positivent (assez de H+).
- Le pH du solvant peut être ajusté afin de faciliter la liaison des protéines aux résines
échangeuses d'ions ou de promouvoir leur élution une fois liées. (1P)
-D’abord il faut équilibre la colonne avec 5 fois son volume avec le tampon de départ (0,5 p)
-Injection de 2ml de l’échantillon en parallèle le tampon de départ circule dans la colonne
(0,5 p)
-Pour décrocher l’enzyme on utilise le tampon avec un gradient de NaCl de 0 à 0,5 M . ou on
opte pour un changement de pH (0,5 p)
-La détection des protéines de fait avec une lecture d’absorbance à 280 nm Et l’amylase est
détectée selon son test d’activité. (0,5 p)
Réponse 4
Pour déterminer le volume mort de la colonne on utilise une grosse molécule qui ne diffuse
pas dans le gel, comme le bleu de dextran qui a un poids moléculaire 2 .106 Da, on injecte 1 ml
à 1mg/ml dans la colonne branché à un réservoir de tampon approprié, le volume d’élution de
cette molécule correspond au volume mort (1 p).
Pour déterminer le poids moléculaire on utilise des marqueurs protéiques comme étalons, on
injecte 1ml du mélange dans une colonne branché au réservoir tampon, on collecte des fraction
de 1ml (soit 100 tubes) et on mesure l’absorbance à 280nm, les marqueurs seront élué en
fonction du poids moléculaire, de la molécule la plus grosse à la plus petite, par la suite on trace
la droite log PM en fonction du volume d’élution. pour déterminer la masse moléculaire De
l’amylase, cette dernière est chromatographiée sur la même colonne dans les mêmes conditions
(tampon, débit, pression hydrostatique, etc.), on note son volume d’élution. En extrapolant sur
la droite, on peut facilement en calculer la masse moléculaire (3p).
Réponse 5
Principe (1Point)