Cours 3
Cours 3
Cours 3
Des démarches similaires pourront être suivies dans les autres cas mais de
manière essentiellement qualitative....
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
La mise au point d'une séparation consiste à déterminer les meilleures
conditions expérimentales qui permettent l'analyse quantitative d'un mélange
donné dans un temps le plus court possible..
Pour l'utilisateur de base, cette phase est souvent “inutile” en effet les
analyses courantes ont déja été optimisées et décrites avec précision. Il suffit
donc dans la plupart des cas de simplement les appliquer.
La chromatographie est une science avant tout expérimentale dans laquelle
l'expérience de l'opérateur joue un grand rôle.
La phase stationnaire est très polaire , les substances sont alors élués en sens
inverse de leur polarité propre. Les composants peu polaires ont une plus
grande affinité pour la phase mobile et sont donc élués rapidement.
Inversement les solutés polaires ont une plus grande affinité pour la phase
stationnaire et sont élués lentement.
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
Si les composés à analyser présentent une certaine polarité et sont solubles
dans l'eau on dans mélanges eau/solvant organique c'est vers une
chromatographie en phase inverse que nous nous dirigerons.
Ce cas est de très loin le cas le plus fréquemment rencontré en analyse de
routine
La phase stationnaire est peu polaire ou apolaire (la phase mobile est alors
généralement polaire), les substances sont alors élués dans le sens de leur
polarité propre.
Les composants polaires ont une plus grande affinité pour la phase mobile et
sont donc élués rapidement.
Inversement les solutés peu polaires ont une plus grande affinité pour la phase
stationnaire et sont élués lentement.
C2 : Diméthylsillyle :
C8 : Octylsillyle
C18 : Octadécylsillyle
Il faudra en effet que des contraintes physiques liées a ces propriétés soient
satisfaites pour que l'analyse soit réalisable en pratique.
Les contraintes principales sont les pressions limites (viscosité) , les risques
particuliers (inflamabilité etc) et les contraintes liées à la détection:
*indices de réfraction
*ongueur d'onde de coupure UV ou "cut-off" est celle à partir de laquelle l'absorbance
du solvant est tellement élevée que l'on ne peut plus l'utiliser en détection U.V car il
devient opaque.
Enfin les solvants mélangés doivent être miscibles entre eux en toutes proportions.
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
Vis cosité (m Pa.s ) Dens ité Coupure UV Incice de réfraction
Indice de polarité à 20°C à 20°C en nm à 20°C
EAU 1,1 0,60 1 --- 1,333
méthanol 0,95 0.55 0,79 210 1,329
ethanol 0,88 0,37 0,79 210 1,361
acétonitrile 0,65 2,24 0,79 210 1,344
diméthyl sulfoxide 0,62 1,54 1,10 --- 1,101
dioxane 0,56 --- 1,03 220 1,422
tétrahydrofurane 0,45 2,98 0,89 220 1,408
chloroforme 0,40 0,23 1,49 245 1,443
éthyl éther 0,38 0,37 0,71 220 1,353
iso - propyl - éther 0,28 0,97 0,72 220 1,363
tétrachlorure de carbone 0,18 1,00 1,59 265 1,466
cyclohexane 0,04 --- 0,78 210 1,427
isooctane 0,01 0,23 0,69 210 1,392
n - pentane 0 0,63 210 1,358
NON MISCIBLES
log k = a log x + b
x est la teneur volumique en solvant organique de la phase mobile
Dans le cas ou des substances ionisables sont présentes (acide ou bases faibles) on a
tout intérêt à contrôler le pH de la phase mobile. En effet selon le pH du milieu l’espèce
sera présente sous forme moléculaire neutre ou sous forme ionique voire si on est à un
pH proche du pKa du couple sous les deux formes en proportions similaires.
On pourrait imaginer à la limite que chaque espèce donne son propre pic avec des
temps de rétention différents. En fait les deux espèces sont en équilibres rapide et on
n'observe qu'un seul pic “moyen” mais le temps de rétention va varier avec le pH de la
phase mobile.
L'espèces ionique présente une plus grande affinité avec la phase polaire et
l'espèce neutre une plus grande affinité pour la phase apolaire.
Si la phase mobile est polaire et particulièrement si elle est acqueuse les temps
de rétention seront sensiblement diminués quand l'espèce ionique sera
présente en grande quantité, inversement les temps de rétention seront élevés
si l'espèce neutre est majoritaire.
Inversement plus le pH est élevé et plus l'espèce ioniqueA- est présente ce qui diminue
les temps de rétention.
Si la forme ionique est trop largement majoritaire le composé ne sera pas du tout
retenu par la colonne et sortira au temps mort de celle-ci, il n'y aura pas de
séparation possible.
Pour éviter ce type de problèmes on peut utiliser deux techniques différentes.
x = 30 % aB = - 2,35
x = 70 % B A
tRA = 7,01 min
tRA = 3,83 min
bB = - 0,89
tRB = 8,33 min
α = 1,30
A B tRB = 3,40 min
R =3,15 α = 1,55
R = 2,19
0 5 10 15 0 2 4 6 On observe souvent une
inversion des temps de
x = 40 % x = 100 % B A rétention
tRA = 5,45 min
tRA = 3,32 min
tRB = 5,52 min
tRB = 2,95 min
α = 1,02
R = 0,23 α = 2,09 CHROMATOGRAMMES
R = 2,14
0 2 4 6 8 0 1 2 3 4
chromatographie-chap 3-Thierry Brière5
20,00 2
18,00
12,00 aA = - 1,52
kA 0,5
bA = - 0,57
10,00
8,00
kB -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2
0
0
6,00
-0,5
log kA
aB = - 2,35
4,00
2,00 log kB -1
0,00
0 20 40 60 80 100 -1,5
bB = - 0,89
3,00
3,00
2,80 2,50
Résolution Résolution et sélectivité
2,60 Sélectivité
2,40
2,00 passent par un minimum
2,20
1,50
2,00
1,80 1,00
1,60
0,50
Paramètres principaux
1,40
1,20
0,00
1,00
0 50 100
0 50 100
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
Nous allons maintenant étudier de façon théorique l'effet de la teneur en
solvant organique sur les paramètres principaux de la chromatographie,
N : efficacité de la colonne,
α : sélectivité de la séparation
R : résolution du chromatogramme.
L'efficacité N de la colonne, par définition ne dépend pas du solvant utilisé et
sera donc constante, en revanche la sélectivité et la résolution seront
fortement modifiées par une variation de composition de l'éluant.
Les paramètres de départ se divisent en deux catégories :
Paramètres “physiques” : Porosité, longueur et diamètre interne de la colonne,
diamètre des particules de phase stationnaire, débit de l'éluant. Ces
paramètres “physiques” n'affectent que l'efficacité de la colonne.
Paramètres “chimiques” : nature de la phase stationnaire et de la phase
mobile. Ces paramètres chimiques n'affectent pas l'efficacité de la colonne
mais agissent sur l'équilibre de partition et donc sur les facteurs de rétention
et la sélectivité.
Le paramètre le plus important, la résolution R est affectée à la fois par les
paramètres “physiques” et les paramètres “chimiques”.
Rappelons la relation de Purnell qui relie R à N, α et k2 :
RPurnell = ¼ N0,5 [ (1 - α ) / α ] [ k2 / (1+k2) ]
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
Variation des facteurs de rétention k1 et k2 :
log k = a log x + b et k = 10(a log x +b)
Il sera intéressant de représenter graphiquement les variations de k et log k
avec x.
Selon les valeurs de a1,b1,a2 et b2, plusieurs cas de figure sont possibles :
On pose ∆a = a1 – a2 et ∆b = b1 – b2
➢
Si a1 = a2 et ∆a = 0, les deux droites log k = f(log x) sont parallèles, les
valeurs de k1 et k2 seront toujours différentes et le phénomène
d'inversion des pics ne pourra se produire.
➢ Si ∆b et ∆a sont de même signe alors log xmini sera négatif et xmini sera
inférieur à 1, le phénomène d'inversion des pics sera observable.
➢ Si ∆b = 0, log xmini = 0, xmini =1, les deux pics sont confondus pour x = 100
%, le phénomène d'inversion des pics ne sera pas observable pratiquement.
Variation de la résolution R :
La résolution R est le paramètre le plus important en chromatographie, on
considère que la séparation est correcte et utilisable pour un dosage
quantitatif si R > 1,5.
On devra donc trouver la composition du solvant optimale qui conduira a une
résolution supérieure à R = 1,5 avec un temps d'analyse le plus court
possible, c'est le principe même de l'optimisation de la séparation
chromatographique.
La résolution R est définie mathématiquement par :
R = ½ ( tR2 – tR1 ) / ( σ1 + σ2 ) avec tR2 > tR1
On considère pour simplifier que l'efficacité est la même pour les deux
composés, dans ces conditions on peut écrire plus simplement :
R = ABS ( ½ * Nvrai0,5 * ( tR1- tR2 ) / ( tR1 + tR2 )
Remarque : L'utilisation de la valeur absolue prend en compte une éventuelle
inversion de deux pics. chromatographie-chap 3-Thierry Brière
Exprimons cette résolution en fonction de x
R = ABS [ ½ * N0,5 * ( k1 – k2 ) / ( 2 + k1 + k2 ) ]
La position relative des extrema xmini et xmaxi sont fonctions des paramètres
a1, b1, a2 et b2 des deux composés à séparer.
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
Position du minimum de la courbe xmini :
La résolution minimale correspond évidemment à la superposition
des deux pics pour laquelle k1 = k2 ; α = 1 et R = 0
Nous avons déjà déterminé sa position : xmini = 10 - ∆b / ∆a
Position du maximum de la courbe xmaxi :
Pour déterminer la position de ce point nous allons dériver la fonction R = f(x).
R = ABS [ ½ * Nvrai0,5 * ( k1 – k2) / ( 2 + k1 + k2) ]
Pour simplifier cette expression nous allons supprimer la valeur absolue qui n'est la
en fait que pour rendre R positif en cas d'inversion des pics, pour situer le maximum
elle n'interviendra pas, on pourrait la garder pour pouvoir déterminer le minimum de la
courbe mais cela est inutile puisque nous connaissons déjà ce résultat.
R = ½ * Nvrai0,5 * ( k1 – k2 ) / ( 2 + k1 + k2 )
Le premier terme 1/2*Nvrai0,5 ne dépend pas de x et nous pouvons donc l'éliminer.
Nous devons donc dériver la fonction : g(x) = ( k1 (x) – k2 (x) ) / ( 2 + k1 (x) + k2 (x) )
avec k1 (x) = 10 (a1*log(x)+b1) et k2 (x) = 10 (a2*log(x)+b2)
Résolution simplifiée :
On peut simplifier quelque peu le problème en faisant une approximation sur la
valeur de la fonction s(x) = 2 + k1(x) + k2(x).Si on est en solvant à forte teneur en
solvant organique, les composés hydrophobes n'auront pas une grande affinité avec
la phase stationnaire, les facteurs de rétention seront très petits et on pourra
simplifier s(x) en s(x) = 2, les termes k1 et k2 étant négligeable devant 2.
xmaxi = 10 - ( log ( a1 / a2 ) + ∆b ) / ∆a
xmini = 10 - ∆b / ∆a
Version 1 : simsolvR.xls
Cette feuille toute prête permet de bien visualiser l'influence de la teneur en solvant
organique sur la résolution R.
Les paramètres principaux sont les constantes a1, b1, a2 et b2 caractéristiques des
deux composés à séparer et l'efficacité N de la colonne utilisée. On ne se préoccupe
donc pas de l'influence des paramètres “physiques” qui sont globalement inclus par
le paramètre N.
Pédagogiquement, cette séparation des facteurs permet une grande simplification
en allant à l'essentiel.
Des boutons utilisant des macros permettent d'un simple clic de modifier rapidement
la feuille ou de faire certains calculs.
Il est enfin possible d'affiner encore par l'utilisation de gradients de solvant qui
permétrons d'optimiser l'analyse. Nous consacrerons un chapitre a ces
gradients de solvant...
La méthode finalement retenue sera telle que tous les pics intéressants seront résolus.
Le couple limitant ayant une résolution R de 1,5 ou plus. Idéalement une résolution de
R=1,5 est suffisante mais il est néanmoins préfférable de prévoir jusqu'a R = 2 car la
performance d'une colonne évolue dans le temps et son efficacité diminuera au fil des
injections successives.
Constante de partage : K = CS / CM
∆RG0 = - RT ln K
∆RG0 : Variation d’enthalpie libre de l’équilibre de partage entre phase mobile et phase
stationnaire.
chromatographie-chap 3-Thierry Brière
∆RH0 : Variation d’enthalpie de l’équilibre de partage entre phase mobile et
phase stationnaire.
ln KR = - ∆RH0 / R T + ∆RS0 / R
ln KR
Pente = - ∆ RH0 / R
Ordonnée à l'origine = ∆ RS0 / R
1/T (K-1)
ε = VM / Vint
Vint / VM = 1 / ε
VS / VM = 1 / ε - 1 = ( 1 – ε ) / ε
Posons VS / VM = ( 1 – ε ) / ε = φ
k = K VS / VM
k=Kφ ln KR = - ∆RH0 / R T + ∆RS0 / R
ln k = ln K + ln φ ln k = - ∆RH0 / R T + ∆RS0 / R + ln φ
α = k2/k1
ln α = ln (k2/k1) = ln k2 – ln k1 = a2 / T + b2 – ( a1 / T + b1 ) = (a2 – a1) / T + b2 – b1
R = ¼ N1/2 [ (α – 1 ) / α ] [ k / ( 1+ k ) ]