TD Janvier 2023

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Université Mohammed VI des sciences de la santé

Faculté de Médecine et de Pharmacie


Casablanca

Master Biologie des cancers

Module: Avancées dans les méthodes de détection et de


caractérisation des cancers

Travaux dirigés
Prs. DEHBI. H & TAZZITE.A
Année Universitaire 2022-2023
Exercices

1- Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium dans NCBI

2- Recherche d’amorces simples et vérification de leur qualité

3- Recherche d’amorces avec Primer3


Les séquences sont stockées sous forme de fichiers texte

Pour lire et traiter les séquences, les logiciels d'analyse


autorisent un ou plusieurs formats des données.

Exemple de formats utilisés :

 Format FASTA:
• Format de fichier le plus répandu
• Très simple
• Pratique
Séquence du gène invA de Salmonella typhimurium
format FASTA

Séquence
cible à
amplifier
(300pb)
Choisissez des amorces adéquates
Amorces déduites des séquences en amont et en aval
Que pensez vous de la séquence ces amorces?
Pour trouver la séquence reverse , on peut
utiliser:

https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
http://reverse-complement.com

PRIMER REVERSE : CCGCCAATAAAGTTCACAA


Amorces déduites des séquences en amont et en aval

Amorce gauche

5’-TTATCGCCACGTTC
GGGCAA-3
Amorce droite
5’-CCGCCAATAAAGTT
CACAAA-3’

Tm???
Tm
• Amorce gauche: 62°C
• Amorce droite: 52 °C

Différence Tm > 2°C


Recherche d’amorces avec Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm
Plusieurs couples d’amorces sont proposés

Légende
>>>>>> Amorce gauche
<<<<<< Amorce droite

Le logiciel a trouvé d’autres amorces plus optimisées mais pas à la même


position
Analyse de la qualité des amorces
BLAST : Spécificité des amorces
Les primers choisies s’alignent uniquement avec des séquences
provenant de Salmonella
Exercice 2

La séquence présentée est celle d’une partie du gène de la b globine

humaine comprenant le promoteur, l’exon 1 et une partie de l’intron 1. Sur

cette séquence de 315 pb , le n° 100 (A sur le brin codant)correspond au

début de la transcription, de 150 à 153 est l’ATG initiateur de la traduction

et le n° 241 est le G de fin de l’exon 1.

On veut amplifier par PCR le fragment commençant à 36 et se terminant à

302 suivant la numérotation indiquée au dessus du brin codant 5’ 3’.


1) Quelles amorces seront utilisées?

2) Quels sont les différents constituants nécessaires à la réaction de PCR?

3) Quelles sont les différentes étapes d’une réaction de PCR?

A quoi servent- elles?

4) Comment peut-on mettre en évidence le produit de PCR?

5)Quels sont les paramètres à modifier pour améliorer l’efficacité et la

spécificité d’une PCR ?


7) Vous disposez de 9 échantillons et vous devez effectuer la même PCR
sur chacun d’eux. Vous disposez des constituants suivants :
– Amorce directe: 100μM
– Tampon Polymérase: 10x
– Amorce indirecte: 100μM
– MgCl2: 15mM
– Polymérase: 1U/μl
– dATP,dCTP,dGTP, dTTP: 100mM

Les concentrations finales sont pour:


– chaque amorce : 200 nM,
– dNTPs : 250μM,
– MgCl2: 1.5mM,
– tampon de polymérase 1X,
– polymérase 0.5U
– 1μl de matrice pour un volume réactionnel final de 50μl par tube.

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