Thèse Camille

Université de Lille 2 Faculté des Sciences Pharmaceutiques
Année Universitaire 2014/2015 et Biologiques de Lille
MEMOIRE
POUR LE DIPLOME D'ETUDES SPECIALISEES
DE BIOLOGIE MEDICALE
Soutenu publiquement le 21 avril 2015

Par Camille DAUCHY épouse DEFURNE
Conformément aux dispositions du Décret du 10 septembre 1990

tient lieu de
THESE EN VUE DU DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE
_____________________________
Caractérisation de la résistance aux azolés

d’Aspergillus fumigatus chez les patients atteints de
BPCO dans la région Nord-Pas de Calais :
circulation entre les réservoirs cliniques et
environnementaux
_____________________________
Membres du jury :
Président : Monsieur le Professeur El Moukhtar ALIOUAT, Professeur des

Universités, Laboratoire de Parasitologie, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques et Biologiques, Lille
Assesseurs: Monsieur le Professeur Boualem SENDID, Professeur des Universités-

Praticien Hospitalier, Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHRU de Lille
Monsieur le Professeur Saad NSEIR, Professeur des Universités-
Praticien Hospitalier, Pôle de Réanimation Médicale, CHRU de Lille
Madame le Docteur Stéphanie FRY, Praticien Hospitalier, Clinique des
Maladies Respiratoires, CHRU de Lille
Directeur de thèse : Madame le Docteur Emilie FREALLE, Praticien Hospitalier, Laboratoire

de Parasitologie-Mycologie, CHRU de Lille
Faculté des Sciences Pharmaceutiques
et Biologiques de Lille
3, rue du Professeur Laguesse - B.P. 83 - 59006 LILLE CEDEX

03.20.96.40.40 - : 03.20.96.43.64
http://pharmacie.univ-lille2.fr
Université Lille 2 – Droit et Santé
Président : Professeur Xavier VANDENDRIESSCHE

Vice- présidents : Professeur Alain DUROCHER
Professeur Régis BORDET
Professeur Eric KERCKHOVE
Professeur Eric BOULANGER
Professeur Frédéric LOBEZ
Professeur Damien CUNY
Professeur Benoit DEPREZ
Professeur Murielle GARCIN
Monsieur Pierre RAVAUX
Monsieur Larbi AIT-HENNANI
Monsieur Antoine HENRY
Directeur Général des Services : Monsieur Pierre-Marie ROBERT
Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques
Doyen : Professeur Damien CUNY

Vice-Doyen, 1er assesseur : Professeur Bertrand DECAUDIN
Assesseur en charge de la pédagogie Dr. Annie Standaert
Assesseur en charge de la recherche Pr. Patricia Melnyk e ROGER
Assesseur délégué à la scolarité Dr. Christophe Bochu
Assesseur délégué en charge des
relations internationales Ph Pr. Philippe Chavatte
Assesseur délégué en charge de la vie étudiante M. Thomas Morgenroth
Chef des services administratifs : Monsieur Cyrille PORTA
Liste des Professeurs des Universités - Praticiens Hospitaliers

Civ. NOM Prénom Laboratoire
Mme ALLORGE Delphine Toxicologie
M. BROUSSEAU Thierry Biochimie
Mme CAPRON Monique Immunologie
M. DECAUDIN Bertrand Pharmacie Galénique
M. DINE Thierry Pharmacie clinique
M. DUBREUIL Luc Bactériologie
Mme DUPONT-PRADO Annabelle Hématologie
M. DUTHILLEUL Patrick Hématologie
M. GRESSIER Bernard Pharmacologie
M. LUYCKX Michel Pharmacie clinique
M. ODOU Pascal Pharmacie Galénique
M. DEPREUX Patrick Chimie Organique (ICPAL)
2
Liste des Professeurs des Universités
M. ALIOUAT El Moukhtar Parasitologie
Mme AZAROUAL Nathalie Physique
M. BERTHELOT Pascal Chimie Thérapeutique 1
M. CAZIN Jean-Louis Pharmacologie – Pharmacie clinique
M. CHAVATTE Philippe Chimie Thérapeutique 2
M. COURTECUISSE Régis Sciences végétales et fongiques
M. CUNY Damien Sciences végétales et fongiques
Mme DELBAERE Stéphanie Physique
M. DEPREZ Benoît Chimie Générale
Mme DEPREZ Rebecca Chimie Générale
M. DUPONT Frédéric Sciences végétales et fongiques
M. DURIEZ Patrick Physiologie
M. GARÇON Guillaume Toxicologie
Mme GAYOT Anne Pharmacotechnie Industrielle
M. GESQUIERE Jean-Claude Chimie Organique
M. GOOSSENS Jean François Chimie Analytique
Mme GRAS Hélène Chimie Thérapeutique 3
M. HENNEBELLE Thierry Pharmacognosie
M. LEMDANI Mohamed Biomathématiques
Mme LESTAVEL Sophie Biologie Cellulaire
M. LUC Gerald Physiologie
Mme MELNYK Patricia Chimie thérapeutique 2
Mme MUHR – TAILLEUX Anne Biochimie
Mme PAUMELLE-LESTRELIN Réjane Biologie Cellulaire
Mme PERROY – MAILLOLS Anne Catherine Droit et déontologie pharmaceutique
Mme ROMOND Marie Bénédicte Bactériologie
Mme SAHPAZ Sevser Pharmacognosie
M. SERGHERAERT Eric Droit et déontologie pharmaceutique
M. SIEPMANN Juergen Pharmacotechnie Industrielle
M. STAELS Bart Biologie Cellulaire
M TARTAR André Chimie Organique
M. VACCHER Claude Chimie Analytique
M. WILLAND Nicolas Chimie organique
M. MILLET Régis Chimie Thérapeutique (ICPAL)
Liste des Maitres de Conférences - Praticiens Hospitaliers

Mme BALDUYCK Malika Biochimie
Mme GARAT Anne Toxicologie
Mme GOFFARD Anne Bactériologie
M. LANNOY Damien Pharmacie Galénique
Mme ODOU Marie Françoise Bactériologie
M. SIMON Nicolas Pharmacie Galénique
Liste des Maitres de Conférences

Mme AGOURIDAS Laurence Chimie thérapeutique 2
Mme ALIOUAT Cécile Marie Parasitologie (90%)
M. ANTHERIEU Sébastien Toxicologie
Mme AUMERCIER Pierrette Biochimie
Mme BANTUBUNGI Kadiombo Biologie cellulaire
3
Mme BARTHELEMY Christine Pharmacie Galénique
Mme BEHRA Josette Bactériologie
M BELARBI Karim Pharmacologie
M. BERTHET Jérôme Physique
M. BERTIN Benjamin Immunologie
M. BLANCHEMAIN Nicolas Pharmacotechnie industrielle
M. BOCHU Christophe Physique
M. BRIAND Olivier Biochimie
Mme CACHERA Claude Biochimie
M. CARNOY Christophe Immunologie
Mme CARON Sandrine Biologie cellulaire (80%)
Mme CHABÉ Magali Parasitologie (80%)
Mme CHARTON Julie Chimie Organique (80%)
M CHEVALIER Dany Toxicologie
M. COCHELARD Dominique Biomathématiques
Mme DANEL Cécile Chimie Analytique
Mme DEMANCHE Christine Parasitologie (80%)
Mme DEMARQUILLY Catherine Biomathématiques
Mme DUMONT Julie Biologie cellulaire
M. FARCE Amaury Chimie Thérapeutique 2
Mme FLIPO Marion Chimie Organique
Mme FOULON Catherine Chimie Analytique
M. GELEZ Philippe Biomathématiques
M. GERVOIS Philippe Biochimie
Mme GRAVE Béatrice Toxicologie
Mme GROSS Barbara Biochimie
Mme HAMOUDI Chérifa Mounira Pharmacotechnie industrielle
Mme HANNOTHIAUX Marie-Hélène Toxicologie
Mme HELLEBOID Audrey Physiologie
M. HERMANN Emmanuel Immunologie
Mme HOUSSIN-THUILLIER Pascale Hématologie
M. KAMBIA Kpakpaga Nicolas Pharmacologie
M. KARROUT Youness Pharmacotechnie Industrielle
Mme LALLOYER Fanny Biochimie
M. LEBEGUE Nicolas Chimie thérapeutique 1
Mme LECOEUR Marie Chimie Analytique
Mme LIPKA Emmanuelle Chimie Analytique
Mme MARTIN Françoise Physiologie
M. MOREAU Pierre Arthur Sciences végétales et fongiques
Mme MUSCHERT Susanne Pharmacotechnie industrielle
Mme NEUT Christel Bactériologie
Mme NIKASINOVIC Lydia Toxicologie
Mme PINÇON Claire Biomathématiques
M. PIVA Frank Biochimie
Mme PLATEL Anne Toxicologie
M. RAVAUX Pierre Biomathématiques
Mme RIVIERE Céline Pharmacognosie
Mme ROGER Nadine Immunologie
M. ROUMY Vincent Pharmacognosie
Mme SEBTI Yasmine Biochimie
Mme SIEPMANN Florence Pharmacotechnie Industrielle
Mme SINGER Elisabeth Bactériologie
Mme STANDAERT Annie Parasitologie
M. TAGZIRT Madjid Hématologie
M. WELTI Stéphane Sciences végétales et fongiques
M. YOUS Saïd Chimie Thérapeutique 1
M. ZITOUNI Djamel Biomathématiques
4
M. FURMAN Christophe Pharmacobiochimie (ICPAL)
Mme GOOSSENS Laurence Chimie Organique (ICPAL)
Professeurs Agrégés
Mme MAYES Martine Anglais
M. MORGENROTH Thomas Droit et déontologie pharmaceutique
Professeurs Certifiés
M. HUGES Dominique Anglais
Mlle FAUQUANT Soline Anglais
M. OSTYN Gaël Anglais
Professeur Associé - mi-temps

M. DHANANI Alban Droit et déontologie pharmaceutique
Maîtres de Conférences ASSOCIES - mi-temps

Mme BERTOUX Elisabeth Pharmacie Clinique -
Biomathématiques
M. BRICOTEAU Didier Biomathématiques
M. FIEVET Pierre Information Médicale
M. FRIMAT Bruno Pharmacie Clinique
M. MASCAUT Daniel Pharmacie Clinique
M. WATRELOS Michel Droit et déontologie pharmaceutique
M. ZANETTI Sébastien Biomathématiques
AHU
Mme DROUET Maryline Pharmacie Galénique
Mme GENAY Stéphanie Pharmacie Galénique
5
Faculté des Sciences Pharmaceutiques
et Biologiques de Lille
3, rue du Professeur Laguesse - B.P. 83 - 59006 LILLE CEDEX
Tel. : 03.20.96.40.40 - Télécopie : 03.20.96.43.64
http://pharmacie.univ-lille2.fr
L’Université n’entend donner aucune approbation aux opinions

émises dans les thèses ; celles-ci sont propres à leurs auteurs.
6
A mon président de jury,
Monsieur le Professeur El Moukhtar ALIOUAT
Professeur des Universités,

Laboratoire de Parasitologie - Biologie animale
Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de Lille
Université de Lille II
Equipe Signalisation Moléculaire et Contrôle de la

Croissance et de la Différenciation des Parasites
Centre d'Infection et d'Immunité de Lille
Institut Pasteur de Lille
Vous me faites l’honneur de présider ce jury de thèse et je vous en remercie.

J’ai su apprécier tout au long de mon cursus vos grandes qualités de pédagogue.
Veuillez trouver ici le témoignage de ma reconnaissance
et de mon profond respect.
7
A mes juges,
Monsieur le Professeur Boualem SENDID
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier

Chef de Service
Laboratoire de Parasitologie - Mycologie
Centre Hospitalier Régional Universitaire de Lille
Directeur
Equipe 2, UMR 995 Inserm-Lille2
Fungal Associated Invasive & Inflammatory Diseases
Faculté de Médecine, Pôle Recherche
Je vous remercie de me faire l’honneur d’accepter de juger ce travail.

Veuillez trouver ici l’expression de mes sentiments
les plus respectueux et de toute ma considération.
8
Monsieur le Professeur Saad NSEIR
Professeur des Universités - Praticien Hospitalier

Service d’Urgence Respiratoire et Réanimation Médicale
Merci d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse.

Veuillez trouver ici l’expression de ma profonde reconnaissance.
9
Madame le Docteur Stéphanie FRY
Praticien Hospitalier
Clinique des Maladies Respiratoires
Equipe Immunité Pulmonaire

Merci d’avoir collaboré à la réalisation de ce travail et

d’avoir accepté de faire partie de ce jury de thèse.
Veuillez trouver ici le témoignage de toute ma gratitude.
10
A mon directeur de thèse,
Madame le Docteur Emilie FREALLE
Praticien Hospitalier
Laboratoire de Parasitologie – Mycologie
Equipe Infection Pulmonaire et Immunité Innée

Tu m’as fait l’honneur de me confier ce travail.

Je tiens à te remercier sincèrement de m’avoir parfaitement
encadrée tout au long de cette thèse.
J’ai pu apprécier à tes côtés ton implication, ton professionnalisme, ta réactivité,
ta grande disponibilité, ta rigueur et ta sympathie.
J’ai été très heureuse de travailler avec toi.
11
A toutes les personnes qui ont collaboré à l’élaboration de ce travail,
L’ensemble du personnel du Laboratoire de Parasitologie - Mycologie du

CHRU de Lille,
En particulier Michèle, Filo et Gaëlle, en biologie moléculaire et Dorothée, Sandrine
et Stéphanie en environnement. Merci pour votre aide précieuse, votre disponibilité
et votre investissement pour le projet FungiCOPD.
A toutes les personnes qui m’ont accompagnées durant ces quatres années :
Mes co-internes,
Merci d’avoir rendu mes stages si agréables.
Les enseignants, biologistes et techniciens, avec qui j’ai travaillé,

Merci de m’avoir encadrée et formée tout au long de mon internat.
12
A mes parents,
Pour m’avoir donnée les moyens de réussir et m’avoir toujours encouragée. Merci
pour votre éducation, les valeurs que vous m’avez transmises, votre présence et
votre amour depuis toujours.
A mes sœurs,
Tantôt modèles, confidentes ou complices,
Merci d’être toujours là pour moi.
A mon mari,
Merci pour ton soutien, ta patience et surtout ton amour.
Tu combles de bonheur chaque jour de ma vie.
A mes amis,
Merci pour tous ces moments heureux partagés.
A ma famille et ma belle famille.
13
SOMMAIRE
LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................... 17
TABLE DES ILLUSTRATIONS ................................................................................. 19
Figures...................................................................................................................... 19
Tableaux ................................................................................................................... 20
INTRODUCTION ...................................................................................................... 22
GENERALITES ........................................................................................................ 24
I. La BPCO ........................................................................................................... 24
A. Définition, étiologie et diagnostic .................................................................... 24
B. Classifications ................................................................................................ 25
C. Traitement ...................................................................................................... 26
D. Épidémiologie ................................................................................................ 27
E. Les exacerbations de la BPCO ...................................................................... 29
1. Physiopathologie et origine des exacerbations .......................................... 29
2. Prise en charge .......................................................................................... 31
II. Aspergillus et infections aspergillaires au cours de la BPCO ............................ 32
A. Taxonomie des Aspergillus ............................................................................ 32
B. Identification morphologique .......................................................................... 34
1. Morphologie macroscopique : caractères culturaux ................................... 34
2. Morphologie microscopique ....................................................................... 36
C. Réservoirs environnementaux et mode de contamination ............................. 38
D. Pouvoir pathogène d’A. fumigatus dans la BPCO .......................................... 39
1. Colonisation saprophyte bronchique .......................................................... 40
2. Aspergillose pulmonaire invasive ............................................................... 41
a) Facteurs de risque .................................................................................. 41
b) Incidence chez les patients atteints de BPCO ........................................ 41
c) Diagnostic chez les patients atteints de BPCO ....................................... 42
III. Traitement des aspergilloses chez les patients atteints de BPCO :
antifongiques utilisables et impact de l’émergence des résistances ......................... 43
A. Sensibilité des Aspergillus aux antifongiques ................................................ 43
1. Antifongiques utilisables pour le traitement des aspergilloses ................... 43
a) Les polyènes........................................................................................... 43
b) Les échinocandines ................................................................................ 44
c) Les antifongiques azolés ........................................................................ 44
2. Recommandations pour la prise en charge des aspergilloses chez les
patients atteints de BPCO ................................................................................. 46
B. Mécanismes de résistance aux azolés........................................................... 46
1. Mutations du gène cyp51A ......................................................................... 47
2. Autres mécanismes de résistance.............................................................. 49
C. Détection de la résistance aux azolés au laboratoire ..................................... 50
1. Détermination des CMI en milieu liquide : méthodes de référence ............ 50
2. Détermination des CMI en milieu gélosé : méthode Etest® ....................... 51
3. Identification d’isolats résistants par ensemencement sur milieu Sabouraud
additionné d’antifongiques azolés ..................................................................... 51
4. Détection rapide de la résistance aux azolés par biologie moléculaire ...... 51
D. Origine de la résistance ................................................................................. 52
1. Acquisition de la résistance au cours d’un traitement par antifongique azolé
................................................................................................................... 52
2. Émergence de la résistance par exposition à des isolats résistants d’origine
environnementale .............................................................................................. 52
E. Prévalence des isolats résistants d’A. fumigatus aux azolés ......................... 53
OBJECTIFS .............................................................................................................. 57
14
MATERIELS ET METHODES .................................................................................. 58
I. Patients et définitions des statuts colonisés et sensibilisés ............................... 58
II. Obtention des isolats cliniques et environnementaux d’Aspergillus fumigatus par
culture ....................................................................................................................... 59
A. Isolats cliniques .............................................................................................. 59
B. Isolats environnementaux .............................................................................. 60
1. Capteurs à poussières ............................................................................... 60
2. Autres prélèvements environnementaux .................................................... 61
III. Quantification de l’exposition environnementale aux moisissures par qPCR . 61
A. Extraction de l’ADN des capteurs à poussières ............................................. 61
B. Détection d’ADN fongique par qPCR panfongique ........................................ 62
C. Détection d’ADN d’Aspergillus spp................................................................. 63
D. Détection d’ADN d’A. fumigatus ..................................................................... 64
E. Analyse statistique ......................................................................................... 65
IV. Caractérisation phénotypique des isolats cliniques et environnementaux
d’Aspergillus fumigatus ............................................................................................. 66
A. Identification morphologique .......................................................................... 66
B. Identification d’isolats résistants aux azolés par ensemencement sur milieu
Sabouraud additionné d’itraconazole .................................................................... 66
C. Détermination de la sensibilité aux antifongiques par méthode Etest® ......... 66
D. Détermination de la thermotolérance ............................................................. 67
V. Caractérisation génotypique des isolats cliniques et environnementaux
d’Aspergillus fumigatus ............................................................................................. 67
A. Extraction de l’ADN ........................................................................................ 67
B. Réaction de polymérisation en chaine (PCR) ................................................ 68
1. PCR ciblant les régions ITS1 et ITS2 ......................................................... 68
2. PCR ciblant le gène β-tubuline ................................................................... 69
3. PCR ciblant le gène cyp51A ....................................................................... 69
C. Électrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR................................. 70
D. Purification des produits de PCR ................................................................... 70
E. Séquençage des produits de PCR ................................................................. 70
F. Analyse et alignement de séquences............................................................. 71
VI. Détection directe d’isolats mutés TR34/L98H d’Aspergillus fumigatus dans
l’environnement ........................................................................................................ 71
A. qPCR ciblant le motif TR34 situé dans le promoteur du gène cyp51A (qPCR
TR34) .................................................................................................................... 71
B. qPCR ciblant la mutation L98H du gène cyp51A (qPCR L98H) ..................... 73
RESULTATS ............................................................................................................ 75
I. Caractéristiques des patients inclus et prévalence de la
colonisation/sensibilisation par A. fumigatus ............................................................ 75
II. Prévalence de l’exposition environnementale à A. fumigatus et quantification du
niveau d’exposition aux moisissures ........................................................................ 76
A. Mesure de l’exposition environnementale par culture .................................... 76
B. Quantification du niveau d’exposition aux moisissures par qPCR ................. 76
1. Détéction d’ADN fongique par qPCR panfongique ..................................... 76
2. Détection d’ADN d’Aspergillus spp. ............................................................ 78
3. Détection d’ADN d’A. fumigatus ................................................................. 79
a) Mise au point : choix de la concentration en sonde ................................ 79
b) Analyse des capteurs à poussières ........................................................ 79
C. Comparaison de l’exposition fongique entre les groupes colonisés/sensibilisés
et non colonisés/non sensibilisés par A. fumigatus ............................................... 80
1. Culture ........................................................................................................ 81
2. qPCR .......................................................................................................... 81
15
III. Caractérisations phénotypique et génotypique des isolats cliniques et
environnementaux d’A. fumigatus ............................................................................ 82
A. Confirmation de l’identification des isolats par méthodes phénotypique et
moléculaire............................................................................................................ 82
B. Identification des mutations du gène cyp51A ................................................. 84
1. Mutations non silencieuses ........................................................................ 84
2. Mutations silencieuses ............................................................................... 86
3. Circulation des isolats mutés ou non au sein et entre les réservoirs cliniques
et environnementaux ......................................................................................... 86
a) Circulation des isolats au sein des réservoirs cliniques et
environnementaux ......................................................................................... 86
b) Circulation des isolats entre les réservoirs cliniques et environnementaux
................................................................................................................ 86
c) Distribution géographique des isolats cliniques et environnementaux .... 87
C. Sélection des isolats résistants aux azolés par ensemencement sur milieu ITZ
4 mg/l .................................................................................................................... 87
D. Détermination des CMI par méthode Etest®.................................................. 88
E. Prévalence de la résistance aux azolés ......................................................... 89
1. Prévalence de la résistance à l’ITZ ............................................................ 89
2. Prévalence de la mutation TR34/L98H....................................................... 89
IV. Détection directe des isolats mutés TR34/L98H dans les capteurs à
poussières ................................................................................................................ 90
A. qPCR ciblant le motif TR34 situé dans le promoteur du gène cyp51A (qPCR
TR34) .................................................................................................................... 90
1. Mise au point : choix de la concentration en amorces ................................ 90
2. Analyse des capteurs à poussières ............................................................ 91
B. qPCR ciblant la mutation L98H du gène cyp51A (qPCR L98H) ..................... 93
1. Mise au point .............................................................................................. 93
a) Choix de la concentration en amorces.................................................... 93
b) Choix de la concentration en sondes ...................................................... 94
2. Analyse des capteurs à poussières ............................................................ 94
DISCUSSION ........................................................................................................... 96
CONCLUSION........................................................................................................ 104
ANNEXES .............................................................................................................. 106
Annexe 1 ................................................................................................................ 106
Annexe 2 ................................................................................................................ 107
Annexe 3 ................................................................................................................ 108
Annexe 4 ................................................................................................................ 113
Annexe 5 ................................................................................................................ 115
BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................... 116
16
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN : Acide désoxyribonucléique
AI : Aspergillose invasive
AMB : Amphotéricine B
APC : Aspergillose pulmonaire chronique
APCC : Aspergillose pulmonaire chronique cavitaire
APCN : Aspergillose pulmonaire chronique nécrosante
API : Aspergillose pulmonaire invasive
ARN : Acide ribonucléique
ARNr : ARN ribosomique
BC : Bronchite chronique
BET : Bromure d’éthidium
BPCO : Bronchopneumopathie chronique obstructive
CAS : Caspofungine
CAT : COPD assessment test
CME : Concentration minimale efficace
CMI : Concentration minimale inhibitrice
Cp : Crossing point
CYP51 : lanostérol 14α déméthylase
CVF : Capacité vitale forcée
dNTP : Désoxyribonucléotide triphosphate où N = Adénine, Cytosine, Guanine,
Thymine
EABPCO : Exacerbation aigüe de bronchopneumopathie chronique obstructive
EORTC/MSG : European Organization for Research and Treatment of Cancer /
Mycoses Study Group
Eq. : Equivalent
FRET : Fluorescent resonance energy transfert
GM : Galactomannane
GOLD : Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease
ITS : Internal Transcribed Spacer
ITZ : Itraconazole
LBA : Lavage broncho-alvéolaire
LROP : Liquide de rinçage oro-pharyngé
MEA : Malt Extract Agar
Milieu ITZ : milieu Sabouraud additionné de 4 mg/l d’itraconazole
17
mMRC : Modified medical research council
OR : Odds Ratio
Pb : paires de base
PCR : Polymerase chain reaction
POS : Posaconazole
qPCR : Quantitative polymerase chain reaction
SK1/2 : milieu Sabouraud dilué au ½ additionné d’amikacine
Tm : Melting temperature
TVO : Trouble ventilatoire obstructif
UNG : Uracil ADN glycosylase
UFC : Unité formant colonie
VEMS : Volume expiratoire maximal à la première seconde
VOR : Voriconazole
WT : Wild type
18
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Figures
Figure 1 : Classification ABCD d'après GOLD 2011
Figure 2 : Indice de surmortalité par région, France, 2000-2003
Figure 3 : Espèces de la section Fumigati du genre Aspergillus (arbre
phylogénétique basé sur le gène de la β-tubuline)
Figure 4 : Aspect macroscopique de cultures d'Aspergillus sur milieu Sabouraud,
recto (gauche) et verso droite)
Figure 5 : Schéma des têtes aspergillaires
Figure 6 : Morphologies macroscopique et microscopique d'A. lentulus et
d'A.fumigatus
Figure 7a et 7b : Structure du POS(A), ITZ(B) et VOR(C) (7a) et représentation de
leur enzyme cible CYP51A (7b)
Figure 8 : Cartographie des mutations trouvées dans le gène cyp51A dans le
modèle d’homologie de la protéine CYP51A.
Figure 9 : Représentation des principales mutations décrites pour le gène cyp51A
d'A. fumigatus
Figure 10 : Répartition géographique de la prévalence des isolats cliniques d’A.
fumigatus résistants et de la mutation TR34/L98Hdans les isolats cliniques et
environnementaux en France et en Europe
Figure 11 : Courbes d'amplification et de fusion de la gamme étalon et des capteurs
à poussières obtenues par qPCR panfongique
Figure 12 : Corrélation entre le nombre de colonies de moisissures obtenues par
culture et les quantités d’ADN fongiques détectées par qPCR panfongique
Figure 13 : Corrélation entre le nombre de colonies d’Aspergillus obtenues par
culture et la quantité d’ADN fongique détectée par qPCR Aspergillus
Figure 14 : Comparaison de 2 concentrations en sonde AfumiP1 (0,04 µM en rouge
et 0,08 µM en vert) pour la détection d’A. fumigatus par qPCR
Figure 15 : Corrélation entre le nombre de colonies d’A. fumigatus obtenues par
culture et la quantité d’ADN fongique détectée par qPCR A. fumigatus
Figure 16 : Alignement des 3 types de séquences des régions ITS1 et ITS2 obtenus
pour les 116 isolats avec les séquences des souches A. fumigatus ATCC 1022 et
UWFP 503
Figure 17 : Alignement des 3 types de séquences du gène β-tubuline obtenus pour
les 116 isolats avec les séquences des souches A. fumigatus CBS 133.61 et N.
fischeri CBS 544.65
Figure 18 : Distribution géographique au sein de la région Nord-Pas-de-Calais des
isolats cliniques et environnementaux présentant une mutation non silencieuse ou
non (WT) (C : isolats cliniques)
Figure 19 : Analyse en qPCR TR SYBR®Green des gammes WT et TR34/L98H à
différentes concentrations en amorces TR-F et TR-R (0,1; 0,2; 0,4 et 1µM). La
concentration optimale en amorces choisie pour l’analyse des capteurs est encadrée.
19
Figure 20 : Courbes de fusion obtenues pour les capteurs à poussières positifs en
qPCR TR34 (SYBR®Green) (amplification WT pour les capteurs n° 1, 4, 12, 21, 24,
26, 29, 30, 33, absence d’amplification TR34).
Figure 21 : Analyse en qPCR L98H SYBR®Green des gammes WT et TR34/L98H
en utilisant différentes concentrations en amorces L98F et L98R (0,1; 0,2; 0,4 et
1µM). La concentration optimale en amorces choisie est encadrée.
Figure 22 : Analyse en qPCR L98H Taqman des gammes WT et TR34/L98H à
différentes concentrations en sondes L98 WT (FAM) et L98H (VIC) (0,1 et 0,2 µM).
La concentration optimale en sondes choisie est encadrée.
Tableaux
Tableau 1 : Classification spirométrique de la BPCO d'après GOLD 2007

Tableau 2 : Schéma général du traitement de la BPCO
Tableau 3 : Critères d'hospitalisation des exacerbations d'après l'HAS
Tableau 4 : Classification infragénérique du genre Aspergillus
Tableau 5 : Caractères macroscopiques des Aspergillus
Tableau 6 : Principales caractéristiques microscopiques des espèces d’Aspergillus
Tableau 7 : Mutations du gène cyp51A identifiées chez les isolats d'Aspergillus
fumigatus résistants aux azolés
Tableau 8 : Seuils d'interprétation des CMI établis par l'EUCAST pour A. fumigatus
Tableau 9 : Critères d'inclusion et d'exclusion des patients de l'étude FungiCOPD
Tableau 10 : Amorces utilisées pour la qPCR panfongique
Tableau 11 : Amorces et sondes utilisées pour la qPCR Aspergillus spp. (Flc:
fluorescéine, LC640: Red 640)
Tableau 12 : Amorces et sondes utilisées pour la qPCR A. fumigatus
Tableau 13 : Composition des mix avec concentrations en sonde différentes
Tableau 14 : Amorces utilisées pour la PCR ciblant les régions ITS1 et ITS2
Tableau 15 : Amorces pour la PCR ciblant le gène codant pour la β-tubuline
Tableau 16 : 3 coupes d'amorces pour la PCR ciblant le gène cyp51A
Tableau 17 : Amorces designées pour la qPCR TR34 SYBR®Green
Tableau 18 : Composition des mix en fonction des concentrations en amorces
Tableau 19 : Amorces et sondes designées pour la qPCR L98H
Tableau 20 : Composition des mix pour la détermination de la concentration optimale
en amorces pour la qPCR L98H SYBR®Green
Tableau 21 : Comparaison du nombre total de colonies, du nombre de colonies d’A.
fumigatus et de la fréquence de positivité à A. fumigatus des capteurs positifs en
culture entre les patients colonisés (C) versus patients non colonisés (NC) et entre
les patients colonisés et/ou sensibilisés (C et/ou S) versus les patients non colonisés
non sensibilisés (NC/NS)
Tableau 22 : Comparaison des quantités d’ADN fongique, d’Aspergillus et d’A.
fumigatus dans les capteurs à poussières et de la fréquence de positivité à A.
20
fumigatus des capteurs positifs en qPCR A.fumigatus entre les patients colonisés (C)
versus patients non colonisés (NC) et entre les patients colonisés et/ou sensibilisés
(C et/ou S) versus les patients non colonisés non sensibilisés (NC/NS)
Tableau 23 : Caractérisation des isolats cliniques et environnementaux : origine,
séquençage du gène cyp51A et résultat de la culture sur milieu ITZ
Tableau 24 : Aspect de la culture sur milieu ITZ pour les isolats ITZ+
Tableau 25 : CMI déterminées par méthode Etest® pour les isolats ITZ+ et/ou
présentant des mutations du gène cyp51A
Tableau 26 : Prévalence de la résistance à l'ITZ et de la mutation TR34/L98H en
fonction des isolats, des patients et des capteurs positifs à A. fumigatus
Tableau 27 : Composition des mix pour la qPCR L98H avec des concentrations en
sondes L98 WT et L98H de 0,1, 0,2 et 0,4µM.
Tableau 28 : Comparaison des résultats de qPCR TR34, qPCR L98H, qPCR A.
fumigatus et de culture pour les capteurs positifs en qPCR TR34 ou qPCR L98H
21
INTRODUCTION
La Bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une pathologie
respiratoire chronique caractérisée par une obstruction bronchique non
complétement réversible associée à une réponse inflammatoire dont le principal
facteur de risque est le tabagisme (1). Selon la Global Burden of Disease Study, elle
pourrait devenir la troisième cause de mortalité dans le monde en 2020 (2).
L’évolution de la BPCO est marquée par des épisodes d’exacerbation qui ont un
impact économique important : les hospitalisations pour exacerbation représentent la
part la plus importante des coûts imputables aux patients atteints de BPCO (3).
Le rôle des bactéries et des virus respiratoires dans l’augmentation de l’inflammation
bronchique et systémique au cours d’une exacerbation est bien documenté (4,5), ces
micro-organismes étant considérés comme agents étiologiques dans 75% des
exacerbations (6). Cependant, le rôle des agents fongiques tels qu’Aspergillus n’a
pas encore été établi.
Aspergillus fumigatus est un champignon microscopique (micromycète) largement
répandu dans l’environnement, aussi bien à l’extérieur qu’à l’intérieur des habitations.
Il est responsable de manifestations cliniques variées allant de la colonisation
saprophyte des voies respiratoires supérieures aux formes pulmonaires invasives
(7). Les patients atteints de BPCO constituent un groupe à risque d’aspergillose
pulmonaire invasive (API) de par l’antibiothérapie large spectre et les corticoïdes
qu’ils reçoivent (8,9). L'importance de l’isolement d’A. fumigatus dans les
expectorations des patients atteints de BPCO présentant une exacerbation n’est pas
clairement établie, mais une culture positive à A. fumigatus au cours d’une
exacerbation pourrait suggérer un rôle de ce micromycète dans l’aggravation de la
fonction respiratoire.
Dans ce contexte, nous avons évalué la prévalence de colonisation et sensibilisation
par A. fumigatus au sein de cette population de patients atteints de BPCO dans la
région Nord-Pas de Calais, ainsi que le rôle de l’exposition environnementale
domestique dans les phénomènes de colonisation et de sensibilisation par A.
fumigatus.
Malgré la colonisation par Aspergillus et le risque d’API dans cette population, les
patients BPCO bénéficient rarement d’un traitement par antifongiques azolés : on
parle de patients « naïfs ». Cependant, l’émergence de la résistance aux azolés chez
A. fumigatus ayant été rapportée aussi bien chez des patients traités pour une
22
aspergillose chronique (10–12) que chez des patients naïfs et dans l’environnement,
où elle serait liée à l’utilisation de fongicides azolés en agriculture (13), le risque
d’apparition d’isolats résistants aux azolés est réel chez les patients atteints de
BPCO, le principal mécanisme de résistance aux azolés étant la mutation de la cible
des azolés, l’enzyme lanostérol 14α déméthylase codée par le gène cyp51A (14).
Nous avons donc secondairement caractérisé les isolats cliniques (obtenus à partir
de prélèvements respiratoires) et environnementaux (obtenus à partir de
prélèvements effectués au domicile de ces patients atteints de BPCO) afin de
déterminer la prévalence des isolats d’A. fumigatus résistants aux azolés, d’identifier
les mécanismes impliqués et de clarifier la circulation de ces isolats entre les
réservoirs cliniques et environnementaux.
23
GENERALITES
I. La BPCO
A. Définition, étiologie et diagnostic
La BPCO est une maladie respiratoire chronique définie par une obstruction
permanente, progressive et non complètement réversible des voies aériennes. Cette
obstruction est causée par l’association, variable selon les patients, d’une diminution
du calibre des bronchioles du fait de modifications anatomiques (remodelage) et
d’une destruction des alvéoles pulmonaires (emphysème) qui, par le biais de la
diminution de la force de rétractation élastique du poumon entraine un collapsus des
lumières bronchiques. Il s’y associe une réponse inflammatoire pulmonaire anormale
à des toxiques inhalés, particules ou gaz nocifs (tabac, polluants, etc.). Le symptôme
principal de la BPCO est la dyspnée (1).
On distingue les facteurs de risque de BPCO environnementaux et génétiques. Le
tabac est de loin le principal facteur de risque environnemental de BPCO et les
expositions professionnelles constituent au moins 15% de l’étiologie des BPCO.
D’autres facteurs sont incriminés tels que les fumées domestiques de combustion
des systèmes de chauffage ou de cuisine dans les pays émergents et la pollution
atmosphérique, qui joue un rôle dans le déclenchement d’exacerbations, mais dont
le rôle éventuel dans le développement de la BPCO est incertain. Parmi les facteurs
de risques génétiques, le déficit en alpha 1-antitrypsine est le seul clairement
identifié dans la BPCO (15).
Le diagnostic de la BPCO est basé sur l’exploration fonctionnelle respiratoire avec
mesure du volume expiratoire maximal à la première seconde (VEMS) et de la
capacité vitale forcée (CVF) par spirométrie. Le trouble ventilatoire obstructif (TVO)
est défini par un rapport VEMS/CVF inférieur à 70% après administration d’un
bronchodilatateur, quelque soit la valeur observée du VEMS (1). C’est la présence
d’un TVO dans un contexte clinique compatible (tabagisme ancien, exposition
professionnelle) en l’absence d’autre cause de TVO, en particulier un asthme ou des
dilatations des bronches qui aboutit au diagnostic de BPCO.
Le terme BPCO inclut la bronchite chronique (BC) avec TVO et l’emphysème pan-
lobulaire et/ou centro-lobulaire avec TVO. La BC se définit cliniquement par une
hypersécrétion bronchique se manifestant par une toux productive quotidienne ou
quasi-quotidienne durant au moins trois mois par an au cours d’au moins deux
24
années consécutives. Elle peut être simple (sans obstruction bronchique) ou
obstructive (accompagnée d’un TVO). La BC reflète l’exposition à des facteurs de
risque environnementaux. Elle ne conduit pas systématiquement à une obstruction
bronchique. L’emphysème se définit anatomiquement par un élargissement anormal
et permanent des espaces aériens distaux (c'est-à-dire situés au-delà des
bronchioles terminales), avec destruction des parois alvéolaires, sans fibrose
associée (15).
Des comorbidités associées sont fréquentes, elles doivent être recherchées et
traitées : anxiété et dépression, cancers bronchiques, ostéoporose, affections
cardiovasculaires, dénutrition et obésité. Elles aggravent les symptômes et le
pronostic de la BPCO. L’évolution de la BPCO est marquée par un déclin accéléré
du VEMS au cours du temps, un risque d’exacerbations pouvant mettre en jeu le
pronostic vital, un risque de handicap avec réduction des activités quotidiennes voire
l’apparition d’une insuffisance respiratoire chronique (1).
B. Classifications
La Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) définit 4 stades de
sévérité de BPCO en fonction du VEMS, il s’agit de la classification spirométrique
GOLD (Tableau 1) (1).
Stades Caractéristiques Équivalence clinique

(+toux et expectoration)
Stade I : VEMS/CVF < 70% Absence de dyspnée

BPCO légère VEMS ≥ 80% valeur prédite
Stade II : VEMS/CVF < 70% Dyspnée d’effort inconstante

BPCO modérée 50% ≤ VEMS < 80% valeur prédite
Stade III: VEMS/CVF < 70% Dyspnée d’effort

BPCO sévère 30% ≤ VEMS < 50% valeur prédite
Stade IV : VEMS/CVF < 70% Dyspnée au moindre effort ou

BPCO très sévère VEMS < 30% valeur prédite dyspnée de repos
Ou VEMS < 50% valeur prédite avec
insuffisance respiratoire chronique
Tableau 1 : Classification spirométrique de la BPCO d'après GOLD 2007 (1)
D’après les récentes recommandations de la GOLD en 2011, l’évaluation du patient

BPCO doit toujours inclure les symptômes, le degré d’obstruction, les antécédents
d'exacerbations et les comorbidités. Une nouvelle classification des patients BPCO a
donc été proposée par GOLD, intégrant les symptômes ressentis par le patient, qui
sont quantifiés au moyen du COPD Assessment Test (CAT) et de l’échelle de
25
dyspnée modifiée «Medical Research Council» (mMRC) (cf. Annexe 1), la
spirométrie et le nombre d’exacerbations au cours de l’année passée. Ces trois
points permettent de diviser les patients en quatre catégories A, B, C et D (Figure 1).
Ainsi, d’après cette classification ABCD, les groupes A et B sont considérés comme
étant à risque faible, tandis que les groupes C et D sont considérés comme étant à
risque élevé (16).
Figure 1 : Classification ABCD d'après GOLD 2011 (16)
Toutefois, l’intérêt de la classification ABCD reste discuté : une étude norvégienne

basée sur des dossiers cliniques et spirométriques de patients atteints de BPCO a
montré l’absence de preuve de l’intérêt de la nouvelle classification GOLD ABCD en
termes de prédiction de la mortalité par rapport à la classification spirométrique
GOLD (17). Une autre étude norvégienne montre que la classification ABCD semble
être plus difficile à utiliser (18). Une étude danoise portant sur 6628 BPCO a montré
que le groupe B pouvait avoir une survie significativement plus courte que le groupe
C mais cela est sans doute dû à une comorbidité à l'origine de la dyspnée et souligne
l'importance de rechercher les comorbidités cardiovasculaires dans les BPCO (19).
Cette classification n’est pas encore recommandée par la société française de
pneumologie à ce jour.
C. Traitement
Le traitement de la BPCO dépend du stade (Tableau 2) et repose sur le sevrage

tabagique, les bronchodilatateurs inhalés (bêta2-agonistes et anticholinergiques de
courte ou de longue durée d’action), les associations fixes de bêta2-agonistes de
longue durée d’action et de corticostéroïdes inhalés dans les formes sévères à très
sévères avec exacerbations fréquentes, la réhabilitation respiratoire qui fait partie
intégrante du traitement et la vaccination (grippe, pneumocoque). La corticothérapie
26
orale au long cours n’est pas recommandée dans la BPCO stable. Il n’y a pas non
plus de place pour la corticothérapie inhalée utilisée seule dans la BPCO (16).
I : Léger II : Modéré III : Sévère IV : Très sévère
VEMS/CVF<0,7
VEMS ≥ 80% valeur 50% ≤ VEMS < 80% 30% ≤ VEMS < 50% VEMS < 30% valeur
prédite valeurs prédite valeur prédite prédite
Ou VEMS < 50% valeur
prédite avec insuffisance
respiratoire chronique
Réduction des facteurs de risque ; vaccination antigrippale et antipneumococcique
Bronchodilatateur de courte durée d’action (si besoin)
Un ou plusieurs bronchodilatateurs de longue durée d’action

Réhabilitation respiratoire
Glucocorticoïdes inhalés sous forme d’association
fixe si exacerbations répétées* (VEMS < 60 % pour
salmétérol/fluticasone)
Oxygénothérapie longue
durée si insuffisance
respiratoire chronique
* Les glucocorticoïdes inhalés seuls n’ont pas l’AMM en France Traitements chirurgicaux
Tableau 2 : Schéma général du traitement de la BPCO (15)
D. Épidémiologie
La prévalence de la BPCO en France est difficile à estimer en raison du sous-

diagnostic et de la complexité à réaliser des épreuves fonctionnelles respiratoires
dans le cadre d’études épidémiologiques. Elle est de l’ordre de 5 à 10 % des adultes
de plus de 45 ans en France (20). Les données des certificats de décès ont mis en
évidence une augmentation des taux de mortalité chez les femmes et une
stabilisation chez les hommes entre 1979 et 2000. En 2006, la mortalité liée à la
BPCO était évaluée à 16500 personnes (20).
Les enquêtes régionales montrent de fortes disparités entre le Nord-Pas de Calais et
les autres régions. La carte suivante (Figure 2) extraite de la publication de l’InVS
dans le Bulletin épidémiologique hebdomadaire de juillet 2007 (21), sur l’indice de
surmortalité par région correspondant à la différence relative entre le taux moyen
annuel régional et le taux moyen annuel national illustre les disparités de mortalité.
27
Figure 2 : Indice de surmortalité par région, France, 2000-2003 (21)
Le Nord et l’Est sont plus atteints que les autres régions, ainsi que la Bretagne chez
les femmes. Le Nord-Pas de Calais cumule en fait les difficultés : tabagisme plus
important, mauvaise qualité de l’air, fréquence de l’exposition professionnelle, niveau
de vie plus bas, moindre consommation d’aliments riches en antioxydants, marquant
un risque globalement plus élevé de développer une BPCO (22).
Dans l’étude européenne ECRHS (European Community Respiratory Health
Survey), la prévalence des symptômes respiratoires (toux ou expectoration
chronique) avec une spirométrie normale en France était parmi les plus faibles
d’Europe de 9,2 % contre 8 % aux Pays-Bas, 9,8 % en Grande-Bretagne, 10,4 % en
Italie, 23,7 % en Espagne. La prévalence de la BPCO au stade 1 ou plus de la
classification GOLD dans cette classe d’âge était de 1,5 % variant de 0,9 % en Italie
à 7,4 % pour la Suisse. Toutefois, il convient de souligner que cette étude concernait
uniquement des adultes jeunes. Les résultats obtenus permettent d’illustrer les
variations selon le pays, mais pas d’estimer la prévalence de la maladie (23). Dans
l’étude Confronting COPD International Survey, la France était également le pays
d’Europe ayant la plus faible prévalence (BC ou diagnostic connu de BPCO ou de
BC) (24).
Dans le monde, Il existe de grandes variations de prévalence de la BPCO dans les
études sur le sujet parues entre 1962 et 2001 qui s'expliquent d'une part par
l'hétérogénéité des populations étudiées (tranches d'âge, groupes de fumeurs) et
d'autre part par l'hétérogénéité des méthodes employées pour diagnostiquer la
BPCO (symptômes, spirométrie) (21). L’étude internationale BOLD (Burden Of
Obstructive Lung Disease) a toutefois utilisé une méthodologie standardisée
rigoureuse en se basant sur les critères spirométriques et a porté sur 9 425 patients
dans 12 pays. Ces données donnent des informations grossièrement comparables
28
entre les pays sur la prévalence de la BPCO avec toutefois une prévalence plus
élevée dans certains pays du monde comme en Afrique du Sud. De même, si la
prévalence est généralement plus élevée chez les hommes que chez les femmes,
l’inverse est noté dans certains pays tels qu'aux États-Unis, en Australie et en
Autriche (25). L’étude PLATINO (Proyecto Latinoamericano de Investigación en
Obstrucción Pulmonar) s’est intéressée à la prévalence de la BPCO dans 5 villes
d’Amérique latine situées dans des pays différents : Brésil, Chili, Mexique, Uruguay
et Venezuela. Ces données indiquent que la prévalence de la BC était élevée dans
cette population : de 20 à 30 % de la population (26).
LA BPCO constitue un problème de santé publique majeure par le nombre de
personnes touchées, le handicap dont ces personnes sont affectées, leur mortalité et
les dépenses de santé nécessaires pour leur prise en charge. Elle pourrait devenir la
troisième cause de mortalité dans le monde d’ici 2020 d’après la Global Burden of
Disease Study (2).
E. Les exacerbations de la BPCO
L’exacerbation de BPCO est un évènement aigu caractérisé par une aggravation des
symptômes respiratoires au-delà des variations quotidiennes et qui conduit à une
modification thérapeutique. Le diagnostic des exacerbations aiguës de BPCO
(EABPCO) repose exclusivement sur la clinique : augmentation de la dyspnée, de la
toux, du volume de l’expectoration ou modification de l’expectoration (aspect
purulent). L’exacerbation peut être un mode de découverte de la BPCO (1).
1. Physiopathologie et origine des exacerbations
D’un point de vue physiopathologique, les EABPCO sont associées à une

augmentation de l’inflammation des voies respiratoires supérieures et inférieures et
de l’inflammation systémique. La réponse inflammatoire des voies respiratoires
pendant l’exacerbation provoque œdème, bronchospasme, augmentation de la
production des expectorations, conduisant à une aggravation de la limitation du flux
d’air et au développement d’une hyperinflation (6). Des études montrent qu’il y a un
lien entre l’augmentation de l’inflammation des voies aériennes et la colonisation des
voies aériennes des patients atteints de BPCO par des micro-organismes
pathogènes potentiels en particulier des bactéries et des virus (27,28).
Les trois quarts des EABPCO sont d’origine infectieuse : bactérienne, virale ou
mixte. La pollution de l'air est parfois à l’origine de l’exacerbation. L’étude APHEA
29
(Air Pollution and Health: European Approach) dans 6 villes européennes reporte un
effet significatif du niveau de pollution de l’air sur les hospitalisations des patients
BPCO (29). Dans un certain nombre de cas, la cause de l’exacerbation n’est pas
identifiée.
Les exacerbations d’origine bactérienne sont évoquées en cas de purulence
(coloration verdâtre) récente ou majorée de l’expectoration. Les bactéries sont
retrouvées dans les expectorations des EABPCO dans 42% à 69,6% en fonction des
études (30–32). Toutefois, le rôle précis des bactéries dans les EABPCO est difficile
à évaluer car ce sont les mêmes bactéries qui colonisent les voies respiratoires des
patients BPCO à l’état stable à savoir Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae, Moraxella catarrhalis et Pseudomonas aeruginosa (6). Dans l’étude de
Wilkinson et al. menée chez des patients atteints de BPCO modérée à sévère, une
colonisation bactérienne dans les expectorations a été observée chez 48,2% des
patients en état stable. Pendant l’exacerbation, 69,6% des exacerbations étaient
associées à des bactéries (30). La preuve de l’implication des bactéries dans les
exacerbations provient de l’efficacité de l’antibiothérapie administrée en cas de
purulence de l’exacerbation. La prévalence des bactéries responsables des
exacerbations diffère en fonction des études et des moyens de détection
utilisés (culture ou qPCR) (30,32,33). Globalement, la bactérie la plus fréquente est
Haemophilus influenzae (19,7 à 37,5%), suivie de Streptococcus pneumoniae (14,3
à 25%) et Moraxella catarrhalis (14,3 à 19,2%). Pseudomonas aeruginosa est plus
impliqué chez les patients atteints de BPCO sévère (33). Des bactéries atypiques
comme Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila et Mycoplasma
pneumoniae ont également été retrouvées dans les expectorations de patients
présentant une EABPCO, mais une étude n’a pas trouvé de rôle pour ces trois
bactéries atypiques dans les exacerbations (34).
Les exacerbations d’origine virale sont souvent précédées de symptômes ORL
(rhume, rhinorrhée) dans un contexte épidémique hivernal. Le taux de détection des
virus respiratoires dans les expectorations des patients présentant une EABPCO
varie de 22% à 57% (4,35–38,31). Une revue récente de 19 études de prévalence
des virus respiratoires chez les patients atteints d’EABPCO regroupant 1728 patients
a montré que les Rhino/Entérovirus (16,39%), le Virus Respiratoire Syncytial (VRS)
(9,90%) et le virus de la grippe (7,83%) sont les virus les plus répandus. D’autres
virus sont impliqués avec des taux inférieurs de détection : Coronavirus (4,08%) et
Para-influenza (3,35%). Les Adénovirus (2,07%), le hMPV (2,78%) et Bocavirus
30
(0,56%) semblent être de rares agents responsables d‘EABPCO. Cette même revue
montre la plus grande prévalence des virus dans les voies respiratoires inférieures
par rapport aux voies respiratoires supérieures (39). Les exacerbations déclenchées
par des virus respiratoires sont plus sévères, associées à des temps de récupération
longs, et à un risque plus élevé d'hospitalisations que les exacerbations pour
lesquelles les virus respiratoires ne sont pas détectés (6).
Enfin, les co-infections bactériennes et virales dans les EABPCO existent et sont
associées à un plus grand affaiblissement de la fonction pulmonaire et à plus
d’hospitalisations (40).
2. Prise en charge
La prise en charge des EABPCO débute par la recherche des critères

d’hospitalisation (Tableau 3) et de la cause de l’exacerbation, la purulence fait
évoquer une origine bactérienne. Le traitement des EABPCO est celui de la cause
(antibiotiques en cas d’infection bactérienne) et des symptômes (bronchodilatateurs).
Il associera éventuellement une corticothérapie par voie orale en cas de signes de
gravité ou une amélioration insuffisante après 48 heures, une oxygénothérapie
éventuelle et une assistance ventilatoire mécanique en cas d'acidose respiratoire
non compensée. La gravité des exacerbations est généralement considérée comme
légère quand les exacerbations de symptômes respiratoires nécessitent un
changement du traitement inhalé par le patient, modérée quand les exacerbations de
symptômes respiratoires nécessitent une intervention médicale comprenant un
traitement court par antibiotiques et/ou corticothérapie orale, et sévère quand les
exacerbations des symptômes respiratoires nécessitent une hospitalisation (16). En
cas d'exacerbation sévère, le pronostic vital peut être mis en jeu.
Critères d'hospitalisation des exacerbations de BPCO

Sujet âgé (> 70 ans)
Présence de comorbidités
BPCO sévère (stade III) ou très sévère (stade IV)
Signes cliniques ou gazométriques de gravité immédiate
Nécessité d’une oxygénothérapie
Dégradation rapide
Augmentation marquée des symptômes (dyspnée de repos) ou dégradation majeure par rapport
à l’état de base (cyanose, œdèmes des membres inférieurs, troubles de la conscience)
Exacerbations fréquentes ou épisode récent d’évolution défavorable
Difficulté diagnostique
Patient isolé, aides à domicile insuffisantes
Tableau 3 : Critères d'hospitalisation des exacerbations d'après l'HAS (41)
31
Les épisodes d’exacerbation ont donc un impact économique important : les
hospitalisations pour exacerbations représentent la part la plus importante des coûts
imputables aux patients atteints de BPCO (3). De plus, elles sont associées à une
mortalité et morbidité importantes (6).
S’il existe des preuves de l’implication des bactéries et des virus dans les EABPCO,
le rôle potentiel de la colonisation et de l’infection fongique est cependant peu
documenté.
II. Aspergillus et infections aspergillaires au cours de la BPCO
A. Taxonomie des Aspergillus
Le genre Aspergillus appartient au règne des Fungi, au phylum des Ascomycota, à la

classe des Eurotiomycètes, à l'ordre des Eurotiales et à la famille des
Trichocomaceae (42). Il s'agit de champignons microscopiques (micromycètes)
filamenteux ou moisissures, au mycélium cloisonné (septomycètes) hyalins
présentant une reproduction sexuée avec formation d'asques contenant chacun
8 ascospores (ascomycètes), et une reproduction asexuée avec formation de
structures conidiogènes (cellules productrices des conidies) spécialisées appelées
phialides. Ces dernières sont organisées en « têtes aspergillaires », qui caractérisent
le genre Aspergillus (43). Raper et Fennell, en 1965, avaient recensé environ
150 espèces décrites sur des critères essentiellement morphologiques (macroscopie
et microscopie des cultures). Parmi elles, Aspergillus fumigatus est l'espèce la plus
fréquemment isolée en pathologie humaine, suivie d'A. flavus, A. niger, A. terreus et
A. nidulans (44). Depuis, l’utilisation des techniques de biologie moléculaire,
notamment le séquençage multilocus de gènes conservés (calmoduline, β-tubuline,
actine, ARN polymérase 2 et ARN ribosomique) a permis de réviser totalement la
classification des Aspergillus et de décrire de nouvelles espèces. Actuellement, plus
de 300 espèces sont décrites (45). Des sous-genres et des sections ont été créés en
lien avec leur correspondant téléomorphe (sexué) (46). Les dernières révisions de la
nomenclature regroupent les Aspergillus en 4 sous-genres et 19 sections (Tableau 4)
(47).
32
Sous-genre Section Téléomorphe
Aspergillus Aspergillus* Eurotium
Restricti Eurotium
Circumdati Candidi*
Circumdati* Neopetromyces
Flavi* Petromyces
Flavipedes Fennellia
Nigri*
Terrei*
Fumigati Cervini
Clavati Neocarpenteles, Dichotomomyces
Fumigati* Neosartorya
Nidulantes Aeni Emericella
Bispori
Cremei Chaetosartorya
Nidulantes* Emericella
Ochraceorosei
Silvati
Sparsi
Usti* Emericella
Tableau 4 : Classification infragénérique du genre Aspergillus (47)
*Sections où l’on retrouve des espèces impliquées en pathologie humaine
La section Fumigati qui inclut A. fumigatus comprend 33 espèces (Figure 3) (48). De

nombreuses espèces ont été récemment identifiées par séquençage multilocus des
gènes conservés précédemment cités (49–51). Ainsi, A. lentulus, très proche
morphologiquement d’A. fumigatus, apparaît naturellement résistant à de nombreux
antifongiques contrairement à A. fumigatus sensu stricto qui est habituellement
sensible à tous les antifongiques. D’autres espèces de la section Fumigati dont A.
viridinutans, A. fumigatiaffinis, Neosartorya pseudofischeri et N. udagawae ont
également été identifiées grâce au séquençage multilocus après avoir été
considérées à tort comme A. fumigatus en se basant uniquement sur les critères
morphologiques (50,52,53). De plus, des résistances in vitro aux antifongiques ont
aussi été rapportées pour ces espèces (50,51).
33
Figure 3 : Espèces de la section Fumigati du genre Aspergillus (arbre phylogénétique basé sur le gène de
la β-tubuline) (48)
Le séquençage du génome d'A. fumigatus a été réalisé en 2005 (54), et la forme

sexuée d'A. fumigatus, longtemps inconnue, a été récemment décrite : Neosartorya
fumigata (55). À côté des stades asexués ou anamorphes, les Aspergillus peuvent
aussi être nommés par leurs stades sexués (Tableau 4). À noter qu'un même genre
téléomorphe peut avoir ses anamorphes dans différentes sections.
B. Identification morphologique
1. Morphologie macroscopique : caractères culturaux
Les critères macroscopiques pour l’identification d’espèce comprennent la vitesse de

pousse, l’aspect et la couleur des colonies recto et verso (Tableau 5). L’optimum
thermique de croissance est un critère utile pour certaines espèces thermophiles
comme A. fumigatus (56).
Les Aspergillus ont une croissance plus ou moins rapide sur milieu de Sabouraud
additionné d’antibiotiques. Leur pousse est inhibée par le cycloheximide (actidione).
Si nécessaire, leur fructification peut être stimulée par repiquage de la colonie sur
gélose à l’extrait de malt (Malt Extract Agar MEA) ou sur milieu de Czapek qui
34
constituent les milieux de référence pour ces champignons. Après 24 à 48 heures de
culture, on observe des colonies plates, formées de courts filaments aériens blancs.
Les colonies prennent leur couleur caractéristique après 48 à 96 heures avec la
maturation des spores (Figure 4).
Caractères
A. fumigatus A. flavus A. nidulans A. niger A. terreus A. versicolor
morphologiques
Duveteuse à Blanc puis de

Poudreuse Duveteuse à
Duveteuse Granuleuse poudreuse couleur varié :
Culture recto Vert-bleuté à poudreuse
Vert jaune Noire Blanc puis rosée, jaunâtre
gris noirâtre Vert cresson ou verte
jaune ocre
Incolore, Incolore,
Incolore ou
Culture verso jaune, vert ou rosé ou Pourpre, Incolore à
Ocre à rouge variant du jaune
brun selon les brun-rouge rougeâtre jaune pâle
au brun
souches foncé
Croissance
Croissance Croissance Croissance
rapide en 3-
très rapide en Croissance rapide en 2-3 rapide en 3-5 Croissance lente
5 jours
24-48h rapide en 2- jours jours en 5-7 jours
Conditions de Optimum
Optimum 3 jours Optimum Optimum Optimum
thermique à
croissance thermique de Optimum thermique à thermique à thermique à 25-
25-30°C
40-42°C thermique à 25-30°C 25-30°C 30°C (pousse
(pousse
(pousse 37°C (pousse (pousse aussi jusqu’à 40°C)
aussi à
jusqu’à 57°C) jusqu’à 42°C) à 37°C)
37°C)
Tableau 5 : Caractères macroscopiques des Aspergillus (56)
Aspergillus fumigatus
Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Figure 4 : Aspect macroscopique de cultures d'Aspergillus sur milieu Sabouraud, recto (gauche) et verso
droite) (56)
35
2. Morphologie microscopique
L’identification microscopique d’Aspergillus repose sur l’observation des formes

asexuées des champignons au microscope à l’objectif 20x ou 40x. Les éléments sont
observés en prélevant les colonies filamenteuses et poudreuses avec un scotch.
Elles sont déposées ensuite dans une goutte de bleu de lactophénol entre lame et
lamelle. Les filaments mycéliens, les organes de fructification et les spores sont
ensuite analysés (56).
Le genre Aspergillus est caractérisé par un thalle végétatif formé de filaments
mycéliens, ou hyphes. Les conidiophores sont produits à partir des hyphes végétatifs
et se terminent par une vésicule portant les cellules de la conidiogenèse, les
phialides. Ces phialides sont insérées soit directement sur la vésicule, soit sur les
métules. Elles produisent les spores ou conidies nécessaires à la reproduction
asexuée du champignon. L’ensemble vésicule, phialide, conidies forme la tête
aspergillaire qui caractérise le genre Aspergillus (Figure 5). Les spores sont toujours
unicellulaires, de forme variable, mesurant 2 à 5 µm de diamètre et sont plus ou
moins pigmentées.
Le Tableau 6 résume les principaux critères d’identification microscopique d’espèce
d’Aspergillus.
Figure 5 : Schéma des têtes aspergillaires (56)
36
Caractères
A. fumigatus A. flavus A. nidulans A. niger A. terreus A. versicolor
morphologiques
Court, 300 µm,

Long, 1 mm à Brun, lisse, Lisse, hyalin Lisse, Lisse,
lisse et incolore,
2,5mm, sinueux, très ou brunâtre, incolore, jaunâtre, long
Conidiophore avec évasement
verruqueux avec petit (75 à très long (1.5 court, 100 à (500 à 700
progressif au 100 µm) à 3 mm) 250 µm µm)
aspérités
sommet
Hémisphérique, Sphérique, 25 à Globuleuse, Ovale, 12-16

Vésicule Sphérique Globuleuse
20 à 30 µm 45 µm 30 à 100 µm µm
Directement
Portées par Portées par Portées par Portées par
portées sur la Directement sur des métules, des métules, des métules, des métules,
vésicule, la vésicule ou sur la partie disposées sur sur la partie disposées sur
Phialides
dressées, portées par des supérieure tout le supérieure tout le
densément métules de la pourtour de la de la pourtour de la
groupées vésicule vésicule vésicule vésicule
Globluleuses,
Rondes, Lisses,
3,5-5 µm,
Globuleuses, Globuleuses à vertes, brunes, globuleuses
vertes, subglobuleuses, échinulées. échinulées à à Globuleuses,
Conidies échinulées, vert pale, Souvent très légèrement 2 à 3,5µm,
petites (2,5 à 3 échinulées, 3,5 disposées verruqueuses, elliptiques, échinulées
µm) à 4,5 µm en chaine, souvent petites (1,5
3-3,5 µm disposées en à 2,5 µm)
chaine
Bisériée,
Unisériée, en Bisériée, en radiée
colonne Bisériée ou Bisériée en
Tête Bisériée ou colonne N.B :
colonne,
compacte assez unisériée, (300- radiée, noire à évasée Présence de
aspergillaire courte et
grande (jusqu’à 400 µm), radiée maturité (aspect pinceaux
compacte
100 µm) d’éventail) évoquant
Penicillium
Tableau 6 : Principales caractéristiques microscopiques des espèces d’Aspergillus (56)
Certaines espèces de la section Fumigati dont A. novofumigatus, A. fumigatiaffinis,

A. fumisynnematus et A. lentulus ont une morphologie très proche d’A. fumigatus
(48), d’où l’importance des outils de biologie moléculaire pour les identifier. L’espèce
la plus fréquemment retrouvée dans les prélèvements cliniques est A. lentulus
(49,57–60). Au niveau macroscopique, A. lentulus est caractérisé par des colonies
floconneuses de couleur blanche entrecoupées de colonies vertes au recto (Figure
6). Au verso, les colonies sont de couleur jaune. La sporulation pauvre et lente a
donné le nom à l’espèce (lentulus). A. lentulus pousse faiblement à 45°C et ne
pousse pas à 48°C, contrairement à A. fumigatus. Au niveau microscopique, le
conidiophore est à paroi lisse, incolore, de 250 à 300 µm de long, les vésicules sont
plus petites que A. fumigatus, de 8-10 µm de large, hyalines. Les phialides sont plus
courtes, unisériées et les conidies sont similaires à A. fumigatus : bleues vertes,
globuleuses et rugueuses, de 2,5 à 3 µm de diamètre (Figure 6) (49).
37
A. lentulus A. fumigatus
Milieu MEA Milieu MEA
Figure 6 : Morphologies macroscopique et microscopique d'A. lentulus et d'A.fumigatus (48)
C. Réservoirs environnementaux et mode de contamination
Les Aspergillus sont des champignons cosmopolites très répandus dans

l’environnement, où ils vivent en saprophytes colonisant de nombreux
écosystèmes (43). Ubiquistes, on les rencontre aussi bien en milieu rural (dans les
silos à grains, foin, paille tassée et humide, céréales ou fruits moisis, matières
organiques d'origine végétale en décomposition, compost, terreau, etc.) qu'en milieu
urbain, et aussi bien à l'extérieur qu'à l'intérieur des habitations (poussières
accumulées derrière les meubles, les réfrigérateurs, sur les cadres, dans les faux
plafonds et les conduits d'aération, ou dans la terre des plantes en pot). Les
Aspergillus sont également rencontrés sur certains fruits et légumes, dans le pain, le
poivre, les épices, le thé et aliments lyophilisés. Ils sont aussi présents dans l'eau et
l'air (61).
La recherche d’Aspergillus et plus largement des moisissures dans l’environnement
intérieur peut se faire sur 3 types de prélèvements : les prélèvements d’air (par
impaction sur gélose notamment), les prélèvements de surface (par des boites
gélosés contacts ou des écouvillons) et les prélèvements de poussières (62). Ces
dernières années, des collecteurs électrostatiques de poussières ont été proposés
afin de combiner certains avantages des prélèvements d’air et de poussières (63–
65). A partir de ces prélèvements environnementaux, la mesure des concentrations
de spores fongiques s’effectue généralement par microscopie ou mise en culture.
38
Plus récemment, des techniques de qPCR, plus rapides et plus sensibles que la
culture, se sont fortement développées dans les études environnementales (66,67).
Les spores d’Aspergillus sont naturellement présentes dans l’air extérieur, à une
concentration estimée entre 1 et 100 spores/m3 (68). Les enquêtes
aéromycologiques montrent qu‘Aspergillus représentent 1 à 5% des isolements des
moisissures loin derrière Cladosporium (20 à 30%), Alternaria (9 à 18%) et
Penicillium (6 à 8%) (69). Les spores aspergillaires pénètrent aussi facilement dans
les locaux y compris les hôpitaux, par l’intermédiaire des occupants ou via les
systèmes de ventilation dans lesquels elles peuvent exploiter des niches écologiques
diverses. En milieu hospitalier, la réalisation de travaux présente un risque
d’aérodispersion de spores fongiques, et par conséquent un facteur de risque de
contamination pour les patients immunodéprimés hospitalisés (70). Aspergillus est
présent dans 50% des habitations et arrive en troisième position après Cladosporium
(83%) et Penicillium (75%) (71). L’humidité favorise leur survie et leur
développement, notamment dans l’environnement intérieur. Une étude dans les
logements insalubres dans l’est de la France a montré que les concentrations en
moisissures étaient significativement plus élevées que dans les logements sains et
que les moisissures les plus fréquemment isolées étaient Penicillium, Cladosporium
et Aspergillus versicolor (72).
Les spores d’Aspergillus étant en suspension dans l’air, leur inhalation est obligatoire
et quotidienne. On évalue de 2000 à 3000 le nombre de spores d’A. fumigatus
inhalées chaque mois (73). La contamination se fait donc principalement par voie
aérienne, c’est donc l’appareil broncho-pulmonaire qui est le plus fréquemment
concerné par la maladie aspergillaire.
D. Pouvoir pathogène d’A. fumigatus dans la BPCO
L’infection aspergillaire est limitée dans la population générale en dépit d’une

inhalation régulière de spores car elles sont éliminées par le tapis mucociliaire chez
l’hôte immunocompétent. Les Aspergillus sont des pathogènes opportunistes et leur
spectre clinique dépend de la réceptivité de l’hôte, de facteurs favorisants locaux
(cavités résiduelles pulmonaires, lésions bronchiques et pulmonaires) et généraux
(immunodépression, corticoïdes, immunosuppresseurs, neutropénie, allogreffe de
moelle osseuse) de l’hôte et de l’exposition fongique dans l’environnement (quantité
et virulence des spores inhalées) (74). Kosmidis et Denning (7) considèrent les
différents tableaux cliniques comme un spectre continu de maladies, une forme
39
pouvant évoluer dans une autre selon le degré d’immunodépression. Ils distinguent :
• La colonisation saprophyte bronchique ;
• Les aspergilloses allergiques comprenant l’aspergillose broncho-pulmonaire
allergique (ABPA) et l’alvéolite allergique extrinsèque ;
• Les aspergilloses trachéobronchiques ;
• Les aspergilloses pulmonaires chroniques (APC) comprenant l’aspergillome
(cavité préformée), l’aspergillose pulmonaire chronique nécrosante (APCN) et
l’aspergillose pulmonaire chronique cavitaire (APCC) ;
• L’aspergillose pulmonaire invasive (API).
Des études récentes ont montré que les patients atteints de BPCO étaient un groupe
à risque de développer une aspergillose pulmonaire aiguë ou chronique (7,9). De
plus, l’isolement d’A. fumigatus dans les prélèvements respiratoires de ces patients
est fréquent (75), mais les données concernant sa signification sont limitées. La
colonisation par Aspergillus pourrait être associée à une probabilité élevée d’avoir
une API (76) et une mortalité plus élevée (77).
1. Colonisation saprophyte bronchique
La colonisation est définie par l’isolement répété d’Aspergillus à partir de

prélèvements des voies respiratoires, sans preuve d’infection à Aspergillus. Elle
correspond à une atteinte saprophyte sans invasion tissulaire (7). La distinction entre
colonisation et infection repose sur la clinique, bien qu’un signal plus fort en qPCR
peut indiquer une infection plutôt qu’une colonisation (7).
Les patients atteints de BPCO sont une population à risque de colonisation par
Aspergillus (8,78). Dans une étude portant sur des patients hospitalisés en
réanimation, l’isolement d’Aspergillus à partir de prélèvements respiratoires était
associé à la fois au diagnostic sous-jacent de BPCO (Odds Ratio : OR=2.9) et au
traitement par corticoïdes (OR=4.5) (79). La colonisation peut correspondre à un
passage temporaire d’Aspergillus dans les voies respiratoires, à un portage bénin à
long terme ou un signe précédent l’API. Il y a peu d’études prospectives sur la
prévalence de la colonisation des voies respiratoires chez les patients présentant
une EABPCO, il est donc difficile de définir l’influence d’Aspergillus comme agent
causal d’exacerbation. Récemment, Huerta et al. ont étudié la prévalence de
colonisation par Aspergillus dans les expectorations d’une cohorte prospective de
patients BPCO hospitalisés pour une EABPCO entre janvier 2008 et décembre 2009
: elle était de 16,6% à l’admission et de 14,1% après une année de suivi (80).
40
2. Aspergillose pulmonaire invasive
L’API est définie par une invasion aspergillaire bronchique plus ou moins distale, un
envahissement du parenchyme pulmonaire et/ou vasculaire occasionnant un risque
de dissémination viscérale.
a) Facteurs de risque
Elle est fréquemment observée chez les patients présentant une hémopathie
maligne, une greffe de moelle osseuse allogénique, en fin du stade de l'infection VIH,
une transplantation d'organes solides et en cas de granulomatose chronique (81–
83). En dehors de ces groupes à risque d’immunodéprimés, on décrit de plus en plus
de cas chez des patients atteints de maladies broncho-pulmonaires chroniques, en
particulier de BPCO (81,9,76). En effet, la BPCO provoque une altération de
l’épithélium bronchique favorisant la colonisation fongique et une diminution de
l’immunité locale, notamment des fonctions phagocytaires des macrophages (9).
L’utilisation de la corticothérapie par voie inhalée associée aux bronchodilatateurs
dans la BPCO sévère et très sévère ou par voie orale en cas d’exacerbation de
BPCO chez ces patients augmente encore le risque d’API. Une antibiothérapie à
large spectre est aussi un facteur de risque d’API chez ces patients, sélectionnant
l’écologie fongique (8,84). D’autres facteurs de risque sont associés au
développement de l’API chez le patient atteint de BPCO : la fumée de tabac, les
comorbidités fréquemment associées dont la dénutrition, l’alcoolisme et le diabète
(8). Des études ont montré que certaines infections, notamment les infections virales
telles que la grippe ou l’infection à CMV, peuvent précéder l’API, ce qui suggère un
rôle dans l’étiologie (9). L’API chez les patients atteints de BPCO serait associée à
une augmentation de la durée d’hospitalisation (85) et à une mortalité élevée de 72 à
95% (9,76,86).
b) Incidence chez les patients atteints de BPCO

Bien qu’une incidence d’environ 2% ait été rapportée par quelques études (8,76), il
est difficile d’évaluer la vraie incidence de l’API chez les patients atteints de BPCO
en raison de l’absence de définition cohérente des cas et de l’absence de mesures
de surveillance de l’infection (9). Dans une méta-analyse de 53 études de cas fatals
d’API survenus entre 1995 et 1999, 46 patients sur 1941 (1,3%) étaient porteurs
d’une BPCO (87). Une autre étude sur 1850 patients hospitalisés en réanimation
entre 2000 et 2003 présentant une API en dehors du cadre d’une hémopathie ou
d’une tumeur solide maligne a montré que 35 patients (1,89%) présentaient une
41
BPCO (81). Enfin, une étude espagnole a montré que l’incidence de l’API était plus
élevée aux stades avancés de la BPCO (III et IV de GOLD) (76) .
c) Diagnostic chez les patients atteints de BPCO

Le diagnostic d’API chez les patients atteints de BPCO est souvent difficile. Le
principal signe clinique est une pneumonie non spécifique d’évolution défavorable
sous antibiothérapie avec exacerbation de la dyspnée. Les signes radiologiques
peuvent montrer l’apparition de nodules, d’excavations ou de nouveaux infiltrats alors
que les signes du halo ou du croissant gazeux, pathognomoniques dans les API
chez les patients d’hématologie sont rares dans la BPCO (9).
Concernant les examens mycologiques, la référence est l’isolement en culture
d’Aspergillus par prélèvement biopsique pulmonaire, pas toujours réalisable en
raison de la fonction respiratoire médiocre à ce stade. Néanmoins, l’isolement de
filaments aspergillaires dans les expectorations et/ou les aspirations trachéales de
ces patients signifie le développement d’une maladie aspergillaire dans un cas sur
deux. Bien que les patients BPCO puissent être colonisés par Aspergillus, il est
essentiel de reconnaître à un stade précoce la possibilité d’une API dans la BPCO
en particulier chez les patients de stade IV corticodépendants. De ce fait, la présence
d’Aspergillus dans l’expectoration ne doit pas être banalisée et mérite une
exploration complémentaire. Enfin, la réalisation d’une endoscopie bronchique avec
lavage broncho-alvéolaire (LBA) s’avère très contributive chez les patients BPCO.
L’identification de filaments aspergillaires sera un argument décisif pour poser un
diagnostic toujours difficile et décider de la mise en route du traitement (8).
Bien que les méthodes standard de détection d’Aspergillus (examen direct
microscopique avec mise en évidence de filaments mycéliens et mise en culture)
restent des outils diagnostiques majeurs (88), la PCR quantitative en temps réel
(qPCR) permet aussi de détecter Aspergillus avec une meilleure sensibilité et une
plus grande rapidité que la culture. Par ailleurs, Fraczek et al. ont montré que le
rendement de culture et le signal de qPCR étaient plus élevés sur les prélèvements
des voies respiratoires supérieures, les expectorations et les aspirations
bronchiques, que sur les prélèvements distaux et diluées comme le LBA, avec une
meilleure sensibilité pour la qPCR (89).
La détection d’anticorps sériques et le dosage du galactomannane (GM) orientent le

diagnostic. La recherche positive d’anticorps sériques anti-A. fumigatus demeure un
des critères diagnostiques d’API chez le BPCO proposés par Bulpa et al. (9), même
42
si ces patients corticodépendants sur le long terme peuvent présenter une réponse
en anticorps affaiblie, qui pourrait limiter l’utilité d’une telle recherche chez certains
patients (8). Le GM sérique a une faible sensibilité chez les patients atteints de
BPCO, de l’ordre de 40-55%, contrairement aux patients atteints d’hémopathie
maligne où elle est beaucoup plus élevée (71% pour les API prouvées) (8).
Le pronostic des patients atteints de BPCO présentant une API est largement
inférieur à celui des patients atteints d’hémopathie maligne. Le gain pronostique
obtenu chez les patients d’hématologie est corrélé à la rapidité de mise en route du
traitement antifongique après une procédure diagnostique bien validée avec les
critères de l’EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of
Cancer/Mycoses Study Group), non applicables chez les patients BPCO (8). Bulpa et
al. ont proposé une définition des API chez les patients BPCO, qui identifie 4 niveaux
d’infections par analogie avec les critères de l’EORTC/MSG : l’API prouvée, l’API
probable, l’API possible et la colonisation (9).
III. Traitement des aspergilloses chez les patients atteints de

BPCO : antifongiques utilisables et impact de l’émergence des
résistances
A. Sensibilité des Aspergillus aux antifongiques

1. Antifongiques utilisables pour le traitement des
aspergilloses
Plusieurs classes d’antifongiques sont utilisables sur les Aspergillus : les polyènes,
les échinocandines et les azolés.
a) Les polyènes
Le chef de file des polyènes est l'amphotéricine B (AMB). C’est un antifongique
fongicide à large spectre qui cible la membrane fongique. L’AMB est utilisable par
voie parentérale, est néphrotoxique et donne des réactions lors de l’injection (fièvre,
myalgies, nausées). Ces effets indésirables sont atténués grâces aux formes
vectorisées par des lipides (AMB liposomale ou complexe lipidique d'AMB) (90).
L’AMB liposomale est indiquée dans le traitement des infections fongiques invasives
à Aspergillus de seconde intention en alternative thérapeutique en cas d'échec ou
d'intolérance au voriconazole (VOR). Dans les principales études, l'AMB est efficace
sur la majorité des espèces, mais la résistance primaire est reconnue chez A. terreus
et chez certains isolats d’A. flavus et A. ustus (91,92) et plus récemment, elle a été
démontrée chez certaines espèces de la section Fumigati dont A. lentulus et A.
43
fumigatiaffinis (51). Chez A. fumigatus, les preuves du développement de résistance
acquise manquent.
b) Les échinocandines
Les échinocandines constituent la classe la plus récente parmi les antifongiques et
ciblent la paroi fongique. Trois molécules sont disponibles : la caspofungine (CAS), la
micafungine et l’anidulafungine. Sur les Aspergillus, les échinocandines sont
fongistatiques. Elles sont indiquées dans l’aspergillose invasive (AI) en seconde
intention chez les patients réfractaires ou intolérants à l’AMB et/ou aux azolés. Les
échinocandines sont utilisables par voie parentérale et ont un excellent profil, elles
sont bien tolérées, présentent peu d’effets indésirables et d’interactions
médicamenteuses, et la posologie est simple ne nécessitant pas d’adaptation
particulière (93). On en sait beaucoup moins sur la résistance acquise aux
échinocandines. Bien que des infections à A. fumigatus avec des CMI élevées aient
été signalées de façon sporadique (94,95), elles peuvent être sous-diagnostiquées à
cause du test de sensibilité de la CAS beaucoup moins simple d’interprétation que
celui des azolés.
c) Les antifongiques azolés

Les antifongiques azolés actifs sur les Aspergillus sont les dérivés triazolés suivants :
l’itraconazole (ITZ), le voriconazole (VOR) et le posaconazole (POS). D’autres azolés
puissants sont en cours d’évaluation clinique (albaconazole, ravuconazole et
isavuconazole) (96).
Mécanisme d’action
Les antifongiques azolés sont des antifongiques fongicides qui ciblent la membrane
fongique. Ils bloquent la voie de biosynthèse de l’ergostérol, principal stérol
constituant la membrane fongique, via l’inhibition d’une enzyme de la superfamille
des cytochromes P450, la lanostérol 14α déméthylase ou CYP51. Ils entraînent la
diminution de la synthèse de l’ergostérol, l’accumulation de stérols toxiques et des
lésions membranaires du champignon (97). L’enzyme CYP51 est codée par le gène
cyp51 chez les moisissures (erg11 chez les levures) (98). A. fumigatus possède 2
gènes qui codent pour l’enzyme CYP51 : les gènes cyp51A et cyp51B qui sont
étroitement liés et interviennent tous les deux dans la biosynthèse de l’ergostérol
(99).
44
Sur le plan moléculaire, un des atomes d’azote de l’antifongique (N-4) se lie à
l’atome de fer de l’hème situé dans le site actif de l’enzyme du cytochrome P450 (en
vert sur la Figure 7b) bloquant ainsi l’accès du ligand naturel, le lanostérol dans le
site actif et donc l’activation de ce cytochrome. La modélisation de la protéine
CYP51A montre la présence de deux canaux d’accès au ligand pour le lanostérol et
les antifongiques azolés (channel 1 et 2). Xiao et al. ont montré que le POS et l’ITZ,
antifongiques à longue chaine latérale, empruntaient préférentiellement le canal 2
pour accéder au site actif de l’enzyme alors que le VOR, plus petite molécule
interagit de façon moindre avec le canal 2 (100) (Figure 7a).
Figure 7a et 7b : Structure du POS(A), ITZ(B) et VOR(C) (7a) et représentation de leur enzyme cible
CYP51A (7b) (100)
Formes disponibles et indications
L’ITZ est un triazolé disponible par voie orale et parentérale de première génération
qui n’est plus utilisé en première intention dans le traitement ou la prophylaxie de l’AI.
Il a été supplanté par le VOR et le POS sur des arguments d’efficacité, de
biodisponibilité et de tolérance. Par contre, il reste indiqué dans l’aspergillome en
traitement alternatif à la chirurgie d’exérèse, en cas d’APCC et en prophylaxie
primaire chez les patients atteints de granulomatose septique chronique (101). Le
VOR est un triazolé de deuxième génération à large spectre, actif sur Aspergillus,
Fusarium, et certaines espèces de Scedosporium. Il est administrable par voie orale
ou parentérale et constitue le traitement de première ligne de l’AI (102). Le POS est
un triazolé de troisième génération à très large spectre avec une activité sur les
levures, les moisissures incluant Aspergillus, Fusarium, et certains zygomycètes. Il
est disponible uniquement par voie orale et est utilisé en traitement curatif de
45
deuxième intention en cas d’AI prouvées ou probables réfractaires (stabilité à J7) ou
en cas d’intolérance au traitement de première intention. Le POS est également
indiqué en prophylaxie chez les patients à haut risque d’AI : patients en neutropénie
secondaire aux chimiothérapies pour leucémies aiguës myéloïdes et syndromes
myélodysplasiques ou patients receveurs de greffe de cellules souches
hématopoïétiques sous traitement immunosuppresseur à haute dose pour la maladie
du greffon contre l’hôte (GVH).
2. Recommandations pour la prise en charge des

aspergilloses chez les patients atteints de BPCO
Le traitement antifongique de l’API chez les patients BPCO ne fait pas l’objet de
recommandations particulières, il est le même que celui des API des patients
d’hématologie recommandé par la société américaine des maladies infectieuses
(Infectious Diseases Society of America) en 2008. Le voriconazole (VOR) est le
traitement de référence des API. L’amphotéricine B (AMB) liposomale est utilisé en
alternative. Les traitements de seconde intention incluent les autres formulations de
l’amphotéricine B (Abelcet®), la caspofungine (CAS) ou le posaconazole (POS)
(103). Toutefois chez ces patients, la question de la décroissance ou de l’arrêt des
corticoïdes doit être discutée (8).
Ainsi, les antifongiques triazolés tiennent une place majeure dans le traitement et la
prévention des infections aspergillaires et représentent la seule classe
d’antifongiques utilisable par voie orale. Bien qu’A. fumigatus soit naturellement
sensible aux triazolés, l’émergence d’isolats d’A. fumigatus résistants aux azolés a
été rapportée en France et dans le monde (104). Malgré la survenue de cas d’API
causés par des isolats résistants chez des patients immunodéprimés et associés à
une mortalité plus élevée (105), aucun cas d’aspergillose à A. fumigatus résistant
aux azolés n’a été rapporté à ce jour chez un patient atteint de BPCO.
B. Mécanismes de résistance aux azolés
A. fumigatus est naturellement sensible aux antifongiques azolés, contrairement à

des espèces de la section Fumigati de morphologie très voisine telles qu’A. lentulus
et Neosartorya udagawae qui présentent une faible sensibilité aux azolés (106,107).
Les mécanismes de résistance chez A. fumigatus sont donc des mécanismes de
résistance acquise. Il existe un mécanisme principal de résistance acquise aux
azolés : la modification de la cible des azolés, l’enzyme lanostérol 14α déméthylase
46
par mutation et/ou surexpression du gène cyp51A (14). D’autres mécanismes de
résistance comme les pompes à efflux sont décrits.
1. Mutations du gène cyp51A
Les mutations retrouvées le plus fréquemment sont localisées en position G54, M220
et L98 du gène cyp51A (Figure 9Erreur ! Source du renvoi introuvable.). Elles
sont responsables de substitutions induisant une modification structurale de la
protéine inhibant sa liaison avec les azolés. Ces mutations sont les seules
confirmées comme étant associées formellement à une résistance aux azolés par
transformation d’une souche sensible avec le gène cyp51A muté (108). La première
mutation correspond à une substitution de la glycine en position 54 (G54) du gène
cyp51A. Les isolats cliniques présentant cette mutation montrent une résistance
croisée à l’ITZ et au POS mais pas au VOR (109–111). Cela s’explique par la
localisation de la mutation G54 à proximité de l’entrée du canal 2 (Figure 8), qui
interagit avec les longues chaines latérales de l’ITZ et du POS mais pas avec le VOR
qui est une petite molécule et qui n’a pas besoin de cette interaction (112). La
seconde mutation est localisée sur la méthionine en position 220 (M220) et est
associée à une résistance à l’ITZ et une sensibilité diminuée au POS, VOR et
ravuconazole (113). La troisième mutation L98H correspond à la substitution d’une
leucine en histidine en position 98. Elle est associée à la répétition en tandem d’une
séquence de 34 paires de base (pb) dans le promoteur du gène cyp51A (Tandem
Repeat 34 ou TR34). Ce mécanisme moléculaire TR34/L98H, que l’on appellera
mutation TR34/L98H, entraine une augmentation jusqu’à huit fois du niveau
d’expression du gène cyp51A et est associée à une résistance multiple à tous les
antifongiques triazolés (114). La cause de la multirésistance est discutée : elle
s’explique d’après Snelders et al. par la localisation de la leucine 98, sur une boucle
structurale hautement conservée parmi les membres de la famille des protéines
CYP51 (Figure 8). Ainsi, même si elle n’est pas située à proximité des canaux
d’accès des ligands ou de l’hème, la substitution L98H entrainerait une augmentation
de la flexibilité de cette boucle réduisant le diamètre d’entrée de tous les
antifongiques au niveau des canaux d’accès (112). Cependant, en 2011, Fraczek et
al. suggèrent comme Mellado et al. en 2007, que la multirésistance est uniquement
due au promoteur dupliqué (région TR34) (114,115).
47
Substitution
Génotype Phénotype
Acide Aminé
Hotspot
G54 E, K, R, V, W R à ITZ et POS, S à VOR
M220 K, I, T, V, R R à ITZ et POS, R ou S à VOR
L98 H R à tous les azolés
Autres mutations
N22 D R à ITZ, autres non documentés
S52 T R à tous les azolés
Y121 F R VOR
G138 C, R R à tous les azolés
Q141 H R à tous les azolés
H147 Y R à tous les azolés
P216 L R à ITZ et POS, S à VOR
M236 K, T, V R à ITZ
T289 A R VOR
S297 T R à ITZ et POS, S à VOR
P394 L R à ITZ, autres non documentés
Y431 C R à tous les azolés
G432 S R à ITZ et POS, S à VOR
G434 C R à tous les azolés
T440 A R à ITZ, autres non documentés
G448 S R à tous les azolés
Y491 H R à ITZ, autres non documentés
F495 I R à ITZ et POS, S à VOR
Mutations trouvées dans des isolats sensibles et résistants
F46 Y Variable
G89 G Variable
E130 D Variable
M172 V Variable
N248 T Variable
D255 E Variable
L358 L Variable
S400 I Variable
E427 G, K Variable
C454 C Variable
Tableau 7 : Mutations du gène cyp51A identifiées chez les isolats d'Aspergillus fumigatus résistants aux
azolés (104,108,116)
Les autres mutations non confirmées par transformation d’une souche sensible mais
décrites comme associées à une résistance aux azolés chez des isolats d’A.
fumigatus sont présentées dans le Tableau 7. Certaines mutations du gène cyp51A
(E130, N248, D255, …) ont été retrouvées dans des isolats sensibles et résistants,
elles ne sont pas toujours associées à des résistances aux azolés car elles sont
situées à des endroits moins stratégiques comme en périphérie de la protéine Figure
8) (112).
48
Figure 8 : Cartographie des mutations trouvées dans le gène cyp51A dans le modèle d’homologie de la
protéine CYP51A. En pourpre: mutations corrélées à la résistance aux azolés ; en vert : mutations
corrélées avec un profil sensible aux azolés ; en marron : mutations trouvées dans des isolats résistants
aux azolés (112)
A noter que des mutations peuvent être associées au sein de mêmes isolats. C’est le
cas du mécanisme de résistance émergent TR46/Y121F/T289A qui correspond à la
répétition en tandem d’une séquence de 46 pb dans le promoteur du gène cyp51A
associée aux 2 mutations Y121F et T289A, responsable d’une résistance élevée au
VOR et associée à une augmentation des CMI de l’ITZ et du POS (Figure 9), décrit
pour des isolats cliniques aux Pays-Bas, en Belgique et dans l’environnement en
Inde (117–119).
Figure 9 : Représentation des principales mutations décrites pour le gène cyp51A d'A. fumigatus
2. Autres mécanismes de résistance
Des isolats résistants d’A. fumigatus sans mutation du gène cyp51A ont été
rapportés (112), suggérant d’autres mécanismes alternatifs de résistance comme la
surexpression de pompes à efflux bien documentée chez Candida albicans (120).
Deux types de pompes sont impliqués : la famille des transporteurs à ATP Binding
Cassette (ABC transporteurs) et la famille des Super Major Facilitateurs (Major
facilitator superfamily MFS). Les gènes codant pour ces pompes sont redondants
chez A. fumigatus : il y a au moins 49 gènes codant pour les pompes de la famille
49
ABC et 278 codant pour ceux de la famille MFS. La surexpression de cinq de ces
gènes a été incriminée dans la résistance aux triazolés chez A. fumigatus (AfuMDR1,
AfuMDR2, AfuMDR3, AfuMDR4 et ATRF) (121). L'action de ces pompes à efflux a
également été mentionnée dans la résistance fongique dans le biofilm, en particulier
chez les patients atteints de mucoviscidose (122).
Plus récemment, l’étude de Buied et al. suggère la surexpression du gène cyp51B
comme mécanisme possible de résistance aux azolés sur des isolats d’A. fumigatus
résistants aux azolés sans mutations associées au niveau du gène cyp51A (123).
C. Détection de la résistance aux azolés au laboratoire
1. Détermination des CMI en milieu liquide : méthodes

de référence
Les méthodes de référence américaine du Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI) et européenne de l’European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing (EUCAST) déterminent les concentrations minimales
inhibitrices (CMI) par dilution en milieu liquide (milieu RPMI 1640 additionné de
glucose à 2% pour l’EUCAST et 0.2% pour le CLSI) en microplaque pour les
champignons filamenteux (taille de l’inoculum de 0,4-5 x104 UFC/ml pour le CLSI et
2-5 x105 UFC/ml pour l’EUCAST) (124,125).
Les CMI se déterminent par cette technique à 100% d’inhibition après 48 heures
d’incubation sauf pour les échinocandines pour lesquelles le paramètre recommandé
est la concentration minimale efficace (CME) car leur mode d’action sur les
moisissures génère une croissance résiduelle in vitro. La CME correspond à la plus
faible concentration conduisant à une croissance aberrante détectable par des
altérations morphologiques des hyphes au microscope. Les seuils d’interprétation de
l’EUCAST pour définir si une souche d’A. fumigatus est sensible ou résistante sont
présentés dans le Tableau 8 .
CMI (mg/l) S R
Amphotéricine B ≤1 >2
Itraconazole ≤1 >2
Posaconazole ≤0.12 >0.25
Voriconazole ≤1 >2
Tableau 8 : Seuils d'interprétation des CMI établis par l'EUCAST pour A. fumigatus (126)
Ces techniques sont lourdes et mal adaptées aux tests de routine et sont donc
réservées aux laboratoires spécialisés. Elles ont pour objectifs la standardisation
50
technique, l’établissement des seuils d’interprétation, la validation des techniques de
routine, les études épidémiologiques et d’activité des nouveaux antifongiques (127).
2. Détermination des CMI en milieu gélosé : méthode

Etest®
La méthode Etest® est une technique de détermination de CMI en milieu gélosé

adaptée à la routine. Les Etests® (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) sont des
bandelettes graduées imprégnées d’un gradient croissant d’antifongique. Ces
bandelettes sont déposées sur une gélose préalablement ensemencée (en général
un milieu RPMI) et la CMI est lue directement à l’intersection entre la base de
l’ellipse d’inhibition et la bandelette graduée. La méthode Etest® présente une
excellente corrélation avec la méthode de référence CLSI surtout pour l’itraconazole
et le voriconazole avec une concordance comprise entre 80 et 100% quand les
Etests® sont lus à 48 heures (128). Les seuils d’interprétation pour déterminer si une
souche est sensible ou résistante sont les même que ceux établis par l’EUCAST
(Tableau 8).
3. Identification d’isolats résistants par

ensemencement sur milieu Sabouraud additionné
d’antifongiques azolés
La détection in vitro de la sensibilité aux antifongiques au laboratoire peut prendre au

moins 5 à 7 jours avec les méthodes décrites précédemment (méthodes de
référence et Etests®). Les milieux additionnés d’antifongiques azolés (ITZ, POS ou
VOR) sont de plus en plus utilisés comme technique de dépistage pour la résistance
aux azolés (108). De nombreux travaux utilisent des milieux additionnés d’ITZ à
concentrations variables de 4 mg/l (13,129,130) ou 8 mg/l (116) pour dépister la
résistance aux azolés des isolats d’A. fumigatus car la résistance à l’ITZ apparaît
commune à toutes ces souches résistantes aux azolés (14). Même si cette technique
n’est pas encore utilisée en routine, elle pourrait être un outil de dépistage futur utile
pour identifier les isolats nécessitant des investigations plus poussées (détermination
des CMI des antifongiques azolés par exemple) (108).
4. Détection rapide de la résistance aux azolés par

biologie moléculaire
Pour réduire encore plus le délai diagnostique de la résistance aux azolés, des
auteurs ont utilisé la biologie moléculaire et notamment la qPCR pour détecter
51
rapidement la résistance aux azolés et déterminer directement le mécanisme de
résistance responsable. Ainsi, Van Der Linden et al. ont développé 2 qPCR pour
détecter le mécanisme de résistance TR34/L98H. La première qPCR cible la
répétition en tandem de la séquence de 34 pb dans le promoteur du gène cyp51A et
utilise comme système de détection l’hydrolyse de sonde (Taqman), la seconde
qPCR cible la substitution L98H et utilise comme système de détection l’hybridation
de 2 sondes (FRET) (131). Garcia-Effron et al. ont développé une qPCR multiplex
utilisant des sondes Molecular Bacons ciblant les mutations les plus fréquentes
(G54, L98, G138 et M220) (132).
D. Origine de la résistance
1. Acquisition de la résistance au cours d’un
traitement par antifongique azolé
La résistance aux azolés d’isolats cliniques d’A. fumigatus (résistance clinique)

apparaît classiquement pendant un traitement curatif ou préventif par antifongique
azolé et fait intervenir une grande variété de mutations. De nombreux auteurs ont
rapporté ce phénomène surtout chez les patients traités par azolés à long terme pour
des aspergillomes ou des aspergilloses pulmonaires chroniques (10–12). Le mode
de reproduction du champignon semble être important pour l’expression
phénotypique de la résistance aux azolés. Chez les patients présentant un
aspergillome ou des lésions cavitaires, le champignon se reproduit par sporulation,
ce qui facilite le transfert de gènes de résistance aux spores et à leur descendance
et par conséquent son adaptation à la pression de sélection exercée par les azolés.
En effet, les mutations sont ou seront exprimées dans la conidie initiale mais aussi
dans toutes les conidies filles. Mais chez les patients atteints d’aspergillose invasive,
l’infection progresse par élongation des hyphes sans sporulation. Des mutations
spontanées peuvent se produire dans les noyaux des hyphes mais étant donné le
nombre total de noyaux par hyphe (jusqu’à un million), elles n’auront qu’un faible
impact sur le phénotype du champignon, les gènes mutés étant moins fréquents que
les gènes sauvages (133). Le développement de résistance au cours d’une AI est
donc considéré comme peu probable par certains auteurs, sauf en cas d’évolution
vers un aspergillome (104).
2. Émergence de la résistance par exposition à des

isolats résistants d’origine environnementale
52
Une étude néerlandaise sur la prévalence de la résistance aux azolés chez des
patients dont la plupart n’avait jamais bénéficié de traitement antifongique (« patients
naïfs ») rapporte que la mutation TR34/L98H était impliquée dans 90% des isolats
résistants (105). L’hypothèse d’une transmission interhumaine d’un clone résistant a
été exclue à cause de la présence extrêmement rare de ce phénomène et parce que
ces isolats résistants ont été isolés chez des patients sans aucun lien
épidémiologique. De plus, près d’un tiers des patients infectés par un isolat muté
TR34/L98H présentait une AI, pathologie dans laquelle le champignon croit par
élongation des hyphes ; condition peu favorable à l’expression phénotypique des
résistances comme vu précédemment. L’hypothèse d’une origine environnementale
est donc apparue, notamment liée à l’utilisation de fongicides azolés en agriculture.
Elle a été suggérée pour la première fois aux Pays-Bas (116). En plus d’avoir été
retrouvée chez des patients naïfs, cette mutation a été rapportée dans de
nombreuses niches environnementales (sol, compost, parterres de fleurs, feuilles,
graines de plantes, prélèvement d’airs des hôpitaux) (13). Les pays européens
utilisent couramment des fongicides azolés, le plus souvent des imidazolés et des
triazolés qui ont le même mécanisme d’action que les antifongiques azolés utilisés
en médecine humaine. La consommation des fongicides azolés a été stable dans la
plupart des pays européens au cours de ces dernières années à l’exception des
Pays-Bas où la consommation a doublé depuis le milieu des années 1990. Par
exemple, on estime que près de la moitié de la surface agricole néerlandaise dédiée
aux céréales et aux vignes est traitée avec des fongicides azolés (133). A contrario,
aux États-Unis, ils sont utilisés dans moins de 5% des terres cultivées. L’utilisation
de ces fongicides azolés dans l’environnement pourrait diminuer la population des
isolats d’A. fumigatus sensibles aux azolés et sélectionner les isolats résistants
(134).
E. Prévalence des isolats résistants d’A. fumigatus aux

azolés
Les premiers cas d’A. fumigatus résistants à l’itraconazole ont été décrits en 1997 en
Californie sur des isolats cliniques (135). Depuis, de nombreux cas ont été rapportés
en France, Espagne, Belgique, Danemark, Suisse, Norvège, Pays-Bas, Royaume-
Uni, Canada, Chine, Iran et États-Unis. Même s’il est difficile d’avoir une estimation
fiable de la prévalence des isolats résistants (beaucoup de laboratoires ne testent
pas systématiquement les isolats), celle-ci est en constante augmentation depuis 10
ans avec de grandes variations en fonction des pays. Le programme mondial de
53
surveillance des résistances fongiques ARTEMIS impliquant 62 centres entre 2008
et 2009 a rapporté un taux de résistance de 5,8% (136). Une autre étude prospective
du réseau SCARE impliquant 22 centres médicaux dans 19 pays a identifié une
prévalence globale de 3,4%. La résistance aux azolés chez A. fumigatus variait entre
0 et 26% entre les 22 centres et a été détectée dans 11 (57,9%) des 19 pays
européens participants. Il est intéressant de souligner que près de la moitié des
isolats d’A. fumigatus résistants (48,9%) présentait une résistance multiple aux
azolés causée par la mutation TR34/L98H sur le gène cyp51A (137).
En France, la prévalence des isolats résistants cliniques est variable et dépend de la
population étudiée. En 1999, la prévalence de résistance à l’ITZ étudiée sur 156
isolats d’A. fumigatus collectés entre 1996 et 1998 était de 2,5% (138). En 2011,
celle-ci a été évaluée à 0,85% sur 118 isolats cliniques d’A. fumigatus collectés entre
2006 et 2009 issus de 89 patients d’hématologie de l’hôpital Henri Mondor à Créteil
(1 isolat résistant sur 118) (139). Cette faible prévalence peut s’expliquer par le petit
nombre de patients recevant un traitement à long terme par azolés dans cette
population. Une autre étude en 2011 chez 131 patients adultes atteints de
mucoviscidose de l’hôpital Cochin à Paris a montré une prévalence de 4,6% (140).
Parmi ces 131 patients, 47 (35,9%) avaient déjà reçu un traitement par ITZ. Cette
prévalence élevée de résistance aux azolés dans cette population de patients
atteints de mucoviscidose a été confirmée par une autre étude française à l’hôpital
de Nantes avec une fréquence de résistance élevée à 8% (130).
En Europe, la prévalence de la résistance est variable en fonction des pays (Figure
10) mais elle a augmenté significativement dans 2 pays d’Europe : les Pays-Bas et le
Royaume-Uni. Au Pays-Bas, une étude prospective sur plus de 1900 isolats
collectés entre 1994 et 2007 a rapporté une augmentation constante de la
prévalence annuelle d’isolats résistants, de 1,7% à 6% en 2006. Il convient de noter
que tous les isolats résistants ont été identifiés après 1999, et que 94% présentait la
mutation TR34/L98H (116). En 2008, le taux de résistance aux azolés aux Pays-Bas
a été estimé à 5,3% (de 0,8 à 9,5%) (105). Au Royaume-Uni, une étude sur 519
isolats cliniques d’A. fumigatus collectés entre 1992 et 2007 a rapporté une
prévalence de résistance de 5%, avec une nette augmentation après 2004 (1% avant
2004 versus 8% après) (10). Depuis, la tendance à l’augmentation a été confirmée
avec en 2008 et 2009 respectivement 14 et 20% d’isolats résistants (141).
Néanmoins ces chiffres doivent être considérés avec prudence. En effet, il y avait
probablement un biais d'inclusion dans cette étude : le laboratoire de mycologie
54
régional de Manchester est l'un des centres nationaux de référence pour les
infections aspergillaires et l'augmentation du nombre de tests de sensibilité réalisés
depuis 2003 a révélé un phénomène auparavant sous-évalué.
Dans les autres pays du monde, la prévalence de résistance des isolats cliniques
était de 2% en Inde en 2012 (142), de 3,2% en Iran en 2013 (143), 7,1% au Japon
en 2012 (144).
La Figure 10 résume les données disponibles concernant la fréquence de la
résistance clinique aux azolés et la présence d’isolats cliniques ou
environnementaux portant la mutation TR34/L98H en France et en Europe. Il est
intéressant de souligner les isolats résistants portant la mutation TR34/L98H ont été
retrouvés à la fois parmi les isolats cliniques et environnementaux mais aussi le
potentiel de propagation important de cette mutation à travers le monde. En effet,
elle n’est plus limitée aux isolats des Pays-Bas et a été de plus en plus fréquemment
rapportée depuis 2007 dans d’autres pays européens dont l’Espagne, la Belgique et
la Norvège en 2008 (116,145), le Royaume-Uni et la France en 2009 (130,11,140) et
en 2014 (146), le Danemark en 2011 (129) et l’Allemagne en 2012 (147). L'étude
prospective du réseau SCARE a indiqué que la mutation TR34/L98H avait été
identifiée dans d’autres pays européens comme l’Italie et l'Autriche et que c’était le
mécanisme de résistance principale (55%) dans six pays européens. Cette mutation
a même été décrite en dehors de l’Europe, notamment en Inde (119) en Chine (148).
55
Figure 10 : Répartition géographique de la prévalence des isolats cliniques d’A. fumigatus résistants et
de la mutation TR34/L98Hdans les isolats cliniques et environnementaux en France et en Europe
56
OBJECTIFS
Ce travail de thèse entre dans le cadre de l’étude FungiCOPD intitulée « Circulation
des pathogènes fongiques dans l’environnement domestique : impact clinique de
l’exposition aux moisissures et à Pneumocystis jirovecii sur les patients atteints de
BPCO ». Il s’agit d’une étude observationnelle de type cohorte prospective qui a
comme objectif principal d’évaluer le lien entre l’exposition au risque fongique aux
moisissures et les phénomènes de colonisation/sensibilisation fongiques au cours
des exacerbations sévères chez les patients atteints de BPCO grâce à une approche
bipolaire, ciblant d’une part le patient BPCO présentant une exacerbation sévère
avec la recherche de colonisation et de sensibilisation par les moisissures, et d’autre
part son environnement domestique avec la mesure de l’exposition domestique aux
moisissures à l’aide de capteurs à poussières exposés 10 semaines à son domicile.
Plus spécifiquement, les objectifs de ce travail sont de déterminer la prévalence de
colonisation par A. fumigatus, le niveau d’exposition aux moisissures et à A.
fumigatus dans l’environnement domestique et de caractériser les phénomènes de
résistance aux azolés dans les isolats cliniques et environnementaux d’A. fumigatus
dans cette population de patients atteints de BPCO du Nord-Pas de Calais, non
traités par antifongiques azolés (patients « naïfs »), afin d’étudier la circulation entre
les réservoirs cliniques et environnementaux.
La colonisation par A. fumigatus a été recherchée par culture et qPCR Aspergillus
sur les prélèvements respiratoires des patients inclus. Le niveau d’exposition
environnementale fongique a été mesuré chez ces patients par culture et qPCR
(panfongique, Aspergillus et A. fumigatus) directement sur les capteurs à poussières.
Après identification morphologique des isolats cliniques et environnementaux d’A.
fumigatus collectés chez ces patients, une caractérisation phénotypique incluant la
recherche des isolats résistants aux azolés et la détermination de la thermotolérance
a été effectuée dans un premier temps. Dans un second temps, une caractérisation
génotypique incluant le séquençage des régions ITS1 et ITS2 des ARN
ribosomiques, et du gène de la ß-tubuline pour la confirmation de l’identification, et le
séquençage du gène cyp51A pour la recherche éventuelle de mutations impliquées
dans la résistance aux azolés a été réalisée, afin de clarifier la circulation d’A.
fumigatus au sein et entre les différents réservoirs cliniques et environnementaux.
Enfin, la détection directe d’isolats résistants présentant la mutation TR34/L98H dans
l’environnement domestique de ces patients à partir des capteurs à poussières a été
testée par qPCR.
57
MATERIELS ET METHODES
I. Patients et définitions des statuts colonisés et sensibilisés
Les patients atteints de BPCO inclus dans l’étude prospective FungiCOPD entre août
2011 et juillet 2014 sont issus des services de Pneumologie, de Réanimation et de
Médecine Polyvalente Post-Urgence du CHRU de Lille. Les critères d’inclusion et
d’exclusion de l’étude sont présentés dans le Tableau 9.
Critères d’inclusion
Homme ou femme de 35 à 90 ans
Patient présentant une BPCO (stades I à IV)
Patient présentant un épisode d’exacerbation sévère nécessitant une hospitalisation
Critères d’exclusion
Tuberculose active
Cancer (ou traitement anticancéreux au cours des 3 années précédentes)
Bronchectasies diffuses
Mucoviscidose
Asthme
Toute autre pathologie pulmonaire diagnostiquée (sarcoïdose, fibrose pulmonaire, pneumoconiose)
Traitement anti P. jirovecii ou antifongique de moins de 6 mois
Femme enceinte ou allaitante
Patient non assuré social
Patient non consentant pour participer à l’étude
Patient ne pouvant comprendre l’étude et ses objectifs
Patient sous tutelle, curatelle
Tableau 9 : Critères d'inclusion et d'exclusion des patients de l'étude FungiCOPD
Au moment de cette inclusion et après information et recueil de consentement par un

médecin du service, un examen bioclinique complet leur était soumis. Il
comprenait notamment :
1) Des examens mycologiques réalisés spécifiquement dans le cadre du projet :
a. Une analyse des expectorations comprenant un examen microscopique, une mise
en culture pour l’obtention des isolats cliniques d’A. fumigatus et une qPCR
Aspergillus spp. (149) (cf. III.C), pour la recherche spécifique d’une colonisation par
A. fumigatus ou d’autres moisissures,
b. Un sérodiagnostic pour rechercher une sensibilisation aux moisissures y compris à
A. fumigatus,
Les résultats de ces examens mycologiques ont permis d’identifier :
• Les patients « colonisés » par A. fumigatus présentant un examen
microscopique, une culture et/ou une qPCR Aspergillus spp. positif(s) sur
expectoration
58
• Les patients « sensibilisés » par A. fumigatus présentant des anticorps anti-A.
fumigatus (ELISA) ou des précipitines (Ouchterlony) à taux significatif.
2) Un bilan environnemental constitué :
a. D’un questionnaire habitat complété avec le patient pendant son hospitalisation,
b. D’un capteur à poussières à déposer à son domicile et à renvoyer au bout de 10
semaines au Laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHRU de Lille.
Un suivi téléphonique trimestriel des épisodes d’exacerbation a été réalisé pour ces
patients inclus jusqu’à 18 mois après l’inclusion. A l’issue de ces 18 mois, un bilan
bioclinique complet de fin d’étude était effectué au cours d’une nouvelle visite afin de
suivre l’évolution des marqueurs mycologiques et de la fonction respiratoire.
II. Obtention des isolats cliniques et environnementaux

d’Aspergillus fumigatus par culture
A. Isolats cliniques
Les isolats cliniques d’A. fumigatus proviennent de 2 types de prélèvements

cliniques : les expectorations et les liquides de rinçage oro-pharyngé (LROP)
effectués au moment de l’inclusion des patients BPCO et au moment de la visite de
fin d’étude réalisée 18 mois après l’inclusion.
Les expectorations de chaque patient ont été traitées en mycologie conventionnelle
avec un examen direct au bleu de lactophénol et une mise en culture sur 4 milieux :
un milieu chromogénique incubé à 37°C, un milieu Sa bouraud dilué au ½ additionné
d’amikacine (SK1/2) incubé à 24°C et 2 milieux cont enant de l’érythritol, l’un incubé à
24°C et l’autre à 37°C. Après 7 jours d’incubation, une identification morphologique
macroscopique et microscopique des colonies de champignons filamenteux était
effectuée. Puis chaque isolat, était repiqué sur SK1/2 afin d’obtenir une subculture
pure, et un morceau de gélose recouverte de la moisissure était découpé au scalpel
et placé dans un tube contenant de l’eau stérile à 4°C. Au total, toutes les colonies
étaient conservées pour A. fumigatus, avec un minimum de 10 colonies et 1 colonie
pour les autres espèces. Le prélèvement était ensemencé sur milieu Sabouraud
additionné d’itraconazole à 4 mg/l (milieu ITZ, cf. Annexe 2) si plus de 10 colonies
d’A. fumigatus étaient isolées. En cas de culture positive sur le milieu ITZ, les
colonies supplémentaires étaient également conservées. Les LROP ont été traités
en mycologie conventionnelle de la même manière que les expectorations à partir de
mars 2014.
59
B. Isolats environnementaux
Les isolats environnementaux proviennent de prélèvements de poussières effectués

à l’aide de capteurs à poussières, exposés 10 semaines au domicile du patient, dans
sa chambre, ou d’échantillons environnementaux (écouvillon, air) prélevés au cours
des visites à domicile effectuées pour les premiers patients.
1. Capteurs à poussières
Préparation
Les capteurs à poussières préparés au laboratoire étaient constitués de lingettes

électrostatiques (20 x 30 cm) non-imprégnées d’antifongiques et d’antibactériens
[« Apta Captizz® » (Intermarché)] et stérilisées à l’autoclave. Ensuite, elles étaient
conditionnées en boite CD puis soit déposées au domicile au moment de l’enquête
environnementale (si celle-ci est réalisée), soit remises au patient pendant son
hospitalisation.
Analyse mycologique
Après 10 semaines d’exposition, le capteur était envoyé par le patient au laboratoire

puis pris en charge pour en extraire les spores fongiques de la façon suivante : la
lingette était pliée en 8, une fois en deux dans le sens de la longueur face exposée
vers l’extérieur, puis deux fois en deux dans l’autre sens. Elle était placée dans un
sac stérile, où étaient ajoutés 20 ml de Tween 80 à 0,1 % en eau physiologique
stérile. Ensuite, elle était brassée 10 minutes dans un broyeur homogénéiseur : le
Stomacher®. On obtenait un liquide de rinçage de la lingette du capteur à poussières
par essorage manuel.
Les liquides de rinçage de la lingette du capteur à poussières de chaque patient ont
été traités en mycologie conventionnelle avec mise en culture de 100 µl (2 gouttes)
sur 3 milieux : un milieu SK1/2 incubé à 30°C, un m ilieu contenant du bénomyl
incubé 24°C et un milieu DG18 (Oxoid, Dardilly, Fra nce) incubé à 24°C. Les boites
de culture ont été incubées pendant 7 jours avec observation régulière des boites,
afin de déterminer s’il y avait croissance de micro-organismes et de pouvoir compter
et identifier les colonies au fur et à mesure de leur croissance et avant
envahissement de la boite. Les isolats ont été conservés de la même manière que
pour les expectorations (toutes les colonies pour A. fumigatus, jusqu’à 10 colonies, et
1 colonie pour les autres espèces). Un milieu ITZ était ensemencé s’il y avait plus de
10 colonies d’A. fumigatus. En cas de culture positive sur le milieu ITZ, les colonies
60
supplémentaires étaient également conservées. Des aliquots de liquide de rinçage
étaient ensuite conservés à -80°C pour chaque capte ur.
2. Autres prélèvements environnementaux
Des prélèvements d’air et d’écouvillonnages ont été réalisés dans certaines zones
(humides, moisies, siphons de lavabos, plantes etc.) au domicile des patients lors
des enquêtes environnementales réalisées au début de l’étude. La durée de
recrutement ayant été plus longue que prévue, et en l’absence de personnel dédié
après la 1ère année de l’étude, ces enquêtes n’ont pas été réalisées pour les patients
inclus à partir de septembre 2012 (patient n°8). Ce s prélèvements ont été mis en
culture selon le même protocole que les capteurs à poussières.
III. Quantification de l’exposition environnementale aux

moisissures par qPCR
En parallèle de la mesure de l’exposition environnementale par mise en culture des

prélèvements environnementaux précédemment décrite, une quantification par PCR
quantitative en temps réel (qPCR) a été effectuée à partir des liquides de rinçage des
capteurs à poussières conservés à -80°C. Après extr action de l’ADN des spores
fongiques provenant des liquides de rinçage, 3 qPCR ont été effectuées pour
quantifier l’exposition environnementale fongique dans un premier temps, aux
Aspergillus spp. dans un second temps, et plus spécifiquement à A. fumigatus dans
un troisième temps.
A. Extraction de l’ADN des capteurs à poussières
L’extraction de l’ADN des spores fongiques contenues potentiellement dans les

capteurs à poussières a été effectuée avec le kit « QIAamp DNA Mini Kit » de
Qiagen (Courtaboeuf, France). Ce kit extrait et purifie les acides nucléiques grâce à
une micro colonne de silice qui adsorbe et retient les acides nucléiques lors des
différents traitements et lavages et permet leur élution en phase finale. Le protocole
utilisé était celui préconisé par la société Qiagen avec quelques modifications. Une
pré-lyse mécanique dans le Magna Lyser® (Roche Diagnostics, Meylan, France) par
agitation de 70 secondes à 7000 tours/minute des tubes contenant des microbilles
de verre de 425-600 µm de diamètre (Sigma Aldrich, Saint Quentin-Fallavier, France)
et 200 µl de liquide de rinçage ont été ajoutés au protocole. Ensuite, le surnageant a
été récupéré pour réaliser la lyse en présence de 180 µl de tampon ATL et de 20 µl
61
de Protéinase K. A partir de cette étape, l’extraction a été effectuée en suivant
précisément la procédure du fabricant : ajout de 200 µl de tampon AL suivi d’une
incubation à 70°C pendant 10 minutes, puis ajout de 200 µl d’éthanol absolu. Le
mélange obtenu était déposé sur la colonne de centrifugation et lavé avec 500 µl de
tampon AW1 puis de 500 µl de tampon AW2. L’ADN était ensuite élué avec 200 µl
de tampon AE.
B. Détection d’ADN fongique par qPCR panfongique
La quantification d’ADN fongique dans les capteurs à poussières a été réalisée par
une qPCR utilisant le système de détection SYBR®Green sur un automate ABI 7500
(Applied Biosystems, Courtaboeuf, France). La PCR cible des régions conservées du
gène de l’ARN ribosomique 18S des champignons (ARNr 18S), plus précisément
une région d’environ 390 pb. Les amorces utilisées étaient le couple FR1/FF390
(Tableau 10), identifié par Chemidlin et al. comme optimal en terme de spécificité,
couverture des espèces détectées et longueur d’amplicon en qPCR pour la cible
ARNr 18S (150).
Nom Séquence
FR1 5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′
FF390 5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′
Tableau 10: Amorces utilisées pour la qPCR panfongique (150)
La réaction d’amplification a été réalisée dans un volume réactionnel de 20 µl

contenant 1,25 µM de chaque amorce, 500 ng de T4 gene 32 protein (Affymetrix,
Paris, France), 10µl de SYBR® Select Master Mix (Applied Biosystems) contenant
l’AmpliTaq® DNA Polymerase, les dNTP, le SYBR®green I, le marqueur
fluorescent de référence pour la normalisation du signal (ROX™) et 2 µl d’ADN.
L’amplification sur le ABI 7500 a été réalisée selon le protocole suivant : une phase
d’activation de l’enzyme à 95°C pendant 10 minutes, 40 cycles de PCR composés
d’une étape de dénaturation de l’ADN à 95°C pendant 15 secondes, une étape
d’hybridation des amorces à 50°C pendant 30 seconde s et une étape d’élongation à
70°C pendant 1 minute.
La fluorescence émise par le SYBR®Green lorsqu’il est incorporé à l’ADN a été
mesurée à chaque cycle, à la fin de l’étape d’élongation (acquisition data). Une
dernière étape a été ajoutée pour obtenir les courbes de fusion spécifique de 70°C à
95°C à 0,2°C/sec. Les courbes de fluorescence obten ues et les courbes de fusion
ont été analysées par le logiciel ABI 7500 Software v2.0.6. Les résultats étaient
62
exprimés en déterminant le seuil de détection, ou « crossing point » (Cp)
correspondant au cycle d’amplification où la fluorescence de l’échantillon devient
significativement différente du signal de base.Le Cp étant inversement proportionnel
à la quantité d’ADN contenue dans l’échantillon, plus la quantité d’ADN est élevée,
plus le Cp est petit. Chaque extrait d’ADN a été amplifié une fois au pur, une autre
fois au 1/10ème pour la recherche d’inhibiteurs.
Dans chaque série d’ADN à tester, un témoin négatif d’amplification, contenant de
l’eau stérile a été ajouté.
Pour la quantification en spores fongiques, une gamme étalon a été réalisée à partir
d’une suspension calibrée contenant 106 spores/ml d’A. fumigatus préparée de la
façon suivante : des spores provenant d’une culture d’au moins 72h ont été
prélevées à l’oese stérile et déposées dans une suspension Medium de NaCl à 0.9%
(bioMérieux, Marcy l’Etoile, France). Une numération des spores en cyturine de la
suspension a été effectuée et des dilutions ont été réalisées de façon à obtenir 50
spores par ligne horizontale (8 petits carrés) correspondant à un inoculum calibré à
106 spores/ml. Ensuite, cette suspension a été diluée au 1/10ème, au 1/100ème et au
1/1000ème pour obtenir 3 points de gamme à 105, 104 et 103 spores/ml. L’extraction
d’ADN était effectuée à l’aide du kit Qiagen comme décrit précédemment.
C. Détection d’ADN d’Aspergillus spp.
La détection d’ADN d’Aspergillus spp. dans les capteurs à poussières a été réalisée
par qPCR sur l’automate LightCycler® 1.0 (Roche Diagnostics, Meylan, France), à
l’aide de sondes d’hybridation de type FRET (fluorescent resonance energy
transfert), comme décrit précédemment (149). Les amorces et les sondes utilisées
sont décrites dans le Tableau 11. La qPCR cible un gène mitochondrial de 91 pb
codant pour un ARN de transfert d’Aspergillus (Numéro GenBank L37095) (151). Le
mélange réactionnel a été obtenu en utilisant le kit Fast DNA Master Hybridization
Probes (Roche Diagnostics, Meylan, France) contenant une Taq polymérase Hot
start. La réaction d’amplification a été réalisée dans un volume réactionnel final de 20
µl contenant 4,5 mM de MgCl2, 0,25 U de Uracil ADN glycosylase (UNG) à 1 U/µl,
chaque amorce sens et antisens en concentration finale 0,25 mM et 0,5 mM
respectivement, 0,5 mM de chacune des deux sondes d’hybridation LC3 et LC4
marquées respectivement au Red 640 et à la fluorescéine et 2 µl de Mix Fast start
contenant la Taq polymérase. Après introduction de ce mélange réactionnel dans
chaque capillaire, 5 µl d’extrait d’ADN des capteurs à poussières a été ajouté.
63
Type Nom Séquence
d’oligonucléotide
Sens 5’-CTGTTAGTGCGGGAGTTCAAATCT-3’
Amorces
Antisens 5’-AACACCTGACCTTTCGCGTGTA-3’
LC4 5’-CTGAGCTAATTTCTTTCAACCCAAGGGA(Flc)-3’
Sondes FRET
LC3 5’-CTGTTAGTGCGGGAGTTCAAA(LC640)TCT-3’
Tableau 11 : Amorces et sondes utilisées pour la qPCR Aspergillus spp. (Flc: fluorescéine, LC640: Red
640) (151)
L’amplification sur le Light Cycler® 1.0 a été réalisée selon le protocole suivant : une
phase d’activation de l’UNG à 50°C pendant 2 minute s, une phase d’inactivation de
l’UNG et de dénaturation initiale de l’ADN à 95°C p endant 8 minutes, 45 cycles
composés d’une étape de dénaturation de l’ADN à 95°C pendant 10 secondes, une
étape d’hybridation des sondes et amorces à 60°C pe ndant 10 secondes et une
étape d’élongation à 72°C pendant 10 secondes. L’am plification s’est terminée par
une étape de refroidissement à 40°C pendant 2 minut es.
La fluorescence a été mesurée à chaque cycle, juste après la phase d’hybridation.
Les courbes de fluorescence obtenues ont été analysées par le logiciel LightCycler
software version 3.5. Les résultats étaient exprimés en déterminant le seuil de
détection ou Cp comme précédemment. Chaque extrait d’ADN a été amplifié deux
fois.
l’eau stérile et le témoin négatif d’extraction ont été ajoutés.
Pour la quantification en spores fongiques, la même gamme étalon préparée pour la
qPCR panfongique a été utilisée : 3 points de gamme à 105, 104 et 103 spores/ml.
D. Détection d’ADN d’A. fumigatus
La détection d’ADN d’A. fumigatus par qPCR a été réalisée sur l‘automate ABI 7500
(Applied Biosystems) avec comme système de détection une sonde Taqman. Les
amorces et la sonde utilisées sont décrites dans le Tableau 12. La concentration
finale en amorces était de 1 µM. La sonde a été testée à 2 concentrations différentes
de 0,04 µM et 0,08 µM afin de déterminer la concentration optimale en terme de
sensibilité et de spécificité sur une gamme standard d’ADN d’A. fumigatus (gamme
Af) réalisée à partir de la souche de référence CBS144.89 à 1 ng/µl (Af1) diluée au
1/10ème (Af2) au 1/100ème, 1/1000ème,1/10000ème et au 1/100000ème pour obtenir 5
points de gamme à 10000 fg/µl (Af3), 1000 fg/µl (Af4), 100 fg/µl (Af5), 10 fg/µl (Af6)
64
et 1 fg/µl (Af7). La composition des mélanges réactionnels est indiquée dans le
Tableau 13.
Type Nom Séquence

AfumiF1 5′- GCCCGCCGTTTCGAC-3′
Amorces
AfumiR1 5′- CCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTAC -3′
Sonde Taqman AfumiP1 5’-6-FAM-CCCGCCGAAGACCCCAACATG-MGB-3’
Tableau 12: Amorces et sondes utilisées pour la qPCR A. fumigatus (152)
Concentration finale en
0,04 µM 0,08 µM
sonde
H2O 2,7 µl 1,9 µl
Mix sonde Applied 12,5 µl 12,5 µl
Amorce AfumiF1 (10 µM) 2 µl 2 µl
Amorce AfumiR1 (10 µM) 2 µl 2 µl
Amorce AfumiP1 (1 µM) 0,8 µl 1,6 µl
ADN 5 µl 5 µl
Tableau 13: Composition des mix avec concentrations en sonde différentes
de 2 min à 50°C, une phase de 10 min à 95°C suivie de 45 cycles de PCR composés
d’une étape de dénaturation de l’ADN à 95°C pendant 15 sec et d’une étape
d’hybridation des amorces et d’élongation à 60°C pe ndant 1 min.
Après détermination de la concentration optimale en sonde, les capteurs à
poussières ont été analysés en duplicate.
l’eau stérile et le témoin négatif d’extraction ont été ajoutés.
Pour la quantification, 3 points de la gamme standard Af3, Af4 et Af5 ont été utilisés.
E. Analyse statistique
L’analyse statistique des données a été effectuée à l’aide du logiciel SigmaPlot 12.0.
Dans un premier temps, nous avons testé à l’aide du coefficient de Spearman la
corrélation entre les résultats obtenus en culture et en qPCR panfongique,
Aspergillus et A. fumigatus pour la mesure du niveau d’exposition environnementale.
Dans un second temps, afin d’étudier le lien entre l’exposition fongique et les
phénomènes de colonisation et de sensibilisation, les quantités fongiques,
aspergillaires et d’A. fumigatus ont été comparées entre différents groupes de
patients : les patients colonisés (C), les patients non colonisés (NC), les patients
colonisés et/ou sensibilisés (C et/ou S) et les patients non colonisés non sensibilisés
(NC/NS). Les quantités moyennes et médianes ont été calculées. La normalité a été
65
vérifiée par le test de Shapiro-Wilk. Pour les données paramétriques, les moyennes
ont été comparées par le test de Student. Pour les données non paramétriques, les
médianes ont été comparées par le test de Mann-Whitney. Pour la comparaison des
fréquences de positivité à A. fumigatus des capteurs à poussières, le test de
McNemar a été utilisé.
IV. Caractérisation phénotypique des isolats cliniques et

environnementaux d’Aspergillus fumigatus
A. Identification morphologique
L’identification morphologique d’A. fumigatus était basée sur l’aspect macroscopique

et l’aspect microscopique des colonies décrits dans les généralités (cf. II.B.).
B. Identification d’isolats résistants aux azolés par

ensemencement sur milieu Sabouraud additionné
d’itraconazole
La résistance aux azolés a été dépistée par ensemencement de chaque isolat sur
milieu Sabouraud contenant 4mg/l d’itraconazole, préparé au laboratoire (milieu ITZ,
cf. Annexe 2). Des conidies provenant d’une culture d’A. fumigatus de 5 à 7 jours ont
été mises en suspension dans de l’eau stérile pour obtenir une turbidimétrie
équivalente à 0,5 MacFarland (McF). Chaque suspension a été ensemencée par
écouvillonnage sur milieu ITZ. Les milieux ont été incubés à 37°C pendant 72
heures. Un contrôle négatif constitué d’une suspension de conidies d’un isolat non
résistant aux azolés et ne présentant pas de mutation du gène cyp51A, ainsi qu’un
contrôle positif constitué d’une suspension de conidies d’un isolat présentant la
mutation TR34/L98H ont également été ensemencés et incubés dans les mêmes
conditions. Parallèlement, chaque suspension était ensemencée sur SK1/2 sans ITZ
et incubée à 37°C pour vérifier la pousse de la sus pension.
C. Détermination de la sensibilité aux antifongiques par

méthode Etest®
La méthode Etest® (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) permet de déterminer la CMI

pour un antifongique en milieu gélosé. En cas de culture positive sur le milieu ITZ
(ITZ+) et/ou de détection d’une mutation non silencieuse du gène cyp51A (cf. V.B.3),
les CMI ont été déterminées par cette méthode pour 5 antifongiques : itraconazole
(ITZ), posaconazole (POS), voriconazole (VOR), amphotéricine B (AMB) et
66
caspofongine (CAS). Pour la réalisation des Etests®, une suspension calibrée de 106
spores/ml dont la préparation est détaillée dans la partie III.B a été réalisée pour
chaque isolat à tester. Les milieux RPMI (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) ont été
ensemencés à l’aide d’un écouvillon stérile et les 5 bandelettes d’antifongiques
contenant le gradient de concentration ont été déposées sur les milieux. La lecture
des résultats des CMI s’est faite après incubation à 37°C à 24h, 48h et 72h, sur fond
noir afin de faciliter la mise en évidence des zones d’intersection. L’interprétation des
résultats S ou R a été effectuée à l’aide des seuils d’interprétation proposés par
l’EUCAST, présentés dans les généralités (152).
D. Détermination de la thermotolérance
A. fumigatus est une espèce thermotolérante capable de se développer jusqu’à 50°C

contrairement aux autres espèces du complexe Fumigati telle qu’A. lentulus, espèce
récemment décrite très proche morphologiquement d’A. fumigatus mais incapable de
se développer à 48°C (49). Pour confirmer l’identif ication de l’espèce, chaque
suspension à 0,5 McF préparée pour l’ensemencement des milieux ITZ a été
ensemencée en parallèle sur milieu SK1/2 et incubée à 50°C pendant 72h.
V. Caractérisation génotypique des isolats cliniques et

environnementaux d’Aspergillus fumigatus
Après caractérisation phénotypique, l’ADN des isolats cliniques et environnementaux

a été extrait en vue d’une caractérisation génotypique qui s’est effectuée en deux
temps. Dans un premier temps, nous avons confirmé l’identification des isolats par
séquençage après amplification de 2 gènes cibles : les régions ITS1 et ITS2 des
ARN ribosomiques (ARNr) et le gène ß-tubuline. Le séquençage de ces deux gènes
nous a permis de valider par biologie moléculaire l’identification des isolats au sein
de la section Fumigati conformément aux données publiées (154).
Dans un second temps, nous avons séquencé le gène cyp51A, cible des
antifongiques azolés, pour la recherche éventuelle de mutations impliquées dans la
résistance aux azolés.
A. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN des isolats cliniques et environnementaux d’A. fumigatus a été

effectuée manuellement avec le kit « QIAamp DNA Mini Kit » (Qiagen).
67
Le protocole d’extraction qui a été utilisé est le protocole tissu préconisé par la
société Qiagen. Des conidies issues de cultures âgées de 2 à 5 jours étaient mises
en suspension dans environ 1 ml d’eau stérile contenue dans un tube eppendorf
stérile. Ces suspensions étaient ensuite centrifugées à 11000 rpm pendant 7
minutes, l’eau était retirée à l’aide d’une pipette stérile en laissant un culot et de l’eau
stérile était rajoutée pour effectuer un nouveau lavage. En tout, 3 lavages à l’eau
stérile ont été effectués. A la fin des lavages, le culot contenant les spores était
additionné de 180 µl de tampon ATL et 20 µl de Protéinase K et le tout était incubé
une nuit à 56°C pour une lyse efficace de la paroi cellulaire solide et complexe des
champignons. A partir de cette étape, l’extraction a été effectuée en suivant
précisément la procédure du fabricant comme décrit précédemment (cf. III.A.).
B. Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
Les PCR ciblant les régions ITS1 et ITS2, les gènes β-tubuline et cyp51A ont été
effectuées avec la même Taq polymérase, la GoTaq DNA polymerase à 5U/µl
(Promega, Charbonnières-les-Bains, France) et son tampon 5X, du MgCl2 (25 mM)
et des dNTP (10 mM de chaque nucléotide). Seules la nature et la concentration des
amorces ainsi que le programme d’amplification différaient en fonction des PCR, le
principe étant le même : après activation des enzymes Taq et dénaturation initiale, le
cycle d’amplification est répété n fois : dénaturation de l’ADN, hybridation des
amorces et élongation. Les amplicons étaient conservés à 4°C.
1. PCR ciblant les régions ITS1 et ITS2
Les régions ITS (Internal Transcribed Spacer) sont localisées entre les sous unités
18S, 5,8S et 28S de l’ARNr. Ces régions sont très conservées, variables et
spécifiques d’espèces, elles permettent donc de différencier les espèces fongiques à
l’intérieur d’un genre (155). Les régions ITS1 et ITS2 de l’ARNr ont été amplifiées
avec les amorces universelles ITS1 et ITS4 (Tableau 14).
Nom Séquence
ITS1 (sens) 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4 (antisens) 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
Tableau 14 : Amorces utilisées pour la PCR ciblant les régions ITS1 et ITS2 (155)

contenant 10 µl de tampon 5X (Promega), 3 µl MgCl2 à 25 mM (concentration finale
de 1,5 mM), 1 µl dNTP à 10 mM (concentration finale de 0,2 mM), 1 µl de chacune
68
des amorces à 20 µM (concentration finale de 0,4 µM), 0,4 µl de GoTaq DNA
polymerase (2U), 13,6 µl d’eau distillée stérile et 20 µl d’ADN. La réaction
d’amplification a été réalisée dans un thermocycleur GenAmp 2700 (Applied
Biosystems, Courtaboeuf, France). Le programme de la PCR incluait une pré-
dénaturation à 94°C pendant 5 min suivie par 20 cyc les consécutifs comprenant une
dénaturation à 94°C pendant 35 sec, une hybridation spécifique des amorces à 54°C
pendant 55 sec et une élongation à 72°C pendant 45 sec, avec un ajout de 4 sec par
cycle. Quinze cycles supplémentaires incluaient une dénaturation à 94°C pendant 45
sec, une hybridation spécifique des amorces à 54°C pendant 55 sec et une
élongation à 72°C pendant 2 min. Enfin une élongati on finale à 72°C pendant 10 min
a été effectuée.
2. PCR ciblant le gène β-tubuline
La PCR β-tubuline permet de distinguer A. fumigatus des autres espèces fongiques

morphologiquement semblables de la section Fumigati telles qu’A. lentulus. Le
mélange réactionnel et le programme d’amplification sont identiques à ceux de la
PCR ciblant les régions ITS1 et ITS2. Seules les amorces (Tableau 15) utilisées
diffèrent (même volume et même concentration).
Nom Séquence
βtub1 (sens) 5’-AATTGGTGCCGCTTTCTGG-3’
βtub2 (antisens) 5’-AGTTGTCGGGACGGAATAG-3’
Tableau 15 : Amorces pour la PCR ciblant le gène codant pour la β-tubuline (49)
3. PCR ciblant le gène cyp51A
Nous avons créé 3 couples d’amorces (Tableau 16) qui permettent d’amplifier
l’ensemble du gène cyp51A avec son promoteur. La position des 3 couples
d’amorces sur le gène cyp51A est indiquée en Annexe 3.
Nom Séquence
Couple CYP51AF-1 (sens) 5’-TAATCGCAGCACCACTCCAG-3’
d’amorces n°1
CYP51AR-1 (antisens) 5’-GACATCCTTGWGCTTGCCGTTGAG-3’
(CYP51A-1)
Couple CYP51AF-2 (sens) 5’-TCTACCTGGGCGTTCAGGG-3’
d’amorces n°2
CYP51AR-2 (antisens) 5’-CTTCGAGGACTTTTGGCTGTGAG-3’
(CYP51A-2)
Couple CYP51AF-3 (sens) 5’-AACCCTGTTGATGGCTGGTC-3’
d’amorces n°3
CYP51AR-3 (antisens) 5’-GCAACAACACTTCAGGGCCA-3’
(CYP51A-3)
Tableau 16 : 3 coupes d'amorces pour la PCR ciblant le gène cyp51A
69
contenant 10 µl de tampon 5X, 3 µl MgCl2 à 25 mM (concentration finale de 1,5
mM), 1 µl dNTP à 10 mM (concentration finale de 0,2 mM), 2 µl de chacune des
amorces à 10 µM (concentration finale de 0,4 µM), 0.4 µl GoTaq DNA polymerase
(2U) et 26,6 µl d’eau distillée stérile et 5 µl d’ADN. La réaction d’amplification a été
réalisée dans un thermocycleur GenAmp 2700 (Applied Biosystems). Le programme
de la PCR établi incluait une pré-dénaturation à 95°C pendant 10 min puis 45 cycles
composés d’une étape de dénaturation à 95°C pendant 1 min, d’une étape
d’hybridation spécifique des amorces à 55°C pendant 1 min et d’une étape
d’élongation à 72°C pendant 1 min. Enfin une élonga tion finale à 72°C pendant 10
min a été effectuée.
C. Électrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR
Pour la migration des produits de PCR, un gel d’agarose à 2% a été préparé avec un
tampon standard Tris Borate EDTA (TBE) 1X (1g d’agarose pour 50 ml de TBE 1X)
contenant du Bromure d’éthidium (BET). Cinq microlitres de l’échantillon de PCR ont
été mélangés avec 5 µl d’un tampon de migration contenant du bleu de
bromophénol, sur une feuille de parafilm. Les échantillons et 5 µl d’un marqueur de
poids moléculaire le Smart Ladder MW-1700-02 (Eurogentec, Angers, France) ont
été chargés séparément dans les puits du gel. L’électrophorèse a été effectuée à 90
Volts dans du tampon TBE 1X pendant 30 min. Les produits d’amplification ont été
visualisés sous lumière UV, grâce au BET incorporé auparavant dans le gel. Chaque
PCR doit donner un produit d’amplification spécifique du gène ciblé : une seule
bande d’ADN à la taille attendue de 600bp pour les régions ITS1 et ITS2, 495bp pour
le gène β-tubuline et 725bp, 705bp et 826bp pour les 3 fragments du gène cyp51A.
D. Purification des produits de PCR
L’électrophorèse des produits de PCR ayant révélé une bande unique correspondant
au fragment d’intérêt pour chacune des PCR, la purification a été réalisée
directement à partir de l’échantillon amplifié liquide à l’aide du kit NucleoSpin®
(Macherey-Nagel, Hoerdt, France) sur membrane de silice. Cette étape a été
réalisée par la société GenoScreen en amont du séquençage.
E. Séquençage des produits de PCR
Le séquençage des produits de PCR a été réalisé par la société GenoScreen selon
70
la méthode de Sanger à l’aide du kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied
Biosystems). Le produit de la réaction a ensuite été analysé sur le séquenceur
capillaire ABI3730 XL DNA Analyser (Applied Biosystems).
F. Analyse et alignement de séquences
Les séquences obtenues pour les 3 gènes ont été analysées grâce au logiciel Bioedit
(http://bioedit.com) qui permet d’obtenir une séquence consensus, après analyse des
électrophorégrammes correspondants pour chaque isolat et correction (si
nécessaire) de la séquence sens et de la séquence antisens.
Pour les régions ITS1 et ITS2 et le gène β-tubuline, les séquences consensus
obtenues pour chaque isolat d’A. fumigatus ont été comparées, à l’aide du
programme en ligne BLAST (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), aux séquences
des bases de données des banques internationales accessibles en ligne (GenBank).
Pour le gène cyp51A, les 3 séquences consensus obtenues grâce aux 3 couples
d’amorces ont été alignées grâce aux zones de chevauchements, afin de déterminer
la séquence finale comportant le promoteur et la totalité du gène. La séquence
protéique a ensuite été déterminée à partir de la séquence finale en nucléotides,
après élimination des parties non-codantes de la séquence (promoteur et introns), de
façon à mettre en évidence la présence ou non de mutations non silencieuses déjà
décrites ou d’en mettre en évidence de nouvelles.
VI. Détection directe d’isolats mutés TR34/L98H d’Aspergillus

fumigatus dans l’environnement
Pour détecter la présence d’isolat d’A. fumigatus muté TR34/L98H directement dans
les capteurs à poussières, 2 qPCR en temps réel ont été testées à partir de l’ADN
extrait des capteurs à poussières (cf.III.A), l’une ciblant la répétition en tandem d’une
séquence de 34 pb dans le promoteur du gène cyp51A (TR34) et, l’autre, la
substitution d’une leucine en histidine en position 98 (L98H) dans le gène cyp51A.
A. qPCR ciblant le motif TR34 situé dans le promoteur du

gène cyp51A (qPCR TR34)
Cette première qPCR cible la séquence répétée de 34 pb dans le promoteur du gène

cyp51A d’A. fumigatus. Elle a été réalisée sur l’automate ABI 7500 (Applied
Biosystems) en utilisant le système de détection SYBR®Green. Avant de tester les
capteurs à poussières, la mise au point a été effectuée sur 2 gammes étalons, l’une
71
constituée d’une suspension préparée à partir de l’isolat n°366 d’ A. fumigatus,
obtenu à partir du capteur à poussières du patient n°27, sensible aux azolés et ne
présentant pas de mutation du gène cyp51A (isolat WT), et contenant 106, 105, 104,
103 et 102 spores/ml (gamme WT), l’autre constituée d’une suspension préparée à
partir de l’isolat n°240 d’ A. fumigatus, obtenu à partir du capteur à poussières du
patient n°7, présentant la mutation TR/L98H contenant 106, 105, 104, 103 et 102
spores/ml (gamme TR34/L98H). Deux amorces permettant d’amplifier un fragment
de 112 (WT) ou 146 (avec TR34) pb ont été designées pour notre étude (Tableau
17) et ont été testées aux concentrations de 0,1 µM, 0,2 µM, 0,4 µM et 1 µM
(Tableau 18) afin de déterminer la concentration optimale en terme de sensibilité et
spécificité. La position des amorces sur le gène cyp51A est indiquée en Annexe 3.
Nom Séquence
TR-F (sens) 5’-AATAATCGCAGCACCACTCC-3’
TR-R (antisens) 5’-GGGTGTATGGTATGCTGGAA-3’
Tableau 17 : Amorces designées pour la qPCR TR34 SYBR®Green
Concentration finale
0,1 µM 0,2 µM 0,4 µM 1 µM
des amorces
Amorce TR-F 10 µM 0,2 µL 0,4 µL 0,8 µL 2 µL
Amorce TR-R 10 µM 0,2 µL 0,4 µL 0,8 µL 2 µL
Mix SYBR®Green 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
ADN 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL
Eau 7,6 µL 7,2 µL 6,4 µL 4 µL
Tableau 18 : Composition des mix en fonction des concentrations en amorces
d’activation de l’enzyme à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR composés d’une
étape de dénaturation de l’ADN à 95°C pendant 15 se c, une étape d’hybridation des
amorces et d’élongation à 60°C pendant 1 min. La fl uorescence a été mesurée à
chaque cycle, à la fin de l’étape d’élongation (acquisition data). Une dernière étape a
été ajoutée pour obtenir les courbes de fusion spécifique de 70°C à 95°C à
0,2°C/sec. Les courbes de fluorescence obtenues et les courbes de fusion ont été
analysées par le logiciel ABI 7500 Software v2.0.6.
Une fois les concentrations optimales déterminées, les capteurs à poussières ont été
analysés au pur et au 1/10ème.
72
B. qPCR ciblant la mutation L98H du gène cyp51A (qPCR
L98H)
Cette deuxième qPCR cible la substitution d’une leucine en histidine en position 98

(L98H) dans le gène cyp51A d’A. fumigatus. Elle a été réalisée sur l’automate ABI
7500 (Applied Biosystems) en utilisant 2 amorces permettant d’amplifier un fragment
de 91 pb et ciblant la zone contenant la mutation L98H, et 2 sondes Taqman, l’une
permettant de détecter les isolats non mutés d’A. fumigatus présentant une leucine
en position 98 (sonde L98 WT, marquée par le fluorophore FAM), l’autre permettant
de détecter les isolats mutés en position 98 (histidine) en cas de présence de la
mutation L98H chez les isolats mutés TR34/L98H (sonde L98H, marquée par le
fluorophore VIC) (Tableau 19). La position des amorces et des sondes sur le gène
cyp51A est indiquée en Annexe 3.
Type Nom Séquence

L98F (sens) 5’-GTTGGGTCAAAAAACCACAGTCTA-3’
Amorces
L98R (antisens) 5’-GACCTCTTCCGCATTGACATC-3’
Sonde L98 WT 5’-6-FAM-AACGGCAAGCTCAA-MGB-BHQ-3’
Sondes Taqman
Sonde L98H 5’-VIC-ACGGCAAGCACAA-MBG-BHQ-3’
Tableau 19 : Amorces et sondes designées pour la qPCR L98H
Avant de tester les capteurs à poussières, une mise au point a été effectuée à partir
des 2 gammes étalons WT et TR/L98H qui avait été utilisées pour la qPCR TR34.
Tout d’abord, les amorces ont été testées en qPCR SYBR®Green (Applied
Biosystems) aux concentrations 0,1 µM, 0,2 µM, 0,4 µM et 1 µM (Tableau 20) afin de
déterminer la concentration optimale.
Concentration finale
0,1 µM 0,2 µM 0,4 µM 1 µM
des amorces
Amorce L98F 10 µM 0,2 µL 0,4 µL 0,8 µL 2 µL
Amorce L98R 10 µM 0,2 µL 0,4 µL 0,8 µL 2 µL
Mix SYBR®Green 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
ADN 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL
Eau 7,6 µL 7,2 µL 6,4 µL 4 µL
Tableau 20 : Composition des mix pour la détermination de la concentration optimale en amorces pour la
qPCR L98H SYBR®Green
Le programme d’amplification sur le ABI 7500 était identique à celui utilisé pour la
qPCR TR34. Les courbes de fluorescence obtenues et les courbes de fusion ont été
analysées par le logiciel ABI 7500 Software v2.0.6.
Une fois la concentration optimale d’amorces déterminée, les sondes L98 WT et
L98H ont été testées aux concentrations de 0,1 µM, 0,2 µM et 0,4 µM sur les
73
gammes étalons WT et TR/L98H afin de déterminer la concentration optimale en
sondes.
Le programme d’amplification sur le ABI 7500 était le même que pour la qPCR A.
fumigatus. Les courbes de fluorescence obtenues ont été analysées par le logiciel
ABI 7500 Software v2.0.6.
Une fois les concentrations optimales d’amorces et de sondes déterminées, les
capteurs à poussières ont été analysés au pur et au 1/10ème.
74
RESULTATS
I. Caractéristiques des patients inclus et prévalence de la
colonisation/sensibilisation par A. fumigatus
Quarante et un patients BPCO issus des services de Pneumologie, de Réanimation

et de Médecine Polyvalente Post-Urgence du CHRU de Lille ont été inclus entre août
2011 et juillet 2014 dans le cadre de l’étude FungiCOPD. L’âge de ces patients à
l’inclusion varient entre 46 et 86 ans, avec une moyenne de 63,8 ans (+/- 9,7). Le
sex-ratio de la population est de 3,2. Le bilan bioclinique à l’inclusion a permis de
collecter 39 expectorations pour la recherche de la colonisation et 41 sérums pour la
recherche de la sensibilisation par A. fumigatus. A partir de mars 2014, la recherche
de la colonisation a également été effectuée à partir des LROP (n=5). Le bilan
bioclinique effectué lors de la visite de fin d’étude a permis de collecter 8
expectorations et 8 LROP chez 8 patients. L’ensemble des caractéristiques des
patients à l’inclusion et les résultats des analyses mycologiques sont présentés dans
l’Annexe 4.
A l’inclusion, une colonisation par A. fumigatus a été détectée chez 15 patients sur
39 (38,5%) : 1 colonisation a été détectée par culture et qPCR Aspergillus spp., 8 par
culture seule (23,1%), et 6 par qPCR seule. Parmi les 8 patients ayant bénéficié
d’une visite de fin d’étude avant juillet 2014, 4 sont colonisés. Seul 1 de ces 4
patients était colonisé à l’inclusion (patient n°9) .
La mise en culture des expectorations et des LROP des 39 patients a permis
d’obtenir 68 isolats cliniques d’A. fumigatus. Parmi ces 68 isolats cliniques, 56
proviennent des prélèvements cliniques à l’inclusion et 12 des prélèvements
cliniques de la visite de fin d’étude. La répartition des isolats en fonction des patients
est présentée dans le Tableau 23.
La présence d’anticorps anti-A. fumigatus a été détectée à l’inclusion chez 13
patients sur les 41 patients (31,7%). Notons que 7 patients (17,1%) étaient à la fois
colonisés et sensibilisés par A. fumigatus.
75
II. Prévalence de l’exposition environnementale à A. fumigatus et
quantification du niveau d’exposition aux moisissures
A. Mesure de l’exposition environnementale par culture
L’exposition environnementale aux moisissures a pu être mesurée pour 36 patients

pour lesquels les capteurs à poussières ont été récupérés. Cinq capteurs n’ont pas
été reçus au laboratoire pour diverses raisons : 1 capteur a été jeté par un patient, 2
patients sont décédés et 2 patients ont arrêté l’étude. A partir de ces 36 capteurs à
poussières, 1 à 159 colonies de moisissures ont été isolées soit une concentration
de 10 à 1590 colonies/ml et A. fumigatus a été détecté dans 15 capteurs (1 à 19
colonies soit 10 à 190 colonies/ml) soit une fréquence d’exposition domestique à A.
fumigatus chez ces patients de 41,7%. Ces 15 capteurs proviennent des domiciles
de 5 patients colonisés par A. fumigatus (3 ayant une culture positive et 2 une qPCR
Aspergillus spp. positive) et 10 patients non colonisés. Au total, la mise en culture de
ces 36 capteurs à poussières a permis d’obtenir 41 isolats environnementaux d’A.
fumigatus. Sept isolats supplémentaires ont été obtenus à partir d’autres
prélèvements environnementaux (écouvillons, prélèvements d’air) qui avaient été
effectués au cours des enquêtes environnementales réalisées au début de l’étude
pour les premiers patients.
B. Quantification du niveau d’exposition aux moisissures

par qPCR
La quantification de l’ADN fongique, de l’ADN d’Aspergillus spp. et de l’ADN d’A.

fumigatus par qPCR a été effectuée pour 35 capteurs à poussières.
1. Détéction d’ADN fongique par qPCR panfongique
Les 35 capteurs à poussières étaient tous positifs en qPCR panfongique, ce qui

signifie que tous les capteurs à poussières contenaient de l’ADN fongique et donc
que tous les patients sont exposés au risque fongique dans leur environnement. Ces
résultats sont cohérents avec la culture qui montrait la présence de colonies
fongiques pour l’ensemble des capteurs à poussières. La Figure 11 présente les
courbes d’amplification et de fusion de la gamme étalon et des capteurs à
poussières. La très grande hétérogénéité des températures de fusion (melting
temperature ou Tm) pour les capteurs à poussières est cohérente avec une détection
probable de fragments de différentes tailles en fonction des espèces fongiques. Les
76
quantités d’ADN fongique variaient de 2,47.104 à 1,31.106 équivalent (Eq.) spores/ml
dans les capteurs, soit un ratio de 108 à 10162 par rapport à la culture.
Courbes d’amplification Courbes de fusion
Gamme
étalon
(Spores d’A.
fumigatus)
Capteurs à
poussières
Figure 11 : Courbes d'amplification et de fusion de la gamme étalon et des capteurs à poussières

obtenues par qPCR panfongique
La présence d’inhibiteurs a été détectée pour 2 patients, les patients n°23 (Cp à 33,8
au 1/10ème et 32,4 au pur) et 34 (Cp à 23,8 au 1/10ème et 24,6 au pur).
L’analyse de la corrélation entre le nombre de colonies de moisissures obtenues en
culture et la quantité fongique exprimée en Eq. spores/ml par qPCR panfongique n’a
pas permis de mettre en évidence une relation linéaire entre les résultats de ces 2
méthodes (Figure 12). Mais le calcul du coefficient de corrélation de rangs de
Spearman montre l’existence d’une relation significative entre ces 2 méthodes
(p=0,0047).
77
Figure 12 : Corrélation entre le nombre de colonies de moisissures obtenues par culture et les quantités
d’ADN fongiques détectées par qPCR panfongique
2. Détection d’ADN d’Aspergillus spp.
Les 35 capteurs à poussières étaient tous positifs en qPCR Aspergillus spp., ce qui
signifie que tous les capteurs à poussières contenaient de l’ADN aspergillaire et donc
que tous les patients sont exposés à des Aspergillus dans leur environnement. En
culture, sur ces 35 capteurs, 28 capteurs (80%) étaient positifs à Aspergillus (1 à 75
colonies soit 10 à 750 colonies/ml) soit 7 de moins qu’en qPCR. Dans les capteurs
positifs en qPCR, les quantités d’ADN d’Aspergillus spp. variaient de 3,80.102 à
2,43.104 Eq. spores/ml, soit un ratio de 1 à 735 par rapport à la culture.
L’analyse de la corrélation entre le nombre de colonies d’Aspergillus obtenues en
culture et la quantité d’Aspergillus exprimée en Eq. spores/ml obtenue par qPCR
Aspergillus n’a pas permis de mettre en évidence une relation linéaire entre les
résultats de ces 2 méthodes (Figure 13) et le calcul du coefficient de corrélation de
rangs de Spearman n’a pas non plus montré l’existence d’une relation significative
entre ces 2 méthodes (p>0,05).
78
Figure 13 : Corrélation entre le nombre de colonies d’Aspergillus obtenues par culture et la quantité
d’ADN fongique détectée par qPCR Aspergillus
3. Détection d’ADN d’A. fumigatus
a) Mise au point : choix de la concentration en sonde

La sonde AfumiP1 a été testée à 2 concentrations différentes de 0,04 µM et 0,08 µM
sur une gamme standard d’ADN d’A. fumigatus (gamme Af) constituée de 5 points
de gammes (de 104 à 1 fg/µl) analysée en duplicate. La concentration optimale en
sonde AfumiP1 choisie était de 0,08 µM (courbes vertes sur la Figure 14) car la
fluorescence était plus intense et la limite de détection était de 1 fg/µl contre 10 fg/µl
avec une concentration de 0,04 µM.
Figure 14 : Comparaison de 2 concentrations en sonde AfumiP1 (0,04 µM en rouge et 0,08 µM en vert)

pour la détection d’A. fumigatus par qPCR
b) Analyse des capteurs à poussières

Parmi les 35 capteurs à poussières analysés en duplicate, 33 étaient positifs soit 18
capteurs supplémentaires par rapport à la culture. Les capteurs à poussières
négatifs provenaient du domicile des patients n°15 et 23. Aucune colonie d’A.
fumigatus n’avait été isolée en culture pour ces 2 capteurs.
79
Les quantités d’ADN d’A. fumigatus dans les capteurs positifs variaient de 2,6 à 98,9
fg/µl. Etant donné qu’un génome d’A. fumigatus correspond à environ 30 fg d’ADN
(156), ces quantités étaient équivalentes à 87 à 3297 Eq. spores/ml, soit un ratio de
1 à 110 par rapport à la culture.
L’analyse de la corrélation entre les résultats obtenus par culture pour A. fumigatus
et la qPCR A. fumigatus montre l’absence de relation linéaire et de corrélation entre
culture et qPCR (p>0,05), avec notamment des quantités élevées d’ADN d’A.
fumigatus obtenues dans des capteurs pour lesquels peu de colonies avaient été
obtenues en culture. Par exemple, le capteur du patient n°18 présentait 3 colonies en
culture soit 30 colonies/ml et 98,9 fg/µl d’ADN d’A. fumigatus (Figure 15).
Inversement, le capteur du patient n°22 présentait une quantité faible d’ADN d’A.
fumigatus de 4,3 fg/µl avec un nombre élevé de 19 colonies d’A. fumigatus soit 190
colonies/ml.
Figure 15 : Corrélation entre le nombre de colonies d’A. fumigatus obtenues par culture et la quantité
d’ADN fongique détectée par qPCR A. fumigatus
C. Comparaison de l’exposition fongique entre les groupes

colonisés/sensibilisés et non colonisés/non sensibilisés par
A. fumigatus
Pour étudier le lien entre l’exposition fongique et les phénomènes de colonisation et

de sensibilisation fongiques, différents groupes de patients ont été comparés : les
patients colonisés (C), les patients non colonisés (NC), les patients colonisés et/ou
sensibilisés (C et/ou S) et les patients non colonisés et non sensibilisés (NC/NS).
80
1. Culture
Nous avons comparé le nombre de colonies obtenues en culture entre les patients C
et les patients NC d’une part et entre les patients C et/ou S et les patients NC/NS
d’autre part pour les 36 capteurs étudiés par culture pour évaluer le lien entre
l’exposition aux moisissures dans un premier temps et l’exposition à A. fumigatus
dans un second temps, et les phénomènes de colonisation et sensibilisation par A.
fumigatus. Enfin, dans un troisième temps, nous avons comparé la fréquence de
positivité à A. fumigatus des capteurs à poussières en culture en fonction des
différents groupes.
Pour les colonies de moisissures et les colonies d’A. fumigatus, les médianes ont été
comparées par le test de Mann-Whitney, qui n’a pas montré de différence
significative entre les groupes de patients (p>0,05). La comparaison des fréquences
de positivité à A. fumigatus des capteurs en culture par le test de McNemar n’a pas
non plus montré de différence significative entre les différents groupes (Tableau 21).
Tous C vs NC C et/ou S vs NC/NS

les par A. fumigatus par A. fumigatus
patients C NC C et/ou S NC/NS
(n=36) (n=14) (n=22) (n=20) (n=16)
Moyenne 27,9 29,9 26,7 30,7 24,5
Nombre total
de colonies Médiane 18,5 11 22,5 17,5 19,5
(Min-Max) (1-159) (1-159) (4-101) (1-159) (4-101)
Nombre de Moyenne 2 1,9 2,1 3 0,9
colonies d’A. Médiane 4,1 0,5 0 0 0
fumigatus (Min-Max) (0-19) (0-11) (0-19) (0-19) (0-3)
% de capteurs positifs à A.
41,7 50 36,4 45 37,5
fumigatus (n=15)
Tableau 21 : Comparaison du nombre total de colonies, du nombre de colonies d’A. fumigatus et de la
fréquence de positivité à A. fumigatus des capteurs positifs en culture entre les patients colonisés (C)
versus patients non colonisés (NC) et entre les patients colonisés et/ou sensibilisés (C et/ou S) versus les
patients non colonisés non sensibilisés (NC/NS)
2. qPCR
Nous avons comparé les quantités d’ADN obtenues pour les qPCR panfongique,
Aspergillus et A. fumigatus entre les patients C et les patients NC d’une part et entre
les patients C et/ou S et les patients NC/NS d’autre part pour les 35 capteurs étudiés
par qPCR.
Les médianes des quantités d’ADN fongique et d’ADN d’Aspergillus ont été
comparées par le test de Mann-Whitney, qui n’a pas montré de différence
significative entre les groupes de patients (p>0,05). Pour la qPCR A. fumigatus,
malgré des quantités d’ADN plus élevés pour les groupes « C » et « C et/ou S »,
81
nous n’avons pas non plus retrouvé de différence significative, mais avec un « p »
plus faible que pour les autres qPCR (p= 0,142 pour C vs NC et p=0,180 pour C
et/ou S vs NC/NS). Enfin, les fréquences de positivité à A. fumigatus des capteurs en
qPCR n’étaient pas non plus significativement différentes entre les différents groupes
(Tableau 22).
C vs NC C et/ou S vs NC/NS
Tous les par A. fumigatus par A. fumigatus
patients
(n=35) C NC C et/ou S NC/NS
(n=13) (n=22) (n=19) (n=16)
Moyenne 3,4E+05 4,2E+05 2,9E+05 4,1E+05 2,4E+05
qPCR
panfongique 2,3E+05 1,5E+05 2,5E+05 2,3E+05 2,1E+05
Médiane
(Eq. spore/ml) (2,5E+04- (2,5E+04- (4,5E+04- (2,5E+04- (4,5E+04-
(Min-Max)
1,3E+06) 1,3E+06) 1,2E+06) 1,3E6) 8,1E+05)
Moyenne 6,2E+03 6,4E+03 6,2E+03 5,8E+03 6,7E+03
qPCR
Aspergillus 4,3E+03 2,5E+03 4,4E+03 2,5E+03 5,7E+03
Médiane
(Eq. spore/ml) (3,8E+02- (3,9E+02- (3,8E+02- (3,9E+02- (3,8E+02-
(Min-Max)
1,3E+06) 2,4E+04) 1,9E+04) 2,4E+04) 1,9E+04)
qPCR A. Moyenne 12,9 18,8 9,4 16,7 8,4
fumigatus Médiane 9 12,8 8,1 12,8 8,1
(fg/µl) (Min-Max) (0-98,9) (0-98,9) (0-27,1) (0-98,9) (0-23,1)
% de capteurs positifs
(n=33) 94,3 92,3 95,4 94,7 93,8
Tableau 22 : Comparaison des quantités d’ADN fongique, d’Aspergillus et d’A. fumigatus dans les
capteurs à poussières et de la fréquence de positivité à A. fumigatus des capteurs positifs en qPCR
A.fumigatus entre les patients colonisés (C) versus patients non colonisés (NC) et entre les patients
colonisés et/ou sensibilisés (C et/ou S) versus les patients non colonisés non sensibilisés (NC/NS)
III. Caractérisations phénotypique et génotypique des isolats

cliniques et environnementaux d’A. fumigatus
Au total, 68 isolats cliniques et 48 isolats environnementaux ont été obtenus et

étudiés, soit 116 isolats d’A. fumigatus.
A. Confirmation de l’identification des isolats par méthodes

phénotypique et moléculaire
La culture à 50°C était positive pour la totalité d es 116 isolats d’A. fumigatus.
Pour le séquençage ITS, 92 séquences comportaient un pourcentage de similarité
de 100% avec la séquence de la souche A. fumigatus ATCC 1022 (séquence
GenBank KF314727). Vingt-deux séquences possédaient la mutation en position
T126C retrouvée dans les bases de données, avec un pourcentage de similarité de
100% avec la souche A. fumigatus UWFP 503 (séquence GenBank AY214448). Il
s’agit de 12 isolats environnementaux provenant de 5 patients différents (patients
n°1, 2, 22, 29 et 39) et de 10 isolats cliniques pr ovenant du même patient (patient
n°42). Deux séquences présentaient la mutation C46G , non retrouvée dans les
82
bases de données, correspondant à 2 isolats cliniques provenant du même patient
(patient n°24) (Figure 16).
Figure 16 : Alignement des 3 types de séquences des régions ITS1 et ITS2 obtenus pour les 116 isolats
avec les séquences des souches A. fumigatus ATCC 1022 et UWFP 503
Pour le séquençage ß-tubuline, 114 séquences comportaient un pourcentage de

similarité de 100% avec la séquence de la souche A. fumigatus CBS
133.61 (séquence GenBank KF314730). Une séquence présentait la mutation
silencieuse située sur un intron en position G12A non retrouvée dans les bases de
données. Elle correspond à un isolat environnemental du patient n°9 (isolat 59). Une
séquence présentait la mutation non silencieuse G360A qui entraine dans la
séquence protéique la substitution d’une valine par une isoleucine en position 45
(V45I) non retrouvée dans les bases de données. Cette séquence correspond à un
isolat environnemental du patient n°2 (isolat 287). Malgré la présence de cette
mutation ponctuelle, le séquençage des régions ITS1 et ITS2 et les nombreuses
différences entre les gènes ß-tubuline d’espèces même proche phylogénétiquement,
telle que Neosartorya fischeri (souche CBS 544.65, séquence GenBank KJ175519)
83
(Figure 17) ont permis de confirmer l’identification de l’espèce A. fumigatus pour cet
isolat.
Figure 17 : Alignement des 3 types de séquences du gène β-tubuline obtenus pour les 116 isolats avec
les séquences des souches A. fumigatus CBS 133.61 et N. fischeri CBS 544.65
Les données ont donc permis de confirmer l’identification morphologique

(macroscopique et microscopique) de la totalité des 116 isolats d’A. fumigatus.
Aucune autre espèce de la section Fumigati n’a été isolée dans notre population.
B. Identification des mutations du gène cyp51A
1. Mutations non silencieuses
Le séquençage du gène cyp51A et de son promoteur effectué sur les 116 isolats d’A.
fumigatus a permis de mettre en évidence 5 profils de mutation différents dans 10
isolats dont 5 cliniques et 5 environnementaux chez 6 patients différents. La mutation
TR34/L98H a été détectée dans 2 isolats environnementaux provenant de 2 patients
différents (patients n°7 et n°22). Les mutations as sociées F46Y, M172V, N248T,
D255E, E427K ont été détectées dans 2 isolats cliniques provenant du même patient
(patient n°24) et dans 1 isolat environnemental (pa tient n°7). Un autre isolat
environnemental provenant du capteur du patient n°9 a présenté l’association des 3
84
mutations F46Y, M172V, E427K. La mutation A284T a été détectée dans 3 isolats
cliniques issus du même patient (patient n°41). Enf in, la mutation H285Y a été
détectée dans un isolat environnemental provenant du patient n°22. Les
caractéristiques des isolats et les résultats du séquençage cyp51A sont résumés
dans le Tableau 23.
Séquençage du gène cyp51A

N° Statut à Nombre
Origine des isolats
Patient l’inclusion d’isolats Mutation non Mutation
WT
silencieuse silencieuse
Air 3 3
1 NC/NS Environnement
Capteur 2 2
Clinique Expectoration 3 3
Air 1 1
2 C/S
Environnement Écouvillon 1 1
Capteur 4 3 1 G1696A
Air 1 1 G1696A
1 TR34/L98H
7 NC/NS Environnement 1 F46Y, M172V,
Capteur 2
N248T, D255E,
E427K
8 NC/NS Environnement Écouvillon 1 1
1 F46Y, M172V,
Environnement Capteur 1
9 C E427K
10 S Clinique Expectoration 10 10
12 NC/NS Environnement Capteur 1 1
18 C/S
Environnement Capteur 4 4
Environnement Capteur 4 4
19 S
Clinique LROP 1 1
21 C/S Clinique Expectoration 5 5 G1696A
1 TR34/L98H*
22 NC/NS Environnement Capteur 12 10
1 H285Y
2 F46Y, M172V,
24 NC/NS Clinique Expectoration 6 4 N248T, D255E,
E427K
27 S Environnement
Capteur 1 1
Capteur 1 1
Capteur 2 1 1 G1696A
31 S Environnement
Capteur 1 1
34 C Clinique Expectoration 12 6+1* 5 G1696A
Clinique LROP 11 11
39 C
Environnement
Capteur 3 3
40 C Environnement
Capteur 3 3
41 C/S Clinique Expectoration 8 5 3 A284T
Expectoration 9 9 C1562T
42 C Clinique
LROP 1 1
TOTAL 116 77 10 21
Tableau 23 : Caractérisation des isolats cliniques et environnementaux : origine, séquençage du gène
cyp51A et résultat de la culture sur milieu ITZ
C : colonisé, S : sensibilisé, C/S : colonisé et sensibilisé, NC/NS : non colonisé et non sensibilisé par A. fumigatus ; WT : Wild
type (Absence de mutation) ;
*Isolats obtenus par sélection après ensemencement direct du prélèvement sur milieu ITZ si >10 colonies d’A.fumigatus ;
Rouge : isolats avec culture positive sur milieu ITZ ;
Jaune : patients colonisés pour lesquels des isolats cliniques et environnementaux ont été obtenus en culture;
Bleu : prélèvement de la visite de fin d’étude
85
2. Mutations silencieuses
Sur les 116 isolats étudiés, 13 isolats présentaient la mutation silencieuse G1696A
dont 3 isolats environnementaux chez 3 patients différents (patients n°2, 7 et 30) et
10 isolats cliniques chez 2 patients différents (patients n°21 et 34). Neuf isolats
cliniques provenant du même patient (n°42) présenta ient la mutation silencieuse
C1562T.
3. Circulation des isolats mutés ou non au sein et

entre les réservoirs cliniques et environnementaux
a) Circulation des isolats au sein des réservoirs cliniques et

environnementaux
La coexistence dans un même prélèvement d’isolats présentant ou non des
mutations du gène cyp51A a été mise en évidence aussi bien dans les prélèvements
cliniques (réservoirs cliniques) que dans les capteurs à poussières (réservoirs
environnementaux).
Dans les prélèvements cliniques, des isolats mutés ou non coexistent chez les
patients n°24, 34 et 41. L’expectoration du patient n°24 présente 4 isolats non mutés
et 2 isolats présentant le profil F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K. L’expectoration
du patient n°34 présente 7 isolats non mutés et 5 i solats présentant la même
mutation silencieuse G1696A. L’expectoration du patient n°41 présente 5 isolats non
mutés et 3 isolats présentant la même mutation non silencieuse A284T.
Dans les capteurs à poussières et donc dans l’environnement domestique des
patients, des isolats mutés ou non coexistent chez les patients n°2, 7, 22 et 30.
Les capteurs des patients n°2 et 30 présentent un i solat non muté et un isolat
présentant la mutation silencieuse G1696A. Les capteurs des patients n°7 et 22
présentent 2 isolats mutés avec 2 profils de mutation différents dont 1 présentant la
mutation TR34/L98H associée pour le patient n°7 à 1 isolat présentant le profil F46Y,
M172V, N248T, D255E, E427K et pour le patient n°22 à 1 isolat présentant la
mutation H285Y.
b) Circulation des isolats entre les réservoirs cliniques et

environnementaux
La circulation des isolats entre les réservoirs cliniques et environnementaux a pu être
étudiée pour seulement 3 patients pour lesquels à la fois des isolats cliniques et
environnementaux d’A. fumigatus avaient été obtenus en culture : les patients n°2,
18 et 39 (en jaune dans le Tableau 23). Notons que le patient n°19 possède
86
également un isolat clinique et des isolats environnementaux mais l’isolat clinique
provient d’un LROP effectué en visite de fin d’étude, le patient n’était donc pas
considéré comme colonisé à l’inclusion.
Un des isolats environnementaux du patient n°2 prés ente une mutation silencieuse
(G1696A), non retrouvée dans les isolats cliniques de ce patient.
Les isolats cliniques et environnementaux des patients n°18 et 39 ne présentent pas
de mutations du gène cyp51A.
c) Distribution géographique des isolats cliniques et environnementaux

Les isolats environnementaux mutés TR34/L98H ont été retrouvés dans 2 villes
distinctes : Marcq-en-Barœul et Faches-Thumesnil (Figure 18). L’isolat
environnemental muté H285Y provient de Marcq-en-Barœul et, les isolats cliniques
mutés A284T, de Marquillies. Les isolats mutés F46Y, M172V, N248T, D255E,
E427K et F46Y, M172V, E427K sont localisés à Lille et à Faches-Thumesnil. La
plupart des isolats provenaient de domiciles situés en région lilloise, en raison du
recrutement des patients au CHRU de Lille.
Figure 18 : Distribution géographique au sein de la région Nord-Pas-de-Calais des isolats cliniques et

environnementaux présentant une mutation non silencieuse ou non (WT) (C : isolats cliniques)
C. Sélection des isolats résistants aux azolés par

ensemencement sur milieu ITZ 4 mg/l
Sur les 116 isolats étudiés, 7 sont ITZ+ (culture positive sur milieu Sabouraud
additionné d’ITZ à 4mg/l) et 109 ITZ- (culture négative sur milieu Sabouraud
87
additionné d’ITZ 4mg/l). Parmi les 7 isolats ITZ+, on retrouve les 2 isolats
environnementaux mutés TR34/L98H des patients n°7 et n°22, l’isolat
environnemental muté H285Y du patient n°22 et les 3 isolats cliniques mutés A284T
du patient n°41. Un isolat clinique provenant du pa tient n°34, obtenu par
ensemencement direct de l’expectoration sur milieu ITZ est ITZ+ et ne présente pas
de mutation du gène cyp51A. Notons que la croissance sur ITZ est plus ou moins
dense pour les 7 isolats ITZ+ (Tableau 24). Aucune croissance n’a été observée sur
milieu ITZ pour les isolats mutés F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K et F46Y,
M172V, E427K ni pour les isolats présentant des mutations silencieuses.
Aspect de
la culture
sur milieu
ITZ
Mutation TR/L98H H285Y A284T WT

Nombre
2 1 3 1
d’isolats
Origine
Environnement Environnement Clinique Clinique
des isolats
N° Patient 7 et 22 22 41 34
Tableau 24 : Aspect de la culture sur milieu ITZ pour les isolats ITZ+
D. Détermination des CMI par méthode Etest®
Les CMI ont été déterminées par méthode Etest® sur les 10 isolats présentant des
mutations non silencieuses et l’isolat ITZ+ ne présentant pas de mutation du gène
cyp51A. Les résultats sont récapitulés dans le Tableau 25.
CMI (mg/l) Origine des
Mutations cyp51A Patient
ITZ VOR POS isolats
ITZ+
TR34/L98H 24 0.75 0.38 Environnement 7
TR34/L98H >32 1 0.5 Environnement 22
H285Y 8 1 0.25 Environnement 22
Non >32 2 1 Clinique 34
A284T 1.5 0.19 0.19 Clinique 41
A284T 1.5 0.19 0.19 Clinique 41
A284T 2 0,38 0,125 Clinique 41
ITZ-
F46Y, M172V, E427K 0,38 0,125 0,064 Environnement 9
F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K 1.5 0.125 0.125 Environnement 7
F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K 1.5 0.125 0.094 Clinique 24
F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K 3 0.38 0.125 Clinique 24
Tableau 25 : CMI déterminées par méthode Etest® pour les isolats ITZ+ et/ou présentant des mutations
du gène cyp51A
Rouge : Résistant, Orange : Intermédiaire, Vert: Sensible selon les seuils déterminés par l’EUCAST (126)
88
Les 7 isolats ITZ+ présentent tous des CMI élevées pour l’ITZ : 4 isolats ITZ+ sont
résistants à l’ITZ avec une CMI strictement supérieure à 2 mg/l et 3 isolats ITZ+ sont
de sensibilité intermédiaire (CMI supérieure à 1 mg/l mais inférieure ou égale à 2
mg/l). Les isolats environnementaux mutés TR34/L98H sont résistants à l’ITZ et au
POS mais pas au VOR, bien qu’ils présentent tout de même des CMI plus élevées
pour ce dernier. L’isolat clinique ITZ+ du patient 34 est résistant à tous les
antifongiques azolés et ne présente pas de mutations sur le gène cyp51A.
Concernant les isolats ITZ-, 2 isolats mutés F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K
des patients n°7 et 24 sont intermédiaires à l’ITZ, 1 isolat clinque muté F46Y,
M172V, N248T, D255E, E427K est résistant à l’ITZ et l’isolat environnemental muté
F46Y, M172V, E427K est sensible à l’ITZ.
E. Prévalence de la résistance aux azolés
1. Prévalence de la résistance à l’ITZ
Sur les 116 isolats cliniques et environnementaux étudiés, 5 isolats sont résistants à
l’ITZ (CMI ITZ> 2 mg) soit une prévalence de résistance globale à l’ITZ en fonction
du nombre d’isolats d’A. fumigatus de 4,3% (5/116). Sur les 5 isolats R à l’ITZ, 2 sont
d’origine clinique et 3 d’origine environnementale, soit une prévalence de résistance
clinique à l’ITZ de 2,9% (2/68) et une prévalence de résistance environnementale à
l’ITZ de 6,3% (3/48).
La résistance à l’ITZ a été détectée dans l’environnement de 2 patients (n°7 et 22)
soit une prévalence en fonction des patients de 5,6% (2/36) et dans les prélèvements
cliniques de 2 patients (n°24 et 34), soit une prév alence de 4,9% (2/41).
Deux capteurs (n°7 et 22) parmi les 15 capteurs pos itifs en culture à A. fumigatus
présentent des isolats résistants à l’ITZ soit une prévalence de résistance à l’ITZ en
fonction des capteurs positifs à A. fumigatus de 13,3% (2/15) (Tableau 26).
2. Prévalence de la mutation TR34/L98H
La mutation TR34/L98H a été détectée dans 2 isolats sur 48 isolats

environnementaux (4,2%) chez 2 patients différents, la prévalence de la mutation
TR34/L98H dans l’environnement domestique de notre population est donc de 5,6%
(2/36). En fonction des capteurs positifs à A. fumigatus, la prévalence de la mutation
TR34/L98H s’élève à 13,3% (2/15) (Tableau 26). Aucun isolat clinique présentant la
mutation TR34/L98H n’a été détecté.
89
Prévalence de la résistance à Prévalence de la mutation
l’ITZ TR34/L98H
Isolats Isolats
Isolats Isolats
environne Total environne Total
cliniques cliniques
mentaux mentaux
En fonction des isolats 2,9 % 6,3 % 4,3 % 0 4,2 % 1,7%
(n=116) (2/68) (3/48) (5/116) (0/68) (2/48) (2/116)
En fonction des patients 4,9 % 5,6 % 0 5,6 %
(n=41) (2/41) (2/36) (0/68) (2/36)
En fonction des capteurs
13,3 % 13,3 %
positifs à A .fumigatus
(n=15) (2/15) (2/15)
Tableau 26 : Prévalence de la résistance à l'ITZ et de la mutation TR34/L98H en fonction des isolats, des
patients et des capteurs positifs à A. fumigatus
IV. Détection directe des isolats mutés TR34/L98H dans les

capteurs à poussières
La détection des isolats mutés TR34/L98H a été effectuée à l’aide de 2 qPCR, l’une
ciblant le motif TR34 situé dans le promoteur et l’autre la mutation L98H du gène
cyp51A.
A. qPCR ciblant le motif TR34 situé dans le promoteur du

gène cyp51A (qPCR TR34)
1. Mise au point : choix de la concentration en

amorces
Les amorces TR-F et TR-R ont été testées à 4 concentrations différentes : 0,1 µM,
0,2 µM, 0,4 µM et 1 µM sur 5 points des 2 gammes WT et TR34/L98H décrites
précédemment (106, 105, 104, 103 et 102 spores/ml). Les courbes de fusion montrent
la présence de 2 pics : le premier pic correspond au Tm de l’isolat WT et le second
correspond au Tm de l’isolat muté car le promoteur est plus long pour l’isolat muté
(34 pb en plus soit un fragment de 146 pb versus 112 pb pour l’isolat WT) (Figure
19).
Les essais réalisés ont permis de montrer que la concentration optimale en amorces
TR-F et TR-R était de 0,4 µM car, malgré l’apparition de dimères d’amorces, la limite
de détection est la plus faible, de 102 spores/ml, pour les 2 gammes WT et
TR34/L98H (Figure 19).
90
Gamme WT Gamme TR34/L98H Courbes de fusion
TR34/L98
h
WT
0,1
µM
0,2
µM
0,4
µM
1
µM
Figure 19 : Analyse en qPCR TR SYBR®Green des gammes WT et TR34/L98H à différentes concentrations

en amorces TR-F et TR-R (0,1; 0,2; 0,4 et 1µM). La concentration optimale en amorces choisie pour
l’analyse des capteurs est encadrée.
2. Analyse des capteurs à poussières
Les capteurs à poussières ont ensuite été analysés au pur et au 1/10ème. Dans
chaque série, 5 points des 2 gammes WT et TR34/L98H (106, 105, 104, 103 et 102
spores/ml) étaient ajoutés pour la quantification en Eq. spores/ml.
91
Sur les 35 capteurs à poussières analysés, aucun isolat présentant une mutation
TR34 n’a été mis en évidence, y compris pour les capteurs n°7 et 22 pour lesquels 1
isolat muté TR34/L98H avait été détecté par culture.
Par contre, la détection d’A. fumigatus WT était positive pour 9 capteurs, qui
présentaient un signal d’amplification avec un Tm de l’amplicon situé au même
endroit que le Tm de la gamme WT (Figure 20).
Gamme WT et Gamme
échantillons positifs TR34/L98H
avec amplification (amplicon de 146
WT (amplicon de pb)
112 pb)
Figure 20: Courbes de fusion obtenues pour les capteurs à poussières positifs en qPCR TR34
(SYBR®Green) (amplification WT pour les capteurs n° 1 , 4, 12, 21, 24, 26, 29, 30, 33, absence
d’amplification TR34).
Les quantités en qPCR TR34 dans ces 9 capteurs variaient de 2,2.103 à 2,6.105 Eq.
spores/ml (Tableau 28). Une faible concordance entre le nombre de colonies d’A.
fumigatus et la qPCR TR34 était observée puisque, la présence de colonies d’A.
fumigatus n’avait été détectée en culture que pour 4 des 9 capteurs positifs en qPCR
TR34, avec un ratio de 4205 à 13000 par rapport à la culture pour ces 4 capteurs. De
même, 11 capteurs positifs en culture à A. fumigatus étaient négatifs en qPCR TR34.
De la même façon, si nous étudions la concordance entre la qPCR A. fumigatus et la
qPCR TR34, les 9 capteurs positifs en qPCR TR34 étaient également positifs en
qPCR A. fumigatus, avec des quantités variant de 2,8 à 13,5 fg/µl, soit 93 à 450 Eq.
spores/ml (Tableau 28), avec un ratio qPCR TR34/qPCR A. fumigatus variant de 10
à 1359. Par contre, parmi les 26 capteurs négatifs en qPCR TR34, 24 étaient positifs
et 2 seulement étaient négatifs en qPCR A. fumigatus. Ces résultats s’expliquent par
la sensibilité plus faible de la qPCR TR34 par rapport à la qPCR A. fumigatus car elle
cible le gène cyp51A présent en une seule copie dans le génome d’A. fumigatus
(157) alors que la qPCR A. fumigatus cible les régions ITS des ARNr, dont le gène
est présent en multicopie.
92
B. qPCR ciblant la mutation L98H du gène cyp51A (qPCR
L98H)
1. Mise au point
a) Choix de la concentration en amorces
Les amorces L98F et L98R ont été testées préalablement en qPCR SYBR®Green à
4 concentrations différentes : 0,1 µM, 0,2 µM, 0,4 µM et 1 µM sur les 2 gammes WT
et TR34/L98H décrites précédemment. Ces essais nous ont permis de sélectionner
la concentration de 0,2 µM, qui permettait d’obtenir une limite de détection de 104
spores/ml, identique pour les 2 gammes WT et TR34/L98H (Figure 21).
Gamme WT Gamme TR34/L98H Courbes de fusion
0,1
µM
0,2
µM
0,4
µM
1
µM
Figure 21 : Analyse en qPCR L98H SYBR®Green des gammes WT et TR34/L98H en utilisant différentes
concentrations en amorces L98F et L98R (0,1; 0,2; 0,4 et 1µM). La concentration optimale en amorces
choisie est encadrée.
93
b) Choix de la concentration en sondes
Avec la concentration optimale en amorces L98F et L98R de 0,2 µM, les sondes L98
WT et L98H ont été testées aux concentrations de 0,1 µM, 0,2 µM et 0,4 µM sur les
gammes WT et TR/L98H afin de déterminer la concentration optimale en sondes
(Figure 22). La composition des mélanges réactionnels est indiquée dans le Tableau
27.
Concentration finale en Sonde 0,1 Sonde 0,2 Sonde 0,4
sonde µM µM µM
Amorce L98F 10 µM 0,4 µL 0,4 µL 0,4 µL
Amorce L98R 10 µM 0,4 µL 0,4 µL 0,4 µL
Sonde L98 WT 0,2 µL 0,4 µL 0,8 µL
Sonde L98H 0,2 µL 0,4 µL 0,8 µL
Mix sonde Applied 10 µL 10 µL 10 µL
ADN 2 µL 2 µL 2 µL
Eau 6,8 µL 6,4 µL 5,6 µL
Tableau 27 : Composition des mix pour la qPCR L98H avec des concentrations en sondes L98 WT et
L98H de 0,1, 0,2 et 0,4µM.
La concentration optimale en sonde choisie était de 0,1 µM car pour les 2 sondes, la
limite de détection était la plus faible à cette concentration : 104 spores/ml et il n’y a
eu aucun signal avec la concentration en sonde de 0,4 µM (Figure 22).
Sonde L98 WT (FAM) Sonde L98H (VIC)
0,1
µM
0,2
µM
Figure 22 : Analyse en qPCR L98H Taqman des gammes WT et TR34/L98H à différentes concentrations en
sondes L98 WT (FAM) et L98H (VIC) (0,1 et 0,2 µM). La concentration optimale en sondes choisie est
encadrée.
2. Analyse des capteurs à poussières
Les capteurs à poussières ont ensuite été analysés au pur et au 1/10ème. Dans
chaque série, 3 points des 2 gammes WT et TR34/L98H (106, 105 et 104 spores/ml)
94
étaient ajoutés pour la quantification en Eq. spores/ml.
Seul le capteur n°18 est sorti positif en WT en qPC R L98H. Ce capteur était positif à
A. fumigatus en culture, avec 3 colonies, soit une concentration de 30 colonies/ml,
positif en qPCR A. fumigatus (98,9 fg/µl), mais négatif en qPCR TR34 (Tableau 28).
Les 14, 33 et 9 autres capteurs positifs en culture à A. fumigatus, en qPCR A.
fumigatus et en qPCR TR34 respectivement étaient négatifs en qPCR L98H. On
remarque que, même pour les capteurs n°7 et 22, pou r lesquels des isolats
TR34/L98H avaient été identifiés en culture, aucun signal correspondant à la
présence d’isolats portant la mutation L98H n’a été détecté en qPCR L98H.
qPCR Nombre de colonies

qPCR L98H
qPCR TR34 (Eq. A. fumigatus d’A. fumigatus
Capteur (Eq.
spores/ml) (fg/µl) (Eq. obtenues en culture
spores/ml)
spores/ml) (colonies/ml)
Capteurs positifs en qPCR TR34
1 8,4E+04 Négatif 11,2 (373) 20
4 1,4E+05 Négatif 3,1 (103) 0
12 1,9E+05 Négatif 11,1 (370) 20
21 2,2E+03 Négatif 4,3 (143) 0
24 2,3E+03 Négatif 6,7 (223) 0
26 2,0E+05 Négatif 11,1 (370) 0
29 4,9E+03 Négatif 2,8 (93) 0
30 2,2E+05 Négatif 7,9 (263) 20
33 2,6E+05 Négatif 13,5 (450) 20
Capteurs positifs en qPCR L98H
18 Négatif Positif 98,9 (3297) 30
Tableau 28 : Comparaison des résultats de qPCR TR34, qPCR L98H, qPCR A. fumigatus et de culture
pour les capteurs positifs en qPCR TR34 ou qPCR L98H
95
DISCUSSION
Colonisation et sensibilisation par A. fumigatus
Dans notre étude prospective, nous rapportons une prévalence élevée de

colonisation par A. fumigatus au cours d’une exacerbation aiguë de BPCO
(EABPCO), de 23,1% par culture et de 38,5% par culture et qPCR. Les études de
prévalence de colonisation par A. fumigatus chez les patients BPCO présentant une
EABPCO sont peu nombreuses, rétrospectives et souvent hétérogènes de par la
définition utilisée pour la colonisation (76,80,158). Une étude prospective récente
espagnole (80) similaire à la notre sur la prévalence d’isolement d’A. fumigatus par
culture sur des expectorations de 240 patients hospitalisés pour une EABPCO, a
rapporté une prévalence de 16,6% à l’inclusion et de 14,1% après un an de suivi.
Une autre étude anglaise, qui n’a pas non plus utilisée la qPCR pour détecter la
présence d’Aspergillus dans les expectorations, rapporte une fréquence d’isolement
d’A. fumigatus lors des EABPCO de 28% (158), soit des données similaires aux
notre si on tient compte de la prévalence de 23,1% obtenue par culture.
La prévalence de 38,5% que nous obtenons en combinant culture et qPCR peut

toutefois être surestimée car nous détectons une colonisation par Aspergillus en
qPCR et non spécifiquement par A. fumigatus. Notre étude utilise pour la première
fois la qPCR Aspergillus pour la détection de la colonisation par A. fumigatus chez
les patients BPCO, alors que ce moyen de détection est très utilisé pour les patients
atteints de mucoviscidose et permet d’améliorer la sensibilité de la détection (159).
L’analyse des données épidémiologiques, biologiques et cliniques collectées est

prévue à l’issue de l’étude. Elle devrait permettre d’identifier les facteurs de risque ou
de gravité associés à cette colonisation, tels que la corticothérapie, la fréquence des
EABPCO, ou l’isolement d’autres pathogènes (bactéries ou virus).
La présence d’anticorps anti-A. fumigatus a été détectée chez 13 patients (31,7%),

soit une sensibilisation plus fréquente dans notre cohorte que dans celle de Bafadhel
et al. qui ont rapporté une fréquence de sensibilisation par A. fumigatus de 13% dans
d’une cohorte de 128 patients BPCO (158). Ces données ne sont cependant pas
directement comparables car la sensibilisation était détectée par dosage des IgE
dans leur étude, alors que nous avons recherché les IgG anti-Aspergillus et les
précipitines dans notre étude. Parmi ces patients sensibilisés, seuls 7 patients
étaient également colonisés (17,1%).
96
Quantification de l’exposition environnementale aux moisissures
Dans notre étude, la fréquence d’exposition environnementale à A. fumigatus

déterminée par culture est de 41,7% (15/36 capteurs), ce qui confirme l’abondance
d’A. fumigatus dans l’environnement domestique intérieur (les capteurs à poussières
étant exposés dans la chambre des patients). Par contre, étant donné que sur les 15
capteurs positifs en culture à A. fumigatus, seuls 5 provenaient de domicile de
patients colonisés par A. fumigatus, nous n’avons pas pu mettre en évidence de
corrélation entre l’exposition et la colonisation par A. fumigatus. Ces résultats
pourraient être liés d’une part à l’existence de facteurs de risque de colonisation
spécifiques tels qu’une corticothérapie ou des antibiotiques au long cours, et d’autre
part à l’existence d’autres sources d’exposition aux moisissures liées par exemple à
l’alimentation (poivre, thé, etc.) ou à des activités professionnelles ou de loisirs.
L’étude de la quantification du niveau d’exposition environnementale fongique par

qPCR n’a pas permis de mettre en évidence une relation linéaire entre la qPCR
panfongique et les résultats de la culture, mais le calcul du coefficient de Spearman
montre une corrélation significative entre ces 2 méthodes. Etant donné que la qPCR
panfongique cible une région conservée de l’ARNr 18S de tous les champignons,
moisissures et levures (150), Les différences observées pourraient être due à la
présence de levures, quantifiées par la qPCR mais non prises en compte pour la
culture. Ainsi, la qPCR refléterait l’exposition globale fongique et la culture,
l’exposition aux moisissures.
A l’inverse, les qPCR Aspergillus et A. fumigatus n’ont pas montré de corrélation

significative avec les résultats de culture. Ce type de résultats (absence de
corrélation) a déjà été retrouvé dans d’autres études, notamment celle de Roussel et
al. où l’absence de corrélation entre culture et qPCR d’espèces fongiques dans des
capteurs à poussières exposés dans des locaux d’archives avait été prouvée (160).
L’absence de corrélation pourrait s’expliquer par la présence dans les capteurs à
poussières de spores non viables incapables de former du mycélium, mais qui sont
détectées en qPCR (66). On pourrait envisager de déterminer pour ces qPCR un Cp
seuil comme l’ont fait Bellanger et al. pour la qPCR A. fumigatus, qui permettrait de
différencier les spores viables des spores non viables. Une autre possibilité serait de
traiter les liquides de rinçage des capteurs à poussières avec du propidium
monoazide (PMA), agent compatible avec les techniques de qPCR et capable de
distinguer les cellules vivantes et mortes (161).
97
La comparaison des niveaux d’exposition fongique, aux Aspergillus et à A. fumigatus
en culture et en qPCR entre les patients colonisés et sensibilisés et les patients non
colonisés et non sensibilisés n’a pas permis de mettre en évidence de lien significatif
entre l’exposition environnementale domestique fongique et les phénomènes de
colonisation et de sensibilisation chez les patients atteints de BPCO. L’absence de
lien entre les concentrations d’A. fumigatus dans les poussières (mesurées par
qPCR) et la colonisation par A. fumigatus chez des patients atteints d’asthme, autre
pathologie respiratoire chronique, a été récemment rapportée par Fairs et al. qui, par
contre, ont retrouvé un lien entre les concentrations aériennes d’ADN d’A. fumigatus
et la colonisation (162). Dans notre étude, bien que les différences observées ne
soient pas significatives, l’analyse d’un plus grand nombre de patients pourrait
permettre de confirmer les premières tendances, notamment les quantités d’ADN
d’A. fumigatus plus élevées retrouvées dans les domiciles de patients colonisés et/ou
sensibilisés. Par ailleurs, une association entre la mesure de contaminants fongiques
dans les poussières et l’apparition de symptômes cliniques a été rapportée dans de
nombreuses études (163,164). Dans notre étude, l’impact de l’exposition fongique
domestique sur l’évolution de la fonction respiratoire (VEMS, fréquence et gravité
des exacerbation) sera analysé en fin d’étude afin d’identifier les paramètres
associés à une évolution péjorative (ex : charge fongique élevée ou présence
d’espèces spécifiques).
Identification des isolats d’A. fumigatus
La caractérisation des 68 et 48 isolats d’A. fumigatus d’origine clinique et

environnementale respectivement, nous a permis de confirmer l’identification d’A.
fumigatus pour l’ensemble des 116 isolats de notre étude. Aucune autre espèce de
la section Fumigati, aussi bien dans les prélèvements cliniques que dans
l’environnement domestique des patients atteints de BPCO, n’a été identifiée.
Bien qu’A. lentulus ait été isolé dans plusieurs pays au cours d’infections invasives
chez des patients immunodéprimés (transplantés ou patients d’hématologie) (49,58–
60), son isolement reste rare dans les prélèvements cliniques et aucune donnée de
prévalence n’est disponible. Chez les patients BPCO, l’isolement d’A. lentulus a été
rapporté en Espagne chez un patient admis en réanimation pour une EABPCO. Mais
A. fumigatus a été isolé dans 2 aspirations bronchiques et dans une troisième, il était
associé à A. lentulus. Le rôle d’A. lentulus comme agent étiologique de l’infection n’a
donc pas pu être établi (57). Dans les prélèvements environnementaux, A. lentulus a
98
été isolé dans plusieurs études dans des échantillons de sols en Corée (7/17) et en
Espagne (1/31), suggérant que la niche écologique d’A. lentulus pourrait être le sol
(165,166).
Notre étude confirme donc la faible fréquence d’isolement d’autres espèces de la

section Fumigati dans les prélèvements cliniques et dans l’environnement
domestique, mais l’identification de telles espèces peut être suspectée devant un
isolat d’A. fumigatus présentant une sensibilité diminuée aux antifongiques ou ayant
une sporulation pauvre ou lente. La mise en place d’une identification plus poussée
pour ces isolats par biologie moléculaire basée sur le séquençage des régions ITS et
du gène β-tubuline est donc à envisager en routine, quelque soit l’origine du
prélèvement et le type de patients.
Mutations du gène cyp51A et résistance aux azolés : circulation

entre les réservoirs cliniques et environnementaux
Au total, nous décrivons dans cette étude portant sur 116 isolats d’A. fumigatus :
• La mutation TR34/L98H associée à la résistance aux azolés pour la première
fois dans le Nord-Pas de Calais, dans 2 isolats environnementaux provenant
du domicile de 2 patients différents,
• La mutation H285Y associée à la résistance à l’ITZ dans un isolat
environnemental, jamais décrite à ce jour,
• La mutation A284T avec une CMI à l’ITZ élevée mais inférieure à 2 mg/l, donc
non considérée comme résistante d’après l’EUCAST, dans 3 isolats cliniques
provenant du même patient, déjà décrite par Bueid et al. (141),
• Les profils de mutations F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K et F46Y,
M172V, E427K associées ou non à la résistance aux azolés dans la littérature
(145,10,112). Dans notre étude, un des isolats mutés F46Y, M172V, N248T,
D255E, E427K présente une CMI>2mg/l pour l’ITZ et est donc associée à une
résistance à cet antifongique,
• Un isolat clinique ne présentant pas de mutation du gène cyp51A très
résistant à l’ITZ (CMI>32mg/l) et à tous les azolés ce qui suggère un
mécanisme alternatif de résistance aux antifongiques azolés,
• Les mutations silencieuses G1696A et C1562T non associées à une
résistance aux azolés et jamais décrites.
99
Nous rapportons la présence de la mutation TR34/L98H dans l’environnement
domestique de 2 patients BPCO, soit une prévalence de 5,6%. Cette mutation est
caractérisée par un potentiel de propagation important, qui a initialement été décrite
au Pays-Bas (116) et qui est actuellement fréquemment rapportée dans d’autre pays
d’Europe et dans le monde, aussi bien dans des isolats cliniques
qu’environnementaux. Elle serait liée à l’utilisation de fongicides azolés en
agriculture. Notre étude confirme l’origine environnementale de la résistance car elle
a été détectée dans 2 isolats environnementaux. En France, cette mutation a déjà
été décrite dans l’environnement d’un patient d’hématologie, à partir d’un échantillon
de sol (146). En Europe, la présence de cette mutation dans des isolats
environnementaux provenant d’échantillons de sols prélevés dans l’environnement
extérieur des hôpitaux a été rapportée en Belgique (116), en Italie (167) mais
également aux Pays-Bas et au Danemark avec respectivement 12% (6/49) et 11%
(4/38) d’échantillons de sols contenant des isolats d’A. fumigatus présentant cette
mutation (13,166). En Inde, Chowdhary et al. rapportent une prévalence d’isolats
environnementaux présentant la mutation TR34/L98H de 7% (44/630) à partir
d’échantillons de sols prélevés dans l’environnement extérieur des hôpitaux (147).
Dans notre étude, nous rapportons une prévalence de la mutation TR34/L98H en
fonction des capteurs à poussières positifs en culture à A. fumigatus de 13,3%,
comparable aux données européennes mais s’il s’agit de la première description
d’isolats présentant cette mutation dans l’environnement domestique, et non en
milieu extérieur. Les 2 patients présentant cet isolat muté dans leur environnement
domestique habitent dans 2 villes distinctes de la métropole lilloise. Alors que Rocchi
et al. avaient retrouvé cette mutation chez un patient agriculteur ayant bénéficié
d’une allogreffe de moelle pour anémie aplasique sévère, qui utilisait des fongicides
et dans un environnement agricole (le lien génétique entre les 2 isolats cliniques et
environnementaux n’avait pas été établi) (146), nous détectons cette mutation dans
un environnement urbain, ce qui suggère que l’exposition à la résistance aux azolés
et à cette mutation TR34/L98H ne se limite pas à l’environnement rural où sont
utilisés les fongicides, mais que les spores aspergillaires abondantes dans
l’environnement étant capables de disséminer, tous les environnements sont donc
concernés.
Aucun isolat clinique présentant la mutation TR34/L98H n’a été rapporté, ce qui peut
s’expliquer par le faible nombre de patients ayant présenté des isolats cliniques d’A.
fumigatus dans notre cohorte (11 patients). En France, cette mutation avait déjà été
100
décrite dans des isolats cliniques de patients atteints de mucoviscidose dans des
cohortes de 50 et 131 patients (130,140). Par contre, d’autres mutations associées
ou non à une résistance aux azolés (A284T et F46Y, M172V, N248T, D255E,
E427K) et un isolat non muté, résistant aux azolés ont été rapportés dans les isolats
cliniques de cette étude. Elles seront développées plus loin.
La détermination des CMI nous a permis de confirmer l’association entre la mutation

TR34/L98H et une multirésistance aux azolés, avec une résistance à l’ITZ et au POS
(CMI> 2 et 0,25 mg/l, respectivement), et une CMI élevée pour le VOR, qui reste
cependant inférieure à la CMI limite de 2 mg/l définie par l’EUCAST. Les 2 patients
pour lesquels les isolats TR34/L98H ont été retrouvés ne sont ni colonisés ni
sensibilisés par A. fumigatus. Ainsi, aucun impact de l’exposition à des isolats
environnementaux résistants aux azolés n’a pu être mis en évidence chez ces
patients. Mais, alors que les cas d’API causés par un A. fumigatus résistant avec la
mutation TR34/L98H rapportés à ce jour concernent uniquement des patients
d’hématologie, transplantés ou atteint de cancers (105,168,169,146), nos données
indiquent que l’émergence de pathologies aspergillaires causées par des isolats
résistants pourrait concerner d’autres populations, notamment les patients atteints de
BPCO.
Il est intéressant de noter que dans l’environnement des 2 patients pour lesquels des
isolats TR34/L98H ont été identifiés, d’autres profils de mutations coexistent : la
mutation TR34/L98H est associée aux 5 mutations F46Y, M172V, N248T, D255E,
E427K dans l’environnement du patient n°7 et à la m utation H285Y dans
l’environnement du patient n°22. De même, des génot ypes cyp51A différents ont été
retrouvés pour les capteurs d’autres patients (patients n°2 et 30) et dans des
expectorations (exemple : présence d’isolats A284T et d’isolats non mutés pour le
patient n°41). La présence d’isolats d’ A. fumigatus génétiquement différents dans un
même prélèvement a déjà été rapportée notamment chez des patients atteints de
mucoviscidose fréquemment colonisés par A. fumigatus (170). Nos données, qui
confirment la coexistence d’isolats sensibles et résistants aux azolés, indiquent que
les méthodes habituellement utilisées en routine ne sont pas adaptées car la
sensibilité d’A. fumigatus aux antifongiques est généralement déterminée à partir
d’une colonie. Ainsi, la nécessité d’une détermination des CMI à partir de plusieurs
colonies ou une recherche d’isolats résistants par ensemencement direct des
prélèvements ou à partir de plusieurs colonies sur un milieu contenant de l’ITZ a
récemment été suggérée par Denning et Bowyer (156). Cette dernière méthode a
101
montré son intérêt dans notre étude, au cours de laquelle 2 isolats résistants à l’ITZ
ont été obtenus après ensemencement direct du capteur à poussières ou de
l’expectoration sur milieu Sabouraud additionné d’ITZ à 4mg/l (milieu ITZ), car plus
de 10 colonies avaient été obtenues en culture (isolat environnemental TR34/L98H
du patient n°22 et isolat clinique WT du patient n° 34). Par ailleurs, des CMI élevés à
l’ITZ pour les 7 isolats poussant sur milieu ITZ ont confirmé la validité de ce milieu
pour la sélection d’isolats résistants.
Nous décrivons pour la première fois la mutation H285Y, associée à une résistance
isolée à l’ITZ (CMI à 8 mg/l), qui semble être d’origine environnementale puisque
l’isolat d’A. fumigatus provenaient d’un capteur à poussières. Une modélisation
protéique est en cours, en collaboration avec le Dr R. Wintjens (Université Libre de
Bruxelles) afin de localiser la mutation par rapport au site actif de l’enzyme CYP51A.
Dans les isolats cliniques, nous avons retrouvé des mutations déjà rapportées dans
littérature : la mutation A284T et les mutations F46Y, M172V, N248T, D255E,
E427K. La mutation A284T est associée à une CMI élevée à l’ITZ (1,5 à 2 mg/L),
mais qui reste inférieure au seuil de 2 mg/L défini par l’EUCAST. Dans la littérature,
elle a été rapportée par Bueid et al. et est associée à une réduction de la sensibilité à
l’ITZ, au VOR et au POS, mais les CMI ne sont pas précisées (141). Malgré
l’isolement de ces souches à partir de prélèvements cliniques, et bien qu’aucun isolat
environnemental portant ces mutations n’ait été retrouvé dans notre étude, l’origine
des mutations identifiées est probablement environnementale car les patients inclus
dans notre étude sont « naïfs » (non exposés aux antifongiques azolés). Par ailleurs,
le profil de mutations F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K a déjà été retrouvé dans
un isolat environnemental par Snelders et al. (112).
Nous décrivons également un isolat clinique ne présentant pas de mutation du gène

cyp51A résistant aux antifongiques azolés avec des CMI très élevées. Ce type
d’isolats a déjà été décrit dans de nombreuses études (10,112,141). La résistance
serait alors liée à l’existence de mécanismes alternatifs tels que la surexpression des
pompes à efflux (122) ou la surexpression du gène cyp51B (123). Des investigations
supplémentaires sur cet isolat pourraient être envisagées afin d’identifier les
mécanismes impliqués.
Dans notre cohorte de patients, la présence d’isolats cliniques et environnementaux

n’a pu être mise en évidence que pour 3 patients, les patients n°2, 18 et 39. Une
mutation silencieuse du gène cyp51A a été retrouvée dans un isolat environnemental
102
chez le patient n°2. Tous les autres isolats ne pré sentaient pas de mutation.
L’absence d’isolats mutés dans le prélèvement clinique pour le patient n°2 est en
faveur d’une absence de corrélation entre les isolats cliniques et environnementaux.
Cependant, l’analyse de la relation entre exposition et colonisation nécessiterait une
analyse génotypique plus fine par exemple par microsatellite (171).
Au total, nous décrivons de nombreux profils de mutations au sein d’isolats cliniques

et environnementaux de patients atteints de BPCO, mais nous n’avons pas pu mettre
en évidence de circulation entre les réservoirs cliniques et environnementaux car
aucune mutation n’est retrouvée à la fois dans l’environnement et dans le
prélèvement clinique du patient.
Détection directe de la mutation TR34/L98H
Dans notre étude, l’utilisation de qPCR pour détecter directement la mutation

TR34/L98H a permis de valider cette approche pour la détection de cette mutation à
partir d’isolats. Mais la détection directe à partir du liquide de rinçage des capteurs à
poussières a montré un intérêt limité puisque les capteurs n°7 et 22 étaient négatifs
alors qu’ils présentaient en culture chacun un isolat muté TR34/L98H. Comme
mentionné précédemment, l’absence de corrélation culture/qPCR a déjà été
rapportée par d’autres auteurs (160). Pourtant dans la littérature, la détection directe
des mutations du gène cyp51A par qPCR a déjà montré son intérêt à partir de
prélèvements cliniques tels qu’une biopsie de cerveau dont l’examen direct était
positif avec présence de filaments mycéliens (détection par une qPCR ciblant la
mutation TR34/L98H) (131), ou un LBA avec un index galactomannane supérieur à 1
(détection par une qPCR multiplex ciblant les mutations TR34/L98H, T289A et
Y121F) (172).
Dans notre étude, l’absence de détection de l’ADN d’isolats TR34/L98H à partir des
capteurs à poussières résulte probablement de charges fongiques faibles, et d’une
sensibilité insuffisante de la qPCR liée notamment à la présence d’une seule copie
du gène cyp51A dans le génome d’A. fumigatus, qui a déjà été rapportée
précédemment (157). L’ajout d’une amplification préalable, qui a été utilisée par
d’autres auteurs (173), pourrait être envisagé pour améliorer les performances de
notre méthode, qui pourrait alors être appliquée à la détection de la mutation
TR34/L98H à la fois à partir d’isolats d’A. fumigatus résistants aux azolés et de
prélèvements cliniques ou environnementaux.
103
CONCLUSION
Cette étude prospective chez 41 patients atteints de BPCO hospitalisés pour une
exacerbation montre une prévalence élevée de colonisation par A. fumigatus, de
38,5%, mais aucun lien avec l’exposition environnementale domestique aux
moisissures ou à A. fumigatus, mesurée par culture ou par qPCR, n’a pu être mis en
évidence. La caractérisation du gène cyp51A au sein des isolats cliniques et
environnementaux d’A. fumigatus a permis de mettre en évidence des profils de
mutations déjà décrits associés ou non à une résistance au azolés, tels que le profil
de mutations F46Y, M172V, N248T, D255E, E427K dans les réservoirs cliniques et
environnementaux, la mutation TR34/L98H décrite pour la première fois dans
l’environnement de patients BPCO du Nord-Pas de Calais, ce qui confirme son
origine environnementale, et la mutation A284T dans un prélèvement clinique. La
mutation H285Y associée à la résistance aux azolés jamais décrite à ce jour a été
découverte dans l’environnement d’un patient. Bien que nous n’ayons pas mis en
évidence de circulation de ces isolats mutés entre les réservoirs cliniques et
environnementaux, notre étude qui montre pour la première fois la présence d’isolats
mutés, résistants aux azolés, dans un environnement intérieur, indique que
l’exposition domestique aux moisissures pourrait jouer un rôle dans l’émergence
d’isolats résistants chez les patients susceptibles, tels que les patients atteints de
pathologies respiratoires chroniques (BPCO, mucoviscidose, asthme,etc.), mais
également les patients immunodéprimés à risque d’aspergillose invasive.
Par ailleurs, la coexistence d’isolats d’A. fumigatus sensibles et résistants aux azolés
au sein des prélèvements cliniques ou environnementaux montre la nécessité d’une
détermination de la sensibilité aux antifongiques sur plusieurs colonies en routine.
L’utilisation d’outils simples de dépistage de la résistance aux azolés tels qu’une
sélection sur milieu Sabouraud additionné d’itraconazole pourrait également être
envisagée, soit à partir des colonies, soit directement à partir des prélèvements.
Enfin, la caractérisation moléculaire des isolats pourrait être effectuée par détection
directe de la mutation TR34/L98H par qPCR, qui a montré de bons résultats sur les
isolats. La détection directe de cette mutation à partir de prélèvements cliniques ou
environnementaux pourrait également être envisagée, mais les données
préliminaires obtenues dans notre étude n’ont pas permis de valider cet outil pour le
moment. De meilleures performances pourraient être obtenues par l’ajout d’une
étape préliminaire d’amplification (avant la PCR en temps réel), qui permettrait
104
d’améliorer la sensibilité de la qPCR, et l’utilisation de prélèvements plus riches en
ADN aspergillaire (tels que biopsies, LBA ou expectorations avec examen
microscopique positif).
Une partie de ce travail a déjà été valorisée sous forme d'une communication orale à
l'ECCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) en
mai 2014 (cf. Annexe 5). L’objectif de recrutement étant de 90 patients, l’étude est
toujours en cours. L’analyse finale des données cliniques, biologiques,
épidémiologiques et environnementales collectées à l’inclusion et à la visite de fin
d’étude chez ces patients devrait permettre d’identifier les facteurs de risques de
colonisation par A. fumigatus liés au patient, mais également à l’habitat (humidité par
exemple), et d’évaluer son impact sur l’évolution de la fonction respiratoire. La
caractérisation phénotypique et génotypique des nouveaux isolats cliniques et
environnementaux d’A. fumigatus pourrait permettre de mettre en évidence de
nouvelles mutations et apporter de nouvelles données sur la circulation entre les
réservoirs cliniques et environnementaux.
105
ANNEXES
Annexe 1
Évaluation des symptômes de la BPCO :
Score CAT (COPD Assessment Test)
Echelle de dyspnée modifiée mMRC (modified Medical Research Council)
Stade 0 : je suis essoufflé uniquement pour un effort important

Stade 1 : je suis essoufflé quand je me dépêche à plat ou quand je monte une
pente légère
Stade 2 : je marche moins vite que les gens de mon âge à plat ou je dois
m’arrêter quand je marche à mon pas à plat
Stade 3 : je m’arrête pour respirer après 90 mètres ou après quelques minutes
à plat
Stade 4 : je suis trop essoufflé pour quitter ma maison ou je suis essoufflé rien
qu’à m’habiller
106
Annexe 2
Préparation du milieu de Sabouraud additionné d’itraconazole à 4 mg/l
(Milieu ITZ)
Pour 250 ml :
Solution d’itraconazole dans le DMSO :

Préparer une solution contenant 1 mg d’itraconazole dans 1 ml de DMSO
Milieu de Sabouraud :
Dans une bouteille en verre de 250 ml, mettre :
• Glucose : 5 g
• Peptone : 2,5 g
• Agar : 3,75 g
• Eau : 250 ml
pH final = 6
- Autoclaver 10 min à 110-120°C
- Laisser refroidir
- Ajouter dans le milieu tiède ou froid la solution d’itraconazole
- Agiter
- Distribuer dans des boîtes de Pétri (20 ml par boîte)
107
Annexe 3
Position des amorces pour la PCR CYP51A (3 couples CYP51A-1, CYP51A-2,
CYP51A-3), la qPCR TR34 (TR-F et TR-R) et la qPCR L98H (L98-F et L98-R) et
des sondes de la qPCR L98H (L98 WT et L98H) sur le gène cyp51A
108
109
110
111
112
Annexe 4
Caractéristiques des patients à l’inclusion
Recherche d'A. Recherche Capteur à poussières

Date d'inclusion
N° d'inclusion
fumigatus dans les d'anticorps anti-A.

expectorations fumigatus
Statut
Culture qPCR
Sexe
Ville
Age
Nombre de qPCR qPCR
Nombre qPCR A.
colonies panfongique Aspergillus
Culture qPCR ELISA Ouchterlony total de fumigatus
d'A. (Eq. (Eq.
colonies (fg/µl)
fumigatus spores/ml) spores/ml)
1 24/08/11 M Marquette lez Lille 63 Négative Négative 0 0 NC/NS 25 2 2,77E+05 5,00E+03 11,19
Positive (3 1,54E+05 1,94E+03
2 06/09/11 M Templeuve 68 colonies) Négative 25 4 C/S 39 6 15,98
3 02/12/11 M Hellemmes 65 Négative Négative 0 0 NC/NS 35 0 1,23E+05 1,90E+04 6,36
4 06/12/11 M Lille 47 Négative Négative 2 2 S 25 0 3,11E+05 1,44E+04 3,13
5 30/12/11 F Lille 48 Négative Négative 0 0 NC/NS 9 1 9,66E+04 1,79E+04 6,61
6 18/06/12 M Haubourdin 66 Négative NR 0 0 NC/NS Non reçu
7 27/03/12 M Faches-Thumesnil 73 Négative Négative 1 0 NC/NS 101 2 3,02E+05 7,28E+03 9,02
8 27/04/12 F Haubourdin 54 Négative Négative 0 0 NC/NS 6 0 5,27E+04 3,79E+03 4,27
9 10/07/12 F Lille 57 Négative Positive 32 0 C 88 11 1,31E+06 2,43E+04 19,20
10 10/07/12 M Ronchin 59 Négative NR 37 1 S 68 0 7,65E+04 1,27E+03 27,12
11 28/08/12 M Lille 62 Non expectorant 0 0 NC/NS 15 0 2,85E+05 7,00E+03 11,13
12 28/08/12 M Mons-en-Baroeul 60 Négative Négative 0 0 NC/NS 22 2 2,30E+05 1,17E+04 11,07
14 29/10/12 F Ronchin 71 Négative Négative 0 0 NC/NS Non reçu
15 26/11/12 M Wattignies 72 Négative Négative 0 0 NC/NS 17 0 8,07E+05 1,47E+04 0,00
16 27/11/12 M Bachy 58 Négative Négative 0 1 NC/NS Non reçu
17 10/12/12 M Faches-Thumesnil 60 Négative Positive 31 3 C/S 7 0 6,19E+04 2,35E+03 7,78
Positive (1 8,59E+04 1,64E+04
18 08/01/13 M Lille 69 colonie) Positive 1 1 C/S 4 3 98,89
19 16/01/13 F Lille 52 Négative Négative 35 4 (cat+) S 20 13 2,26E+05 2,44E+03 2,77
20 29/01/13 M Carvin 72 Négative Positive 0 0 C 4 0 1,45E+05 9,77E+03 5,81
Positive (3 2,47E+04 1,35E+03
21 26/02/13 F Allennes les marais 59 colonies) Positive >80 5 C/S 4 0 4,31
113
Recherche d'A. Recherche
Date d'inclusion
Capteur à poussières
N° d'inclusion
fumigatus dans les d'anticorps anti-A.
expectorations fumigatus Culture qPCR
Statut
Sexe
Ville
Age
Nombre de qPCR qPCR
Nombre qPCR A.
colonies panfongique Aspergillus
Culture qPCR ELISA Ouchterlony total de fumigatus
d'A. (Eq. (Eq.
colonies (fg/µl)
fumigatus spores/ml) spores/ml)
22 25/03/13 M Marcq-en-Barœul 58 Négative Négative 0 0 NC/NS 42 19 4,52E+04 5,90E+02 4,26

23 27/03/13 M Lille 63 Négative Positive 9 1 C/S 1 0 7,44E+04 4,90E+02 0,00
Positive (6 6,43E+04 2,53E+03
24 03/04/13 M Lille 67 colonies) Négative 0 0 C 10 0 6,69
25 30/04/13 M Villeneuve-d'Ascq 55 Négative Négative 0 0 NC/NS 11 0 5,99E+05 8,30E+03 11,11
26 22/05/13 M Wambrechies 64 Négative Positive 22 8 C/S 38 0 5,38E+05 7,80E+02 11,12
27 22/05/13 M Salome 69 Négative Négative 16 1 S 32 3 3,47E+05 7,80E+02 19,60
28 22/05/13 M Mons-en-Baroeul 80 Négative Négative 0 0 NC/NS 4 0 9,58E+04 3,80E+02 3,28
29 22/05/13 M Lille 51 Négative NR 0 0 NC/NS 26 0 2,71E+05 6,20E+02 2,77
30 28/05/13 M Villeneuve-d'Ascq 56 Négative Négative 0 0 NC/NS 23 2 1,99E+05 1,42E+03 7,93
31 28/05/13 M Loos 67 Négative Négative 73 2 S 15 1 2,77E+05 4,30E+03 2,56
32 28/05/13 M Ronchin 63 Non expectorant 1 1 S 36 0 1,20E+06 4,53E+03 17,89
33 11/06/13 F Lille 83 Négative Négative 0 0 NC/NS 33 2 2,79E+05 2,89E+03 13,49
Positive (20 1,31E+06 1,18E+04
34 23/07/13 M Lille 58 colonies) Positive 0 0 C 27 0 12,81
35 29/01/14 F Villeneuve-d'Ascq 77 Négative Positive 0 0 C Non reçu
36 11/02/14 M Wavrin 46 Négative Négative 0 0 NC/NS 13 0 1,01E+05 8,75E+02 8,17
37 11/03/14 F Haubourdin 55 Négative Négative 0 0 NC/NS 10 0 1,07E+05 6,36E+03 23,12
38 17/03/14 M Ronchin 78 Négative Négative 0 1 NC/NS Non reçu
39 25/03/14 F Lille 86 Négative Positive 0 0 C 12 3 1,28E+05 3,85E+02 17,89
40 28/03/14 M Lille 77 Négative Positive 0 0 C 15 3 5,19E+05 4,51E+03 25,17
Positive (5 1,02E+06 6,53E+03
41 23/04/14 M Marquillies 66 colonies) Positive 13 0 C/S 10 0 18,36
Positive (3
42 29/07/14 M Hellemmes 63 colonies) Positive 0 0 C 159 0
Statut : C : colonisé, S : sensibilisé, C/S : colonisé et sensibilisé, NC/NS : non colonisé et non sensibilisé
114
Annexe 5
Résumé de la communication orale présentée à l’ECCMID (mai 2014)
Circulation of moulds between clinical and environmental reservoirs in a COPD

patient population: emergence of Aspergillus fumigatus azole-resistance in the North
of France
Dauchy C1, Standaert-Vitse A 2,3, Le Rouzic O4,5, Nseir S6, Dei-Cas E1,2, Aliouat EM2,3, Fry
S4, Fréalle E1,2
1. Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHRU de Lille & Faculté de Médecine de Lille, Univ. Lille Nord de
France, Lille, France
2. Institut Pasteur de Lille, Centre d’Infection et d’Immunité de Lille (CIIL), INSERM U1019, CNRS UMR 8204,
Univ. Lille Nord de France, Lille, France
3. Laboratoire de Parasitologie, Faculté de Pharmacie de Lille, France
4. Clinique des Maladies Respiratoires, CHRU de Lille, France
5. Institut Pasteur de Lille, Centre d’Infection et d’Immunité de Lille (CIIL), INSERM U1019, CNRS UMR 8024,
Université Lille Nord de France, Lille, France
6. Pôle de Réanimation, CHRU de Lille, France
Background: The emergence of azole resistance in Aspergillus fumigatus has been reported
in azole-exposed patients, but also in azole-naïve patients and in the environment,
suggesting both long-term azole therapy and the use of azole fungicides in agriculture could
be involved in drug resistance emergence. The main resistance mechanism implicates point
mutations in the 14α-sterol demethylase gene (cyp51A) and/or increased cyp51A expression
due to a tandem repeat (TR) promoter alteration. In this study, Aspergillus colonization
prevalence and domestic mould exposure level were determined in an azole-naïve COPD
patient population. A. fumigatus clinical and environmental isolates were characterized by
cyp51A sequencing in order to clarify the circulation of A. fumigatus mutated isolates
between clinical and environmental reservoirs.
Methods: Sputa from 33 COPD patients that were admitted to the Pneumology Department
of Lille University Hospital (France) were prospectively collected from August 2011 to July
2013 for fungal detection by culture and Aspergillus qPCR. For each patient, domestic mould
exposure level was determined by culture (colony counting) using an electrostatic dust fall
collector (EDC) that had been exposed for 10 weeks in the patient’s bedroom. Clinical and
environmental samples were further cultured on itraconazole-containing Sabouraud agar
medium for azole-resistant isolates selection when more than 10 A. fumigatus isolates were
detected. Detection of cyp51A alterations was performed by cyp51A sequencing for all A.
fumigatus clinical and environmental isolates.
Results: The inclusion of 33 COPD patients yielded 31 sputa and 29 EDCs. Aspergillus
colonization was detected in 10 patients (32.2%) by culture and/or qPCR. Mould level in
EDCs varied from 1 to 101 colonies. A. fumigatus was detected in 12 EDCs (41.4%) (1 to 19
colonies) from 1 A. fumigatus colonized patient, 1 Aspergillus qPCR positive patient and 10
non-colonized patients. Cyp51A sequencing in 25 A. fumigatus clinical and 34 environmental
isolates revealed the presence of F46Y/M172V/N248T/D255E/E427K mutated isolates in 3
clinical isolates from 2 patients. TR34/L98H mutation was detected in 2 out of 34
environmental isolates (5.9%) from 2 different patients, yielding a 6.9% prevalence of
TR34/L98H A. fumigatus isolates in patient’s homes and a 16.7% prevalence in A. fumigatus
culture positive EDCs. In both TR34/L98H A. fumigatus positive EDCs, another mutated
isolate was detected, one exhibiting the F46Y/M172V/N248T/D255E/E427K mutation and the
other one a H285Y mutation.
Conclusion: This is the first report of TR34/L98H A. fumigatus isolates in the North of France.
The detection of cyp51A mutated isolates in environmental samples supports the role of
agricultural azoles in the emergence azole-resistance.
Keywords: COPD, mould environmental exposure, azole-resistance
115
BIBLIOGRAPHIE
1. Rabe KF, Hurd S, Anzueto A, Barnes PJ, Buist SA, Calverley P, et al. Global strategy for the
diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive
summary. Am J Respir Crit Care Med. 2007;176(6):532-55.
2. Murray CJ, Lopez AD. Alternative projections of mortality and disability by cause 1990-2020:
Global Burden of Disease Study. Lancet. 1997;349(9064):1498-504.
3. Miravitlles M, Murio C, Guerrero T, Gisbert R. Costs of chronic bronchitis and COPD: a 1-year
follow-up study. Chest. 2003;123(3):784-91.
4. Seemungal T, Harper-Owen R, Bhowmik A, Moric I, Sanderson G, Message S, et al. Respiratory
viruses, symptoms, and inflammatory markers in acute exacerbations and stable chronic obstructive
pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2001;164(9):1618-23.
5. Rosell A, Monsó E, Soler N, Torres F, Angrill J, Riise G, et al. Microbiologic determinants of
exacerbation in chronic obstructive pulmonary disease. Arch Intern Med. 2005;165(8):891-7.
6. Wedzicha JA, Seemungal TAR. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet.
2007;370(9589):786-96.
7. Kosmidis C, Denning DW. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 2015;70:270-
277.
8. Ader F, Nseir S, Guery B, Tillie-Leblond I. Aspergillose pulmonaire aiguë invasive et pathologies
pulmonaires chroniques. Rev Mal Respir. 2006;23(3 Suppl):6S11-6S20.
9. Bulpa P, Dive A, Sibille Y. Invasive pulmonary aspergillosis in patients with chronic obstructive
pulmonary disease. Eur Respir J. 2007;30(4):782-800.
10. Howard SJ, Cerar D, Anderson MJ, Albarrag A, Fisher MC, Pasqualotto AC, et al. Frequency and
evolution of Azole resistance in Aspergillus fumigatus associated with treatment failure. Emerg Infect
Dis. 2009;15(7):1068-76.
11. Howard SJ, Pasqualotto AC, Denning DW. Azole resistance in allergic bronchopulmonary
aspergillosis and Aspergillus bronchitis. Clin Microbiol Infect. 2010;16(6):683-8.
12. Tashiro M, Izumikawa K, Hirano K, Ide S, Mihara T, Hosogaya N, et al. Correlation between
triazole treatment history and susceptibility in clinically isolated Aspergillus fumigatus. Antimicrob
Agents Chemother. 2012;56(9):4870-5.
13. Snelders E, Huis in ’t Veld RAG, Rijs AJMM, Kema GHJ, Melchers WJG, Verweij PE. Possible
Environmental Origin of Resistance of Aspergillus fumigatus to Medical Triazoles. Appl Environ
Microbiol. 2009;75(12):4053-7.
14. Alcazar-Fuoli L, Mellado E. Current status of antifungal resistance and its impact on clinical
practice. Br J Haematol. 2014;166(4):471-84.
15. Société de Pneumologie de Langue Française. Recommandations de la Société de Pneumologie
de Langue Française sur la prise en charge de la BPCO (mise à jour 2009). Presse Médicale Paris Fr
1983. 2010;39(9):895-8.
16. Vestbo J, Hurd SS, Agustí AG, Jones PW, Vogelmeier C, Anzueto A, et al. Global strategy for the
diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive
summary. Am J Respir Crit Care Med. 2013;187(4):347-65.
17. Leivseth L, Brumpton BM, Nilsen TIL, Mai X-M, Johnsen R, Langhammer A. GOLD classifications
and mortality in chronic obstructive pulmonary disease: the HUNT Study, Norway. Thorax.
2013;68(10):914-21.
18. Johannessen A, Nilsen RM, Storebø M, Gulsvik A, Eagan T, Bakke P. Comparison of 2011 and
2007 Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease guidelines for predicting mortality and
hospitalization. Am J Respir Crit Care Med. 2013;188(1):51-9.
19. Lange P, Marott JL, Vestbo J, Olsen KR, Ingebrigtsen TS, Dahl M, et al. Prediction of the clinical
course of chronic obstructive pulmonary disease, using the new GOLD classification: a study of the
general population. Am J Respir Crit Care Med. 2012;186(10):975-81.
20. Fuhrman C, Delmas M-C, pour le groupe épidémiologie et recherche clinique de la SPLF.
Épidémiologie descriptive de la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) en France. Rev
116
Mal Respir. 2010;27(2):160-8.
21. Fuhrman C. Mortalité liée à la BPCO en France métropolitaine, 1979-2003. Bulletin
épidémiologique hebdomadaire. 2007;27-28:242-5.
22. Etude Epidémiologique sur la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) dans trois
régions françaises ayant des taux de mortalité contrastés - Ministère des Affaires sociales, de la Santé
et des Droits des femmes - www.sante.gouv.fr [Internet]. [cité 12 janv 2015]. Disponible sur:
http://www.sante.gouv.fr/etude-epidemiologique-sur-la-broncho-pneumopathie-chronique-obstructive-
bpco-dans-trois-regions-francaises-ayant-des-taux-de-mortalite-contrastes.html
23. De Marco R, Accordini S, Cerveri I, Corsico A, Sunyer J, Neukirch F, et al. An international
survey of chronic obstructive pulmonary disease in young adults according to GOLD stages. Thorax.
2004;59(2):120-5.
24. Rennard S, Decramer M, Calverley PMA, Pride NB, Soriano JB, Vermeire PA, et al. Impact of
COPD in North America and Europe in 2000: subjects’ perspective of Confronting COPD International
Survey. Eur Respir J. 2002;20(4):799-805.
25. Buist AS, McBurnie MA, Vollmer WM, Gillespie S, Burney P, Mannino DM, et al. International
variation in the prevalence of COPD (the BOLD Study): a population-based prevalence study. Lancet.
2007;370(9589):741-50.
26. Menezes AMB, Perez-Padilla R, Jardim JRB, Muiño A, Lopez MV, Valdivia G, et al. Chronic
obstructive pulmonary disease in five Latin American cities (the PLATINO study): a prevalence study.
Lancet. 2005;366(9500):1875-81.
27. O’Donnell R, Breen D, Wilson S, Djukanovic R. Inflammatory cells in the airways in COPD.
Thorax. 2006;61(5):448-54.
28. Sethi S, Murphy TF. Infection in the Pathogenesis and Course of Chronic Obstructive Pulmonary
Disease. N Engl J Med. 2008;359(22):2355-65.
29. Anderson HR, Spix C, Medina S, Schouten JP, Castellsague J, Rossi G, et al. Air pollution and
daily admissions for chronic obstructive pulmonary disease in 6 European cities: results from the
APHEA project. Eur Respir J. 1997;10(5):1064-71.
30. Wilkinson TMA, Hurst JR, Perera WR, Wilks M, Donaldson GC, Wedzicha JA. Effect of
interactions between lower airway bacterial and rhinoviral infection in exacerbations of COPD. Chest.
2006;129(2):317-24.
31. Perotin J-M, Dury S, Renois F, Deslee G, Wolak A, Duval V, et al. Detection of multiple viral and
bacterial infections in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease: a pilot prospective
study. J Med Virol. 2013;85(5):866-73.
32. Garcha DS, Thurston SJ, Patel ARC, Mackay AJ, Goldring JJP, Donaldson GC, et al. Changes in
prevalence and load of airway bacteria using quantitative PCR in stable and exacerbated COPD.
Thorax. 2012;67(12):1075-80.
33. Domenech A, Puig C, Martí S, Santos S, Fernández A, Calatayud L, et al. Infectious etiology of
acute exacerbations in severe COPD patients. J Infect. 2013;67(6):516-23.
34. Diederen BMW, van der Valk PDLPM, Kluytmans J a. WJ, Peeters MF, Hendrix R. The role of
atypical respiratory pathogens in exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir
J. 2007;30(2):240-4.
35. Rohde G, Wiethege A, Borg I, Kauth M, Bauer TT, Gillissen A, et al. Respiratory viruses in
exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease requiring hospitalisation: a case-control study.
Thorax. 2003;58(1):37-42.
36. Beckham JD, Cadena A, Lin J, Piedra PA, Glezen WP, Greenberg SB, et al. Respiratory viral
infections in patients with chronic, obstructive pulmonary disease. J Infect. 2005;50(4):322-30.
37. Ko FWS, Ip M, Chan PKS, Chan MCH, To K-W, Ng SSS, et al. Viral etiology of acute
exacerbations of COPD in Hong Kong. Chest. 2007;132(3):900-8.
38. McManus TE, Marley A-M, Baxter N, Christie SN, O’Neill HJ, Elborn JS, et al. Respiratory viral
infection in exacerbations of COPD. Respir Med. 2008;102(11):1575-80.
39. Zwaans W a. R, Mallia P, van Winden MEC, Rohde GGU. The relevance of respiratory viral
infections in the exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease—a systematic review. J Clin
Virol. 2014;61(2):181-8.
117
40. Papi A, Bellettato CM, Braccioni F, Romagnoli M, Casolari P, Caramori G, et al. Infections and
airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. Am J Respir Crit
Care Med. 2006;173(10):1114-21.
41. Guide du parcours de soins BPCO [Internet]. [cité 23 mars 2015]. Disponible sur: http://www.has-
sante.fr/portail/upload/docs/application/pdf/2012-04/guide_parcours_de_soins_bpco_finale.pdf
42. Samson RA. Taxonomy-current concepts of Aspergillus systematic. Plenum Press. New York:
Plenum Press; 1993. 1-22 p.
43. Bennett J. An overview of the genus Aspergillus Aspergillus molecular biology and genomics.
Caister Academic Press. Norwich: Caister Academic Press; 2010. 238 p.
44. Raper KB, Fennel DI. The genus Aspergillus. Williams and Wilkins. Baltimore: Williams and
Wilkins; 1965. 686 p.
45. Samson RA, Visagie CM, Houbraken J, Hong S-B, Hubka V, Klaassen CHW, et al. Phylogeny,
identification and nomenclature of the genus Aspergillus. Stud Mycol. 2014;78:141-73.
46. Samson RA. ist of names of Trichocomataceae published between 1992 and 1999 Integration of
modern taxonomic methods for Penicillium et Aspergillus classification. Haewood Academic
Publishers. Amsterdam: Haewood Academic Publishers; 2000. 73-79 p.
47. Houbraken J, de Vries RP, Samson RA. Modern taxonomy of biotechnologically important
Aspergillus and Penicillium species. Adv Appl Microbiol. 2014;86:199-249.
48. Samson RA, Hong S, Peterson SW, Frisvad JC, Varga J. Polyphasic taxonomy of Aspergillus
section Fumigati and its teleomorph Neosartorya. Stud Mycol. 2007;59:147-203.
49. Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, Nickle D, Marr KA. Aspergillus lentulus sp. nov., a New
Sibling Species of A. fumigatus. Eukaryot Cell. 2005;4(3):625-32.
50. Balajee SA, Nickle D, Varga J, Marr KA. Molecular Studies Reveal Frequent Misidentification of
Aspergillus fumigatus by Morphotyping. Eukaryot Cell. 2006;5(10):1705-12.
51. Alcazar-Fuoli L, Mellado E, Alastruey-Izquierdo A, Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL.
Aspergillus section Fumigati: antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.
Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(4):1244-51.
52. Balajee SA, Gribskov J, Brandt M, Ito J, Fothergill A, Marr KA. Mistaken identity: Neosartorya
pseudofischeri and its anamorph masquerading as Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol.
2005;43(12):5996-9.
53. Hong S-B, Shin H-D, Hong J, Frisvad JC, Nielsen PV, Varga J, et al. New taxa of Neosartorya
and Aspergillus in Aspergillus section Fumigati. Antonie Van Leeuwenhoek. 2008;93(1-2):87-98.
54. Nierman WC, Pain A, Anderson MJ, Wortman JR, Kim HS, Arroyo J, et al. Genomic sequence of
the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus. Nature.
2005;438(7071):1151-6.
55. O’Gorman CM, Fuller HT, Dyer PS. Discovery of a sexual cycle in the opportunistic fungal
pathogen Aspergillus fumigatus. Nature. 2009;457(7228):471-4.
56. Chabasse D. Les moisissures d’intérêt médical. Cahier de Formation BIOFORMA. Cahier de
formation BIOFORMA; 2002.
57. Alhambra A, Catalán M, Moragues MD, Brena S, Pontón J, Montejo JC, et al. Isolation of
Aspergillus lentulus in Spain from a critically ill patient with chronic obstructive pulmonary disease.
Rev Iberoam Micol. 2008;25(4):246-9.
58. Montenegro G, Sánchez Puch S, Jewtuchowicz VM, Pinoni MV, Relloso S, Temporitti E, et al.
Phenotypic and genotypic characterization of Aspergillus lentulus and Aspergillus fumigatus isolates in
a patient with probable invasive aspergillosis. J Med Microbiol. 2009;58(Pt 3):391-5.
59. Zbinden A, Imhof A, Wilhelm MJ, Ruschitzka F, Wild P, Bloemberg GV, et al. Fatal outcome after
heart transplantation caused by Aspergillus lentulus. Transpl Infect Dis 2012;14(5):E60-3.
60. Gürcan Ş, Tikveşli M, Üstündağ S, Ener B. A Case Report on Aspergillus lentulus Pneumonia.
Balk Med J. 2013;30(4):429-31.
61. Gangneux J-P, Bouchara J-P, Chabasse D. Biologie et diagnostic des infections à Aspergillus.
Elsevier Masson. 2013;(8-600-A-10).
118
62. Méheust D, Le Cann P, Reboux G, Millon L, Gangneux J-P. Indoor fungal contamination: health
risks and measurement methods in hospitals, homes and workplaces. Crit Rev Microbiol.
2014;40(3):248-60.
63. Noss I, Wouters IM, Visser M, Heederik DJJ, Thorne PS, Brunekreef B, et al. Evaluation of a low-
cost electrostatic dust fall collector for indoor air endotoxin exposure assessment. Appl Environ
Microbiol. 2008;74(18):5621-7.
64. Normand A-C, Vacheyrou M, Sudre B, Heederik DJJ, Piarroux R. Assessment of dust sampling
methods for the study of cultivable-microorganism exposure in stables. Appl Environ Microbiol.
2009;75(24):7617-23.
65. Frankel M, Timm M, Hansen EW, Madsen AM. Comparison of sampling methods for the
assessment of indoor microbial exposure. Indoor Air. 2012;22(5):405-14.
66. Bellanger A-P, Reboux G, Murat J-B, Bex V, Millon L. Detection of Aspergillus fumigatus by
quantitative polymerase chain reaction in air samples impacted on low-melt agar. Am J Infect Control.
2010;38(3):195-8.
67. Lignell U, Meklin T, Rintala H, Hyvärinen A, Vepsäläinen A, Pekkanen J, et al. Evaluation of
quantitative PCR and culture methods for detection of house dust fungi and streptomycetes in relation
to moisture damage of the house. Lett Appl Microbiol. 2008;47(4):303-8.
68. Latgé JP. The pathobiology of Aspergillus fumigatus. Trends Microbiol. 2001;9(8):382-9.
69. Morin O. Aspergillus et aspergilloses: Biologie. Httpwwwem-Premiumcomdoc-Distantuniv-
Lille2frdatatraitesmc08-08438 [Internet]. [cité 13 déc 2014]; Disponible sur: http://www.em-
premium.com.doc-distant.univ-lille2.fr/article/11908/resultatrecherche/3
70. Carter CD, Barr BA. Infection control issues in construction and renovation. Infect Control Hosp
Epidemiol. 1997;18(8):587-96.
71. Mallea M, Renard M, Charpin J. Flore fongique dans les habitations. Rev Fr Mal Respir.
1982;10(2):121-30.
72. Reboux G, Bellanger AP, Roussel S, Grenouillet F, Sornin S, Piarroux R, et al. Indoor mold
concentration in Eastern France. Indoor Air. 2009;19(6):446-53.
73. Latgé J-P. Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin Microbiol Rev. 1999;12(2):310-50.
74. Blandin S, David G. L’aspergillose en pratique pour le pneumologue. Rev Pneumol Clin.
2008;64(4):202-10.
75. Barberan J, Alcazar B, Malmierca E, Garcia de la Llana F, Dorca J, del Castillo D, et al. Repeated
Aspergillus isolation in respiratory samples from non-immunocompromised patients not selected
based on clinical diagnoses: colonisation or infection? BMC Infect Dis. 2012;12:295.
76. Guinea J, Torres-Narbona M, Gijón P, Muñoz P, Pozo F, Peláez T, et al. Pulmonary aspergillosis
in patients with chronic obstructive pulmonary disease: incidence, risk factors, and outcome. Clin
Microbiol Infect. 2010;16(7):870-7.
77. Khasawneh F, Mohamad T, Moughrabieh MK, Lai Z, Ager J, Soubani AO. Isolation of Aspergillus
in critically ill patients: a potential marker of poor outcome. J Crit Care. 2006;21(4):322-7.
78. Barberán J, Mensa J. [Invasive pulmonary aspergillosis in patients with chronic obstructive
pulmonary disease.]. Rev Iberoam Micol. 2014;12:295.
79. Garnacho-Montero J, Amaya-Villar R, Ortiz-Leyba C, León C, Alvarez-Lerma F, Nolla-Salas J, et
al. Isolation of Aspergillus spp. from the respiratory tract in critically ill patients: risk factors, clinical
presentation and outcome. Crit Care Lond Engl. 2005;9(3):R191-9.
80. Huerta A, Soler N, Esperatti M, Guerrero M, Menendez R, Gimeno A, et al. Importance of
Aspergillus spp. isolation in Acute exacerbations of severe COPD: prevalence, factors and follow-up:
the FUNGI-COPD study. Respir Res. 2014;15:17.
81. Meersseman W, Vandecasteele SJ, Wilmer A, Verbeken E, Peetermans WE, Van Wijngaerden
E. Invasive aspergillosis in critically ill patients without malignancy. Am J Respir Crit Care Med.
2004;170(6):621-5.
82. Chakrabarti A, Chatterjee SS, Das A, Shivaprakash MR. Invasive aspergillosis in developing
countries. Med Mycol. 2011;49 Suppl 1:S35-47.
83. Marchetti O, Lamoth F, Mikulska M, Viscoli C, Verweij P, Bretagne S, et al. ECIL
119
recommendations for the use of biological markers for the diagnosis of invasive fungal diseases in
leukemic patients and hematopoietic SCT recipients. Bone Marrow Transplant. 2012;47(6):846-54.
84. Tutar N, Metan G, Koç AN, Yilmaz I, Bozkurt I, Simsek ZO, et al. Invasive pulmonary aspergillosis
in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Multidiscip Respir Med. 2013;8(1):59.
85. Menzin J, Meyers JL, Friedman M, Perfect JR, Langston AA, Danna RP, et al. Mortality, length of
hospitalization, and costs associated with invasive fungal infections in high-risk patients. Am J Health-
Syst Pharm AJHP. 2009;66(19):1711-7.
86. Samarakoon P, Soubani AO. Invasive pulmonary aspergillosis in patients with COPD: a report of
five cases and systematic review of the literature. Chron Respir Dis. 2008;5(1):19-27.
87. Lin SJ, Schranz J, Teutsch SM. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature.
Clin Infect Dis. 2001;32(3):358-66.
88. Arendrup MC, Chryssanthou E, Gaustad P, Koskela M, Sandven P, Fernandez V. Diagnostics of
fungal infections in the Nordic countries: we still need to improve! Scand J Infect Dis. 2007;39(4):337-
43.
89. Fraczek MG, Kirwan MB, Moore CB, Morris J, Denning DW, Richardson MD. Volume
dependency for culture of fungi from respiratory secretions and increased sensitivity of Aspergillus
quantitative PCR. Mycoses. 2014;57(2):69-78.
90. Thompson GR, Cadena J, Patterson TF. Overview of antifungal agents. Clin Chest Med.
2009;30(2):203-15.
91. Koss T, Bagheri B, Zeana C, Romagnoli MF, Grossman ME. Amphotericin B-resistant Aspergillus
flavus infection successfully treated with caspofungin, a novel antifungal agent. J Am Acad Dermatol.
juin 2002;46(6):945-7.
92. Azzola A, Passweg JR, Habicht JM, Bubendorf L, Tamm M, Gratwohl A, et al. Use of lung
resection and voriconazole for successful treatment of invasive pulmonary Aspergillus ustus infection.
J Clin Microbiol. 2004;42(10):4805-8.
93. Bal AM. The echinocandins: three useful choices or three too many? Int J Antimicrob Agents.
2010;35(1):13-8.
94. Arendrup MC, Perkhofer S, Howard SJ, Garcia-Effron G, Vishukumar A, Perlin D, et al.
Establishing in vitro-in vivo correlations for Aspergillus fumigatus: the challenge of azoles versus
echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(10):3504-11.
95. Arendrup MC, Garcia-Effron G, Buzina W, Mortensen KL, Reiter N, Lundin C, et al. Breakthrough
Aspergillus fumigatus and Candida albicans double infection during caspofungin treatment: laboratory
characteristics and implication for susceptibility testing. Antimicrob Agents Chemother.
2009;53(3):1185-93.
96. Pasqualotto AC, Denning DW. New and emerging treatments for fungal infections. J Antimicrob
Chemother. 2008;61 Suppl 1:i19-30.
97. Steinbach WJ, Stevens DA. Review of newer antifungal and immunomodulatory strategies for
invasive aspergillosis. Clin Infect Dis.2003;37 Suppl 3:S157-87.
98. Alcazar-Fuoli L, Mellado E. Ergosterol biosynthesis in Aspergillus fumigatus: its relevance as an
antifungal target and role in antifungal drug resistance. Front Microbiol. 2012;3:439.
99. Mellado E, Diaz-Guerra TM, Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. Identification of Two
Different 14-α Sterol Demethylase-Related Genes (cyp51A and cyp51B) in Aspergillus fumigatus and
Other Aspergillus Species. J Clin Microbiol. 2001;39(11):4225.
100. Xiao L, Madison V, Chau AS, Loebenberg D, Palermo RE, McNicholas PM. Three-dimensional
models of wild-type and mutated forms of cytochrome P450 14alpha-sterol demethylases from
Aspergillus fumigatus and Candida albicans provide insights into posaconazole binding. Antimicrob
101. Gallin JI, Alling DW, Malech HL, Wesley R, Koziol D, Marciano B, et al. Itraconazole to prevent
fungal infections in chronic granulomatous disease. N Engl J Med. 2003;348(24):2416-22.
102. Herbrecht R, Denning DW, Patterson TF, Bennett JE, Greene RE, Oestmann J-W, et al.
Voriconazole versus amphotericin B for primary therapy of invasive aspergillosis. N Engl J Med.
2002;347(6):408-15.
103. Walsh TJ, Anaissie EJ, Denning DW, Herbrecht R, Kontoyiannis DP, Marr KA, et al. Treatment
120
of aspergillosis: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect
Dis. 2008;46(3):327-60.
104. Lelièvre L, Groh M, Angebault C, Maherault A-C, Didier E, Bougnoux M-E. Azole resistant
Aspergillus fumigatus: an emerging problem. Médecine Mal Infect. 2013;43(4):139-45.
105. Van der Linden JWM, Snelders E, Kampinga GA, Rijnders BJA, Mattsson E, Debets-
Ossenkopp YJ, et al. Clinical Implications of Azole Resistance in Aspergillus fumigatus, the
Netherlands, 2007–2009. Emerg Infect Dis. 2011;17(10):1846-54.
106. Verweij PE, Te Dorsthorst DTA, Rijs AJMM, De Vries-Hospers HG, Meis JFGM. Nationwide
survey of in vitro activities of itraconazole and voriconazole against clinical Aspergillus fumigatus
isolates cultured between 1945 and 1998. J Clin Microbiol. 2002;40(7):2648-50.
107. Escribano P, Peláez T, Muñoz P, Bouza E, Guinea J. Is azole resistance in Aspergillus
fumigatus a problem in Spain? Antimicrob Agents Chemother. 2013;57(6):2815-20.
108. Howard SJ, Arendrup MC. Acquired antifungal drug resistance in Aspergillus fumigatus:
epidemiology and detection. Med Mycol. 2011;49 Suppl 1:S90-5.
109. Diaz-Guerra TM, Mellado E, Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. A point mutation in the
14alpha-sterol demethylase gene cyp51A contributes to itraconazole resistance in Aspergillus
fumigatus. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(3):1120-4.
110. Mann PA, Parmegiani RM, Wei S-Q, Mendrick CA, Li X, Loebenberg D, et al. Mutations in
Aspergillus fumigatus resulting in reduced susceptibility to posaconazole appear to be restricted to a
single amino acid in the cytochrome P450 14alpha-demethylase. Antimicrob Agents Chemother.
2003;47(2):577-81.
111. Nascimento AM, Goldman GH, Park S, Marras SAE, Delmas G, Oza U, et al. Multiple
resistance mechanisms among Aspergillus fumigatus mutants with high-level resistance to
itraconazole. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(5):1719-26.
112. Snelders E, Karawajczyk A, Schaftenaar G, Verweij PE, Melchers WJG. Azole resistance profile
of amino acid changes in Aspergillus fumigatus CYP51A based on protein homology modeling.
113. Mellado E, Garcia-Effron G, Alcazar-Fuoli L, Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL.
Substitutions at methionine 220 in the 14alpha-sterol demethylase (Cyp51A) of Aspergillus fumigatus
are responsible for resistance in vitro to azole antifungal drugs. Antimicrob Agents Chemother.
2004;48(7):2747-50.
114. Mellado E, Garcia-Effron G, Alcázar-Fuoli L, Melchers WJG, Verweij PE, Cuenca-Estrella M, et
al. A new Aspergillus fumigatus resistance mechanism conferring in vitro cross-resistance to azole
antifungals involves a combination of cyp51A alterations. Antimicrob Agents Chemother.
2007;51(6):1897-904.
115. Fraczek MG, Bromley M, Bowyer P. An improved model of the Aspergillus fumigatus CYP51A
protein. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55(5):2483-6.
116. Snelders E, van der Lee HAL, Kuijpers J, Rijs AJMM, Varga J, Samson RA, et al. Emergence of
azole resistance in Aspergillus fumigatus and spread of a single resistance mechanism. PLoS Med.
2008;5(11):e219.
117. Vermeulen E, Maertens J, Schoemans H, Lagrou K. Azole-resistant Aspergillus fumigatus due
to TR46/Y121F/T289A mutation emerging in Belgium, 2012. Euro Surveill Bull Eur Sur Mal Transm
Eur Commun Dis Bull. 2012;17(48).
118. Van der Linden JWM, Camps SMT, Kampinga GA, Arends JPA, Debets-Ossenkopp YJ, Haas
PJA, et al. Aspergillosis due to voriconazole highly resistant Aspergillus fumigatus and recovery of
genetically related resistant isolates from domiciles. Clin Infect Dis. 2013;57(4):513-20.
119. Chowdhary A, Sharma C, Kathuria S, Hagen F, Meis JF. Azole-resistant Aspergillus fumigatus
with the environmental TR46/Y121F/T289A mutation in India. J Antimicrob Chemother.
2014;69(2):555-7.
120. Cannon RD, Lamping E, Holmes AR, Niimi K, Baret PV, Keniya MV, et al. Efflux-mediated
antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. avr 2009;22(2):291-321.
121. Slaven JW, Anderson MJ, Sanglard D, Dixon GK, Bille J, Roberts IS, et al. Increased
expression of a novel Aspergillus fumigatus ABC transporter gene, atrF, in the presence of
itraconazole in an itraconazole resistant clinical isolate. Fungal Genet Biol FG B. 2002;36(3):199-206.
121
122. Rajendran R, Mowat E, McCulloch E, Lappin DF, Jones B, Lang S, et al. Azole resistance of
Aspergillus fumigatus biofilms is partly associated with efflux pump activity. Antimicrob Agents
Chemother. 2011;55(5):2092-7.
123. Buied A, Moore CB, Denning DW, Bowyer P. High-level expression of cyp51B in azole-resistant
clinical Aspergillus fumigatus isolates. J Antimicrob Chemother. 2013;68(3):512-4.
124. Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing of the ESCMID European Committee for
Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Technical Note on the method for the determination of
broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia-forming moulds. Clin
Microbiol Infect. 2008;14(10):982-4.
125. Wayne P. CLSI. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for
broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; approved standar-second edition.
Doc M38-A2. 2002.
126. EUCAST: Clinical breakpoints [Internet]. [cité 12 janv 2015]. Disponible sur:
http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/
127. Cuenca-Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. The current role of the reference procedures by CLSI
and EUCAST in the detection of resistance to antifungal agents in vitro. Expert Rev Anti Infect Ther.
2010;8(3):267-76.
128. Pfaller JB, Messer SA, Hollis RJ, Diekema DJ, Pfaller MA. In vitro susceptibility testing of
Aspergillus spp.: comparison of Etest and reference microdilution methods for determining
voriconazole and itraconazole MICs. J Clin Microbiol. 2003;41(3):1126-9.
129. Mortensen KL, Jensen RH, Johansen HK, Skov M, Pressler T, Howard SJ, et al. Aspergillus
Species and Other Molds in Respiratory Samples from Patients with Cystic Fibrosis: a Laboratory-
Based Study with Focus on Aspergillus fumigatus Azole Resistance. J Clin Microbiol.
2011;49(6):2243-51.
130. Morio F, Aubin GG, Danner-Boucher I, Haloun A, Sacchetto E, Garcia-Hermoso D, et al. High
prevalence of triazole resistance in Aspergillus fumigatus, especially mediated by TR/L98H, in a
French cohort of patients with cystic fibrosis. J Antimicrob Chemother. 2012;67(8):1870-3.
131. Van der Linden JWM, Snelders E, Arends JP, Daenen SM, Melchers WJG, Verweij PE. Rapid
Diagnosis of Azole-Resistant Aspergillosis by Direct PCR Using Tissue Specimens. J Clin Microbiol.
2010;48(4):1478-80.
132. Garcia-Effron G, Dilger A, Alcazar-Fuoli L, Park S, Mellado E, Perlin DS. Rapid Detection of
Triazole Antifungal Resistance in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 2008;46(4):1200-6.
133. Verweij PE, Snelders E, Kema GHJ, Mellado E, Melchers WJG. Azole resistance in Aspergillus
fumigatus: a side-effect of environmental fungicide use? Lancet Infect Dis. 2009;9(12):789-95.
134. Verweij PE, Kema GHJ, Zwaan B, Melchers WJG. Triazole fungicides and the selection of
resistance to medical triazoles in the opportunistic mould Aspergillus fumigatus. Pest Manag Sci.
2013;69(2):165-70.
135. Denning DW, Venkateswarlu K, Oakley KL, Anderson MJ, Manning NJ, Stevens DA, et al.
Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41(6):1364-8.
136. Lockhart SR, Frade JP, Etienne KA, Pfaller MA, Diekema DJ, Balajee SA. Azole Resistance in
Aspergillus fumigatus Isolates from the ARTEMIS Global Surveillance Study Is Primarily Due to the
TR/L98H Mutation in the cyp51A Gene. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55(9):4465-8.
137. Van der Linden JWM, Arendrup MC, Verweij PE, SCARE network (2011) Prospective
st
international surveillance of azole resistance in Aspergillus fumigatus: SCARE-Network. In: 51
Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC); Sep 17–20; Chicago,
IL. Abstract M-490. (SCARE-NETWORK).
138. Dannaoui E, Persat F, Monier MF, Borel E, Piens MA, Picot S. In-vitro susceptibility of
Aspergillus spp. isolates to amphotericin B and itraconazole. J Antimicrob Chemother.
1999;44(4):553-5.
139. Alanio A, Sitterlé E, Liance M, Farrugia C, Foulet F, Botterel F, et al. Low prevalence of
resistance to azoles in Aspergillus fumigatus in a French cohort of patients treated for haematological
malignancies. J Antimicrob Chemother. 2011;66(2):371-4.
140. Burgel P-R, Baixench M-T, Amsellem M, Audureau E, Chapron J, Kanaan R, et al. High
prevalence of azole-resistant Aspergillus fumigatus in adults with cystic fibrosis exposed to
122
itraconazole. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(2):869-74.
141. Bueid A, Howard SJ, Moore CB, Richardson MD, Harrison E, Bowyer P, et al. Azole antifungal
resistance in Aspergillus fumigatus: 2008 and 2009. J Antimicrob Chemother. 2010;65(10):2116-8.
142. Chowdhary A, Kathuria S, Xu J, Meis JF. Emergence of Azole-Resistant Aspergillus fumigatus
Strains due to Agricultural Azole Use Creates an Increasing Threat to Human Health. PLoS Pathog
2013;9(10):e1003633.
143. Seyedmousavi S, Hashemi SJ, Zibafar E, Zoll J, Hedayati MT, Mouton JW, et al. Azole-
Resistant Aspergillus fumigatus, Iran. Emerg Infect Dis. 2013;19(5):832-4.
144. Tashiro M, Izumikawa K, Minematsu A, Hirano K, Iwanaga N, Ide S, et al. Antifungal
Susceptibilities of Aspergillus fumigatus Clinical Isolates Obtained in Nagasaki, Japan. Antimicrob
145. Rodriguez-Tudela JL, Alcazar-Fuoli L, Mellado E, Alastruey-Izquierdo A, Monzon A, Cuenca-
Estrella M. Epidemiological cutoffs and cross-resistance to azole drugs in Aspergillus fumigatus.
146. Rocchi S, Daguindau E, Grenouillet F, Deconinck E, Bellanger A-P, Garcia-Hermoso D, et al.
Azole-resistant Aspergillus fumigatus isolate with the TR34/L98H mutation in both a fungicide-sprayed
field and the lung of a hematopoietic stem cell transplant recipient with invasive aspergillosis. J Clin
Microbiol. 2014;52(5):1724-6.
147. Chowdhary A, Kathuria S, Xu J, Sharma C, Sundar G, Singh PK, et al. Clonal expansion and
emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the
TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PloS One. 2012;7(12):e52871.
148. Pfaller M, Boyken L, Hollis R, Kroeger J, Messer S, Tendolkar S, et al. Use of Epidemiological
Cutoff Values To Examine 9-Year Trends in Susceptibility of Aspergillus Species to the Triazoles. J
Clin Microbiol. févr 2011;49(2):586‑90.
149. Fréalle E, Decrucq K, Botterel F, Bouchindhomme B, Camus D, Dei-Cas E, et al. Diagnosis of
invasive aspergillosis using bronchoalveolar lavage in haematology patients: influence of
bronchoalveolar lavage human DNA content on real-time PCR performance. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis. 2009;28(3):223-32.
150. Chemidlin Prévost-Bouré N, Christen R, Dequiedt S, Mougel C, Lelièvre M, Jolivet C, et al.
Validation and application of a PCR primer set to quantify fungal communities in the soil environment
by real-time quantitative PCR. PloS One. 2011;6(9):e24166.
151. Costa C, Costa J-M, Desterke C, Botterel F, Cordonnier C, Bretagne S. Real-time PCR coupled
with automated DNA extraction and detection of galactomannan antigen in serum by enzyme-linked
immunosorbent assay for diagnosis of invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 2002;40(6):2224-7.
152. Haugland RA, Varma M, Wymer LJ, Vesper SJ. Quantitative PCR analysis of selected
Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces species. Syst Appl Microbiol. 2004;27(2):198-210.
153. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. 2014 [cité 12 janv 2015].
Disponible sur:
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Antifungal_breakpoints_v_7.0.p
df
154. Balajee SA, Houbraken J, Verweij PE, Hong S-B, Yaghuchi T, Varga J, et al. Aspergillus
species identification in the clinical setting. Stud Mycol. 2007;59:39-46.
155. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor W. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal
RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, M.
A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White. Acad Press Inc N Y N. 1990;315-22.
156. Morton CO, Loeffler J, De Luca A, Frost S, Kenny C, Duval S, et al. Dynamics of extracellular
release of Aspergillus fumigatus DNA and galactomannan during growth in blood and serum. J Med
Microbiol. avr 2010;59(Pt 4):408-13.
157. Zhao Y, Stensvold CR, Perlin DS, Arendrup MC. Azole resistance in Aspergillus fumigatus from
bronchoalveolar lavage fluid samples of patients with chronic diseases. J Antimicrob Chemother.
2013;68(7):1497-504.
158. Bafadhel M, Mckenna S, Agbetile J. Aspergillus fumigatus during stable state and
exacerbations of COPD. Eur Respir J. 2014;(43):64-71.
123
159. Baxter CG, Rautemaa R, Jones AM, Webb AK, Bull M, Mahenthiralingam E, et al. Intravenous
antibiotics reduce the presence of Aspergillus in adult cystic fibrosis sputum. Thorax. 2013;68(7):652-
7.
160. Roussel S, Reboux G, Millon L, Parchas M-D, Boudih S, Skana F, et al. Microbiological
evaluation of ten French archives and link to occupational symptoms. Indoor Air. 2012;22(6):514-22.
161. Vesper S, McKinstry C, Hartmann C, Neace M, Yoder S, Vesper A. Quantifying fungal viability
in air and water samples using quantitative PCR after treatment with propidium monoazide (PMA). J
Microbiol Methods. 2008;72(2):180-4.
162. Fairs A, Agbetile J, Bourne M, Hargadon B, Monteiro WR, Morley JP, et al. Isolation of
Aspergillus fumigatus from sputum is associated with elevated airborne levels in homes of patients
with asthma. Indoor Air. 2013;23(4):275-84.
163. Blanc PD, Quinlan PJ, Katz PP, Balmes JR, Trupin L, Cisternas MG, et al. Higher
environmental relative moldiness index values measured in homes of adults with asthma, rhinitis, or
both conditions. Environ Res. 2013;122:98-101.
164. Norbäck D, Markowicz P, Cai G-H, Hashim Z, Ali F, Zheng Y-W, et al. Endotoxin, ergosterol,
fungal DNA and allergens in dust from schools in Johor Bahru, Malaysia- associations with asthma
and respiratory infections in pupils. PloS One. 2014;9(2):e88303.
165. Hong S-B, Kim D-H, Park I-C, Samson RA, Shin H-D. Isolation and Identification of Aspergillus
Section Fumigati Strains from Arable Soil in Korea. Mycobiology. 2010;38(1):1-6.
166. Mortensen KL, Mellado E, Lass-Flörl C, Rodriguez-Tudela JL, Johansen HK, Arendrup MC.
Environmental study of azole-resistant Aspergillus fumigatus and other aspergilli in Austria, Denmark,
and Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2010;54(11):4545-9.
167. Prigitano A, Venier V, Cogliati M, De Lorenzis G, Esposto MC, Tortorano AM. Azole-resistant
Aspergillus fumigatus in the environment of northern Italy, May 2011 to June 2012. Euro Surveill Bull
Eur Sur Mal Transm Eur Commun Dis Bull. 2014;19(12):20747.
168. Hamprecht A, Buchheidt D, Vehreschild JJ, Cornely OA, Spiess B, Plum G, et al. Azole-
resistant invasive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia in Germany. Euro Surveill
Bull Eur Sur Mal Transm Eur Commun Dis Bull. 2012;17(36):20262.
169. Mellado E, De La Camara R, Buendía B, Rodriguez-Tudela JL, Cuenca-Estrella M.
Breakthrough pulmonary Aspergillus fumigatus infection with multiple triazole resistance in a Spanish
patient with chronic myeloid leukemia. Rev Iberoam Micol. 2013;30(1):64-8.
170. Mortensen KL, Jensen RH, Johansen HK, Skov M, Pressler T, Howard SJ, et al. Aspergillus
Species and Other Molds in Respiratory Samples from Patients with Cystic Fibrosis: a Laboratory-
Based Study with Focus on Aspergillus fumigatus Azole Resistance. J Clin Microbiol.
2011;49(6):2243-51.
171. Bart-Delabesse E, Sarfati J, Debeaupuis JP, van Leeuwen W, van Belkum A, Bretagne S, et al.
Comparison of restriction fragment length polymorphism, microsatellite length polymorphism, and
random amplification of polymorphic DNA analyses for fingerprinting Aspergillus fumigatus isolates. J
Clin Microbiol. 2001;39(7):2683-6.
172. Chong G-LM, van de Sande WWJ, Dingemans GJH, Gaajetaan GR, Vonk AG, Hayette M-P, et
al. Direct detection of Aspergillus and azole resistance of Aspergillus fumigatus on bronchoalveolar
lavage fluid. Validation of a new Aspergillus real-time PCR. J Clin Microbiol. 2015;53(3):868-874.
173. Spiess B, Seifarth W, Merker N, Howard SJ, Reinwald M, Dietz A, et al. Development of novel
PCR assays to detect azole resistance-mediating mutations of the Aspergillus fumigatus cyp51A gene
in primary clinical samples from neutropenic patients. Antimicrob Agents Chemother.
2012;56(7):3905-10.
124
125
Université de Lille 2
FACULTE DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES DE LILLE
MEMOIRE de DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES
(tenant lieu de Thèse en vue du Diplôme d’Etat de Docteur en Pharmacie)
Année Universitaire 2014/2015
Nom : DAUCHY épouse DEFURNE

Prénom : Camille
Titre du mémoire / thèse : Caractérisation de la résistance aux azolés d’Aspergillus fumigatus chez
les patients atteints de BPCO dans la région Nord-Pas de Calais : circulation entre les réservoirs
cliniques et environnementaux
Mots-clés : Aspergillus fumigatus, exposition environnementale, BPCO, qPCR, résistance aux
azolés, gène cyp51A, TR34/L98H
Résumé :
Contexte : La BPCO est une pathologie respiratoire chronique qui pourrait devenir la troisième cause de mortalité
d’ici 2020. Son évolution est caractérisée par des épisodes d’exacerbation dont l’origine peut être infectieuse,
bactérienne et/ou virale mais le rôle des infections fongiques est peu documenté. Les patients BPCO constituent
un groupe à risque de colonisation par Aspergillus fumigatus et d’API, et l’impact de l’isolement d’A. fumigatus
dans leurs expectorations n’est pas clairement établi. Ils bénéficient rarement d’un traitement par antifongiques
azolés et sont dits « naïfs ». L’émergence de la résistance aux azolés chez A. fumigatus ayant été rapportée chez
des patients traités par azolés mais aussi chez des patients « naïfs » ainsi que dans l’environnement, elle serait
liée à l’utilisation de fongicides azolés en agriculture. Le risque d’apparition d’isolats résistants aux azolés est
donc réel chez les patients « naïfs » atteints de BPCO. Le principal mécanisme de résistance implique des
mutations et/ou la surexpression du gène cible des azolés cyp51A. Notre étude vise, d’une part, à déterminer la
prévalence de colonisation par A. fumigatus et le niveau d’exposition à A. fumigatus dans l’environnement
domestique afin d’évaluer le rôle de l’exposition fongique dans la colonisation. D’autre part, nous avons
caractérisé les phénomènes de résistance aux azolés dans les isolats cliniques et environnementaux d’A.
fumigatus dans cette population de patients « naïfs » atteints de BPCO, afin d’étudier la circulation de ces isolats
entre les réservoirs cliniques et environnementaux.
Méthode : Les prélèvements respiratoires de patients atteints de BPCO admis au CHRU de Lille pour un épisode
d’exacerbation ont été collectés prospectivement entre août 2011 et juillet 2014 pour la recherche de la
colonisation par A. fumigatus par culture et qPCR. Pour chaque patient, le niveau d’exposition domestique
fongique a été mesuré par culture et qPCR (panfongique, Aspergillus et A. fumigatus) en utilisant un capteur à
poussières exposé 10 semaines au domicile du patient. Après confirmation de l’identification phénotypique et
moléculaire par séquençage des régions ITS et du gène de la ß-tubuline des isolats cliniques et
environnementaux d’A. fumigatus, le séquençage du gène cyp51A a été réalisé afin de détecter les mutations
associées à une résistance aux azolés. Enfin, la détection directe par qPCR de la mutation TR34/L98H a été
mise au point à partir des isolats et testée sur les capteurs à poussières.
Résultats : 41 patients ont été inclus et 36 capteurs à poussières ont été récupérés. La présence d’A. fumigatus a
été détectée chez 15 patients par culture et/ou qPCR soit une prévalence de colonisation de 38,5%. A. fumigatus
a été détecté dans 15/36 capteurs par culture (41.7%), correspondant à 5 patients colonisés et 10 patients non
colonisés par A. fumigatus. Nous n’avons pas pu mettre en évidence de lien entre exposition environnementale
(mesurée par culture ou qPCR) et colonisation. L’identification d’A. fumigatus a été confirmée pour les 68 isolats
cliniques et les 48 isolats environnementaux obtenus, et aucune autre espèce de la section Fumigati n’a été
isolée. Le séquençage cyp51A a permis de détecter 5 profils de mutations : les 5 mutations F46Y, M172V,
N248T, D255E, E427K, les 3 mutations F46Y, M172V, E427K, la mutation A284T, la mutation H285Y jamais
décrite, et la mutation TR34/L98H détectée dans 2 isolats environnementaux sur 48 (4,2%) chez 2 patients
différents, soit une prévalence de la mutation TR34/L98H de 5,6% dans l’environnement domestique de notre
population, et de 13,3% en fonction des capteurs positifs à A. fumigatus. Il s’agit de la première description
d’isolats portant la mutation TR34/L98H dans le Nord-Pas de Calais. Sa présence dans des isolats
environnementaux semble confirmer son origine environnementale. L’étude de la circulation entre les réservoirs
cliniques et environnementaux a été possible chez 3 patients présentant à la fois des isolats cliniques et
environnementaux mais ces isolats étaient tous sensibles aux azolés et l’impact de l’exposition aux isolats
résistants n’a pas pu être mis en évidence dans notre étude. Une détection directe de la mutation TR34/L98H par
qPCR a pu être validée sur les isolats mais la sensibilité de cette technique (qui cible un gène monocopie) était
insuffisante pour une détection directe de cette mutation dans les capteurs à poussières. De meilleures
performances pourraient être obtenues par l’ajout d’une étape préliminaire d’amplification, et une évaluation sur
des prélèvements plus riches en ADN aspergillaire (tels que biopsies, LBA ou expectorations avec examen
microscopique positif) pourrait être envisagée.
Président : Monsieur le Professeur El Moukhtar ALIOUAT, Professeur des Universités

Assesseurs: Monsieur le Professeur Boualem SENDID, Professeur des Universités-Praticien
Hospitalier
Monsieur le Professeur Saad NSEIR, Professeur des Universités-Praticien
Hospitalier
Madame le Docteur Stéphanie FRY, Praticien Hospitalier
Directeur de thèse : Madame le Docteur Emilie FREALLE, Praticien Hospitalier

Thèse Camille

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Thèse Camille

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Thèse Camille

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Université de Lille 2 Faculté des Sciences Pharmaceutiques

Année Universitaire 2014/2015 et Biologiques de Lille

Soutenu publiquement le 21 avril 2015

Conformément aux dispositions du Décret du 10 septembre 1990

THESE EN VUE DU DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE

Caractérisation de la résistance aux azolés

Président : Monsieur le Professeur El Moukhtar ALIOUAT, Professeur des

Assesseurs: Monsieur le Professeur Boualem SENDID, Professeur des Universités-

Directeur de thèse : Madame le Docteur Emilie FREALLE, Praticien Hospitalier, Laboratoire

3, rue du Professeur Laguesse - B.P. 83 - 59006 LILLE CEDEX

Université Lille 2 – Droit et Santé

Président : Professeur Xavier VANDENDRIESSCHE

Directeur Général des Services : Monsieur Pierre-Marie ROBERT

Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques

Doyen : Professeur Damien CUNY

Chef des services administratifs : Monsieur Cyrille PORTA

Liste des Professeurs des Universités - Praticiens Hospitaliers

Liste des Maitres de Conférences - Praticiens Hospitaliers

Liste des Maitres de Conférences

Professeur Associé - mi-temps

Maîtres de Conférences ASSOCIES - mi-temps

L’Université n’entend donner aucune approbation aux opinions

Monsieur le Professeur El Moukhtar ALIOUAT

Professeur des Universités,

Equipe Signalisation Moléculaire et Contrôle de la

Vous me faites l’honneur de présider ce jury de thèse et je vous en remercie.

Monsieur le Professeur Boualem SENDID

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier

Je vous remercie de me faire l’honneur d’accepter de juger ce travail.

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier

Merci d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse.

Equipe Immunité Pulmonaire

Merci d’avoir collaboré à la réalisation de ce travail et

Madame le Docteur Emilie FREALLE

Equipe Infection Pulmonaire et Immunité Innée

Tu m’as fait l’honneur de me confier ce travail.

L’ensemble du personnel du Laboratoire de Parasitologie - Mycologie du

Les enseignants, biologistes et techniciens, avec qui j’ai travaillé,

A ma famille et ma belle famille.

Tableau 1 : Classification spirométrique de la BPCO d'après GOLD 2007

A. Définition, étiologie et diagnostic

Stades Caractéristiques Équivalence clinique

Stade I : VEMS/CVF < 70% Absence de dyspnée

Stade II : VEMS/CVF < 70% Dyspnée d’effort inconstante

Stade III: VEMS/CVF < 70% Dyspnée d’effort

Stade IV : VEMS/CVF < 70% Dyspnée au moindre effort ou

D’après les récentes recommandations de la GOLD en 2011, l’évaluation du patient

Figure 1 : Classification ABCD d'après GOLD 2011 (16)

Toutefois, l’intérêt de la classification ABCD reste discuté : une étude norvégienne

Le traitement de la BPCO dépend du stade (Tableau 2) et repose sur le sevrage

I : Léger II : Modéré III : Sévère IV : Très sévère

Bronchodilatateur de courte durée d’action (si besoin)

Un ou plusieurs bronchodilatateurs de longue durée d’action

Tableau 2 : Schéma général du traitement de la BPCO (15)

La prévalence de la BPCO en France est difficile à estimer en raison du sous-

E. Les exacerbations de la BPCO

1. Physiopathologie et origine des exacerbations

D’un point de vue physiopathologique, les EABPCO sont associées à une

La prise en charge des EABPCO débute par la recherche des critères