Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

Chapitre I: Méthodes chromatographiques

I. 1. Généralités
La chromatographie est une technique de séparation des substances chimiques (mélange homogène
liquide ou gazeux) qui repose sur des différences de comportement entre une phase mobile et une
phase stationnaire (ou phase fixe).
Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants résulte soit de leur
adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité
différente dans chaque phase.
Phase mobile et phase fixe
A- La phase mobile en chromatographie peut être:
 Soit un gaz (chromatographie en phase gazeuse), la phase mobile est appelée gaz vecteur ou
gaz porteur;
 Soit un liquide (chromatographie sur papier, couche mince ou colonne), la phase mobile est
appelée éluant.
B- La phase fixe peut être solide ou liquide:
Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des
mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme remplissage
d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC)
ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière
plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM).
Un liquide imprégnant un support solide ou encore une chaîne carbonée fixée sur un
support (phase greffée).
--Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse de séparation
caractéristique qui permet de les séparer, et de les identifier. Cette vitesse est fortement dépendante
de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire.
--Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans
l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution-étalon (solution
commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances
servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des
vitesses de séparation. Il s'agit de chromatographie analytique.
Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions pour les identifier par d'autres techniques:
c'est la chromatographie préparative.
I.2. Les différents types de chromatographie
I.2.1. Par nature de la phase mobile
 Chromatographie en phase gazeuse (CPG),

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 Chromatographie en phase liquide (CPL): (Chromatographie sur couche mince (CCM);

chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), ……).
I.2.2. Par type d'interaction
 Chromatographie d'adsorption/d'affinité;
 Chromatographie de partage ;
 Chromatographie à échange d'ions ;
 Chromatographie chirale (soit de la CPG, soit de la CPL) ;
 Chromatographie d'exclusion stérique (CES);
I.2.3. Par type de support
 Chromatographie sur colonne, regroupant notamment chromatographie en phase liquide à
haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse (CPG): la phase stationnaire est
dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou différence de pression;
 Chromatographie planaire (qui recouvre CCM et chromatographie sur papier): la phase
stationnaire est sur la surface d'un support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse
(chromatographie sur papier) ; la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité.
I.2.4. Méthodes couplées
Pour améliorer la qualité de la séparation et de l'identification, de nouveaux appareils permettent:
 De coupler deux types de chromatographies (chromatographie bi-dimensionnelle);
 D’associer la séparation chromatographique à une autre technique d'analyse telle que la
spectrométrie de masse (méthodes GC-MS et LC-MS).
I.3. Principe:
Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases
en contact: la phase stationnaire et la phase mobile (gaz ou liquide) qui se déplace. La séparation est
basée sur l'entraînement différentiel des constituants du mélange. Ces derniers parcourent la phase
stationnaire avec des temps proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à
leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...).

A phase mobile K A phase stationnaire

K = CS/CM K : Coefficient de distribution
CS : Concentration de l’analyte A dans la phase stationnaire
CM : Concentration de l’analyte A dans la phase mobile

Figure I.1. Schéma simplifié de la chromatographie

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Avec l'équilibre suivant:

On a toujours [Spm]<< [Sps], d'où K>> 1 suivant la valeur de K le produit sera plus ou moins
retenu sur la colonne, il sera "élué" plus ou moins rapidement.
- Les répartitions différentes des solutés entre la phase mobile et la phase stationnaire viennent
d'adsorptions différentiées des produits sous l’effet des paramètres physiques (taille des particules,
porosité, surface spécifique...) et des paramètres chimiques: (interactions intermoléculaires comme
les liaisons hydrogène, liaisons de Van der Waals...).
 Choix de la technique: le choix d’une technique chromatographique dépend:
- De la nature du soluté: gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce
organique, polaire, ionique,…
- Du but de l’analyse: identification des composants d’un mélange, nécessité ou non de “coupler”
la chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec la spectrométrie de masse (CPG/SM
ou GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction
en continu pour optimiser des paramètres, dosages (quantification)…
 Chromatogramme.
Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un paramètre relié
à la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne.
Le temps (ou très rarement le volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de
détection en ordonnée.
-La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué. La séparation est
complète quand le chromatogramme présente autant de pics chromatographiques revenant à la ligne
de base qu’il y a de composés dans le mélange à analyser.
-Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tR, qui représente le temps écoulé entre
l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du pic qui lui
est lié. Dans le cas idéal tR est indépendant de la quantité injectée.
-Un constituant non retenu sort de la colonne au temps tM, appelé temps mort (désigné également
par t0).
La différence entre le temps de rétention et le temps mort est désignée par le temps de rétention
réduit du composé t -R. t –R = tR- tM
Un chromatogramme correct est composé de pics de forme symétrique, pas trop larges et bien
séparés.

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FigureI.2. Chromatogramme.
Elution: entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de la phase
mobile.
L’analyse du chromatogramme permet une analyse :
-Qualitative : identification / position du pic
-Quantitative : aire des pic
I. 4. Classification des méthodes chromatographiques: il existe un grand nombre de modes de
chromatographie.
I.4.1. Chromatographies en phase liquide (CPL)
C'est la chromatographie la plus ancienne, où la phase mobile est un liquide. On distingue d’après
le phénomène mis en jeu:
I.4.1.1. La chromatographie de partage ou (la chromatographie liquide-liquide (CLL)):
C’est une méthode de séparation de molécules suivant leur migration/répartition différentielle dans
deux phases liquides non miscibles (la phase stationnaire est liquide et la phase mobile aussi).
1- Chromatographie de partage en phases normale (ou directe) (PN):
On utilise une phase stationnaire (greffons) Polaire: amines -NH2 ou nitriles- C≡N, et phase
mobile apolaire (des solvants peu polaires) exp: l’hexane.

2- La chromatographie de partage en phase inverse ou réverse (RPLC) :

On utilise une phase stationnaire (greffons) Apolaire : des chaînes alkyles (en général chaîne de
16-18 carbones) et une phase mobile polaire.
I.4.1.2. La chromatographie d’exclusion stérique, ou tamisage moléculaire:
Elle permet de séparer les molécules suivant leur taille.

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I.4.1.3. La chromatographie d’adsorption ou liquide-solide (CLS):

Ce mode de chromatographie met en jeu un mécanisme d'adsorption du soluté sur la phase
stationnaire solide et un mécanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide (éluant).
I.4.1.4. Chromatographie planaire ou CCM.
C’est une méthode sensible, de faible coût, il est possible de mener plusieurs séparations en
parallèle. L’appareillage actuel permet de maîtriser les trois étapes essentielles: le dépôt de
l’échantillon, la migration sur la plaque et la mesure de concentration.

-Chaque produit est caractérisé par le rapport frontal (la constante Rf): distance parcourue par le
soluté / distance parcourue par le solvant. Le rapport frontal se calcule entre 0 et 1. Le soluté qui
est très soluble dans la phase fixe aura un RF très faible, à l'inverse, le soluté qui est soluble dans la
phase mobile aura un RF élevé et proche de 1.
Rf = Hp/Hs,

I.4.1.5. La chromatographie par échange d’ions ou chromatographie ionique:

Elle est adaptée à la séparation des ions minéraux et de toutes sortes de molécules organiques à la
condition qu’elles soient polaires ou ionisées.

I.4.1.6. La chromatographie d’affinité: la phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est
greffé un “effecteur” qui présente une affinité pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité
enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).

I.4.2. Chromatographies en phase gazeuse (CPG)

I.4.2.1. Introduction:
La chromatographie en phase gazeuse est une technique de séparation des molécules. Elle est
utilisée pour repérer les substances qui composent un mélange gazeux ou susceptibles de le devenir
sans décomposition par chauffage.
La phase mobile est un gaz vecteur. On distingue:
- La chromatographie gaz-liquide: la phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un support
solide par imprégnation ou par greffage.

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- La chromatographie gaz-solide : la phase stationnaire est un solide poreux, réservé à l’analyse

de mélanges de gaz ou de liquides à bas points d’ébullition.
La chromatographie d'adsorption.peu utilisée en raison des traînées dans les pics d'élution
provoquées par la non linéarité du processus d'adsorption.
- Eventuellement, la phase mobile peut être un fluide à l’état supercritique (ex CO2 à 50°C et 150
bars).
I.4.2.2. Principe de la chromatographie en phase gazeuse
Les éléments gazeux ou volatils d'un échantillon sont placés dans un injecteur. Ils vont
ensuite être emportés (phase mobile) par un gaz porteur qui va les amener dans la phase stationnaire
pour qu'ils y soient séparés. Il s'agit bien souvent d'un liquide ou d'un solide. Plus un élément a
d'affinité avec la phase stationnaire, plus il prendra de temps pour sortir de la colonne de
chromatographie. Les éléments peuvent être identifiés mais aussi quantifiés.

Influence du débit du gaz vecteur sur l'efficacité d'une colonne de CPG

L'équation de Van Deemter permet de calculer la HEPT (hauteur équivalente en plateaux
théoriques) en fonction de la vitesse de la phase mobile dans les colonnes remplies de CPG.
H = A + B/U + C.U
Avec A : la diffusion turbulente
B : la diffusion moléculaire
C : la résistance du transfert de masse
U : la vitesse moyenne de la phase mobile
-Détermination de l'efficacité des colonnes en chromatographie
L’efficacité d’une colonne de chromatographie peut s’exprimer par le nombre N de plateaux
théoriques qu’elle possède. Plus le nombre de plateau est élevé, plus la colonne est efficace.
On définit également la hauteur équivalente de plateaux théoriques (HEPT):
H=L/N
Avec L la longueur de la colonne. Plus la hauteur de plateau H est faible, plus la colonne est
efficace.
Plusieurs relations dans le cas de pics symétriques (gaussien) permettent de calculer le nombre de
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plateaux théoriques en fonction des grandeurs de rétention utilisées:

N= (tR/σ)² = 16(tR/ω)² = 5.54 (tR/δ)²
Facteur de séparation ou de rétention:
Il définit la position relative de 2 pics, le pic du soluté "a" sortant avant le pic du soluté" "b:
Il est égal à: α=t'R(b)/t'R(a) = ωb/ωa

Il faut pour que les pics soit séparé une valeur de α différente de 1. Cependant une séparation
correcte nécessite un retour à la ligne de base du composé "a" avant l'apparition du second pic. Ce
coefficient à lui seul ne garantit pas une bonne résolution.
 Facteur de résolution de la colonne:
Il définit la plus ou moins bonne séparation de 2 solutés:
R= 2(tR(a)-tR(b))/(ωa+ ωb)
La relation peut également s'écrire:

Pour des valeurs de R supérieures à 1,5 les pics sont correctement séparés.
Pour une valeur comprise en 0,6 et 1,5, les pics sont séparés mais sans retour à la ligne de base
entre les pics.

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