Université Sultan Moulay Slimane

Faculté Polydisciplinaire

Béni Mellal, Maroc

TD1: BIOLOGIE CELLULAIRE

TECHNIQUES D’ANALYSES MICROSCOPIQUE

Pr: Majdouline BELAQZIZ

Année Universitaire: 2020/2021

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 PLAN
 INTRODUCTION

LE MICROSCOPE OPTIQUE OU PHOTONIQUE

LES DIFFERENTS TYPES DU MICROSCOPE OPTIQUE

TECHNIQUES DE PREPARATION DES ECHANTILLONS POUR
MICROSCOPIE OPTIQUE
LE MICROSCOPE ELECTRONIQUE
TECHNIQUE DE PREPARATION DES ECHANTILLONS POUR
MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
COMPARAISON ENTRE MICROSCOPE OPTIQUE ET
MICROSCOPE ELECTRONIQUE
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INTRODUCTION
La cellule: unité structurale et fonctionnelle de tout être vivant,
son étude commence par l’observation
Est-ce qu’on peut observer des cellules animales ou végétales
avec nos yeux?
L’œil humain a un pouvoir séparateur < 0,2 mm, peut voir des
objets de taille suffisamment grande
Le pouvoir séparateur : la plus petite distance séparant 2 points
qu’on peut observer distinctement
La taille des cellules varie entre 10 et 50 micromètres
Il faut donc utiliser un appareil avec un pouvoir séparateur plus
petit, grossit l’image de l’objet observé

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INTRODUCTION

Moyens d’étude des cellules

Le microscope optique Le microscope électronique

ou photonique

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LE MICROSCOPE OPTIQUE

C’est quoi un Microscope Optique?

Son pouvoir séparateur est de l’ordre de 0,2 micromètres

Informations sur la morphologie
(taille, forme, constituants de la cellule)

Structure de la cellule

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LE MICROSCOPE OPTIQUE
Microscope optique
Microscope de actuel 40x, 100x, 400 x
Robert Hooke (1665) x30 1000 x

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DESCRIPTION DU MICROSCOPE OPTIQUE

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OBJECTIF DU MICROSCOPE OPTIQUE
 C ’est une lentille de courte focale (quelques mm);
 Le grandissement de l ’objectif est noté G1;
 Un dispositif de rotation permet de changer l ’objectif.

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OCULAIRE DU MICROSCOPE OPTIQUE

C ’est une lentille de plus grande focale (quelques cm);

 Il sert de loupe en grossissant l’image intermédiaire
donnée par l ’objectif;
Le grossissement de l ’objectif est noté G2.

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Les Différents Types Du Microscope
Optique

Le Microscope à fond Clair

 Le Microscope à fond Noir

 Le Microscope à Contraste de Phase

 Le Microscope à Fluorescence

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LE MICROSCOPE A FOND CLAIR
 C’est le plus courant et le plus ancien;
Il permet de recueillir la lumière de la source directement dans les objectifs, après
avoir été transmise par l’échantillon;
 L’ échantillon est éclairé par-dessous et observé par-dessus;
On peut améliorer l’observation en colorant les échantillons;
Visualiser des objets vivants variés (bactéries, unicellulaires…) ou fixés (coupes
histologiques…)

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LE MICROSCOPE A FOND NOIR
Utilise les rayons lumineux dans un fond noir;
 Utilisé pour les éléments trop transparents;
 Les éléments observés apparaissent très brillants (les flagelles,
les fibres );
 N'est pas utilisé pour l'observation d'objets colorés.

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LE MICROSCOPE A CONTRASTE DE PHASE
Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni
coloration dans leur milieu d'origine;
 Le principe est basé sur le fait que les structures biologiques sont
transparentes (n’absorbe pas la lumière transmise).

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LE MICROSCOPE A FLUORESCENCE
Cette technique est utilisée pour certaines molécules qui émettent de la
lumière quand on les éclaire avec une lumière de longueur d'onde supérieure.
 On éclaire l'échantillon avec une lumière ultraviolette, violette ou bleue.

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Une mitose est observée au microscope à fluorescence
Méthode de Préparation de L’échantillon:
Observation Vitale

Observation de cellules vivantes (ex : organismes

unicellulaires, Cellules sanguines…)
Montage dans un liquide physiologique ou un
colorant vital

IMPORTANT POUR LA PREMIÈRE SÉANCE DE TP

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Préparation des lames et observation

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Préparation Des Lames et Observation

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Préparation Des Lames et Observation

Coloration au bleu de Méthylène

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Préparation Des Lames et Observation
Coloration par l’eau Iodée (Lugol)

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Préparation Des Lames et Observation

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Méthode de Préparation de L’échantillon:
Observation non vitale

L’observation est faite sur des cellules fixées et colorées.

Plusieurs étapes de préparation:

FIXATION
DESHYDRATATION INCLUSION
COUPE
COLORATION

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 Le pouvoir séparateur du Microscope
Optique limité par la longueur d’onde,
il ne peut atteindre des grossissements
suffisamment élevés pour permettre
l’observation de la structure fine de la
cellule (organites) ultrastructure

MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
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LE MICROSCOPE ELECTRONIQUE

Il utilise la déviation des électrons pour agrandir les

images Les électrons : particules chargées (-),
longueur d’onde associée à leur vitesse
Plus ils sont accélérés à l’aide de champs
magnétiques plus leur longueur d’onde associée est
petite
Ce microscope a un pouvoir séparateur très petit
(0.5 nm)
2 types de microscopes électroniques:
•Microscope électronique à TRANSMISSION
•Microscope électronique à BALAYAGE
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LE MICROSCOPE ELECTRONIQUE

Microscope électronique à transmission x 200 000

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LE MICROSCOPE ELECTRONIQUE

Les échantillons biologiques nécessitent une

préparation particulière avant l’observation au M.E.
En effet, l’utilisation des électrons présente un
certain nombre d’inconvénients qu’il faut éviter
au cours de cette préparation.
Les cellules étant exposées à un vide très puissant,
aucune observation vitale n’est possible

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Prélèvement de l’organe à observer: l’intestin de souris

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

L’intestin prélevé est placé immédiatement dans un

fixateur qui le Glutaraldéhyde
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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Une étape supplémentaire de post-fixation au tétroxyde

d’osmium est nécessaire afin de fixer les lipides
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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les échantillons sont ensuite déshydratés dans des bains

successives d’alcool de plus en plus concentré de 30%
jusqu’à 100% d’alcool afin d’éliminer toute trace d’eau. 29
Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les échantillons sont placés dans un bain de substitution

composé d’alcool et de résine. 30
Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les échantillons sont longuement imprégnés dans la résine seul.

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Enfin les échantillons sont placés dans des moules que l’on
remplit de résine pur contenant un agent polymérisant.
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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Une étiquette portant la date et la nature de l’échantillon est

placée dans le moule puis la bandelette de tissu est orientée.
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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les inclusions sont inclus à 37°C puis à 60°C pendant plusieurs

jours pour permettre la polymérisation de la résine.
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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Réalisation de coupes semifines.

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Dans un premier temps des coupes semi fines sont réalisées à l’aide d’un
couteau de vert sur lequel une petite cuvette est scellée. La cuvette est remplie
d’eau distillé et le couteau est lentement approché de l’échantillon afin de
réaliser les premières coupes qui flotteront à la surface de l’eau. 36
Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les coupes sont récupérées sur des lames de verre

colorées et observées au microscope photonique.
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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Si la qualité et l’orientation du tissu sont satisfaisante des

coupes ultrafines sont réalisées au couteau de diamant.

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Récupération des coupes

sur des grilles métallique.

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)
FIXATION glutaraldéhyde, qui crée des liaisons entre les
protéines, et le tétroxyde d’osmium, qui consolide les
lipides : Résistance des structures cellulaires aux
bombardements des électrons et au réchauffement
électrostatique
DESHYDRATATION bains successifs d’alcool
INCLUSION structures cellulaires durcies (résines
synthétiques transparentes aux électrons qui
polymérisent pour former un bloc solide (solubles dans
l’alcool)
COUPE coupes ultrafines ayant une épaisseur inférieure
à 0,1 µm pour que les électrons puissent traverser l’objet
COLORATION (CONTRASTE) exposition à des sels
de métaux lourds (plomb, osmium, uranium...), ultra-
microtome à lame en verre ou en diamant 40
Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les échantillons sont enfin prêts à être observer au MET.

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)
Microscope électronique à transmission Les électrons traversent l’objet.
Principe
Microscope optique / microscope électronique
Photons / électrons (canon à électrons)
Électrons accélérés puis focalisés par un champ magnétique sur l’objet à
observer (bobine électromagnétique)
Image de l’objet obtenue après passage par un deuxième champ magnétique.
Image agrandie, renvoyée sur un écran fluorescent (bobine projecteur) ou une
plaque photographique (observation indirecte).
L’appareil est placé sous vide pour permettre un déplacement linéaire
des électrons.
On peut contrôler différentes images d’un objet sur l’écran et les comparer.
On définit ainsi la notion de grandissement :
g = taille de l’image obtenue
taille réelle de l’objet
Les valeurs de grandissements peuvent varier de 10000x à 200000x.

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

Les électrons traversent les objets de la même façon;

l’image observée est alors transparente.
Les métaux lourds permettent de créer un contraste en
arrêtant le passage des électrons par endroits

Les endroits où se sont fixés les métaux lourds

apparaissent sombres, les autres restent plus ou moins
clairs créant des nuances en noir, gris et blanc.
Les lipides, par exemple, ont tendance à se colorer en
sombre, révélant la localisation des membranes cellulaires

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Le Microscope Electronique: Etapes de préparation de
l’Objet (Technique Classique – Coupes Ultrafines)

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Le Microscope Electronique: CRYODECAPAGE (cryofracture)

Cette technique ne nécessite ni fixation ni inclusion des

échantillons à observer.
Elle permet d’étudier les surfaces externes réelles des
cellules et de leurs membranes

CONGELATION azote liquide (-196° C)

FRACTURE plan de fracture au milieu des couches

lipidiques des membranes cellulaires, sublimation de la glace
DECAPAGE révélation des formes des structures
OMBRAGE
REPLIQUE évaporation de platine et de carbone (copie des
formes
OBSERVATION au ME de la réplique
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Le Microscope Electronique: CRYODECAPAGE (cryofracture)

Cryofracture- Cryodécapage
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Le Microscope Electronique: CRYODECAPAGE (cryofracture)

OMBRAGE

REPLIQUE

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Le Microscope Electronique: CRYODECAPAGE (cryofracture)

Photographie montrant une portion de racine de pois

observée à l’aide de la technique de cryodécapage.
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Le Microscope Electronique: CRYODECAPAGE (cryofracture)

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Le Microscope Electronique: Préparation des Petits Objets

Les virus ou certains organites cellulaires isolés ne

peuvent subir l’une des techniques précédemment
décrites à cause de leur petite taille.
Ils sont donc fixés et déshydratés, mis sur un film fin organique
(transparent aux électrons) et subissent l’une des techniques
suivantes:
•Coloration négative
•Ombrage.

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Le Microscope Electronique: Préparation des Petits Objets

• La coloration négative
Les objets sont plongés dans une solution de métaux lourds; l’eau de la solution
s’évapore, et les forces de capillarité entraînent les sels métalliques autour des objets.
Après dessiccation complète, l’observation au M.E montre les
objets en clair sur fond noir 51
Le Microscope Electronique: Préparation des Petits Objets

• L’ombrage :
Les objets reçoivent sous vide une vaporisation oblique de métal
et de ce fait, ce dernier est plus épais en certains endroits qu’en
d’autres.
Un effet d’ombre est ainsi créé faisant paraître l’image
tridimensionnelle. 52
Le MICROSCOPE ELECTRONIQUE A BALAYAGE

L’échantillon fixé et déshydraté puis

recouvert d’une fine couche de métal lourd
vaporisé sous vide sur sa surface et balayé par
un faisceau d’électrons.
L’image obtenue est constituée de points brillants
et de zones d’ombre qui lui donnent un aspect
tridimensionnel
Ce M.E possède un éventail de
grandissements très étendus mais ne donne
que des renseignements morphologiques.

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COMPARAISON ENTRE MICROSCOPE OPTIQUE ET
ELECTRONIQUE

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COMPARAISON ENTRE MICROSCOPE OPTIQUE ET
ELECTRONIQUE

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COMPARAISON ENTRE MICROSCOPE OPTIQUE ET
ELECTRONIQUE

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DES QUESTIONS?

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