Microbiologie Methode Officiel

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE
__________________
MINISTÈRE DU COMMERCE
DIRECTION GÉNÉRALE DU CONTRÔLE

ÉCONOMIQUE ET DE LA RÉPRESSION
DES FRAUDES
Direction des Laboratoires d’Essais

et d’Analyses de la Qualité
MÉTHODES OFFICIELLES D'ANALYSES

RELATIVES À LA MICROBIOLOGIE DES ALIMENTS
(MÉTHODES HORIZONTALES)
Sommaire
1. Arrêté du 29 juillet 2012 rendant obligatoire la méthode horizontale pour le

dénombrement des bactéries sulfito-réductrices se développant en conditions 01
anaérobies. (JO n° 51- 2013)
2. Arrêté du 28 mai 2014 rendant obligatoire la méthode de préparation des

échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen 04
microbiologique. (JO n° 38- 2014)
3. Arrêté du 21 mai 2014 rendant obligatoire la méthode de dénombrement des

staphylocoques à coagulase positive (staphylococcus aureus et autres espèces). 07
(JO n° 68- 2014)
4. Arrêté du 31 juillet 2014 rendant obligatoire la méthode utilisant le milieu gélosé au

plasma de lapin et au fibrinogène pour le dénombrement des staphylocoques à 13
coagulase positive. (JO n° 68- 2014)
5. Arrêté du 2 juin 2015 rendant obligatoire une méthode horizontale pour le

dénombrement des levures et moisissures par cmptage des colonies dans les 17
produits, dont l'activité d'eau est supérieure à 0,95. (JO n° 48- 2015)
6. Arrêté du 2 juin 2015 rendant obligatoire une méthode horizontale pour le

dénombrement des levures et moisissures par cmptage des colonies dans les 22
produits, dont l'activité d'eau est inférieure ou égale à 0,95. (JO n° 52- 2015)
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13 octobre 2013 19
— échantillons d'environnement dans le domaine de la

MINISTERE DU COMMERCE production et de la distribution des aliments.
Arrêté du 10 Ramadhan 1433 correspondant au 29 1. DÉFINITION

juillet 2012 rendant obligatoire la méthode Pour les besoins de la présente méthode, la définition
horizontale pour le dénombrement des bactéries
sulfito-réductrices se développant en conditions suivante s'applique.
anaérobies. 1.1 Bactéries sulfito-réductrices se développant en
———— conditions anaérobies
Le ministre du commerce,
Bactéries formant des colonies dénombrables typiques
Vu le décret présidentiel n° 10-149 du 14 Joumada dans les conditions spécifiées dans la présente méthode.
Ethania 1431 correspondant au 28 mai 2010 portant
nomination des membres du Gouvernement ; 2. PRINCIPE
Vu le décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, 2.1 Ensemencement dans la masse de deux boîtes de
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la Pétri (ou de deux tubes) de milieu au sulfite de fer avec
répression des fraudes ; une quantité spécifiée de l'échantillon pour essai si le
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423 produit initial est liquide, ou avec une quantité spécifiée
correspondant au 21 décembre 2002 fixant les attributions de suspension mère dans le cas d'autres produits.
du ministre du commerce ;
Préparation de deux autres boîtes (ou tubes) de gélose,
Vu le décret exécutif n° 05 - 465 du 4 Dhou EL Kaada dans les mêmes conditions, avec des dilutions décimales
1426 correspondant au 6 décembre 2005 relatif à
l'évaluation de la conformité ; de l'échantillon pour essai ou de la suspension mère.
Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet 2.2 Incubation en anaérobiose des boîtes (ou tubes)
1994, modifié et complété, relatif aux spécifications à 37 °C ± 1 °C pendant 24 h à 48 h ( lecture finale au bout
microbiologiques de certaines denrées alimentaires ; de 48 h ), éventuellement à 50 °C si l'on suspecte la
Arrête : présence des bactéries thermophiles. Dénombrement de
colonies caractéristiques de couleur noire. La couleur
Article ler. — En application des dispositions de noire des colonies et des alentours est due à la formation
l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, du sulfure de fer (II) résultant de la réaction entre les ions
modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a pour objet
sulfurés et les ions trivalents ferriques [ Fe (III) ] présents
de rendre obligatoire la méthode horizontale pour le
dénombrement des bactéries sulfito-réductrices se dans le milieu.
développant en conditions anaérobies. 2.3 Calcul du nombre de bactéries sulfito-réductrices
Art. 2. — Pour le dénombrement des bactéries par millilitre ou par gramme d'échantillon, à partir du
sulfito-réductrices se développant en conditions nombre de colonies obtenues sur les boites (ou tubes).
anaérobies, les laboratoires du contrôle de la qualité et de 3. MILIEU DE CULTURE ET DILUANT
la répression des fraudes et les laboratoires agréés à cet
effet doivent employer la méthode jointe en annexe du 3.1 Gélose pour le dénombrement : gélose au sulfite
présent arrêté. de fer.
Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire 3.1.1 Composition
lorsqu'une expertise est ordonnée.
Art. 3. — Le présent arrêté sera publié au Journal
Digestat enzymatique de caséine 15 g
officiel de la République algérienne démocratique et
populaire. Digestat enzymatique de soja 5g
Fait à Alger, le 10 Ramadhan 1433 correspondant au 29
juillet 2012. Extrait de levure 5g
Mustapha BENBADA.
———————— Disulfite de sodium (Na2S2O5) 1g
ANNEXE Citrate de fer (III) ammoniacal 1g

METHODE HORIZONTALE POUR LE Agar-agar 9 g à 18 ga
DENOMBREMENT DES BACTERIES
SULFITO-REDUCTRICES SE DEVELOPPANT EN Eau 1000 ml
CONDITIONS ANAEROBIES a Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.
La présente méthode spécifie une méthode horizontale
pour le dénombrement des bactéries sulfito-réductrices se 3.1.2 Préparation
développant en conditions anaérobies. Elle est applicable
aux : Dissoudre les ingrédients dans l'eau en chauffant. Si
— produits destinés à l'alimentation humaine et nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il
animale ; soit de 7,6 ± 0,2 à 25 °C.
01
JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 51 8 Dhou El Hidja 1434
20 13 octobre 2013
Verser des portions de 250 ml de milieu dans des Répéter la procédure décrite avec les dilutions
flacons de 500 ml. suivantes, en utilisant une nouvelle pipette stérile pour
chaque dilution.
Si le dénombrement est effectué à l'aide de tubes (4.5),
verser 20 ml à 25 ml de milieu dans les tubes. Stériliser à Ajouter dans chacune des boîtes de Petri environ 15 ml
l'autoclave pendant 15 min à 121°C. de gélose au sulfite de fer (3.1) refroidi à l'aide d'un bain
d'eau (4.2) à une température comprise entre 44°C et
Désaérer le milieu juste avant son utilisation. 47°C. Il convient que le temps écoulé entre
3.2 Diluant peptone - sel l'ensemencement des boîtes de Petri et l'addition du milieu
gélosé n'excède pas 15 min. Bien mélanger l'inoculum
4. APPARIELLAGE ET VERRERIE avec le milieu gélosé à l'aide de mouvements horizontaux,
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en puis laisser le milieu se solidifier.
particulier ce qui suit : Après solidification du milieu, verser dans la boîte 5 ml
4.1 Matériel d'homogénéisation, pour les échantillons à 10 ml du même milieu, de manière à recouvrir la couche
d'aliments solides. précédente.
4.2 Bain d'eau, pouvant être maintenu à une Dans le cas où des tubes sont utilisés, inoculer 1 ml de
température comprise entre 44 °C et 47 °C. chacune des dilutions dans chacun de deux tubes
contenant le milieu gélosé, conservés à une température
4.3 Jarres pour anaérobiose, dotés d'un équipement comprise entre 44 °C et 47 °C. Mélanger délicatement en
permettant de générer une atmosphère anaérobie, et évitant la formation de bulles d'air, puis laisser le milieu
comprenant un système de vérification des conditions se solidifier à l'aide d'un bain d'eau (4.2).
anaérobies.
Après solidification du milieu, verser dans chaque tube
4.4 Incubateur, pouvant être maintenu à 37 °C ± 1 °C 2 ml à 3 ml du même milieu, de manière à recouvrir la
et, si nécessaire, à 50 °C ± 1°C. couche précédente.
4.5 tubes à essais, de dimensions 16 mm x 160 mm, et 6.4 Incubation
fioles ou flacons de 500 ml de capacité. Après solidification, incuber les boîtes de Petri dans des
5. ECHANTILLONNAGE jarres pour anaérobiose (4.3) à 37°C ± 10°C pendant
24 h à 48 h.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon
vraiment représentatif, non endommagé ni modifié lors du Si l'on suspecte la présence de bactéries thermophiles,
transport et de l'entreposage. préparer une deuxième série de boîtes de Pétri (voir 6.3).
Incuber ces boîtes à 50 °C ± 1 °C.
6. MODE OPERATOIRE POUR LA
PREPARATION DE L'ECHANTILLON POUR Si des tubes sont utilisés, l'incubation dans des jarres
ESSAI pour anaérobiose n'est pas nécessaire.
6.1 Généralités 6.5 Comptage des colonies
Une représentation schématique du mode opératoire est Lire les résultats après 24 h et après 48 h, selon le degré
donnée au tableau ci-dessous. de coloration noire et le taux de croissance des
micro-organismes. Les colonies noires, éventuellement
6.2 Prise d'essai, suspension mère et dilutions entourées d'une zone noire, sont dénombrées comme des
Il peut être nécessaire d'effectuer un traitement bactéries sufito-réductrices.
thermique de la suspension mère pour éliminer les formes Note 1 — Il peut se produire un noircissement diffus et
végétatives de bactéries formant des spores et/ou les non spécifique du milieu, surtout lorsque l'inoculation est
bactéries non sporulées. Les températures et les temps de effectuée dans des tubes de gélose au lieu de boîtes de
chauffage varient selon les besoins, allant de Pétri. La croissance des bactéries anaérobies, qui
combinaisons produisant un effet de pasteurisation produisent seulement de l'hydrogène (pas de H2S), peut
marqué à un effet d'activation des spores par la chaleur également réduire le sulfite présent et provoquer un
(par exemple 75 °C pendant 20 min) à une ébullition de noircissement général du milieu.
plusieurs minutes. Dans ce cas, le résultat peut être donné
en nombre de spores de bactéries sulfito-réductrices se Dénombrer les colonies sulfito-réductrices dans chaque
développant en conditions anaérobies. boite contenant moins de 150 colonies caractéristiques et
moins de 300 colonies au total.
6.3 Ensemencement
Il est possible que les nombres spécifiés ci -dessus
Prendre deux boîtes de Petri stériles. A l'aide d'une soient trop élevés pour les tubes; dans ce cas ne tenir
pipette stérile, transférer dans chaque boîte 1 ml compte que des tubes dans lesquels les colonies sont bien
d'échantillon pour essai si le produit à tester est liquide, ou séparées.
1 ml de suspension mère pour les autres produits.
Note 2 — La présente méthode se prête également au
Prendre deux autres boîtes de Petri stériles. A l'aide dénombrement des seules Clostridia. Dans ce cas, après
d'une nouvelle pipette stérile, transférer 1 ml de la avoir obtenu des colonies caractéristiques, prélever cinq
première dilution décimale (10-1) de l'échantillon pour d'entre elles dans chaque boite utilisée, puis confirmer le
essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la deuxième genre Clostridium au moyen d'essais de confirmation (par
dilution décimale (10-2) de la suspension mère pour les exemple essais portant sur le pouvoir respiratoire, sur la
autres produits. formation de spores).
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8 Dhou El Hidja 1434 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 51
13 octobre 2013 21
Tableau
représentation schématique du mode opératoire
1 x g prise d'essai + 9 x g diluant
Traitement thermique pour éliminer

Suspension mère les bactéries végétatives ( voir 6.2 )
afin d'obtenir le résultat en nombre
de spores de bactéries ou en
nombre de spores de Clostridia
Dilution (voir 6.2) thermophiles ( voir Note 2 en 6.5 )
En cas de suspicion de bactéries Gélose au sulfite de fer (3.1).

thermophiles (voir 6.4) Incubation à 37 °C ± 1 °C Pendant
24 h à 48 h (voir 6.4)
Gélose au sulfite de fer (3.1).

Incubation à 50 °C ± 1 °C Pendant Interprétation des résultats :
24 h à 48 h (voir 6.4) Résultat donnant le nombre de
bactéries sulfito-réductrices se
développant en conditions
anaérobies.
Interprétation des résultats :
Résultat donnant le nombre de
bactéries sulfito-réductrices se
développant en conditions Essais de confirmation (voir Note 2
anaérobies. en 6.5) portant sur :
— le pouvoir respiratoire
— la formation de spores
Essais de confirmation (voir Note 2 Résultat donnant le nombre de
en 6.5) portant sur : Clostridia.
— le pouvoir respiratoire
— la formation de spores
Résultat donnant le nombre de
Clostridia thermophiles.
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24 Chaâbane 1435
12 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 38 22 juin 2014
Arrêté du 28 Rajab 1435 correspondant au 28 mai I. TERMES ET DEFINITIONS

2014 rendant obligatoire la méthode de
préparation des échantillons, de la suspension Pour les besoins de la présente méthode les termes et les
mère et des dilutions décimales en vue de définitions suivantes s'appliquent :
l'examen microbiologique.
———— 1.1 suspension mère (première dilution)
Le ministre du commerce, Suspension, solution ou émulsion obtenue après qu'une
quantité pesée ou mesurée du produit à analyser (ou de
Vu le décret présidentiel n° 14-154 du 5 Rajab 1435 l'échantillon pour essai préparé à partir de ce produit) a été
correspondant au 5 mai 2014 portant nomination des mélangée avec une quantité neuf fois égale de diluant, en
membres du Gouvernement ; laissant se déposer les particules grossières, s'il y en
Vu le décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, existe. (3 et les notes 1 et 2 en 6.1)
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la
répression des fraudes ; 1.2 Dilutions décimales suivantes
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423 Suspensions ou solutions obtenues en mélangeant un
correspondant au 21 décembre 2002 fixant les attributions volume mesuré de la suspension mère (1.1) avec un
du ministre du commerce ; volume neuf fois égal de diluant et en répétant cette
Vu le décret exécutif n° 05- 465 du 4 Dhou EL Kaada opération sur les dilutions suivantes, jusqu'à obtention
1426 correspondant au 6 décembre 2005 relatif à d'une gamme de dilutions décimales appropriée pour
l'évaluation de la conformité ; l'inoculation des milieux de culture.
Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet 2. PRINCIPE

1994, modifié et complété, relatif aux spécifications
microbiologiques de certaines denrées alimentaires ; Préparation de la suspension mère (1.1), de façon à
obtenir une répartition aussi uniforme que possible des
Arrête : micro-organismes contenus dans la prise s'essai.
Article 1er. — En application des dispositions de Préparation, si nécessaire, de dilutions décimales (1.2)
l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, en vue de réduire le nombre de microorganismes par unité
modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a pour objet de volume pour permettre, après incubation, d'observer
de rendre obligatoire une méthode de préparation des leur éventuel développement (cas des tubes) ou d'effectuer
échantillons, de la suspension mère et des dilutions le dénombrement des colonies (cas des boîtes), comme
décimales en vue de l'examen microbiologique. précisé dans chaque méthode spécifique.
Art. 2. — Pour la préparation des échantillons, de la NOTE - Pour restreindre le domaine de dénombrement
suspension mère et des dilutions décimales en vue de à un intervalle donné ou si des nombres élevés de
l'examen microbiologique, les laboratoires du contrôle de micro-organismes sont attendus, il est possible
la qualité et de la répression des fraudes et les laboratoires d'ensemencer uniquement les dilutions décimales
agréés à cet effet, doivent employer la méthode jointe en nécessaires (deux dilutions successives au minimum).
annexe.
3. DILUANTS
Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire
lorsqu'une expertise est ordonnée. 3.1 Composants de base
Art. 3. — Le présent arrêté sera publié au Journal Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est
officiel de la République algérienne démocratique et recommandé d'utiliser, pour la préparation du diluant, des
populaire. composants de base déshydratés ou une préparation
complète déshydratée. les instructions du fabricant
Fait à Alge, le 28 Rajab 1435 correspondant au 28 mai doivent être suivies scrupuleusement.
2014.
Amara BENYOUNES. Les produits chimiques doivent être de qualité
———————— analytique reconnue et appropriée pour l'analyse
microbiologique.
ANNEXE
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de qualité
METHODE DE PREPARATION équivalente.
DES ECHANTILLONS, DE LA SUSPENSION
MERE ET DES DILUTIONS DECIMALES EN VUE 3.2 Diluants d'emploi général
DE L'EXAMEN MICROBIOLOGIQUE 3.2.1 Solution de peptone - sel
La présente méthode définit les règles générales pour la 3.2.1.1 Composition
préparation de la suspension mère et des dilutions Digestat enzymatique de caséine ............................... 1 g
décimales réalisées en aérobiose, en vue des examens
microbiologiques des produits destinés à la consommation Chlorure de sodium ( NaCl) ................................... 8,5 g
humaines ou à l'alimentation animale. Eau .................................................................... 1000 ml
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24 Chaâbane 1435
22 juin 2014 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 38 13
3.2.1.2 Préparation 4.6 Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml et

10 ml de capacité nominale, graduées respectivement en
Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si 0,1 ml et 0,5 ml.
nécessaire.
4.7 pH - mètre, ayant une précision de lecture de ± 0,1
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après unité pH à 25 °C, permettant de réaliser des mesures
stérilisation il soit de 7 ± 0,2 à 25 °C. précises à ± 0,1 unité pH.
3.2.2 Eau peptonée tamponnée 4.8 Balance, capable de peser à 0,01 g près.
3.2.2.1 Composition
5. ECHANTILLONNAGE
Digestat enzymatique de tissus animaux ................. 10 g L'échantillonnage se fait dans des conditions
Chlorure de sodium ( NaCl) ...................................... 5 g appropriées.
Hydrogénophosphate disodique dodécahydraté (Na2 6. MODE OPERATOIRE
HPO4, 12 H2O) ............................................................ 9 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) .. 1,5 g 6.1 prise d'essai et suspension mère (Première
dilution)
Eau .................................................................... 1000 ml
Dans un bol ou dans un sac en plastique stériles, peser,
3.2.2.2 Préparation avec une incertitude de mesure de ± 5 %, une masse m
(g), ou mesurer, avec une incertitude de mesure de ± 5 %,
Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si un volume v (ml) (au minimum 10 g ou 10 ml, sauf
nécessaire. spécification contraire) représentatifs de l'échantillon pour
essai.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après Ajouter une quantité de diluant égale à 9 x m (g) ou 9 x
stérilisation il soit de 7 ± 0,2 à 25 °C. v (ml). Cette quantité peut être mesurée de préférence en
masse, avec une incertitude de mesure de ± 5%, ou en
3.3 Répartition et stérilisation du diluant volume, avec une incertitude de mesure de ± 5 %.
Répartir le diluant (3.2) en volumes nécessaires à la Note 1 : Il peut être nécessaire dans certains cas,
préparation des suspensions mères dans des fioles (4.4) de notamment pour les produits donnant une suspension
capacité appropriée. mère 1 + 9 trop visqueuse ou trop épaisse, d'ajouter
davantage de diluant. 11 convient alors d'en tenir compte
Répartir le diluant (3.2) en volumes nécessaires à la dans la suite des opérations et / ou dans l'expression des
préparation des dilutions décimales dans des tubes à essai résultats.
(4.5) ou fioles (4.4) en quantité telle qu'après stérilisation, Note 2 : Cette première dilution conditionne en partie la
chaque tube ou fiole contienne 9 ml. L'incertitude de valeur de la limite inférieure de dénombrement, qui
mesure de ce volume final, après stérilisation, ne doit pas dépend également de la technique utilisée (par exemple
excéder ± 2 % ensemencement dans la masse avec un inoculum de 1 ml
dans une suspension 1/10, pour laquelle cette limite est de
Note : S'il est prévu de dénombrer plusieurs groupes de
10 micro-organismes par gramme). S'il est nécessaire,
micro-organismes au moyen de milieux de culture
pour certains dénombrements dans certains produits, de
différents, il peut être nécessaire de répartir tous les
descendre en dessous de cette limite, il est possible
diluants (ou quelques-uns seulement) en quantités
d'utiliser un volume inférieur de diluant. I1 convient de
supérieures à 9 ml, la dimension des fioles (4.4) et des
noter que l'ensemencement de cette suspension, mère peut
tubes à essai (4.5) étant prévue en conséquence.
éventuellement entrainer des difficultés liées au
Boucher les tubes ou les fioles. déséquilibre du rapport inoculum / milieu (inhibition de la
croissance microbienne par concentration accrue des
Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 min. composants de l'aliment).
Pour éviter d'endommager les micro-organismes par de
4 - APPAREILLAGE ET VERRERIE brusques changements de température, la température du
diluant pendant les opérations décrites ci-après, doit être
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en proche de la température ambiante, sauf produits
particulier, ce qui suit. particuliers.
4.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche Homogénéiser le mélange.
(four) et en chaleur humide (autoclave). Si nécessaire , laisser les grosses particules se déposer
4.2 Appareillage pour homogénéisation. durant 15 min au maximum. Les systèmes de filtration
donnant des résultats équivalents peuvent être utilisés.
4.3 Agitateur mécanique.
Dans le cas du dénombrement des spores, un
4.4 Fioles, de capacités appropriées. chauffage de la suspension mère (par exemple pendant 10
min à 80°C) doit être pratiqué immédiatement après sa
4.5 Tubes à essai, de capacités appropriées préparation, suivi d'un refroidissement rapide.
05
24 Chaâbane 1435
14 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 38 22 juin 2014
6.2 Dilutions décimales suivantes
Transvaser, à l'aide d'une pipette stérile (4.6) et avec

une incertitude de mesure de ± 5%, 1 ml de la suspension
mère dans un tube contenant 9 ml de diluant à la
température appropriée.
Note : Si un plus grand volume est nécessaire, il est

possible d'ajouter un volume déterminé de suspension
mère (plus 1 ml), avec une incertitude de mesure de ± 5%,
dans une fiole (4.4) contenant neuf fois le volume de
diluant stérile.
Pour une précision optimale, ne pas introduire la pipette

dans la suspension mère de plus de 1 cm.
Eviter tout contact entre la pipette (4.6) contenant

l'inoculum et le diluant stérile.
Mélanger soigneusement la prise d'essai et le diluant, en

utilisant de préférence un agitateur mécanique (4.3)
pendant 5 s à 10 s, pour obtenir la dilution 10-2.
Si nécessaire, répéter ces opérations sur la dilution 10-2

et les dilutions décimales suivantes en utilisant à chaque
dilution une nouvelle pipette stérile afin d'obtenir les
dilutions 10-3, 10-4, etc... jusqu'à obtention du nombre
approprié de micro-organismes.
6.3 Durée des opérations
Le temps qui s'écoule entre la fin de la préparation de la

suspension mère et le moment où l'inoculum entre en
contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45
min, en limitant à 30 min le temps séparant la préparation
de la suspension mère (6.1) du début de la préparation des
dilutions décimales suivantes.
Note : Si la température ambiante du laboratoire est

trop élevée, il convient de réduire ces deux durées
maximales.
06
30 Moharram 1436 17
JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 68
23 novembre 2014
MINISTERE DU COMMERCE La présente méthode spécifie une technique horizontale

pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase
Arrêté du 21 Rajab 1435 correspondant au 21 mai positive dans les produits destinés à la consommation
2014 rendant obligatoire la méthode de humaine ou à l'alimentation animale, par comptage des
dénombrement des staphylocoques à coagulase colonies obtenues sur milieu solide (milieu de
positive (staphylococcus aureus et autres espèces). Baird-Parker) après incubation en aérobiose à 35° C
———— ou 37° C.
Le ministre du commerce, 1 - Termes et définitions :

Vu le décret présidentiel n° 14-154 du 5 Rajab 1435 Pour les besoins de la présente méthode, les termes et
correspondant au 5 mai 2014 portant nomination des définitions suivants s'appliquent :
membres du Gouvernement ;
1.1 - Staphylocoques à coagulase positive,
Vu le décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990,
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la Bactéries formant des colonies caractéristiques et/ou
répression des fraudes ; non caractéristiques à la surface d'un milieu de culture
sélectif et donnant une réaction positive à la coagulase.
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423 lorsque l'essai est effectué selon la présente méthode.
correspondant au 21 décembre 2002 fixant les attributions
du ministre du commerce ; 1.2 - Dénombrement des staphylocoques à coagulase
Vu le décret exécutif n° 05-465 du 4 Dhou El Kaada positive, détermination du nombre de staphylocoques à
1426 correspondant au 6 décembre 2005 relatif à coagulase positive trouvé par millilitre ou par gramme
d'échantillon, lorsque l'essai est effectué selon la présente
l'évaluation de la conformité ;
méthode.
Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet
1994, modifié et complété relatif aux spécifications 2 - Principe :
microbiologiques de certaines denrées alimentaires ; 2.1 - Ensemencement en surface d'un milieu gélosé
sélectif coulé dans deux séries de boîtes, avec une quantité
Arrête : déterminée de l'échantillon pour essai si le produit à
examiner est liquide, ou de la suspension mère dans le cas
Article 1er. — En application des dispositions de d'autres produits.
l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, Dans les mêmes conditions, ensemencement des
modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a pour objet dilutions décimales obtenues à partir de l'échantillon pour
de rendre obligatoire une méthode de dénombrement des essai ou de la suspension mère, à raison de deux boîtes par
staphylocoques à coagulase positive. dilution.
Art. 2. — Pour le dénombrement des staphylocoques à 2.2 - Incubation de ces boîtes à 35° C ou à 37° C
coagulase positive, les laboratoires du contrôle de la (la température est indiquée dans le bulletin d'analyse) en
qualité et de la répression des fraudes et les laboratoires aérobiose et examen après 24 h et 48 h.
agréés à cet effet doivent employer la méthode jointe en
annexe du présent arrêté. 2.3 - Calcul du nombre de staphylocoques à coagulase
positive par millilitre ou par gramme d'échantillon, à partir
Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire du nombre de colonies caractéristiques et/ou non
lorsqu'une expertise est ordonnée. caractéristiques obtenues dans les boîtes retenues aux
niveaux de dilution donnant un résultat significatif, et
Art. 3. — Le présent arrêté sera publié au Journal confirmées par un résultat positif de l'essai de la
officiel de la République algérienne démocratique et coagulase.
populaire.
3 - Diluant et milieux de culture :
Fait à Alger, le 21 Rajab 1435 correspondant au
21 mai 2014. 3.1 - Diluant
Amara BENOUNES. Voir la méthode de préparation des échantillons, de la
———————— suspension mère et des dilutions décimales en vue de
ANNEXE l'examen microbiologique - Règles générales pour la
préparation de la suspension mère et des dilutions
Méthode horizontale pour le dénombrement des décimales.
staphylocoques à coagulase positive
(Staphylococcus aureus et autres espèces) 3.2 - Milieu gélosé de Baird-Parker (le milieu gélosé
est celui de Baird - Parker avec addition de
(Technique utilisant le milieu gélosé de Baird-Parker et sulfamézathine dans le cas où l'on suspecte la présence de
inclusion des données de fidélité) Proteus).
07
18 30 Moharram 1436
JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 68 23 novembre 2014
NOTE : des milieux commercialisés peuvent être 3.2.2.2 - Emulsion de jaune d'œuf (à une
utilisés. Dans ce cas. il convient de se conformer concentration d'environ 20 % ou selon les instructions du
strictement aux prescriptions du fabricant. fabricant).
3.2.1 - Milieu de base : NOTE : Si une préparation commerciale est disponible,

il convient de l'utiliser.
3.2.1.1 - Composition :
Utiliser des œufs frais de poule à coquille intacte.
Digestat pancréatique de caséine............................. 10 g Nettoyer les œufs avec une brosse à l'aide d'un détergent
Extrait de levure......................................................... 1 g liquide.
Extrait de viande........................................................ 5 g Les rincer à l'eau courante puis désinfecter les coquilles,
soit en les plongeant dans l'éthanol à 70 % (fraction
Pyruvate de sodium................................................. 10 g
volumique) pendant 30 s et les laissant sécher à l'air, soit
L-Glycine................................................................ 12 g en les pulvérisant d'alcool suivi de flambage.
Chlorure de lithium................................................... 5 g En opérant de façon aseptique, casser chaque oeuf et
Agar-agar................................................... 12 g à 22 g a) séparer le jaune du blanc par transferts répétés du jaune
d'une demi-coquille dans l'autre. Placer les jaunes dans un
Eau, pour obtenir un volume final de 1000 ml. flacon stérile (4.5) et ajouter quatre fois leur volume d'eau
a) (Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar). stérile. Mélanger vigoureusement. Chauffer le mélange
dans le bain d'eau (4.4) réglé à 47° C pendant 2 h et
3.2.1.2 - Préparation entreposer à +3° C ± 2° C pendant 18 h à 24 h pour laisser
se former un précipité. Recueillir aseptiquement le liquide
Dissoudre les composants ou le milieu complet surnageant dans un flacon récemment stérilisé pour
déshydraté dans l'eau, en portant à ébullition. l'utilisation.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après L'émulsion peut être conservée 72 h au maximum à +
stérilisation il soit de 7,2 ± 0,2 à 25° C. 3° C ± 2° C.
Répartir le milieu, par quantités de 100 ml, dans des
flacons ou fioles (4.5) de capacité appropriée. 3.2.2.3 - Solution de sulfamézathine (sulfaméthazine,
sulfadimidine) :
Stériliser le milieu à 121°C pendant 15 min.
NOTE : A être utilisée seulement dans le cas où l'on
3.2.2 - Solutions : suspecte la présence d'espèces de Proteus dans
l'échantillon pour essai.
3.2.2.1 - Solution de tellurite de potassium :
3.2.2.3.1 - Composition :
3.2.2.1.1 - Composition :
Sulfamézathine........................................................ 0,2 g
Tellurite de potassium a (K2 Te03) ........................... 1 g
Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) à 0,1
Eau...................................................................... 100 ml. mol/l........................................................................... 10 ml
Eau......................................................................... 90 ml
a : Il est recommandé de s'assurer au préalable que le
tellurite de potassium dont on dispose convient pour cet
3.2.2.3.2 - Préparation :
essai (3.2.2.1.2).
Dissoudre la sulfamézathine dans la solution
3.2.2.1.2 - Préparation : d'hydroxyde de sodium.
Dissoudre complètement le tellurite de potassium dans Compléter à 100 ml avec de l'eau.
l’eau, en chauffant le moins possible.
Stériliser par filtration sur des membranes de 0,22 µm
Il convient que la poudre soit rapidement soluble. Si un
de porosité.
composé blanc insoluble est présent dans l'eau, ne pas
retenir la poudre. La solution peut être conservée au maximum 1 mois à +
Stériliser par filtration sur des membranes de 0,22 µm 3° C ± 2° C.
de porosité.
3.2.3 - Milieu complet :
La solution peut être conservée au maximum 1 mois à
+3° C ± 2° C. 3.2.3.1 - Composition :
Eliminer la solution si un précipité blanc se forme. Milieu de base (3.2.1).......................................... 100 ml
08
30 Moharram 1436 19
23 novembre 2014
Solution de tellurite de potassium............. (3.2.2.1) 1 ml 3.4 - Plasma de lapin :

Emulsion de jaune d'œuf (3.2.2.2).......................... 5 ml Utiliser un plasma déshydraté de lapin, disponible dans
le commerce, et le réhydrater en se conformant aux
Solution de sulfamézathine (3.2.2.3) (si nécessaire)
instructions du fabricant.
............................................................................... 2,5 ml
Si l'on ne peut se procurer du plasma de lapin
déshydraté, diluer un plasma de lapin frais et stérile à 1
3.2.3.2 - Préparation :
volume pour 3 volumes d'eau stérile.
Faire fondre le milieu de base, puis le refroidir à
Si du citrate de potassium ou du citrate de sodium a été
environ 47° C au moyen du bain d'eau (4.4).
utilisé comme anticoagulant du plasma, ajouter une
Ajouter, de façon aseptique, les deux autres solutions solution d'EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique)
(3.2.2.1 et 3.2.2.2) et, si nécessaire (si l'on suspecte la de manière à avoir 0,1 % d'EDTA dans le plasma
présence d'espèces de Proteus dans l'échantillon pour réhydraté ou dilué (le plasma oxalaté ou hépariné ne
essai), la solution de sulfamézathine (3.2.2.3), chaque demande pas d'EDTA).
solution étant préalablement réchauffée au bain d'eau à A défaut d'instructions du fabricant, le plasma réhydraté
47 °C, en mélangeant soigneusement après chaque ou dilué doit être utilisé extemporanément.
addition.
Avant utilisation, contrôler chaque lot de plasma avec
3.2.4 - Préparation des boîtes de milieu gélosé : des souches de staphylocoques à coagulase positive ainsi
qu'avec des souches de staphylocoques à coagulase
Couler la quantité nécessaire du milieu complet (3.2.3), négative.
dans des boîtes de Petri stériles de façon à obtenir une
épaisseur de gélose d'environ 4 mm, et laisser se solidifier. 4 - Appareillage et verrerie :
Les boîtes peuvent être conservées, avant séchage, 24 h
au maximum à +3° C ± 2° C. NOTE : Le matériel à usage unique est acceptable au
même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
NOTE : pour la durée de conservation de boîtes spécifications soient convenables.
préparées industriellement, il convient de suivre les
instructions du fabricant. Matériel courant de laboratoire de microbiologie et en
Avant utilisation, sécher les boîtes, de préférence avec particulier, ce qui suit.
le couvercle enlevé, et avec la surface de la gélose tournée
vers le bas, dans une étuve réglée entre 25° C et 50° C, 4.1 - Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche
jusqu'à disparition des gouttelettes à la surface du milieu. (four) et en chaleur humide (autoclave).
3.3 - Bouillon cuœr-cervelle : 4.2 - Etuve, permettant de maintenir les milieux

inoculés, les boîtes et les flacons à l'intérieur d'une plage
3.3.1 - Composition : de températures de 35° C ± 1° C ou 37° C ± 1° C.
Digestat enzymatique de tissus animaux.................. 10 g
4.3 - Enceinte de séchage ou étuve, pouvant être
Extrait déshydraté de cervelle de veau.................. 12,5 g maintenue à une température entre 25° C ± 1° C et 50° C
Extrait déshydraté de coeur de bœuf.......................... 5 g ± 1° C.
Glucose....................................................................... 2 g 4.4 - Bain d'eau, ou dispositif similaire, réglable à

Chlorure de sodium.................................................... 5 g 47° C ± 2° C.
Hydrogénorthophosphate disodique anhydre 4.5 - Tubes à essai, flacons ou fioles avec des
(Na2HP04)............................................................... 2,5 g bouchons à vis, de capacités appropriées, pour la
stérilisation et la conservation des milieux de culture et
Eau..................................................................... 1000 ml l'incubation des milieux liquides ; en particulier, tubes
stériles à hémolyse, ou flacons à fond rond de dimensions
3.3.2 - Préparation : 10 mm, 75 mm, environ.
Dissoudre les composants ou le milieu complet
4.6 - Boîtes de Pétri, stériles, en verre ou en matière
déshydraté dans l'eau, en chauffant si nécessaire.
plastique.
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,4
± 0,2 à 25° C. 4.7 - Fil droit, et pipette Pasteur.
Répartir le milieu de culture, par quantités de 5 ml à 10
4.8 - Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml,
ml, dans des tubes ou fioles (4.5) de capacité appropriée.
2 ml et 10 ml de capacité nominale, graduées
Stériliser le milieu à 121° C pendant 15 min. respectivement en 0,1 ml et 0,5 ml.
09
20 30 Moharram 1436
4.9 - Étaleurs, stériles, en verre ou en matière plastique. 6.4 - Sélection des boîtes et interprétation
4.10 - pH-mètre, ayant une précision de lecture de 6.4.1 - Après 24 h ± 2 h d'incubation, marquer sur le
± 0,01 unité pH à 25° C, permettant de réaliser des fond des boîtes les positions des colonies caractéristiques
mesures précises à ± 0,1 unité pH. éventuellement présentes (note 1).
Incuber à nouveau toutes les boîtes à 35° C ou à 37° C

5 - Echantillonnage
(la température est indiquée dans le bulletin d'analyse)
L'échantillonnage et la préparation des échantillons durant 24 h ± 2 h supplémentaires, et marquer les
doivent être effectués dans des conditions appropriées. nouvelles colonies caractéristiques. Marquer également
les colonies non caractéristiques éventuellement présentes
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon (note 2).
représentatif, non endommagé ou modifié lors du
transport et de l'entreposage. Ne retenir pour le dénombrement que les boîtes
renfermant au maximum 300 colonies dont 150 colonies
6 - Mode opératoire : caractéristiques et/ou non caractéristiques au niveau de
deux dilutions successives. Il faut qu'une des boîtes
6.1 - Prise d'essai, suspension mère et dilutions renferme au moins 15 colonies.
Voir la méthode de préparation des échantillons, de la Choisir, en vue de la confirmation (6.5), un nombre
suspension mère et des dilutions décimales en vue de déterminé A (en général 5 colonies caractéristiques s'il n'y
l'examen microbiologique-Règles générales pour la a que des colonies caractéristiques, ou 5 colonies non
préparation de suspension mère et des dilutions décimales. caractéristiques s'il n'y a que des colonies non
caractéristiques, ou 5 colonies caractéristiques et 5
6.2 - Ensemencement colonies non caractéristiques si les deux types sont
présents, à partir de chaque boîte).
6.2.1 - Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (4.8), 0,1
S'il y a moins de 15 colonies caractéristiques et/ou non
ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide ou 0,1 ml de
caractéristiques sur les boîtes ensemencées avec un
suspension mère (dilution 10-1) pour les autres produits, à
produit liquide non dilué ou avec la dilution la plus faible
la surface de chacune des deux boîtes de milieu gélosé
pour les autres produits, il est possible de faire une
(3.2.4).
estimation comme décrit en (6.4.3) et en (7.2).
Répéter l'opération avec la dilution 10-2 et les dilutions
suivantes si nécessaire. NOTE 1 : Les colonies caractéristiques sont noires ou
grises, brillantes et convexes (l mm à 1,5 mm de diamètre
6.2.2 - S'il est nécessaire, pour certains produits, de après 24 h d'incubation et 1,5 mm à 2,5 mm de diamètre
procéder à l'estimation de petits nombres de après 48 h d'incubation) et sont entourées d'une auréole
staphylocoques à coagulase positive, les limites du claire qui peut être partiellement opaque. : Après, au
dénombrement peuvent être augmentées d'une puissance moins, 24 h d'incubation, un anneau opalescent peut
de 10 en ensemençant 1 ml de l'échantillon pour essai s'il apparaître dans cette zone claire immédiatement au
est liquide, ou 1 ml de la suspension mère pour les autres contact des colonies.
produits, soit à la surface d'une grande boîte (140 mm) de
milieu gélosé, soit à la surface de trois (3) petites boîtes NOTE 2 :
(90 mm) de milieu gélosé. Dans les deux cas, effectuer ces
Les colonies non caractéristiques ont la même taille que
opérations en double, de façon à avoir deux grandes boîtes
les colonies caractéristiques et peuvent présenter l'une des
ou six petites boîtes.
morphologies suivantes :
6.2.3 - Etaler soigneusement l'inoculum le plus — colonies noires et brillantes avec ou sans bord blanc
rapidement possible à la surface du milieu gélosé en étroit; la zone claire et l'anneau opalescent sont absents ou
évitant de toucher les bords de la boîte avec l'étaleur (4.9). à peine visibles ;
Laisser sécher les boîtes, avec leur couvercle en place,
pendant, environ, 15 min à la température ambiante. — colonies grises dépourvues de zone claire.
6.3 - Incubation : Les colonies non caractéristiques sont surtout formées

de souches de staphylocoques à coagulase positive
Retourner les boîtes préparées selon 6.2.3, les incuber contaminant, par exemple, les produits laitiers, les
pendant 24 h ± 2 h, puis les réincuber pendant 24 h ± 2 h crevettes et les abats. Ce sont moins souvent des souches
supplémentaires dans l'étuve (4.2) à 35° C ou à 37° C. de staphylocoques à coagulase positive qui contaminent
(la température est indiquée dans le bulletin d'analyse). les autres produits.
10
30 Moharram 1436 21
23 novembre 2014
NOTE 3 : Les autres colonies sont celles

éventuellement présentes sur les boîtes et qui n'ont pas bc bnc
l'apparence décrite dans les notes 1 et 2 pour les colonies α= x Cc + x Cnc
caractéristiques et non caractéristiques. Ces colonies sont Ac Anc
considérées comme faisant partie de la flore annexe.
Où
6.4.2 - Si 1 ml d'inoculum a été réparti sur trois boîtes
(7.2.2), effectuer les opérations de dénombrement et de Ac : Nombre de colonies caractéristiques soumises au
confirmation sur l'ensemble de ces boîtes comme s'il test de la coagulase (6.5) ;
s'agissait d'une seule boîte. Anc : Nombre de colonies non caractéristiques soumises
au test de la coagulase (6.5) ;
6.4.3 - Pour faire une estimation de petits nombres de
staphylocoques à coagulase positive, retenir toutes les bc : Nombre de colonies caractéristiques qui ont
boîtes qui contiennent des colonies caractéristiques et non répondu positivement au test de la coagulase ;
caractéristiques. Retenir toutes ces colonies en vue de la
confirmation sans sortir des limites fixées ci-dessus. bnc : Nombre de colonies non caractéristiques qui ont
répondu positivement au test de la coagulase ;
6.5 - Confirmation (recherche de la coagulase) Cc : Nombre total de colonies caractéristiques repérées
sur la boîte (6.4) ;
À l'aide d'un fil stérile (4.7), prélever une partie de
chaque colonie sélectionnée (6.4) et l'ensemencer dans un Cnc : Nombre total de colonies non caractéristiques
tube ou dans un flacon de bouillon cœur-cervelle (3.3). repérées sur la boîte (6.4) ;
Incuber à 35° C ou 37° C (la température est indiquée Arrondir α à un nombre entier.
dans le bulletin d'analyse) pendant 24 h ± 2 h.
7.1.2 - Calcul du nombre N de staphylocoques à
Ajouter aseptiquement 0,1 ml de chaque culture à 0,3 coagulase positive identifiés présents dans la prise
ml de plasma de lapin (3.4) (à moins que d'autres d'essai :
quantités soient spécifiées par le fabricant) dans des tubes
stériles à hémolyse ou flacons (spécifiés en 4.5) et incuber Pour celles des boîtes qui contiennent 300 colonies au
à 35° C ou à 37° C (la température est indiquée dans le maximum, dont 150 colonies caractéristiques et/ou non
bulletin d'analyse). caractéristiques pour deux dilutions successives, calculer
le nombre de staphylocoques à coagulase positive pour
En inclinant le tube, examiner la coagulation du plasma chaque boîte tel qu'il est indiqué en (7.1.1) et calculer le
après 4 h à 6 h d'incubation et, si le test est négatif, nombre N de staphylocoques à coagulase positive
réexaminer après 24 h d'incubation, ou examiner après les identifiés présents dans l'échantillon pour essai, en tant
temps d'incubation préconisés par le fabricant. que moyenne pondérée à partir des deux dilutions
successives à l'aide de l'équation suivante :
Considérer que la réaction à la coagulase est positive
quand le coagulum occupe plus de la moitié du volume ∑α
initialement occupé par le liquide. N=
V (n1 + 0,1 n2 ) d
A titre de contrôle négatif, ajouter, pour chaque lot de
plasma, 0,1 ml de bouillon cœur - cervelle stérile (3.3) à la
quantité recommandée de plasma de lapin (3.4) et faire Où :
incuber sans ensemencement. Pour que la réaction soit
∑α : Somme des colonies de staphylocoques à
valable, le plasma du tube témoin ne devra pas montrer de coagulase positive identifiées sur l'ensemble des boîtes
signes de coagulation. retenues ;
7 - Expression des résultats V: Volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte, en
millilitres ;
7.1 - Cas général
n1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution ;
7.1.1 - Calcul du nombre α de staphylocoques à
coagulase positive identifiés pour chaque boîte n2 : Nombre de boîtes retenues à la seconde dilution ;
retenue :
d : Taux de dilution correspondant à la première
Calculer, pour chacune des boîtes, le nombre α de dilution retenue (la suspension mère est une dilution).
staphylocoques à coagulase positive identifiés, selon Arrondir à deux chiffres significatifs les résultats
l'équation suivante : obtenus.
11
22 30 Moharram 1436
Noter le résultat comme étant le nombre de

staphylocoques à coagulase positive par millilitre (produit ∑α
liquide) ou par gramme (autre produit), exprimé par un Ne =
nombre compris entre 1 et 9,9 multiplié par 10x, où x est Vx 2 x d
la puissance appropriée de 10.
Où :
7.1.3 - Exemple : Un dénombrement d'un produit après ∑α : Somme des colonies de staphyloêoques à
ensemencement avec 0,1 ml de produit a donné les coagulase positive identifiées (7.1.1) sur les deux boîtes
résultats suivants : retenues ;
- à la première dilution retenue (10-2) : 65 colonies d : Taux de dilution de la suspension mère ;
caractéristiques et 85 colonies caractéristiques (aucune
V : Volume étalé sur chaque boîte.
colonie non caractéristique) ;
-3
- à la deuxième dilution retenue (10 ) : 3 colonies 7.2.2 - Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon
caractéristiques et 7 colonies caractéristiques (aucune pour essai (produits liquides) ou de la suspension mère
colonie non caractéristique). (autres produits), ne contiennent aucune colonie de
staphylocoques à coagulase positive et si l'ensemencement
Ont été repiquées : a été effectué avec 0,1 ml d'échantillon, exprimer le
- parmi les 65 colonies, 5 colonies dont toutes les 5 se résultat comme suit ( cas général d'un inoculum de
sont révélées être à coagulase positive ; d'où a = 65 ; 0,1 ml) :
— moins de 10 staphylocoques à coagulase positive par
- parmi les 85 colonies, 5 colonies dont 3 se sont
millilitre (produits liquides) ;
révélées être à coagulase positive ; d'où a = 51;
— moins de 10/d staphylocoques à coagulase positive
- parmi les 3 colonies, 3 colonies dont toutes les 3 se
par gramme (autres produits), où d est le taux de dilution
sont révélées être à coagulase positive ; d'où a = 3 ; de la suspension mère.
- parmi les 7 colonies, 5 colonies dont toutes les 5 se Si l'ensemencement a été effectué avec 1 ml
sont révélées être à coagulase positive ; d'où a =7. d'échantillon, exprimer le résultat comme suit :
— moins de 1 staphylocoque à coagulase positive par
65 + 51 + 3 +7 millilitre (produits liquides) ;
N= = 57272
— moins de 1/d staphylocoque à coagulase positive par
0,22 x 10-2 gramme (autres produits).
Le résultat, après arrondissement, est 5,7 x 104. 8 - Fidélité :
7.2 - Estimation de petits nombres : 8.1- Répétabilité
7.2.1 - Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon La différence absolue entre deux résultats d'essai
pour essai (produits liquides) ou de la suspension mère individuels indépendants (transformés en log 10) (nombre
(autres produits), contiennent chacune moins de 15 de staphylocoques à coagulase positive par gramme ou par
colonies identifiées, exprimer l résultat comme suit. millilitre) où le rapport, sur une échelle normale, entre le
plus élevé et le plus bas des deux résultats d'essai obtenus
a) Pour les produits liquides, nombre estimé de à l'aide de la même méthode sur un matériau identique
staphylocoques à coagulase positive par, millilitre : soumis à l'essai dans le même laboratoire , par le même
opérateur utilisant le même appareillage dans un intervalle
de temps le plus court possible, n'excédera que dans 5%
∑α des cas au plus la limite de répétabilité.
Nα=
V x2 8.2- Reproductibilité
Où : La différence absolue entre deux résultats d'essai
individuels (transformés en log10) (nombre de
∑α : Somme des colonies de staphylocoques à staphylocoques à coagulase positive par gramme ou par
millilitre), où le rapport, sur une échelle normale, entre le
coagulase positive identifiées (7.1.1) sur les deux boîtes
plus élevé et le plus bas des deux résultats d'essai obtenus
retenues ;
à l'aide de la même méthode, sur un matériau identique
V : Volume étalé sur chaque boîte. soumis à l'essai dans des laboratoires différents, par des
opérateurs différents utilisant des appareillages différents,
b) : Pour les autres produits, nombre estimé de
n'excédera que dans 5% des cas au plus la limite de
staphylocoques à coagulase positive par gramme :
reproductibilité.
12
4 Joumada Ethania 1436
14 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 14 25 mars 2015
Vu le décret exécutif n° 05-465 du 4 Dhou EL Kaada


1994, modifié et complété, relatif aux spécifications
microbiologiques de certaines denrées alimentaires ;
Arrête :
Article 1er. — En application des dispositions de

l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990,
de rendre obligatoire une méthode utilisant le milieu
gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène pour le
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive.
Art. 2. — Pour le dénombrement des staphylocoques à

coagulase positive, les laboratoires du contrôle de la
qualité et de la répression des fraudes et les laboratoires
agréés à cet effet doivent employer la méthode jointe en
annexe.


officiel de la République algérienne démocratique et
populaire.
Fait à Alger, le 4 Chaoual 1435 correspondant au 31

juillet 2014.
Amara BENYOUNES.
————————
ANNEXE
Méthode utilisant le mileu gélosé au plasma de lapin et
au fibrinogène pour le dénombrement des
MINISTERE DU COMMERCE staphylocoques à coagulase positive
La présente méthode spécifie une technique pour le

Arrêté du 4 Chaoual 1435 correspondant au 31 juillet dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
2014 rendant obligatoire la méthode utilisant le (staphylococcus aureus et autres espèces) dans les
milieu gélosé au plasma de lapin et au produits destinés à la consommation humaine ou à
fibrinogène pour le dénombrement des l'alimentation animale, par comptage des colonies
staphylocoques à coagulase positive. obtenues en milieu solide (milieu au plasma de lapin
———— et au fibrinogène) après incubation en aérobiose à 35° C
ou 37° C.
Le ministre du commerce,
Vu le décret présidentiel n° 14-154 du 5 Rajab 1435 1. TERMES ET DEFINITIONS
correspondant au 5 mai 2014 portant nomination des
Pour les besoins de la présente méthode, les termes et
définitions suivants s'appliquent.
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la 1.1 Staphylocoques à coagulase positive
répression des fraudes ;
Bactéries formant des colonies caractéristiques en
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423 milieu sélectif gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène,
correspondant au 21 décembre 2002 fixant les attributions lorsque l'essai est effectué selon la technique spécifiée
du ministre du commerce ; dans la présente méthode.
13
25 mars 2015 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 14 15
1.2 Dénombrement des staphylocoques à coagulase 3.2.2 Solutions

positive
3.2. 2.1 Solution de tellurite de potassium
Détermination du nombre de staphylocoques à Préparer la solution de tellurite de potassium comme
coagulase positive trouvé par millilitre ou par gramme indiqué dans la méthode de dénombrement des
d'échantillon, lorsque l'essai est effectué selon la staphylocoques à coagulase positive (staphylococcus
technique spécifiée dans la présente méthode. aureus et autres espèces), technique utilisant le milieu
gélosé de Baird-Parker.
2. PRINCIPE
3.2.2.2 Solution de fibrinogène bovin
2.1 Ensemencement en profondeur du milieu gélosé au
plasma de lapin et au fibrinogène, coulé dans deux boîtes 3.2.2.2.1 Composition
de Petri, avec une quantité déterminée de l'échantillon
Fibrinogène bovin............................................. 5g à 7g
pour essai si le produit est liquide ou avec une quantité
(Selon la pureté du fibrinogène bovin).
déterminée de la suspension mère dans le cas d'autres
produits. Eau stérile............................................................. l 00 ml
Dans les mêmes conditions, ensemencement des 3.2.2.2.2 Préparation

dilutions décimales obtenues à partir de l'échantillon pour En opérant aseptiquement, dissoudre le fibrinogène
essai ou de la suspension mère, à raison de deux boîtes par bovin dans l'eau, juste avant l'utilisation.
dilution.
3.2.2.3 Solution de plasma de lapin et d'inhibiteur de
2.2 Incubation de ces boîtes à 35° C ou 37° C pendant trypsine
18 h à 24 h et, si nécessaire, 24 h supplémentaires.
3.2.2.3.1 Composition
2.3 A partir du nombre de colonies caractéristiques par Plasma de lapin avec EDTA pour coagulase (plasma
boîte de Petri, calcul du nombre de staphylocoques à coagulase EDTA)...................................................... 30 ml
coagulase positive par millilitre ou par gramme
d'échantillon pour essai. Inhibiteur de trypsine............................................ 30 mg
3.2.2.3.2 Préparation
3. DILUANT ET MILIEUX DE CULTURE
En opérant aseptiquement, dissoudre les composants
3.1 Diluant
dans l'eau, juste avant l'utilisation.
Se conformer aux règles générales pour la préparation 3.2.3 Milieu complet
de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de
l'examen microbiologique. 3.2.3.1 Composition
Milieu de base (3.2.1 )........................................... 90 ml
3.2 Milieu gélosé au plasma de lapin et au
fibrinogène. Solution de tellurite de potassium (3.2. 2.1 )...... 0,25 ml
Solution de fibrinogène bovin (3.2.2.2)................ 7,5 ml
NOTE- Des milieux commercialisés conformes aux
Solution de plasma de lapin et d'inhibiteur de
spécifications de la présente méthode peuvent être utilisés.
trypsine (3.2.2.3)....................................................... 2,5 ml
Cependant, en raison de la variabilité constatée des lots de
fabrication du supplément, il est recommandé de tester,
3.2.3.2 Préparation
avant utilisation, chaque lot de solution de fibrinogène
bovin et de plasma de lapin en effectuant des contrôles Faire fondre le milieu de base, puis le laisser refroidir à
positifs et négatifs. 48° C ± 1° C dans un bain d'eau (4.3).
3.2.1 Milieu de base Ajouter de façon aseptique les trois solutions,

préalablement réchauffées à 48° C ± 1° C dans un bain
Voir la méthode de dénombrement des staphylocoques d'eau et, après chaque addition, mélanger soigneusement
à coagulase positive (staphylococcus aureus et autres par rotation, afin de minimiser la formation de mousse.
espèces) technique utilisant le milieu gélosé de
Baird-Parker, à l'exception de la répartition du milieu de Utiliser le milieu complet immédiatement après sa
base, à raison de 90 ml par flacon. préparation, afin d'éviter une précipitation du plasma.
14
16 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 14 25 mars 2015
NOTE- En cas d'utilisation d'une solution 7.2 Ensemencement et incubation

commercialisée de fibrinogène bovin et de plasma de
lapin, respecter scrupuleusement les instructions du 7.2.1 Prendre deux boîtes de Petri stériles (4.4). A l'aide
fabricant pour la préparation de cette solution et du milieu d'une pipette stérile (4.5), transférer dans chacune des
complet (notamment la température du milieu de base). boîtes 1 ml de l'échantillon pour essai si le produit est
Sinon, le milieu peut perdre complètement son activité. liquide, ou 1 ml de la suspension mère dans le cas d'autres
produits.
3.3 Préparation des boîtes de milieu gélosé
Voir la méthode horizontale pour le dénombrement des Prendre deux autres boîtes de Petri stériles, transférer
staphylocoques à coagulase positive (staphylococcus dans chacune des boîtes 1 ml de la première dilution
aureus et autres espèces), technique utilisant le milieu décimale.
gélosé de Baird-Parker.
Répéter ces opérations avec des dilutions successives, à
4. APPAREILLAGE ET VERRERIE l'aide d'une nouvelle pipette stérile pour chaque dilution
décimale.
NOTE- Le matériel à usage unique est acceptable au
même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses 7.2.2 Couler, dans chacune des deux boîtes de Petri
spécifications soient convenables. (7.2.1), le milieu complet (3.2.3) utilisé extemporanément
(ne pas le maintenir en surfusion), de façon à obtenir une
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en épaisseur d'environ 3 mm.
particulier, ce qui suit :
Mélanger soigneusement l'inoculum au milieu de
4.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche culture et laisser solidifier en posant les boîtes de Petri sur
(four) et en chaleur humide (autoclave) ; une surface fraîche et horizontale.
4.2 Etuve, permettant de maintenir les milieux inoculés,
7.2.3 Après solidification complète, retourner les boîtes
les boîtes et les flacons à l'intérieur d'une plage de
ainsi préparées et les faire incuber à l'étuve (4.2) réglée à
températures de 35° C ± 1° C ou 37° C ± 1° C.
35° C ou 37° C pendant 18 h à 24 h et, si nécessaire,
réincuber pendant 18 h à 24 h supplémentaires.
4.3 Bain d'eau, ou dispositif similaire, réglable à
48° C ± 1° C.
7.3 Comptage des colonies
4.4 Boîtes de Petri, stériles, en verre ou en matière
Après une période d'incubation (7.2.3), les
plastique.
staphylocoques forment de petites colonies noires ou
grises ou même blanches, entourées d'un halo de
4.5 Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml, 2
ml et 10 ml de capacité nominale, graduées précipitation indiquant une activité de coagulase. Des
respectivement en 0,1 ml, 0,1 ml et 0,5 ml. colonies de proteus peuvent présenter en début
d'incubation un aspect similaire à celui des colonies de
5. ECHANTILLONNAGE staphylocoques à coagulase positive. Cependant, après 24
h ou 48 h d'incubation, elles prennent un aspect de culture
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon en nappe plus ou moins brunâtre et envahissante qui
représentatif, non endommagé ou modifié lors du permet de ne pas les confondre avec les staphylocoques.
transport et de l'entreposage.
Procéder au comptage des colonies caractéristiques
6. PREPARATION DE L'ECHANTILLON POUR pour chaque boîte.
ESSAI
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la NOTE- Comme la gélose au plasma de lapin et au
méthode de préparation des échantillons, de la suspension fibrinogène est fondée sur une réaction de coagulase, il
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen n'est pas nécessaire de confirmer cette activité.
microbiologique.
8. EXPRESSION DES RESULTATS
7. MODE OPERATOIRE
8.1 Cas général
7.1 Prise d'essai, suspension mère et dilution
Retenir celles des boîtes qui contiennent 300 colonies
Voir la méthode de préparation des échantillons, de la au maximum, dont 100 colonies caractéristiques au niveau
suspension mère et des dilutions décimales en vue de de deux dilutions successives. Il faut qu'une boîte
l'examen microbiologique . renferme, au moins, 15 colonies caractéristiques.
15
25 mars 2015 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 14 17
Calculer le nombre N de staphylocoques à coagulase C

positive présents par millilitre ou par gramme de produit Ne =
en tant que moyenne pondérée à partir de deux dilutions 2
successives à l'aide de l'équation suivante :
Où :
∑C C : Somme des colonies de staphylocoques à coagulase
N= positive comptées (7.3) sur les deux boîtes retenues ;
V (n1 + 0,1 n2 ) d
b) pour les autres produits, nombre estimé de
Où : staphylocoques à coagulase positive par gramme :
∑c : Somme des colonies de staphylocoques C

caractéristiques sur l'ensemble des boîtes retenues ; Ne =
2xd
V : Volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte, en
Où :
millilitres ;
C : Somme des colonies de staphylocoques à coagulase
n1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution ; positive comptées (7.3) sur les deux boîtes retenues ;
d : Taux de dilution de la suspension mère.
n2 : Nombre de boîtes retenues à la seconde dilution ;
8.2.2 Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour
d : Taux de dilution correspondant à la première essai (produits liquides) ou de la suspension mère (autres
dilution retenue (la suspension mère est une dilution). produits), ne contiennent aucune colonie de
staphylocoques à coagulase positive, exprimer le résultat
Arrondir à deux chiffres significatifs les résultats comme suit :
obtenus.
— moins de 1 staphylocoque à coagulase positive par
millilitre (produits liquides) ;
Noter le résultat comme étant le nombre de
staphylocoques à coagulase positive par millilitre (produit — moins de 1/d staphylocoque à coagulase positive par
liquide) ou par gramme (autre produit), exprimé par un gramme (autres produits), où d est le taux de dilution de la
nombre compris entre 1 et 9,9 multiplié par 10x, où x est suspension mère.
la puissance appropriée de 10.
9. FIDELITE
EXEMPLE 9.1 Répétabilité
Un dénombrement d'un produit après ensemencement
La différence absolue entre deux résultats d'essai
avec 0,1 ml de produit a donné les résultats suivants :
individuels indépendants (nombre de staphylocoques à
— à la première dilution retenue (10-2) : 66 colonies coagulase positive par gramme ou par millilitre,
caractéristiques et 54 colonies caractéristiques ; transformés en log10) ou le rapport, sur une échelle
normale, entre le plus élevé et le plus bas des deux
— à la deuxième dilution retenue (10-3) : 4 colonies résultats d'essai obtenus à l'aide de la même méthode sur
caractéristiques et 7 colonies caractéristiques ; un matériau identique soumis à l'essai dans le même
laboratoire par le même opérateur utilisant le même
66 + 54 + 4 + 7 appareillage dans un intervalle de temps le plus court
N= = 5955 possible, n'excédera que dans 5% des cas au plus la limite
2,2 x 10-2 de répétabilité.
9.2 Reproductibilité
Le résultat, après arrondissement, est 6 x 10-3.
La différence absolue entre deux résultats d'essai
8.2 Estimation de petits nombres
individuels (nombre de staphylocoques à coagulase
positive par gramme ou par millilitre, transformés en
8.2.1 Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour log10) ou le rapport, sur une échelle normale, entre le plus
essai (produits liquides) ou de la suspension mère (autres élevé et le plus bas des deux résultats d'essai obtenus à
produits), contiennent chacune moins de 15 colonies, l'aide de la même méthode sur un matériau identique
exprimer le résultat comme suit : soumis à l'essai dans des laboratoires différents par des
opérateurs différents utilisant des appareillages différents,
a) pour les produits liquides, nombre estimé de n'excédera que dans 5% des cas au plus la limite de
staphylocoques à coagulase positive par millilitre : reproductibilité.
16
25 Dhou El Kaada 1436
9 septembre 2015 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 48 17
MINISTERE DU COMMERCE
Arrêté du 14 Chaâbane 1436 correspondant au 2 juin

2015 rendant obligatoire la méthode horizontale
pour le dénombrement des levures et moisissures
par comptage des colonies dans les produits, dont
l'activité d'eau est supérieure à 0,95.
————
Le ministre du commerce ;
Vu le décret présidentiel n° 15-125 du 25 Rajab 1436
correspondant au 14 mai 2015 portant nomination des
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la
répression des fraudes ;
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423
du ministre du commerce ;
Vu le décret exécutif n° 05-465 du 4 Dhou El Kaada
Vu le décret exécutif n° 13-328 du 20 Dhou El Kaada
1434 correspondant au 26 septembre 2013 fixant les
conditions et les modalités d'agrément des laboratoires au
titre de la protection du consommateur et de la répression
des fraudes ;
1994, modifié et complété, relatif aux spécifications micro
biologiques de certaines denrées alimentaires ;
Arrête :
Article 1er. — En application des dispositions de

dénombrement des levures et moisissures par comptage
des colonies dans les produits, dont l'activité d'eau est
supérieure à 0,95.
Art. 2. — Pour le dénombrement des levures et

moisissures par comptage des colonies dans les produits,
dont l'activité d'eau est supérieure à 0,95, les laboratoires
du contrôle de la qualité et de la répression des fraudes et
les laboratoires agréés à cet effet, doivent employer la
méthode jointe en annexe.


Officiel de la République algérienne démocratique et
populaire.
Fait à Alger, le 14 Chaâbane 1436 correspondant au

2 juin 2015.
Amara BENYOUNES.
17
18 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 48 9 septembre 2015
ANNEXE 2.3 Propagule ou germe :
Méthode horizontale pour le dénombrement des Entité viable, capable de se développer dans un milieu
levures et moisissures par comptage des colonies nutritif.
dans les produits, dont l’activité d’eau est
supérieure à 0,95. Exemple : Cellule végétative, groupe de cellules, spore,
groupe de spores ou morceau de mycélium fongique.
1- Domaine d'application
2.4 Colonie :
La présente méthode spécifie une technique horizontale
pour le dénombrement des levures et des moisissures Accumulation visible localisée de masse microbienne
viables présentes dans les produits destinés à la développée sur ou dans un milieu nutritif solide à partir
consommation humaine ou animale, dont l’activité d’eau d’une cellule viable.
est supérieure à 0,95 [œufs, viande, produits laitiers
(excepté le lait en poudre), fruits, légumes, pâtes fraîches, 3. Principe
etc] au moyen de la technique par comptage des colonies
3.1 Des boîtes de Petri préparées en utilisant un milieu
à 25° C ± 1° C.
de culture sélectif défini sont ensemencées.
Cette méthode ne permet pas le dénombrement des En fonction du nombre de colonies attendu, une
spores de moisissures et ne s’applique pas à quantité spécifique de l'échantillon pour essai (si le
l’identification de la flore fongique ou à l’examen des produit est liquide) ou de la suspension mère (dans le cas
aliments pour la recherche des mycotoxines. d'autres produits) ou des dilutions décimales de
l'échantillon ou de la suspension mère est utilisée.
La présente méthode n’est pas appropriée pour le
dénombrement de champignons résistants à la chaleur, tels Des boîtes supplémentaires peuvent être ensemencées
que les Byssochlamys fulva ou Byssochlamys nivea dans les mêmes conditions ; en utilisant des dilutions
présents dans les fruits et légumes en conserve ou en décimales obtenues à partir de l'échantillon pour essai ou
bouteille. de la suspension mère.
2. Termes et définitions 3.2 Les boîtes sont ensuite incubées en aérobiose à

25° C ± 1° C pendant cinq (5) jours. Puis, si nécessaire,
Pour les besoins de la présente méthode, les termes et les boîtes de gélose sont laissées au repos à la lumière du
définitions suivantes s'appliquent : jour pendant un (1) à deux (2) jours.
2.1 Levure : 3.3 Les colonies ou propagules sont alors comptées et,
si nécessaire (pour distinguer les colonies de levures et
Micro-organisme aérobie, mésophile qui, à 25° C et en des bactéries). L'identité des colonies douteuses est
utilisant un milieu gélosé dans les conditions décrites dans confirmée par examen à la loupe binoculaire ou au
la présente méthode, se développe à la surface du milieu microscope.
en formant des colonies (2.4) présentant le plus souvent
un contour régulier et une surface plus au moins convexe. 3.4 Le nombre de levures et de moisissures par gramme
ou par millilitre d'échantillon est calculé à partir du
Des levures se développant en profondeur, plutôt qu’à nombre de colonies ou propagules ou germes obtenus sur
la surface d’un milieu, peuvent former des colonies les boîtes choisies à des taux de dilution permettant
rondes et lenticulaires. d'obtenir des colonies pouvant être dénombrées. Les
moisissures et les levures sont comptées séparément, si
nécessaire.
2.2 Moisissure :
4. Diluant et milieu de culture
Micro-organisme aérobie, mésophile filamenteux qui, à
la surface d’un milieu gélosé et dans les conditions 4.1 Diluant
décrites dans la présente méthode, développe
habituellement des propagules ou des germes (2.3) plats 4.1.1 Généralités
ou duveteux ou des colonies (2.4) présentant souvent des
fructifications colorées et des formes de sporulation. Il est possible d'ajouter des agents tensioactifs, tels que
le poly (oxyéthylène) sorbitan monooléate [par exemple
Des moisissures se développant en profondeur, plutôt Tween 80*] (0,05 %, concentration en masse) pour réduire
qu’à la surface d’un milieu, peuvent former des colonies l'agglutination des spores de moisissures et des conidies.
rondes et lenticulaires.
Sauf dans le cas d'une préparation spécifique de
Note : Il existe des formes intermédiaires des l'échantillon pour essai, il est recommandé d'utiliser de
micro-organismes. La distinction entre une levure (2.1) et l'eau peptonée à 0,1 % (concentration en masse) comme
une moisissure (2.2) peut être arbitraire. diluant.
18
4.1.2 Composition de l'eau peptonée à 0,1% Ajouter 10 ml de solution à 1 % (concentration en

(concentration en masse) masse) dans l'éthanol de chloramphénicol et mélanger.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés (5.5).
Stériliser à l'autoclave à 121° C pendant 15 min.
Digestat enzymatique de tissus 1g
animaux et végétaux Refroidir immédiatement le milieu dans un bain-marie
(5.3) maintenu à une température comprise entre 44° C et
Eau 1000 ml 47° C. Répartir ce milieu par portions de 15 ml dans des
boîtes de Petri stériles (5.6).
4.1.3 Préparation de l'eau peptonée à 0,1 % — laisser le milieu se solidifier et sécher
(concentration en masse)
— utiliser immédiatement ou conserver dans l'obscurité
jusqu'à son utilisation.
Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si
nécessaire. Note - Eviter l'exposition du milieu à la lumière, car
Si nécessaire, ajuster le pH (5.4) à 7 ± 0,2 à 25° C après les produits de décomposition cytotoxiques peuvent
stérilisation. causer la sous-évaluation de la mycoflore dans les
échantillons.
4.2 Milieu de culture
4.2.1.2.2 Addition facultative de chlorhydrate de
chlortétracycline
4.2.1 Dichloran rose bengalechloramphenicol agar
(DRBC) Lorsque la prolifération bactérienne peut poser un
problème (par exemple dans les viandes crues), il est
4.2.1.1 Composition recommandé d'utiliser le chloramphénicol (50 mg/l) et la
chlortétracycline (50 mg/l).
Digestat enzymatique de tissus 5g Dans ce cas, préparer le milieu de base (4.2.1.2),
animaux et végétaux comme décrit ci-dessus, avec seulement 50 mg de
chloramphénicol, le répartir par quantité de 100 ml et
D-Glucose (C6H12O6) 10 g
stériliser.
Phosphate monopotassique
Préparer également une solution avec 0,1%
(KH2PO4) 1g
(concentration en masse) de chlorhydrate de
chlortétracycline dans de l'eau (relativement instable en
Sulfate de magnésium
solution, elle doit être préparée extemporanément) et
(MgSO4, H2O) 0,5 g
stériliser par filtration. Juste avant l'utilisation, ajouter
5 ml de cette solution de manière stérile à 100 ml du
Dichloran
milieu de base et verser dans les boîtes. La gentamicine
(2,6-dichloro-4-nitroaniline) 0,002 g
est déconseillée, car elle peut causer l'inhibition de
Rose ben gale 0,025 g certaines espèces de levures.
Gélose 12 g à 15 g a 4.2.1.2.3 Addition facultative d'éléments trace
Chloramphénicol 0,1 g Pour que les moisissures présentent toutes leur

morphologie, notamment tous les pigments qu'elles
Eau, distillée ou déionisée 1000 ml produisent habituellement, elles ont besoin d'éléments
trace qui ne sont pas présents dans le DRBC.
a : En fonction du pouvoir gélifiant de la gélose.
Pour identifier les moisissures dans ce milieu, ajouter la
*Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est solution d'éléments trace suivante à 1 ml par litre de
milieu, avant passage à l'autoclave :
démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
— ZnSO4, 7H2O : 1g ;
4.2.1.2 Préparation — CuSO4, 5H2O : 0,5g ;
4.2.1.2.1 Généralités — 100 ml d'eau, distillée ou déionisée.
4.2.1.2.4 Addition facultative de Tergitol *

Mettre tous les ingrédients, excepté le chloramphénicol,
en suspension dans l'eau et porter à ébullition pour Afin d'éviter la prolifération de Mucoraceae dans les
dissoudre complètement. Si nécessaire, ajuster le pH (5.4) boîtes de gélose, il est recommandé d'ajouter du Tergitol
à 5,6 ± 0,2 à 25° C, après stérilisation. (1 ml/l) au milieu de culture.
19
4.2.1.3 Essai de performance pour l'assurance de la 5.3 Bain-marie, ou appareillage similaire, pouvant
qualité du milieu de culture fonctionner de 44° C à 47° C.
4.2.1.3.1 Généralité 5.4 pH-mètre, précis à ± 0,1 unité de pH à 25° C.
Le milieu DRBC est un milieu solide. La productivité et 5.5 Flacons, fioles et tubes, pour bouillir et
la sélectivité doivent être soumises à essai selon les conserver les milieux de culture et pour effectuer des
spécifications suivantes :
dilutions.
4.2.1.3.2 Productivité
5.6 Boîtes de petri, stériles, en verre ou en plastique, de
— incubation : Cinq (5) jours à 25° C ± 1° C. 90 mm à 100 mm de diamètre.
— souches :
5.7 Microscope, pour distinguer les levures des
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 ; cellules bactériennes (fond clair, grossissement de x 250
Candida albicans ATCC 10231 ; à x 1000).
Aspergillus niger ATCC 16404 ; 5.8 Etaleurs, en verre ou en plastique (de diamètre
Mucor racemosus ATCC 42647. inférieur à 2 mm et de longueur 80 mm). Il convient que
le diamètre des étaleurs ne dépasse pas 2 mm afin de
Ou souches enregistrées comme équivalentes dans minimiser la quantité d'échantillon y adhérant à la fin de
d'autres collections fongiques. l'étalement.
* Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est
5.9 Loupe binoculaire, (grossissement x 6,5 à x 50)
démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats. pour distinguer et différencier les colonies ou les cellules
des levures et moisissures.
— milieux de référence : Milieux de culture
« Sabouraud Dextrose Agar » (SDA).
6. Echantillonnage
— méthode de contrôle : Quantitative.
Il convient que l'échantillon envoyé au laboratoire soit
— critères : Rapport de productivité, PR ≥ 0,5
réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
— réaction caractéristique : Colonies ou propagules du transport et de l'entreposage. L'échantillon pour le
ou germes caractéristiques selon chaque espèce. laboratoire ne doit pas être congelé.
4.2.1.3.3 Sélectivité L'échantillonnage et la préparation de l'échantillon pour

— incubation : Cinq (5) jours à 25° C ± 1° C. essai se font dans des conditions appropriées.
— souches : 7. Mode Opératoire
Escherichia coli ATCC 25922 ;
Ou Bacillus subtilis ATCC 6633 ; 7.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions
Ou souches enregistrées comme équivalentes dans Préparer la prise d'essai, la suspension mère (première
d’autres collections de bactéries. dilution) et les dilutions suivantes selon des exigences
— méthode de contrôle : Qualitative. réglementaires et normatives spécifiques et appropriées au
produit concerné. Sauf dans le cas d'une préparation
— critères : Inhibition totale. spécifique de l'échantillon pour essai, il est recommandé
d'utiliser de l'eau peptonée à 0,1 % (concentration en
5. Appareillage et verrerie
masse) (4.1.3) comme diluant.
L'utilisation de matériel à usage unique est une
alternative acceptable à l'utilisation de verrerie Utiliser un homogénéisateur péristaltique de préférence
réutilisable, à condition qu'il répond aux exigences à un mélangeur ou à un agitateur.
spécifiées.
En raison de la sédimentation rapide des spores dans la
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en pipette, maintenir la pipette (5.2) horizontale (et non
particulier, ce qui suit : verticale) lorsqu'elle est remplie du volume approprié de
suspension mère et de dilutions.
5.1 Etuve, pouvant fonctionner à 25° C ± 1° C.
Agiter la suspension mère et les dilutions afin
5.2 Pipettes à écoulement total, stériles, d'une capacité d'éviter la sédimentation de particules contenant des
nominale de 1 ml et graduées à 0,1 ml. micro-organismes.
20
7.2 Ensemencement et incubation 7.3 Comptage et sélection des colonies pour

confirmation
7.2.1 Dans une boîte de gélose de DRBC (4.2.1),
transférer avec une pipette (5.2) stérile, 0,1 ml de Lire les boîtes entre deux (2) jours et cinq (5) jours
d'incubation. Sélectionner les boîtes (7.2.3) contenant
l'échantillon pour essai s'il est liquide ou 0,1 ml de la
moins de 150 colonies ou propagules ou germes et
suspension mère dans le cas d'autres produits. compter ces colonies ou propagules ou germes.
Dans une deuxième boîte de gélose DRBC (4.2.1), Si l'on observe un envahissement rapide des boîtes,
transférer à l'aide d'une nouvelle pipette stérile 0,1 ml de retenir les comptages obtenus après deux (2) jours, puis de
la première dilution décimale (10-1) (produit liquide), ou nouveau après cinq (5) jours d'incubation.
0,1 ml de la dilution (10-2) (autres produits).
Note 1 : Les méthodes de dénombrement des levures et
Pour faciliter le dénombrement de faibles populations en particulier des moisissures sont imprécises du fait
de levures et de moisissures, des volumes, jusqu'à 0,3 ml qu'elles consistent en un mélange de mycélium, de spores
d'une dilution (10-1) de l'échantillon ou de l'échantillon asexués et sexués. Le nombre d'unité à l'origine de la
pour essai, s'il est liquide, peuvent être répartis dans trois formation de colonies dépend du degré de fragmentation
(3) boîtes. du mycélium et de la proportion de spores capables de se
développer sur le milieu.
Procéder de la même façon avec les dilutions suivantes
en utilisant une nouvelle pipette (5.2) stérile à chaque Note 2 : Des comptages non linéaires à partir des
dilution décimale. dilutions décimales se produisent souvent, c'est-à-dire
qu'une dilution d'un facteur 10 de l'échantillon n'aboutit
Note : Si la présence de moisissures se développant généralement pas à une réduction d'un facteur 10 du
rapidement est suspectée, se référer à la méthode nombre de colonies à la surface de la boîte de Pétri. Cela
horizontale pour le dénombrement des levures et est dû à la fragmentation du mycélium et à la dispersion
moisissures par comptage des colonies dans les produits à des spores pendant la dilution et à la compétition entre
activité d'eau inférieure ou égale à 0.95. espèces lorsqu'un grand nombre de colonies sont présentes
dans la boîte de petri.
7.2.2 Etaler l'inoculum sur la surface de la boîte de
gélose avec un étaleur (5.8) stérile jusqu'à ce que le Remarque - Les spores des moisissures se
liquide soit entièrement absorbé par le milieu. disséminent facilement dans l'air, à ce titre, manipuler
les boîtes de petri avec précaution pour éviter leur
L'ensemencement des boîtes par inclusion peut prolifération qui pourrait engendrer une surestimation
également être utilisé, mais dans ce cas, l'équivalence de la population dans l'échantillon.
des résultats doit être validée par rapport à
Si nécessaire, effectuer un examen à l'aide de la loupe
l'ensemencement en surface, et la distinction et la
binoculaire (5.9) ou du microscope (5.7) afin de
différenciation des moisissures et des levures ne sont pas
différencier les cellules de levures ou de moisissures des
possibles.
colonies de bactéries.
La méthode d'étalement en surface peut donner des
Les colonies de levures et les colonies propagules de
dénombrements supérieurs. La technique de l'inoculation
moisissures sont comptées séparément, si nécessaire.
en surface facilite l'exposition maximale des cellules à
l'oxygène atmosphérique et évite l'inactivation thermique Pour l'identification des levures et des moisissures,
des propagules fongiques. sélectionner des zones de développement fongique et
effectuer un prélèvement pour un examen microscopique
Les résultats dépendent du type de champignons. approfondi ou un ensemencement dans des milieux
d'isolation ou d'identification appropriés.
7.2.3 Incuber en aérobiose les boîtes préparées (7.2.2),
couvercles en haut, en position droite dans l'étuve (5.1) à 8. Expression des résultats et limites de confiance
25° C ± 1° C pendant cinq (5) jours. Si nécessaire, laisser
reposer les boîtes de gélose à la lumière du jour pendant Les résultats et les limites de confiance doivent être
un (1) à deux (2) jours. exprimés selon les exigences générales et les
recommandations relatives à la microbiologie des
Il est recommandé d'incuber les boîtes (5.6) dans un sac aliments.
plastique ouvert afin d'éviter la contamination de l'étuve
en cas de dissémination des moisissures à l'extérieur des Compter les colonies de levures et les colonies ou
boîtes. propagules de moisissures séparément, si nécessaire.
21
16 Dhou El Hidja 1436
ANNEXE
MINISTERE DU COMMERCE
METHODE HORIZONTALE POUR
LE DENOMBREMENT DES LEVURES
Arrêté du 19 Chaoual 1436 correspondant au 4 août ET MOISISSURES PAR COMPTAGE DES
2015 rendant obligatoire la méthode horizontale COLONIES DANS LES PRODUITS, DONT
pour le dénombrement des levures et moisissures L'ACTIVITE D'EAU EST INFERIEURE
par comptage des colonies dans les produits dont OU EGALE A 0.95
l'activité d'eau est inférieure ou égale à 0,95.
————
1. DOMAINE D'APPLICATION
Le ministre du commerce, La présente méthode spécifie une technique horizontale
Vu le décret présidentiel n° 15-125 du 25 Rajab 1436 de dénombrement des levures osmophiles et des
correspondant au 14 mai 2015, modifié, portant moisissures xérophiles dans les produits destinés à la
nomination des membres du Gouvernement ; consommation humaine ou animale, dont l'activité d'eau
est inférieure ou égale à 0,95 au moyen de la technique
Vu le décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, par comptage des colonies à 25 °C ± 1°C [fruits secs,
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la gâteaux, confitures, viande séchée, poisson salé, grains,
répression des fraudes ; céréales et produits à base de céréales, farines, noix,
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423 épices et condiments, etc].
du ministre du commerce ; La présente méthode ne s'applique pas aux produits
Vu le décret exécutif n° 05-465 du 4 Dhou EL Kaada déshydratés dont l'activité d'eau est inférieure ou égale à
1426 correspondant au 6 décembre 2005 relatif à 0,60 (céréales déshydratées, produits oléagineux, épices,
l'évaluation de la conformité ; légumineuses, graines, poudres pour boissons
instantanées, produits anhydres pour animaux
Vu le décret exécutif n° 13-328 du 20 Dhou EL Kaada domestiques, etc.) et ne permet pas le dénombrement des
1434 correspqndant au 26 septembre 2013 fixant les spores de moisissures. Cette méthode ne s'applique pas
conditions et les modalités d'agrément des laboratoires au également, à l'identification de la flore fongique ou à
titre de la protection du consommateur et de la répression
l'examen des aliments pour la recherche de mycotoxines ;
des fraudes ;
et elle n'est pas appropriée au dénombrement des
Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet moisissures halophiles xérophiles (Polypaecilum pisce et
1994, modifié et complété, relatif aux spécifications Basipetospora halophila), qui peuvent notamment se
microbiologiques de certaines denrées alimentaires ; trouver dans le poisson séché.
Arrête : 2. TERMES ET DEFINITIONS
Article ler. — En application des dispositions de
Pour les besoins de la présente méthode, les termes et
définitions suivantes s'appliquent :
dénombrement des levures et moisissures par comptage 2.1 Levure : Micro-organisme aérobie, mésophile qui, à
des colonies dans les produits, dont l'activité d'eau est 25°C et en utilisant un milieu gélosé dans les conditions
inférieure ou égale à 0,95. décrites dans la présente méthode, se développe à la
surface du milieu en formant des colonies (2.4) présentant
Art. 2. — Pour le dénombrement des levures et le plus souvent un contour régulier et une surface plus au
moisissures par comptage des colonies dans les produits, moins convexe.
dont l'activité d'eau est inférieure ou égale à 0,95, les
laboratoires du contrôle de la qualité et de la répression Des levures se développant en profondeur, plutôt qu'à la
des fraudes et les laboratoires agréés à cet effet doivent surface d'un milieu, peuvent former des colonies rondes et
employer la méthode jointe en annexe. lenticulaires.
Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire 2.2 Moisissure : Micro-organisme aérobie, mésophile
lorsqu'une expertise est ordonnée. filamenteux qui, à la surface d'un milieu gélosé et dans les
conditions décrites dans la présente méthode, développe
officiel de la République algérienne démocratique et habituellement des propagules ou des germes (2.3) plats
populaire. ou duveteux ou des colonies (2.4) présentant souvent des
fructifications colorées et des formes de sporulation.
Fait à Alger, le 19 Chaoual 1436 correspondant au
4 août 2015. Des moisissures se développant en profondeur, plutôt
qu'à la surface, d'un milieu peuvent former des colonies
Bakhti BELAIB. rondes et lenticulaires.
22
Note : Il existe des formes intermédiaires des Note : il est possible d'ajouter des agents tensioactifs,
micro-organismes. La distinction entre une levure (2.1) et tel que le poly (oxyéthylène) sorbitan monooléate 0,05 %
une moisissure (2.2) peut être arbitraire. (concentration en masse) pour réduire l'agglutination des
spores de moisissures et des conidies.
2.3 Propagule ou germe : Entité viable, capable de se
développer dans un milieu nutritif. Sauf dans le cas d'une préparation spécifique de
l'échantillon pour essai, il est recommandé d'utiliser de
Exemple : Cellule végétative, groupe de cellules, spore, l'eau peptonée à 0,1 % (concentration en masse) comme
groupe de spores ou morceau de mycélium fongique. diluant.
2.4 Colonie : Accumulation visible localisée de masse 4.1.2 Composition de l'eau peptonée à 0,1 %
microbienne développée sur ou dans un milieu nutritif (concentration en masse)
solide à partir d'une cellule viable.
Digestat enzymatique de tissus 1g
2.5 levure osmophile et moisissure xérophile : animaux et végétaux
Champignon capable de se développer avec une activité Eau 1000 ml

d'eau inférieure ou égale à 0,95.
3. PRINCIPE 4.1.3 Préparation de l'eau peptonée à 0,1 %

(concentration en masse)
3.1 Des boîtes de Petri préparées en utilisant un milieu Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si
de culture sélectif défini sont ensemencées. En fonction nécessaire. Si nécessaire, ajuster le pH (5.4) à 7 ± 0,2 à
du nombre de colonies attendu, une quantité spécifique de 25 °C après stérilisation.
l'échantillon pour essai (si le produit est liquide) ou de la
suspension mère (dans le cas d'autres produits) ou des 4.2 Milieu de culture
dilutions décimales de l'échantillon ou suspension mère
est utilisée. 4.2.1 Gélose dichloran à 18% (concentration en
masse) de glycérol (DG 18)
Des boîtes de Petri supplémentaires peuvent être
ensemencées dans les mêmes conditions ; en utilisant des 4.2.1.1 Composition
dilutions décimales obtenues à partir de l'échantillon pour
essai ou de la suspension mère. Digestat enzymatique de caséine 5g
3.2 Les boîtes de Petri sont ensuite incubées en D-Glucose (C6H12O6) 10 g
aérobiose à 25 °C ± 1°C pendant cinq (5) à sept (7) jours.
Puis, si nécessaire, les boîtes de gélose sont laissées au Phosphate monopotassique (KH2PO4) 1g
repos à la lumière du jour pendant un (1) à deux (2) jours.
Sulfate de magnésium (MgSO4 H2O) 0,5 g
3.3 Les colonies ou propagules sont alors comptées et,
si nécessaire (pour distinguer les colonies de levure et de Dichloran (2,6-dichloro-4-nitro-aniline) 0,002 g
bactérie), l'identité des colonies douteuses est confirmée
par examen à la loupe binoculaire ou au microscope. Glycérol anhydre 220 g
3.4 Le nombre de levures et de moisissures par gramme Gélose 12 g à 15ga

ou par millilitre d'échantillon est calculé à partir du
nombre de colonies ou propagules ou germes obtenus sur Chloramphénicol 0,1 g
les boîtes de Petri choisies à des taux de dilution
permettant d'obtenir des colonies pouvant être Eau distillée ou déionisée 1000 ml
dénombrées. Les moisissures et les levures sont comptées
séparément, si nécessaire. a : en fonction du pouvoir gélifiant de la gélose
4. DILUANT ET MILIEU DE CULTURE

4.2.1.2 Préparation
4.1 Diluant
4.2.1.2.1 Généralités
4.1.1 Généralités
Mettre tous les ingrédients, excepté le chloramphénicol,
L'utilisation d'un diluant comportant une quantité en suspension dans l'eau et porter à ébullition pour
suffisante de soluté [par exemple une solution de 20 % à dissoudre complètement. Si nécessaire, ajuster le pH (5.4)
35 % (concentration en masse) de glycérol ou de à 5,6 ± 0,2 à 25 °C après stérilisation.
D-glucose] est recommandée pour réduire le choc
osmotique des moisissures xérophiles et des levures Ajouter 10 ml de solution à 1% (concentration en
osmophiles lorsque des dilutions en série sont effectuées masse) dans l'éthanol de chloramphénicol et mélanger.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés (5.5).
avant l'ensemencement.
Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 min.
23
Refroidir immédiatement le milieu dans un bain-marie — Aspergillus restrictus ATCC 42693

(5.3) maintenu à une température comprise entre 44 °C et
47 °C. Répartir ce milieu par portions de 15 ml dans des — Eurotium rubrum ATCC 42690
boîtes de Petri stériles (5.6). — Ou souches enregistrées comme équivalentes dans
Laisser le milieu se solidifier et sécher, si nécessaire, la d'autres collections fongiques.
surface des boîtes de Petri. Utiliser immédiatement ou
conserver dans l'obscurité, jusqu'à son utilisation. Milieux de référence : milieux de culture SDA
(Sabouraud Dextrose Agar)
Remarque : Eviter l'exposition du milieu à la
lumière, car les produits de décomposition
Méthode de contrôle : quantitative
cytotoxiques peuvent causer la sous-évaluation de la
nycoflore dans les échantillons.
Critères : rapport de productivité, PR≥ 0,5
4.2.1.2.2 Addition facultative de chlorhydrate de
chlortétracycline Réaction caractéristique : colonies ou propagules ou
germes caractéristiques selon chaque espèce.
Lorsque la prolifération bactérienne peut poser
problème, il est recommandé d'utiliser le chloramphénicol 4.2.1.3.3 Sélectivité
(50 mg/l) et la chlortétracycline (50 mg/l). Dans ce cas,
préparer le milieu de base, comme décrit ci-dessus, Incubation : cinq (5) jours à 25 °C ± l °C
(4.2.1.2), avec seulement 50 mg de chloramphénicol, le
répartir par quantités de 100 ml et stériliser. Préparer Souches :
également une solution avec 0.1 % (concentration en
masse) de chlorhydrate de chlortétracycline dans de l'eau — Escherichia coli ATCC 25922
(relativement instable en solution, elle doit être préparée — Ou Bacillus subtilis ATCC 6633
extemporanément) et stériliser par filtration. Juste avant
l'utilisation, ajouter 5 ml de cette solution de manière — Ou souches enregistrées comme équivalentes dans
stérile à 100 ml du milieu de base et verser dans les boîtes d'autres collections de bactéries.
de Petri. La gentamicine est déconseillée, car elle peut
causer l'inhibition de certaines espèces de levures. Méthode de contrôle : qualitative
4.2.1.2.3 Addition facultative d'éléments trace Critères : inhibition totale
Pour que les moisissures présentent toute leur 5. APPAREILLAGE ET VERRERIE

morphologie, notamment tous les pigments qu'elles
produisent habituellement, elles ont besoin d'éléments L'utilisation de matériel à usage unique est une
trace qui ne sont pas présents dans le DG 18 (4.2.1). alternative acceptable à l'utilisation de verrerie
Pour identifier les moisissures dans ce milieu, ajouter la réutilisable, à condition qu'il répond aux exigences
solution d'éléments trace suivante à 1 ml par litre de spécifiées.
milieu, avant passage à l'autoclave :
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en
— ZnSO4, 7H2O 1g ;
particulier, ce qui suit :
— Cu SO4 ,5H2O 0,5 g ;
— 100 ml d'eau distillée ou déionisée. 5.1 Etuve, pouvant fonctionner à 25 °C ± 1°C
4.2.1.3 Essai de performance pour l'assurance de 5.2 Pipettes à écoulement total, stériles, d'une capacité
qualité du milieu de culture nominale de 1 ml et graduées en 0,1 ml.
4.2.1.3.1 Généralités 5.3 Bain-marie, ou appareillage similaire, pouvant

fonctionner de 44 °C à 47 °C.
Le milieu DG 18 (4.2.1) est un milieu solide. La
productivité et la sélectivité doivent être soumises à essai 5.4 pH-mètre, précis à ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
selon les spécifications suivantes :
5.5 Bouteilles, fioles et tubes, pour bouillir et conserver
4.2.1.3.2 Productivité les milieux de culture et pour effectuer des dilutions.
Incubation : cinq (5) jours à 25 °C ± 1 °C. 5.6 Boîtes de Petri, stériles, en verre ou en plastique, de
90 mm à 100 mm de diamètre.
Souches :
— Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 5.7 Microscope, pour distinguer les levures de cellules
bactériennes (fond clair, grossissement de x 250 à x
— Wallemia sebi ATCC 42694
1000).
24
5.8 Etaleurs, en verre ou en plastique (diamètre Pour les aliments solides ou particulaires, tels que les
inférieur à 2 mm et de longueur 80 mm). Il convient que noix ou les grains, l'ensemencement direct est
le diamètre des étaleurs ne dépasse pas 2 mm afin de recommandé.
minimiser la quantité d'échantillon y adhérant à la fin de
l'étalement. Les échantillons de ces types de produits sont
désinfectés en surface dans une solution de 0,35 %
5.9 Loupe binoculaire, (grossissement de x 6.5 à x 50) (1000 µg/g) d'hypochlorite de sodium pendant 2 min, puis
pour distinguer et différencier les colonies ou cellules des
rincés avec de l'eau distillée stérile, séchés sur un papier
levures et moisissures.
stérile et placés sur un milieu gélosé.
6. ECHANTILLONNAGE
7.2.2 Étaler le liquide sur la surface de la boîte de
Il convient qu'un échantillon représentatif, non gélose avec un étaleur (5.8) stérile jusqu'à ce que le
endommagé ou altéré au cours du transport ou de liquide soit entièrement absorbé par les milieux.
l'entreposage, ait été envoyé au laboratoire. L'échantillon
pour laboratoire ne doit pas être congelé. L'ensemencement des boîtes par inclusion peut
également être utilisée, mais dans ce cas, l'équivalence des
7. MODE OPERATOIRE POUR LA résultats doit être validée par rapport à l'ensemencement
PREPARATION DE L'ECHANTILLON POUR en surface, et la distinction et la différenciation des
ESSAI moisissures et des levures ne sont pas possibles. La
méthode d'étalement en surface peut donner des
7.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions dénombrements supérieurs. La technique de l'inoculation
en surface facilite l'exposition maximale des cellules à
Préparer la prise d'essai, la suspension mère (première l'oxygène atmosphérique et évite l'inactivation thermique
dilution) et les dilutions suivantes selon les exigences
des propagules fongiques. Les résultats dépendent du type
réglementaires et normatives spécifiques et appropriées
aux produits concernés. de champignons.
Sauf dans le cas d'une préparation spécifique de 7.2.3 Incuber en aérobiose les boîtes préparées (7.2.2),
l'échantillon pour essai, il est recommandé d'utiliser de couvercles en haut, en position droite dans l'étuve (5.1) à
l'eau peptonée à 0,1 % (concentration en masse) (4.1.3) 25 °C ± 1°C pendant cinq (5) à sept (7) jours. Si
comme diluant. Utiliser un homogénéisateur péristaltique nécessaire, laisser reposer les boîtes de gélose à la lumière
de préférence à un mélangeur ou un agitateur. du jour pendant un (1) à deux (2) jours.
En raison de la sédimentation rapide des spores dans la Si la présence de Xeromyces bisporus est suspectée,
pipette, maintenir la pipette (5.2) horizontale lorsqu'elle incuber les boîtes pendant dix (10) jours.
est remplie du volume approprié de la suspension mère et
de dilutions. Il est recommandé d'incuber les boîtes de Petri dans un
sac plastique ouvert afin d'éviter la contamination de
Agiter la suspension mère et les dilutions afin d'éviter la l'étuve en cas de dissémination des moisissures à
sédimentation de particules contenant des
l'extérieur des boîtes de Petri .
micro-organismes.
7.2 Ensemencement et incubation 7.3 Comptage et sélection des colonies pour

confirmation
7.2.1 Dans une boîte de gélose DG 18 (4.2.1), transférer
avec une pipette (5.2) stérile, 0,1 ml de l'échantillon pour Après la période d'incubation spécifiée, sélectionner les
essai s'il est liquide ou 0,1 ml de la suspension mère dans boîtes (7.2.3) contenant moins de 150 colonies ou
le cas d'autres produits. propagules ou germes et compter ces colonies ou
propagules ou germes.
Dans une deuxième boîte de gélose DG 18 (4.2.1),
transférer avec une nouvelle pipette stérile 0,1 ml de la Si on observe un envahissement rapide des boîtes,
première dilution décimale (10-1) (produit liquide) ou 0,1 compter les colonies ou propagules ou germes après deux
ml de la dilution (10-2) (autres produits). (2) jours, puis de nouveau après cinq (5) à sept (7) jours
d'incubation.
Pour faciliter le dénombrement de faibles populations
de levures et de moisissures, des volumes, jusqu'à 0.3 ml Note 1 : Les méthodes de dénombrement des levures et
d'une dilution (10-1) de l'échantillon ou de l'échantillon
en particulier des moisissures sont imprécises du fait
pour essai, s'il est liquide, peuvent être répartis dans trois
qu'elles consistent en un mélange de mycélium, de spores
(3) boîtes de Petri.
asexués et sexués. Le nombre d'unités à l'origine de la
Procéder de la même façon avec les dilutions suivantes formation de colonies dépend du degré de fragmentation
en utilisant une nouvelle pipette stérile à chaque dilution du mycélium et de la proportion de spores capables de se
décimale. développer sur le milieu.
25
Note 2 : Des comptages non linéaires à partir des

dilutions décimales se produisent souvent, c'est-à-dire
qu'une dilution d'un facteur 10 de l'échantillon n'aboutit
généralement pas à une réduction d'un facteur 10 du
nombre de colonies à la surface de la boîte de petri. Cela
est dû à la fragmentation du mycélium et à la dispersion
des spores pendant la dilution et à la compétition entre
espèces lorsqu'un grand nombre de colonies sont présentes
dans la boîte de pétri.
Remarque : les spores des moisissures se disséminent

dans l'air aisément, à ce titre, manipuler les boîtes de
petri avec précaution pour éviter leur prolifération qui
pourrait engendrer une surestimation de la population
dans l'échantillon.
Si nécessaire, effectuer un examen à l'aide de la loupe

binoculaire (5.9) ou du microscope (5.7) afin de
différencier les cellules de levures ou de moisissures des
colonies de bactéries.
Les colonies de levures et les colonies ou les propagules

de moisissures sont comptées séparément, si nécessaire.
Pour l'identification des levures et des moisissures,

sélectionner des zones de développement fongique et
effectuer un prélèvement pour un examen microscopique
approfondi ou un ensemencement dans des milieux
d'isolation ou d'identification appropriés.
8. EXPRESSION DES RESULTATS ET LIMITES

DE CONFIANCE
Les résultats et les limites de confiance doivent être

exprimés selon les exigences générales et les
recommandations relatives à la microbiologie des
aliments.
26

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RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

DIRECTION GÉNÉRALE DU CONTRÔLE

Direction des Laboratoires d’Essais

MÉTHODES OFFICIELLES D'ANALYSES

1. Arrêté du 29 juillet 2012 rendant obligatoire la méthode horizontale pour le

2. Arrêté du 28 mai 2014 rendant obligatoire la méthode de préparation des

3. Arrêté du 21 mai 2014 rendant obligatoire la méthode de dénombrement des

4. Arrêté du 31 juillet 2014 rendant obligatoire la méthode utilisant le milieu gélosé au

5. Arrêté du 2 juin 2015 rendant obligatoire une méthode horizontale pour le

6. Arrêté du 2 juin 2015 rendant obligatoire une méthode horizontale pour le

— échantillons d'environnement dans le domaine de la

Arrêté du 10 Ramadhan 1433 correspondant au 29 1. DÉFINITION

ANNEXE Citrate de fer (III) ammoniacal 1g

représentation schématique du mode opératoire

1 x g prise d'essai + 9 x g diluant

Traitement thermique pour éliminer

En cas de suspicion de bactéries Gélose au sulfite de fer (3.1).

Gélose au sulfite de fer (3.1).

Arrêté du 28 Rajab 1435 correspondant au 28 mai I. TERMES ET DEFINITIONS

Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet 2. PRINCIPE

3.2.1.2 Préparation 4.6 Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml et

6.2 Dilutions décimales suivantes

Transvaser, à l'aide d'une pipette stérile (4.6) et avec

Note : Si un plus grand volume est nécessaire, il est

Pour une précision optimale, ne pas introduire la pipette

Eviter tout contact entre la pipette (4.6) contenant

Mélanger soigneusement la prise d'essai et le diluant, en

Si nécessaire, répéter ces opérations sur la dilution 10-2

6.3 Durée des opérations

Le temps qui s'écoule entre la fin de la préparation de la

Note : Si la température ambiante du laboratoire est

MINISTERE DU COMMERCE La présente méthode spécifie une technique horizontale

Le ministre du commerce, 1 - Termes et définitions :

3.2.1 - Milieu de base : NOTE : Si une préparation commerciale est disponible,

Solution de tellurite de potassium............. (3.2.2.1) 1 ml 3.4 - Plasma de lapin :

3.3 - Bouillon cuœr-cervelle : 4.2 - Etuve, permettant de maintenir les milieux

Glucose....................................................................... 2 g 4.4 - Bain d'eau, ou dispositif similaire, réglable à

Incuber à nouveau toutes les boîtes à 35° C ou à 37° C

6.3 - Incubation : Les colonies non caractéristiques sont surtout formées

NOTE 3 : Les autres colonies sont celles

Noter le résultat comme étant le nombre de

Le résultat, après arrondissement, est 5,7 x 104. 8 - Fidélité :

7.2 - Estimation de petits nombres : 8.1- Répétabilité

Vu le décret exécutif n° 05-465 du 4 Dhou EL Kaada

Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet

Article 1er. — En application des dispositions de

Art. 2. — Pour le dénombrement des staphylocoques à

Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire

Art. 3. — Le présent arrêté sera publié au Journal

Fait à Alger, le 4 Chaoual 1435 correspondant au 31

La présente méthode spécifie une technique pour le

1.2 Dénombrement des staphylocoques à coagulase 3.2.2 Solutions

Dans les mêmes conditions, ensemencement des 3.2.2.2.2 Préparation

3.2.1 Milieu de base Ajouter de façon aseptique les trois solutions,

NOTE- En cas d'utilisation d'une solution 7.2 Ensemencement et incubation

Calculer le nombre N de staphylocoques à coagulase C

∑c : Somme des colonies de staphylocoques C

Arrêté du 14 Chaâbane 1436 correspondant au 2 juin

Article 1er. — En application des dispositions de