Fluorimetrie Moleculaire - 3

doc from JF Perrin
Fluorimtrie Molcualire
Fluorimtrie molculaire: dfinition et description du phnomne, mesures quantitatives,
introduction l'utilisation de la fluorimtrie quantitative et l'utilisation de marqueurs
fluorescents en biologie.
Hors sujet, hors programme : la fluorimtrie atomique
1. Le phnomne de fluorescence molculaire

Les diffrents tats nergtiques possibles des lectrons d'une molcule donne sont discrets,
quantifis.
Les tats lectroniques molculaires sont quantifis. Les diffrences d'nergie entre les tats
lectroniques molculaires varient de 150 600 kJ.mol -1. On rappelle que les orbitales molculaires
rsultent de la combinaison d1 orbitales atomiques d' lectrons d'atomes lis dans la molcule
considre.
A chaque tat lectronique correspond plusieurs niveaux vibrationnels quantifis (les diffrences
d'nergie entre les tats vibrationnels varient de 4 40 kJ.mol-1).
A chaque tat vibrationnel correspond plusieurs niveaux rotationnels quantifis (les diffrences d'nergie
entre les tats rotationnels sont infrieurs 0,5 kJ.mol-1).
Lorsqu'une molcule donne prsente la proprit de fluorescence c'est que :

- on a ralis une excitation photonique UV de la molcule. Lorsqu'une molcule donne est
excitable la longueur d'onde UV , c'est que correspond une nergie permettant le transfert d'un
lectron depuis une orbitale molculaire l'tat fondamental de plus basse nergie vers une autre
orbitale molculaire d'nergie plus leve correspondant un tat dit excit.
- Lors de la dsactivation, on assiste dans un premier temps au retour l'tat vibrationnel de
moindre nergie de l'tat excit (relaxation, dure type = 10-12s). Puis le retour vers l'tat fondamental se
fera sur un niveau vibrationnel quelconque de l'tat lectronique fondamental de moindre nergie avec
mission d'un photon (dure de vie l'tat excit de l'ordre de 10 -9s). La dure de l'ensemble du
processus est de l'ordre de 10-9 10-8s pour une molcule. La longueur d'onde d'mission est toujours
suprieure la longueur d'onde d'excitation puisque E = hv = hc/ . Quand E diminue, augmente.
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En fluorescence molculaire on excite dans l'UV et on observe des missions de longueurs d'ondes plus
leves dans l'UV proche ou le visible. Elles correspondent des transitions faisant intervenir des
lectrons et des lectrons n. Les molcules groupements fluorescents sont souvent des molcules
avec un(des) polycycles conjugus.
Remarque : le phnomne de phosphorescence correspond, lui aussi, une mission de photons aprs
une excitation photonique. Cependant, il fait intervenir un changement de spin de l'lectron lors de la
phase non radiative (le changement de spin conduit ce qu'on appelle un tat triplet en mcanique
quantique). Tout tat triplet excit a une dure de vie trs longue de 10 -5s quelques secondes ou
quelques minutes. Le retour l'tat fondamental (retour ce qu'on appelle un tat singulet pour lequel
les 2 lectrons d'une orbitale sont de spin opposs) est missif. On parle alors de phosphorescence.
Phosphorescence et fluorescence font partie des phnomnes de luminescence.

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2. Le spectrofluorimtre
Le mot fluorimtre devrait tre rserv des appareils filtres qui ne permettent pas l'tude des
spectres mais sont ddis des composs fluorescents donns.
Dans les fluorimtres et les spectrofluorimtres, l'angle entre le flux d'excitation et le flux d'mission
mesur est trs important dfinir. En gnral, on choisi un angle de 90 (aucune lumire d'excitation
rflchie ne peut parvenir au photorcepteur). Attention : on utilise des cuves quartz (on travaille dans
l'UV pour l'excitation) 4 faces polies.
Un microscope fluorescence se comporte en fait comme un fluorimtre pour lequel l'il sert de
photorcepteur.
3. Spectres de fluorescence
Toute molcule fluorescente se caractrise par 2 spectres: le spectre d'excitation (efficacit des
diffrentes longueurs d'ondes exciter pour conduire finalement une mission luminescente) et le
spectre d'mission (intensit relative des missions aux diffrentes longueurs d'onde). Chacun est un
spectre de bande(s).
3.1. Spectres d'excitation

Par principe, il est en correspondance parfaite avec le spectre d'absorption.
En fait, pour l'obtenir pratiquement avec un spectrofluorimtre, on va placer le monochromateur de
rception sur d'mission de fluorescence la longueur d'onde de maximum d'intensit de fluorescence
et on va balayer les longueurs d'onde d'excitation avec le monochromateur d'excitation. Comme les
lampes sources n'ont pas une intensit de flux d'excitation constante avec , on obtient un spectre
d'excitation apparent pour le fluorimtre utilis (qui peut donc correspondre une zone du spectre
d'absorption lgrement dform).
3.2. Spectres d'mission

Pour l'obtenir, on rgle l'excitation , du maximum d'excitation . On enregistre l'intensit d'mission
pour diffrentes longueurs d'ondes slectionnes par le monochromateur dfinissant I de la "lumire"
atteignant le photomultiplicateur (le capteur). En fait, du maximum d'mission de fluorescence qui va
tre obtenu est peu dpendant de la longueur d'onde d'excitation.

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3.3. Reprsentation conventionnelle

Par convention, on reprsente souvent les 2 spectres sur un mme graphe du type de celui de la figure
7. Il faut bien avoir en tte quoi correspond vraiment chaque spectre.
4. Remarque concernant le phnomne de transfert de fluorescence

Si 2 chromophores fluorescents qui appartiennent une mme molcule sont suffisamment proches et
que le spectre d'mission d'un des 2 chromophores appel donneur recouvre le spectre d'excitation de
l'autre chromophore appel accepteur, on constate que l'mission de fluorescence sera due en fait au
chromophore accepteur. Il y a transfert de fluorescence vers le chromophore accepteur.
5. Rendement quantique de fluorescence (Y) (hors programme)

Y = (nombre de molcules se dsactivant d'un tat excit vers l'tat fondamental en mettant un photon)
/ (nombre de photons absorbs) = (nombre de photons mis) / (nombre de photons absorbs).
0 < Y < 1.
6. Facteurs du milieu modifiant la fluorescence d'une molcule donne

- nature du solvant : selon sa nature, le spectre d'mission et le rendement quantique seront modifis.
- pH du milieu : pour des molcules fluorescentes ionisables en solution aqueuse, les variations de pH
entranent des variations de spectre d'mission et de rendement quantique.
- temprature et viscosit : en diminuant la temprature et en augmentant la viscosit, on augmente le
rendement quantique.
- effets d'autres molcules environnantes : par exemple, le dioxygne est connu pour abaisser le
rendement quantique de fluorescence de nombreux fluorochromes. (Dsaration des solutions
analyser).
Il est d'usage d'appeler "Quenching", toute influence qui diminue l'intensit d'mission de fluorescence.
Ainsi de nombreuses natures de solvant peuvent participer au "Quenching".
7. Fluorimtrie et analyse quantitative

Soit des solutions contenant un fluorochrome mesures dans des conditions de rendement
quantique constant. On mesure exc. donne et m. donne.
Soit 0 l'intensit du flux photonique d'excitation exc..
Soit l'intensit du flux photonique transmis (non absorb) exc.
Soit le coefficient d'absorbance molculaire du fluorochrome tudi exc..

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Soit I l'paisseur de cuve de mesure.

Soit c la concentration en fluorochrome.
On a = 0 10-lc (loi de Ber lambert)
Donc le flux absorb est abs = (0 - ) soit abs = 0 - 0 10-lc
soit abs = 0 (1 - 10-lc)
La fluorescence est mesure m. donne. Le rendement quantique est Y et les photons mesurs sont
ceux de longueur d'onde m. dont l'nergie est plus faible que celle des photons absorbs et selon un
angle qui fait qu'on ne mesure qu'une fraction f de la fluorescence.
On a donc fluorescence mesure = f Y 0 (1 10-lc) avec 0<f<1 et avec 0<Y<1.
Si c est faible, le dveloppement limit au premier ordre donne :
fluorescence mesure = f Y 0 ln(10) I c qui devient :
fluorescence mesure = K c avec K coefficient qui sera valu par talonnage.
8. Applications de la fluorescence molculaire en biologie

8.1. Fluorimtrie et dosages quantitatifs de substances (hors anisotropie de fluorescence)
Principe du dosage expos au paragraphe 7.
De nombreux dosages en biologie peuvent tre raliss en mesurant finalement une intensit de
fluorescence. De tels dosages exigent de travailler dans des milieux de composition strictement
dtermine pour s'assurer que les rendements quantiques ne varient pas.
La sensibilit des dosages par fluorimtrie est de 100 1000 fois plus grande que celle des dosages par
absorptiomtrie ! Les dosages fluorimtriques impliquent 2 longueurs d'ondes caractristiques de la
substance mesurer: une exc. donne et m. donne. Ceci amliore a priori les capacits de tels
dosages viter les interfrences par rapport aux dosages absorptiomtriques qui sont ralise une
longueur d'onde d'absorption donne.
Des applications exemples en biologie sont :

- fluorimtrie quantitative dans les dosages mettant en uvre des ractions enzymatiques et faisant
intervenir le couple NAD+/NADH,H+.
Voir ce sujet les chapitres concernant les dosages mettant en uvre des ractions enzymatiques et
faisant intervenir le couple NAD+/NADH,H+.
- fluorimtrie quantitative dans les dosages de substances mettant en uvre des ractions Ag/Ac et des
Ag ou des Ac marqus par des fluorochromes = dosages par immunofluorescence. De tels dosages sont
ralisables en mthodes comptition en phases htrogne, en mthodes non comptitives en phase
htrogne ou en mthode comptitive en phase homogne. Il faut voir ce propos le cours ddi sur
les dosages de substances mettant en uvre des Ag ou des Ac marqus.
- fluorimtrie quantitative en cytomtrie de flux. Voir chapitre ddi. On rappelle simplement qu'une
population de cellules tudier par cytomtrie de flux peut tre marque par des fluorochromes : par
exemple le marquage de l'ADN au BET, le marquage spcifique de telle ou telle cellule par un anticorps
conjugu un fluorochrome.
Chaque cellule engage dans le tube de flux passe devant un clairage laser une longueur d'onde
adquate et donne un flash de fluorescence dont l'intensit dpend de la quantit de fluorochrome fix.
Ceci permet de construire des histogrammes de distribution dans la population des cellules analyses et
de raliser des tris de cellules.
8.2. Anisotropie de fluorescence (hors programme)

On utilise une "lumire" d'excitation polarise. On mesure l'mission de fluorescence selon 2 angles de
polarisation (1 parallle || et 1 perpendiculaire _|_ la polarisation de la "lumire" d'excitation).
L'effet d'anisotropie de fluorescence A est dfini par :
(Intensit mission polarise || ) - (Intensit mission polarise _|_ )

A = ----------------------------------------------------------------------------------------------
(Intensit mission polarise || ) + 2 x (Intensit mission polarise _|_)

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Applications :
- Un antigne marqu par un fluorochrome, selon qu'il est libre ou li un anticorps, ne donnera pas la
mme polarisation de fluorescence (essentiellement par effet de taille, le complexe Ag-Ac est plus gros
que l'Ag libre). Ceci permet des dosages de substances par mthodes immunologiques trs rapides qui
ne ncessitent pas toutes les tapes de lavage des mthodes immunofluorimtriques ou
immunoenzymatiques classiques.
- L'effet d'anisotropie de fluorescence est fondateur de mthodes permettant d'valuer le volume
molculaire l'tat hydrat de biomolcules (hors programme) d'tudier des interactions protines
ligands ; protines molcules de l'environnement solvant.
8.3. Marquages fluorescents "qualitatifs"

8.3.1. Marqueurs fluorescents utiliss pour observations de cellules en microscopie
fluorescence
- Marquages l'acridine orange ou au DAPI ou aux marqueurs fluorescents modernes d'activit
biologique et numrations DEFT. Voir chapitre ddi. On rappelle simplement ici que l'acridine est un
fluorochrome mtachromatique dont la fluorescence n'apparat que lorsque la molcule est intercale
dans les acides nucliques ADN et ARN. L'mission est verte pour des acides nucliques doubles brins
et rouge pour des acides nucliques simples brins.
- Coloration en fluorescence des mycobactries l'auramine. Voir chapitre ddi.
- Marquages spcifiques par anticorps conjugus des fluorochromes en histologie/cytologie et en
microbiologie. Voir les chapitres ddis. Les mots clefs : techniques directes et techniques indirectes.
8.3.2. Marquage fluorescent de l'ADN au BEI et lectrophorses

Voir le chapitre lectrophorses d'acides nucliques.
8.3.3. Remarque concernant le phnomne d'exctinction de fluorescence

Les marqueurs fluorochromes utiliss en biologie sont gnralement des molcules peu stables et dans
les milieux biologiques, l'clairage UV conduit l'apparition de radicaux libres qui conduisent une
raction autocatalytique de destruction des fluorochromes. C'est le phnomne d'extinction de
fluorescence : la fluorescence diminue (de faon exponentielle) sous clairage UV.

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1. Le phnomne de fluorescence molculaire

Lorsqu'une molcule donne prsente la proprit de fluorescence c'est que :

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3.1. Spectres d'excitation

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5. Rendement quantique de fluorescence (Y) (hors programme)

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Soit I l'paisseur de cuve de mesure.

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Des applications exemples en biologie sont :

8.2. Anisotropie de fluorescence (hors programme)

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8.3. Marquages fluorescents "qualitatifs"

8.3.2. Marquage fluorescent de l'ADN au BEI et lectrophorses

8.3.3. Remarque concernant le phnomne d'exctinction de fluorescence

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