Cromatografía

CROMATOGRAFÍA
SEPARACIÓN DE DOS PIGMENTOS NATURALES DE LA PAPRIKA

EMPLEANDO CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA Y DE CAPA FINA
OBJETIVOS
 Familiarizar al estudiante con técnicas de separación como la cromatografía
 Empacar una columna y correr una cromatografía en ella.
 Realizar una cromatografía de capa fina.
 Separar al menos dos de los pigmentos naturales presentes en un extracto
hexánico de “paprika” por cromatografía de columna.
 Confirmar la separación por medio de cromatografía de capa fina.
MARCO TEÓRICO: GENERALIDADES
 La cromatografía es un método físico de separación.
 Se basa en la diferencia de distribución de los componentes de una mezcla entre
dos fases inmiscibles: móvil y estacionaria
 Las moléculas del soluto de la mezcla son retenidas por la fase estacionaria y
arrastradas por la fase móvil.
 La afinidad viene determinada por las fuerzas de tipo Van der Waals, los puentes
de hidrógeno o la transferencia de carga.
 Los componentes que sean fuertemente retenidos se moverán más lentamente.
 Como consecuencia de esta diferencia de movilidad, los componentes se separan.
 La cromatografía es una técnica extremadamente versátil.
 Permite:
 la separación de mezclas,
 la purificación de productos,
 la determinación del grado de pureza de un compuesto,
 el seguimiento de reacciones o
 la detección y caracterización de compuestos.
 Su principal ventaja consiste en que se aplica a cantidades muy
pequeñas de producto (del orden del μg).
MARCO TEÓRICO: CLASIFICACIÓN
 Las técnicas cromatográficas, se pueden clasificar atendiendo a varios
criterios
 naturaleza de las fases Cuadro 1. Métodos cromatográficos basados en
(sólido, líquido, gas) la naturaleza de la fase móvil.
 relación de polaridad de las fases
(fase normal, fase inversa) Tipo de Cromatografía
Fase
Fase móvil
Mecanismo de
estacionaria separación
 mecanismo de separación (adsorción,
Adsorción
exclusión, intercambio iónico, reparto, Sólido Líquido
Exclusión
afinidad),
Líquida (LC) Resina
 disposición de las fases intercambiadora
Líquido Intercambio iónico
(en columna, en plano) y
Líquido Líquido Reparto
 forma de desarrollo del proceso (frontal, Líquido Gas Adsorción
Gaseosa (GC)
de desplazamiento, de elución). Sólido Gas Adsorción
De fluidos supercríticos Sólido-especies

Fluido supercrítico Reparto
(SFC) orgánicas
MARCO TEÓRICO: CROMATOGRAFÍAS A
DESARROLLAR
 Cromatografía de adsorción en
columna (CC)
 Cromatografía de adsorción en
capa fina (TLC)
 FASE ESTACIONARIA –GEL
DE SÍLICE:
MARCO TEÓRICO: CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA
 Fase estacionaria:
sólido adsorbente empacado en columna
de vidrio.
gel de sílice, alúmina, sacarosa y almidón
 Fase móvil:
Disolvente o mezcla de disolventes.
Éter de petróleo ˂ tetracloruro de carbono ˂
ciclohexano ˂ éter etílico ˂ acetona ˂ benceno ˂
acetato de etilo ˂ cloroformo ˂ etanol ˂ metanol ˂
agua ˂ piridina ˂ ácido acético
 Preparación:
Soporte filtrante (arena/gasa/fibra).
Empacado de papilla
Tapa estabilizante (arena/filtro)
Correr para empacar
No dejar secar
 Aplicación de muestra:
Directa o disuelta.
Introducir por corrida.
Proteger sin difundir.
 Desarrollo/elución:
Soporte filtrante (arena/gasa/fibra).
Empacado de papilla
Correr para empacar
No dejar secar
Recolectar con criterio.
MARCO TEÓRICO: CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
 Fase estacionaria
Depositada en soporte
(aluminio, vidrio).
Se puede tratar.
 Fase líquida
Igual que en anterior.
Puede ascender, descender o irradiar
horizontalmente.
 Factor de retardo (Rf)

 Depende de
 Temperatura
 Saturación de cámara
 Fase móvil
 Fase estacionaria
 Preparación:
Se deposita fase estacionaria como capa
delgada de papilla.
Se deja secar o se seca en estufa.
Disponibles comercialmente.
 Aplicación de muestra:
Se deposita en base de placa con capilar.
Zona definida y marcada.
Dejar espacio para eluyente.
 Desarrollo:
Se coloca en cámara saturada y se deja
correr.
Parar un poco antes de alcanzar el tope
Marcar frente de solvente antes de que se
evapore.
Marcar manchas antes de que
desaparezcan
Revelar si es necesario.
Calcular Rf’s.
PARTE EXPERIMENTAL: MATERIALES Y
REACTIVOS
PARTE EXPERIMENTAL: PROCEDIMIENTO
Cromatografía de columna
1. Remueva aguja y émbolo de la jeringa.
2. Coloque la jeringa en soporte con prensa.
3. Coloque en el fondo de la jeringa un pedazo de
gasa de 2 cm x 2 cm (filtro).
4. En beaker 50 mL, pese 2 g de gel de sílice.
5. Adicione al beaker con el gel de sílice suficiente
hexano para formar una papilla.
6. Deposite la papilla en la jeringa.
7. Adicione a la parte superior de la jeringa un filtro
de papel de 1 cm de diámetro.
8. Con el hexano 2 mm por encima del filtro,
adicione 5 gotas del extracto de paprika.
9. Continúe agregando hexano con el gotero hasta
que muestra esté dentro de fase estacionaria.
10. Siga agregando hexano para separar los
colorantes.
11. Recoja cada colorante en un tubo de ensayo
pequeño.
12. Concentre lo recolectado en baño maría en
capilla.
Cromatografía de capa fina
1. En un cromatofolio haga las marcas con lápiz.
2. Siembre:
 extracto original en el lado izquierdo,
 primer colorante separado (amarillo) concentrado
en el centro y
 segundo colorante separado (anaranjado)
concentrado en la derecha..
 Deje secar al aire.
3. Deje secar al aire
Cromatografía de capa fina
4. En un beaker coloque fase móvil para que el líquido
quede a unos 2 mm del fondo.
5. Tape con el vidrio reloj para saturar la cámara de
cromatografía.
6. Coloque el cromatofolio sembrado, seco, en el
beaker.
7. Tape y deje correr, hasta que la fase móvil llegue 2
mm de la parte superior del cromatofolio.
8. Compare las tres muestras que aplicó y calcule los
Rf de cada pigmento puro y en la mezcla.

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