INTRODUCCIÓN A LA

CROMATOGRAFÍA

Dra. Diana Becerra Morales

TÉRMINOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA

Cromatografo Instrumento empleado para realizar

una separación cromatográfica.

Cromatograma Representación gráfica de la composición

de los solutos que salen de una columna
cromatográfica en función del tiempo.

Eluir Proceso en el que la fase móvil se desplaza

a lo largo de la fase estacionaria
transportando los componentes a separar.

Eluyente Disolvente aplicado al principio de una

columna cromatográfica.

Detector Aparato que registra una propiedad físico-

química del material eluido.
 ¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA?

Es un conjunto de técnicas que tienen como

objetivo la separación de mezclas basándose
en las diferentes interacciones de cada
componente en otra sustancia.
CROMATOGRAFÍA
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
Método utilizado inicialmente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los componentes se
distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser
un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel. La fase
estacionaria puede estar contenida en una columna,
extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película.
La fase móvil puede ser gaseosa o líquida.
CROMATOGRAFÍA
Chroma = Color
Graphein = escribir

Mikhail Tswett, 1906

Separación de los
pigmentos vegetales
coloreados
EVOLUCIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA

Desde la columna sencilla de Tswett, se ha

evolucionado hasta los modernos equipos que
hoy se conocen

Cromatografo de gases con

Equipos para HPLC
espectrofotómetro de masas
CROMATOGRAFÍA

De forma general, consiste en pasar una fase móvil (que

contiene una mezcla con el compuesto deseado en el
disolvente) a través de una fase estacionaria fija sólida. La
fase estacionaria retrasa el paso de los componentes de la
muestra, de forma que los componentes la atraviesan a
diferentes velocidades y se separan en el tiempo. Cada uno
de los componentes de la mezcla presenta un tiempo
característico de paso por el sistema, denominado tiempo
de retención.
 En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se
desplaza con una fase móvil que se hace pasar a través de una
fase estacionaria

Eluyente COLUMNA Eluato

Fase móvil Fase estacionaria

Líquido o gas que transporta Sólido o líquido inmovilizado
los analitos a través de una sobre el cual se reparte la
fase estacionaria. especie de analito durante el
paso de una fase móvil.

Las interacciones química cruciales

tienen lugar en la superficie de la fase
estacionaria.
MÉTODOS INSTRUMENTALES

Entrada de la
fase móvil

DETECTOR

Cromatograma
 Según el dispositivo utilizado
para poner en contacto la fase
estacionaria y la fase móvil

TIPOS DE
CROMATOGRAFÍA

Según el mecanismo de
Según los estados de interacción del soluto
las fases implicadas con la fase estacionaria
REPRESENTACIÓN DE UN CROMATOGRAMA

Respuesta del detector

Tiempo de retención (tR): Representa el tiempo transcurrido entre el instante de

inyección y el determinado cuando el pico correspondiente en el cromatograma
alcanza su máximo.
 La separación de los componentes de la muestra
problema se debe a la acción de dos efectos
contrapuestos

Efecto de
retención Efecto de
arrastre

Ejercido sobre los

componentes de la mezcla
por la fase estacionaria que Ejercido por la fase móvil que
está situada en el soporte. los empuja a través del
camino recorrido.
 CLASIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFÍA

FASE MÓVIL GAS LÍQUIDO

Líquido Sólido Líquido Sólido

FASE
ESTACIONARIA
Adsorbente Adsorbente Resina Gel

SOPORTE
Columna Plano Columna
Columna Columna

Reparto Reparto Adsorción Intercambio Tamaño

Reparto Adsorción
iónico molecular

C.G.L C.G.S C.L.L C.P C.C. F. C.L.S

C.C.I C.E.M
NOMBRE c.gas- c.gas- c.líq-líq c. c. capa c. liq-
c. cambio c. exclusión
líq sól papel fina sól
iónico molecular

Figura tomada de Hernández, L.

Introducción al análisis instrumental. 2002
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

1. Cromatografía de adsorción
2. Cromatografía de partición
3. Cromatografía de intercambio iónico
4. Cromatografía de exclusión por tamaño
1. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Se basa en la diferente afinidad de las moléculas por

un disolvente y por la matriz a través de la que
fluyen.
 CROMATOGRAFÍA PLANA

La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en

papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la
fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada
por la gravedad.
2. CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

La fase estacionaria de la cromatografía de partición

es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra vez,
la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de
partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de
partición gas-líquido, GLC).
2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida

insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos
cargados.
La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza
por lo general, en dos fases:

• Las sustancias a separar se unen al intercambiador

mediante uniones fuertes y estables
• Se eluyen de la columna con tampones de diferentes pH
o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes
del tampón con el material, por los sitios de unión.
2. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑO

Puede separarse moléculas de acuerdo a su tamaño y

habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase
estacionaria).
5. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente

específicas entre un tipo de moléculas de soluto y una
segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la
fase estacionaria.
5. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Dentro de las cromatografías cuya fase móvil está

constituida por un líquido, destaca la Cromatografía
Líquida de Alta Resolución (HPLC, High Performance
Liquid Chromatography)

Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar

una muestra líquida, o sólida disuelta, en un disolvente
adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna
cromatográfica.
Cromatógrafo HPLC
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography

Bomba inyector
Inyección

Columna

Desgasificador
Horno para la
columna
Eluente

Reservorio del
Desechos Detector
solvente
CROMATOGRAFO DE GASES
CROMATÓGRAFO DE GASES
En la cromatografía de gases se utiliza una fase móvil gaseosa
para transportar la muestra a través de la columna, que
puede estar rellena o tener revestida la superficie interior

Columnas GC Columnas HPLC

Separación de compuestos

Tiempo (t)

Flujo de gas portador

Separación (tr2-tr1)
Anchura de pico (Wb1,2)

Los compuestos se separan debido a sus diferentes afinidades a la columna

durante la fase estacionaria. Los compuestos con menor afinidad eluirán
antes de la columna, mientras que aquellos que posean una mayor afinidad
eluirán más tarde.
Configuración de un sistema GC
Descripción general

Fuente de
gas

Muestreador Inyector

Columna

Detector

Salida
Configuración de un sistema GC
Descripción general
Configuración de un sistema GC
Gas Portador
El gas portador (por ejemplo, helio, nitrógeno, hidrógeno o una mezcla de argón y metano)
debe ser puro (> 99,9995 %). Los contaminantes pueden reaccionar con la muestra y la
columna, crear picos falsos, sobrecargar el detector y aumentar la línea base, entre muchos
otros problemas.
La función del gas portador es transportar la muestra a través del sistema.
Se recomienda utilizar un gas de gran pureza e instalar trampas para agua, hidrocarburos y
oxígeno.
Configuración de un sistema GC
Gas Portador
Configuración de un sistema GC

Inlet o Inyector
Configuración de un sistema GC

Inlet o Inyector
Configuración de un sistema GC

Inlet o Inyector

Modo split
El modo split permite inyectar
una muestra más grande,
vaporizarla y, a continuación,
transferir tan solo una parte de
ella a la columna. El resto se
desecha como residuo.

La válvula de split permanece

abierta.

La muestra se inyecta en el liner,

donde se vaporiza. A
continuación, la muestra
vaporizada se reparte entre la
columna y la purga de split.
Configuración de un sistema GC

Inlet o Inyector
Configuración de un sistema GC

Columna
La muestra vaporizada se introduce en la columna por medio de un gas
portador. Los compuestos se reparten de forma selectiva entre la fase
estacionaria (revestimiento) y la fase móvil (gas portador).
Puede fijarse una rampa de temperatura del horno para eluir todos los
compuestos.
Isotérmica: la temperatura no varía durante el análisis.
Con rampa: la temperatura aumenta durante el análisis.
Configuración de un sistema GC

Columna
Una columna GC capilar se
compone de un tubo estrecho
(entre 0,05 y 0,53 mm de d. i.)
que presenta en su interior un
revestimiento polimérico fino
(entre 0,1 y 10,0 µm).
El diámetro de la columna influye
sobre la eficiencia, la retención de
soluto, la presión en la cabeza y el
flujo de gas portador.
La longitud de la columna afecta a
la retención de soluto, la presión
en la cabeza, el sangrado y los
costes.
Configuración de un sistema GC

Detector
Configuración de un sistema GC

Detector
Configuración de un sistema GC
Sensibilidad de los detectores
Configuración de un sistema GC

Detector
Configuración de un sistema GC
Cromatograma
El tamaño de pico indica la cantidad de compuesto presente en la muestra.
Cuanto mayor sea la concentración del compuesto, más grande será el pico
obtenido.
El tiempo de retención (tR) es el tiempo que tarda un compuesto en
atravesar la columna.
Si la columna y todas las condiciones de funcionamiento no varían, un
determinado compuesto siempre tendrá el mismo tiempo de retención.
 Resolución de un Cromatograma
Magnitud de la separación lograda por la columna de las componentes de la matriz

tr2-tr1 tr2-tr1

R=1.18 d/w1+w2

Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad

Wb1 Wb2 Wb1 Wb2

Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad

Tiempo de retención y anchura de pico
h

tr2 tri Tiempo de retención del

compuesto "i"
tr1
W1/2 Anchura de pico a la
mitad de la altura
Wbi Anchura de pico en la
línea de base

W1/2

Wb1 Wb2
t

El tiempo de retención de un compuesto no retenido (tM o t0) también

se conoce como tiempo muerto. Las moléculas del soluto no retenido avanzan por la
columna a la misma velocidad que el gas portador.
 Factor de retención (k')

t t  t 'R tr Tiempo de retención

k `  r M  
 tM  tM tM Tiempo de retención del pico no retenido

El factor de retención (también conocido como coeficiente de reparto

o factor de capacidad) es la relación entre los tiempos que un soluto pasa
en las fases estacionaria y móvil. Se calcula dividiendo el tiempo de
retención entre el tiempo de un pico no retenido (tM). Para un compuesto
no retenido, tiene un valor nulo (k = 0).
Dado que todos los solutos pasan el mismo tiempo en la fase móvil,
el factor de retención es una medida de la capacidad de retención
de la fase estacionaria.
Parámetros que influyen sobre el factor de retención:
• Fase estacionaria
Selectividad o factor de separación (α)
a Selectividad
k2 k1 Factor de retención del primer pico

k1 k2 Factor de retención del segundo pico

La selectividad es una medida del tiempo o la distancia entre dos picos.

Si α = 1, ambos picos tendrán el mismo tiempo de retención y coeluirán.
La selectividad se define como la relación de los factores de capacidad.
Parámetros que influyen sobre el factor de retención:
• Fase estacionaria
• Fase móvil
• Temperatura
Eficiencia o número de platos teóricos (N)
2 2
 tr   tr 
N  16    N  5,54   
 Wb   W1/ 2 

La eficiencia de la columna se utiliza para comparar el rendimiento de

diferentes columnas. Se expresa por medio del número de platos
teóricos (N).
Las columnas con un número alto de platos son más eficientes. Una
columna
con un valor N alto generará picos más estrechos para un determinado
tiempo
de retención que una columna con un valor N más bajo.
Parámetros que influyen sobre la eficiencia de la columna:
• Longitud de la columna (a mayor longitud, mayor eficiencia).
• Tamaño de partícula (a menor tamaño de partícula, mayor eficiencia ).
Altura equivalente a un plato teórico (H)

L L Longitud de la columna (mm)

H
N N Número de platos teóricos

Otra medida de la eficiencia de la columna es la altura

equivalente a un plato teórico, que se representa como "H".
Habitualmente, se expresa en milímetros.
Cuanto menor sea cada plato teórico, más platos "contendrá"
una determinada longitud de columna. Esto se traduce en un
mayor número de platos por metro y una mayor eficiencia de
la columna.
 Resolución: separación en la línea de base

La resolución indica la capacidad de una columna

para separar los picos de interés. Rs ≥ 1,5

h
Sobre la resolución influyen la eficiencia (N), la
selectividad (a) y la retención (k).
t r 2  t r1
• Debe tener como mínimo un valor igual Rs 
a 1 para conseguir una separación medible 1 / 2  (Wb 2  Wb1 )
y una cuantificación suficiente.
• Se necesita un valor igual a 0,6 para que se pueda
distinguir un valle entre dos picos de la misma
tri Tiempo de retención del
altura. compuesto "i"
• Para los métodos más robustos normalmente se Wbi Anchura de pico en la base
requieren valores iguales o superiores a 1,7. del compuesto "i"

• Se considera que un valor igual a 1,6 se

corresponde con una separación en línea de base y
garantiza unos resultados cuantitativos de
precisión máxima.

t
¿Cómo se puede influir sobre la separación?

Un número de platos (N) alto aporta las siguientes ventajas:

picos agudos y estrechos
mejora de la detección
capacidad de picos que permite separar muestras complejas
No obstante, la resolución únicamente aumenta de forma proporcional
a la raíz cuadrada del número de platos.
RS ~ N.
Asimismo, el aumento del número de platos viene limitado por las condiciones
experimentales.
Por ejemplo, el tiempo de análisis y la presión.
En una columna de 122 cm de longitud y a una temperatura de 160ºC se obtuvieron
los siguientes tiempos de retención en minutos: pico del aire 0.90, heptano 1.22 y
octano 1.43.

El ancho en la base de los picos fue de 0.14 min para el heptano y de 0.20 min para
el octano.

a) Calcular la retención relativa y la resolución para estos picos.

b)¿Qué longitud debería tener la columna para obtener una resolución de 1.