PRÁCTICA No.

004 – Producción de proteasas a partir de Bacillus subtilis en un medio

a base de suero de leche
Sofía Cascante1, Anahí Velasteguí1 & Juan Negrete1
1
Universidad de las Américas. Carrera de Ingeniería en Biotecnología. Quito– Ecuador.
RESUMEN

Las proteasas son enzimas clave dentro de varias industrias porque solventan problemáticas de
manera efectiva. Es así que, su producción se da a partir de microorganismos, en este informe
se trabajó con B.subtilis como productor, en un medio de cultivo formulado a base de suero de
leche; que es un residuo de la industria láctea, caracterizado por su gran cantidad de nutrientes.
Entonces, se planteó la elaboración de un cultivo de bajo costo a partir de suero de leche, para
la producción de proteasas extracelulares. Finalmente, se determinó con una prueba cualitativa
de precipitación de la caseína, que la producción de dicho metabolito fue menor en
comparación con la producción en un medio convencional.

PALABRAS CLAVES
Proteasas, Bacillus subtilis, suero de leche, medio de cultivo

SUMMARY

Proteases are key enzymes within several industries because they solve problems effectively.
Thus, its production occurs from microorganisms, in this report we worked with B.subtilis as
a producer, in a culture medium formulated from whey; which is a waste from the dairy
industry, characterized by its large amount of nutrients. Then, the development of a low-cost
culture from whey for the production of extracellular proteases was proposed. Finally, it was
determined with a qualitative casein precipitation test that the production of said metabolite
was lower compared to the production in a conventional medium.

KEY WORDS

Proteases, Bacillus subtilis, whey, culture medium

INTRODUCCIÓN

Las proteasas son enzimas que tienen como función la catálisis del rompimiento de un enlace
peptídico entre proteínas, generando como producto aminoácidos o péptidos de menor tamaño.
Además, se clasifican en 2 tipos, las exopeptidasas que pueden realizar cortes en el sector del
amino terminal de la cadena peptídica; mientras que, las endopeptidasas realizan una hidrólisis
dentro de la secuencia proteica (Si et al, 2018).

La importancia de la producción de estas enzimas radica en las grandes aplicaciones que tienen
a nivel industrial como en farmacéuticas, alimentos, textiles, tratamiento de residuos.
Actualmente, se tiene que las proteasas constituyen un 60% de las ventas a nivel mundial de
enzimas (Sharma et al, 2017).
Por otra parte, la cepa de Bacillus es un gran productor de proteasas extracelulares. Entre las
razones principales se encuentra el rápido crecimiento que oferta el microorganismo, el espacio
reducido que ocupa y la facilidad con la que se pueden editar los genomas de estas bacterias
para optimizar sus rendimientos (Chu, 2006). Además, las proteasas producidas tienen una gran
termo estabilidad y pueden trabajar en niveles de pH altos, siendo eficaces en su uso dentro de
detergentes (Krishna & Kodidhela, 2005). Por otra parte, sus requerimientos nutricionales no
son exigentes, trabajando con carbono y nitrógeno como micronutrientes esenciales.

En ese sentido, se buscó un enfoque diferente para el uso de desechos de la industria láctea.
Este subproducto se considera uno de los mayores contaminantes del ambiente a nivel mundial;
siendo nocivo para la vida marina y los océanos; porque posee una alta demanda bioquímica
de oxígeno, generando eutrofización (Ryan & Walsh, 2016). No obstante, contiene una gran
cantidad de macromoléculas como carbohidratos, proteínas, sales de calcio, metales, etc; por
lo que, se lo propone como un medio de cultivo alternativo y de bajo costo, para el crecimiento
de la bacteria B.subtilis y la producción de proteasas extracelulares.

Para determinar la producción del metabolito en el medio se requiere realizar una prueba
cualitativa que utiliza la caseína como sustrato de las proteasas porque es la proteína más
abundante de la leche; Joo et al (2002), explicaron que la actividad proteasa se puede
determinar con los sobrenadantes del medio de cultivo, tras una centrifugación; observando
coágulos.

Finalmente, el presente estudio tiene como objetivo general, elaborar un cultivo de bajo costo
a partir de suero de leche para la producción de proteasas extracelulares. Además, de determinar
la producción de dicho metabolito con la prueba cualitativa de precipitación de la caseína.

METODOLOGÍA

Medio low cost

A partir de 120 mL suero de leche, se sometió a calor en plancha térmica a 80 °C durante 20

minutos para la desproteinización del suero. Posteriormente, se centrifugó en tubos Eppendorf
de 50 mL a 6000 rpm durante 15 minutos. Una vez centrifugado, se extrajo el sobrenadante en
un matraz de 250 mL hasta completar un volumen de 99 mL, sin tomar la capa de grasa presente
en la superficie. Se suplementó con 1 mL de extracto de levadura 1%. Posteriormente, se ajustó
a pH 6 mediante la adición de hidróxido de sodio 20% y se sometió a autoclave a 121 °C
durante 15 minutos. Por último, se inoculó el medio con Bacillus subtilis y se incubó a 30 °C
durante 48 horas.

Extracción de proteasas

En tubos Falcon se colocaron 13 mL de caldo LB cultivado por 48 horas a 30 °C. Los tubos se
centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos y, separó el sobrenadante (solución con enzimas
extracelulares).

Prueba cualitativa
Se preparó la “solución 1” compuesta por leche deslactosada y descremada de la marca Svelty
(99.9% libre de grasa) al 10%; junto con tampón fosfato con un pH 7.1. Posteriormente, se
distribuyeron 5 mL de esta solución 1 en tres tubos Falcon de 15mL respectivamente. Por lo
que, al primer tubo se le agregaron 2mL de tampón fosfato y 2mL del sobrenadante con las
proteasas. Mientras que, al segundo tubo se le añadieron 2mL del tampón fosfato para formar
el control negativo; para finalizar, el tercer tubo Falcon tenía 2 mL de HCl al 3M como control
positivo.

Posterior, los tubos fueron incubados a 37°C durante 10 minutos.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Prueba cualitativa

La muestra con leche deslactosada y descremada indicó la presencia de proteasas, a pesar de la

baja cantidad. Además, el control positivo mostro la presencia de gran cantidad de grumos
blanquecinos efecto del ácido y el control negativo no mostró presencia de grumos. De esta
forma, se valida los resultados de la prueba cualitativa (figura 1).
El primer factor importante en la prueba cualitativa fue elegir el tipo de leche usado, en este
caso, leche descremada-deslactosada con un 99% libre de grasa. Esta decisión se tomó porque
se busca un resultado limpio, ya que, si se trabajaba con leche entera la presencia de grasas
podría haber intervenido en los resultados. Esto se da porque el microorganismo B.subtilis es
capaz de no solo producir proteasas sino también es productor de lipasas, lo que habría
generado errores en la prueba. (Su et al., 2020).

La formación de grumos se explica debido a que este tipo de leche tiene un alto contenido de
proteínas, como la caseína, que puede desnaturalizarse con relativa facilidad y debido a varias
razones, por ejemplo, cambios en la temperatura, el pH o la adición de enzimas, en este caso
las proteasas. La desnaturalización de la proteína se da porque la estructura de la
macromolécula se altera con facilidad debido a la perdida de cadenas peptídicas largas,
resultado de la hidrólisis separa a péptidos y aminoácidos de esta (acción de las proteasas)
formando los coágulos observados (Costa et al., 2002).

Se usó el ácido clorhídrico como agente precipitador debido a que Fallourd & Viscione (2009)
explican que, durante la acidificación de la leche, el pH se altera y como resultado se obtiene
la precipitación de la caseína. Esta proteína es importante en la prueba cualitativa debido a su
alta susceptibilidad a los cambios, como, el proceso de hidrolisis generado por las proteasas,
además, es por este proceso que se altera la estructura helicoidal de la proteína generando que
la misma tome un aspecto a leche cortada. (Datta & Deeth, 2021).

A diferencia de la prueba cualitativa en el medio convencional (figura 2) la presencia de grumos

fue considerablemente menor, se cree que esto se dio porque la concentración de proteasas en
el sobrenadante obtenido es menor. No obstante, esta teoría no se puede comprobar porque no
se realizaron estudios de cuantificación. Lo que se puede inferir por Zikmanis et al (2020) es
que la cantidad de enzima presente se va a ver influenciada por la composición del medio de
cultivo (suero de leche); Esta diferencia de composición depende del proceso lácteo del que se
haya obtenido el suero, por ejemplo, el suero de leche ácido (pH <5) y el suero de leche dulce
(pH de 6-7), la diferencia entre estos dos tipos de suero de leche es la cantidad de sales,
proteínas y lactosa. Siendo el suero de leche ácido el que presenta una mayor cantidad de estos
tres componentes.

Adicionalmente, en la revisión bibliográfica realizada Pant et al (2015) menciona que, la

máxima actividad de las proteasas se da en temperaturas de 40 °C a 50 °C, lo que difiere de la
temperatura utilizada en el laboratorio la cual fue de 37°C, este factor también pudo haber
influido en la actividad hidrolítica que presentaron las enzimas.

De igual forma, otro factor que pudo influir en la obtención de estos resultados fue el tiempo
de incubación de la proteasa, debido a que el mismo difiere y es menor al tiempo de incubación
utilizado por Schönbichler et al (2020) en su estudio de la actividad enzimática de la proteasa
tripsina, donde se presenta un tiempo de incubación de 20 minutos. De igual forma, la
centrifugación utilizada en esta metodología difiere de la utilizada en esta práctica, en este
estudio se usó 5000 rpm por 30 minutos, mientras que la centrifugación de esta práctica si bien
se realizó a la misma velocidad, el tiempo de centrifugación fue de 10 minutos. Existe un
estudio adicional realizado por Shafieque et al (2021) donde se explica que la centrifugación
de sus muestras para comprobar la presencia de proteasas fue 10000 rpm durante 20 minutos a
temperatura de 4°C.

CONCLUSIONES

En conclusión, se elaboró un cultivo de bajo costo a partir de suero de leche, donde se consiguió
el adecuado crecimiento de la bacteria B.subtilis; sin embargo, la producción de proteasas se
determinó que fue menor en este medio a comparación del medio de cultivo alternativo; porque
la cantidad de grumos observada durante la prueba cualitativa fue más baja. Estos resultados
se deben a los siguientes factores o bien la combinación de estos: la composición del medio,
tiempo y temperatura de incubación y centrifugación. La optimización de las condiciones de
operación permitirá mejor obtención y detección de proteasas.

REFERENCIAS
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Bacillus. Journal Of Industrial Microbiology And Biotechnology/Journal Of Industrial
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Fallourd, M. J. & Viscione, L. (2009). Ingredient selection for stabilisation and texture
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https://doi.org/10.1186/s40643-020-00326-6

ANEXOS
Figura 1.- Comparación de prueba cualitativa. A) Control negativo (solución 1). B) Control
positivo (solución 1 y ácido clorhídrico 3M). C) Muestra (solución 1 y sobrenadante con
proteasas). Los círculos y la flecha roja indican la presencia de coágulos blanquecinos.

Figura 2.- Prueba cualitativa mediante leche deslactosada-descremada. A) Solución 1 junto

con sobrenadante con proteasas. B) Solución 1 como control negativo. C) Solución 1 junto con
ácido clorhídrico 3M como control positivo. Los círculos rojos muestran los coágulos formados
por proteína presente en leche.