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1 HPLC Basics Fundamentals of Liquid
Chromatography (HPLC) Courtesy of Agilent

Technologies, Inc
compuesto
Horno de
columna
bomba
Fundamentos de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Este curso le permitirá:
• Explicar los principios generales de los análisis de HPLC.
• Conocer las principales áreas de aplicación de HPLC.
• Identificar los componentes principales de un sistema HPLC y explicar sus principios de

funcionamiento.
HYDROPHILIC = hidrofilico Volatile carboxylic acids = Ácidos carboxílicos volátiles
HYDROPHOBIC = hidrofobico sulfonamides sulfonamidas
POLARITY = polaridad
Primero, ¿qué es la cromatografía líquida?
• La cromatografía líquida es una técnica de separación que implica:
• la colocación (inyección) de un pequeño volumen de muestra líquida
• en un tubo lleno de partículas porosas (fase estacionaria)
• donde los componentes individuales de la muestra son transportados a lo largo del tubo
empacado (columna) por un líquido movido por gravedad.
Nota: La forma moderna de cromatografía líquida ahora se conoce como "cromatografía
ultrarrápida".
• Los componentes de la muestra están separados entre sí por el relleno de la columna que
implica varias interacciones químicas y / o físicas entre sus moléculas y las partículas del relleno.
• Los componentes separados se recogen a la salida de esta columna y se identifican mediante una
técnica de medición externa, como un espectrofotómetro que mide la intensidad del color, o por
otro dispositivo que puede medir su cantidad.
Nota: busque la comparación con HPLC en la página 7HPLC
Página 6Entonces, ¿qué es HPLC?
• HPLC es una abreviatura de cromatografía líquida de alta resolución (también se la conoce como
LC de alta presión)
• La HPLC existe desde hace unos 35 años y es la técnica de separación más utilizada.
• La historia de HPLC:
• Principios de los 60: inicio de la HPLC como cromatografía líquida de alta presión
• Mejoras de finales de los años 70 en el material y la instrumentación de las columnas:

cromatografía líquida de alto rendimiento
• Desde principios de los 80: comenzó el "boom" en HPLC• Desde 2006 aparecieron nuevos
términos como UPLC, RRLC, UFLC, RSLC,… ..
7 ¿Qué es HPLC?
• HPLC es una técnica de separación que implica:
• la inyección de un pequeño volumen de muestra líquida
• en un tubo lleno de partículas diminutas (de 3 a 5 micrones (μm) de diámetro llamado fase
estacionaria)
• donde los componentes individuales de la muestra se mueven por el tubo lleno (columna) con
un líquido (fase móvil) forzado a través de la columna por alta presión suministrada por una
bomba.
En principio, LC y HPLC funcionan de la misma manera, excepto que la velocidad, eficiencia,
sensibilidad y facilidad de operación de HPLC es muy superior.
• Estos componentes están separados entre sí por el empaquetamiento de la columna que implica
varias interacciones químicas y / o físicas entre sus moléculas y las partículas de
empaquetamiento.
• Estos componentes separados son detectados a la salida de este tubo (columna) por un
dispositivo de flujo continuo (detector) que mide su cantidad. Una salida de este detector se
denomina "cromatograma líquido".
Nota: Compare esta descripción con la de la página 4 sobre HPLC "Cromatografía líquida"
¿Qué aspecto tiene un cromatograma líquido?
8Tiempo después de la inyección Se trata del cromatograma resultante de la inyección de un

pequeño volumen de líquido extraído de una cápsula de vitamina E que se disolvió en un
disolvente orgánico. Las separaciones por HPLC modernas generalmente requieren de 10 a 30
minutos cada una. Min 02468101214 Punto de inyección de la muestra en la columna Estos se
denominan picos cromatográficos y cada uno representa un compuesto separado Compuesto A
Compuesto B Compuesto
9 ¿Cómo se ve un LC de alta presión? (1) Describiendo los 5 componentes principales de HPLC y

sus funciones ...
1. Bomba:
• El papel de la bomba es forzar un líquido (llamado fase móvil) a través del cromatógrafo de
líquidos a una tasa de flujo específica, expresada en mililitros por min (mL / min).
• Las velocidades de flujo normales en HPLC están en el rango de 1 a 2 ml / min.
• Las bombas típicas pueden alcanzar presiones en el rango de 6000 a 9000 psi (400 a 600 bar).
• Durante el experimento cromatográfico, una bomba puede entregar una composición de fase
móvil constante (isocrática) o una composición de fase móvil creciente (gradiente).
2. Inyector:
• El inyector sirve para introducir la muestra líquida en la corriente de flujo de la fase móvil.
• Los volúmenes de muestra típicos son de 5 a 20 microlitros (μL).
• El inyector también debe poder soportar las altas presiones del sistema de líquido.
• Un muestreador automático es la versión automática para cuando el usuario tiene muchas

muestras para analizar o cuando la inyección manual no es práctica.
10 (2) Describiendo los 5 componentes principales de HPLC y sus funciones ...
3. Columna:
• Considerada el "corazón del cromatógrafo", la fase estacionaria de la columna separa los

componentes de la muestra de interés utilizando varios parámetros físicos y químicos.
• Las pequeñas partículas dentro de la columna son las que causan la alta contrapresión a
caudales normales.
• La bomba debe empujar con fuerza para mover la fase móvil a través de la columna y esta
resistencia provoca una alta presión dentro del cromatógrafo.
4. Detector:
• El detector puede ver (detectar) las moléculas individuales que salen (eluyen) de la columna.
• Un detector sirve para medir la cantidad de esas moléculas para que el químico pueda analizar
cuantitativamente los componentes de la muestra.
• El detector proporciona una salida a un registrador o computadora que da como resultado el

cromatograma líquido (es decir, el gráfico de la respuesta del detector).
5. Computadora:
• Frecuentemente llamado sistema de datos, la computadora no solo controla todos los módulos
del instrumento de HPLC sino que toma la señal del detector y la usa para determinar el tiempo de
elución (tiempo de retención) de los componentes de la muestra (análisis cualitativo) y el cantidad
de muestra (análisis cuantitativo) 1245 Depósitos de disolvente y desgasificación 3 HPLC
Para qué se utiliza la HPLC Separación y análisis de compuestos no volátiles o térmicamente

inestables La HPLC es óptima para la separación de compuestos químicos y biológicos que no son
volátiles.
Los compuestos no volátiles típicos son:
Fármacos como aspirina, ibuprofeno o acetaminofén (Tylenol)
Sales como cloruro de sodio y fosfato de potasio
Proteínas como la clara de huevo o la proteína de la sangre
 Productos químicos orgánicos como polímeros (por ejemplo, poliestireno, polietileno)
 Hidrocarburos pesados como asfalto o aceite de motor

Muchos productos naturales como ginseng, hierbas medicinales, extractos de plantas
Compuestos térmicamente inestables como trinitrotolueno (TNT), enzimas
NOTA: Si un compuesto es volátil (es decir, un gas, fragancia, hidrocarburo en la gasolina, etc.), la
cromatografía de gases es una mejor técnica de separación.
inyección ¿Para qué se utiliza la HPLC? Análisis cualitativo HPLC
12 La identificación (ID) de compuestos individuales en la muestra;
• el parámetro más común para el ID del compuesto es su tiempo de retención (el tiempo que
tarda ese compuesto específico en eluir de la columna después de la inyección);
• Dependiendo del detector utilizado, el ID del compuesto también se basa en la estructura

química, el peso molecular o algún otro parámetro molecular. Min02.557.51012.515 Punto de
inyección (tiempo cero) Tiempo de retención del compuesto A Tiempo de retención del
compuesto B Tiempo después de la inyección ¿Qué
Para qué se utiliza la HPLC Análisis cuantitativo Medición de la cantidad de un compuesto en una
muestra (concentración); es decir, ¿cuánto hay ?; Hay dos formas principales de interpretar un
cromatograma (es decir, realizar una cuantificación):
1) determinación de la altura del pico de un pico cromatográfico medida a partir de la línea de

base;
2.determinación del área del pico (ver figura a continuación); Para hacer una evaluación
cuantitativa del compuesto, se inyecta una muestra con una cantidad conocida del compuesto de
interés y se mide su altura o área de pico. En muchos casos, existe una relación lineal entre la
altura o el área y la cantidad de muestra. Min02468101214ABCD Área máxima del compuesto A
Área del pico del compuesto A Área del pico del compuesto A Área del pico del compuesto A
Altura del pico del compuesto AHPLC Conceptos básicos
¿Para qué se utiliza la HPLC?
Preparación de compuesto (s) puro (s)
- Recogiendo los picos cromatográficos a la salida del detector,
- y concentrar el compuesto (analito) eliminando / evaporando el disolvente,
- se puede preparar una sustancia pura para su uso posterior (por ejemplo, síntesis orgánica,
clínica
estudios, estudios de toxicología, etc.).
Esta metodología se denomina cromatografía preparativa.
Recoger pico puro de preparativa cromatografía columna
Análisis de trazas Un compuesto traza es un compuesto que es de interés para el analista pero su
concentración es muy baja, por lo general menos del 1% en peso, a menudo partes por millón
(ppm) o menos;
• la determinación de compuestos traza es muy importante en estudios farmacéuticos, biológicos,

toxicológicos y ambientales, ya que incluso una sustancia traza puede ser dañina o venenosa;
• en un cromatograma, las sustancias traza pueden ser difíciles de separar o detectar;
• Se requieren separaciones de alta resolución y detectores muy sensibles.

Estas son las sustancias principales en la muestra
Estas son las sustancias traza en la muestra
Ejemplos de diferentes instrumentos y configuraciones HPLC
16Sistema HPLC modular: configuración básica con bomba isocrática,

inyector manual, detector de longitud de onda variable y controlador
manual
Sistema modular de HPLC: configuración de gama alta con bomba

cuaternaria, inyector automático, termostato de columna, detector de
matriz de diodos y computadora con software de control y análisis de datos
Sistema HPLC integrado “todas las piezas en una caja”: diferentes

configuraciones posibles, aquí con bomba de gradiente, muestreador
automático, horno de columna, VWD y computadora con software de
control y análisis de datos (no se muestra en la imagen)
Veamos módulos individuales ...
Tipos de módulo de bomba:
• Bomba isocrática: proporciona una composición constante de la fase móvil;
• el disolvente debe estar premezclado;
• bomba de menor costo
• Bomba de gradiente: proporciona una composición variable de la fase móvil;
• se puede utilizar para mezclar y producir una fase móvil isocrática o una fase móvil gradiente
–Bomba de gradiente binaria –proporciona dos disolventes
– Bomba de gradiente cuaternario –cuatro

disolventes

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1 HPLC Basics Fundamentals of Liquid

Chromatography (HPLC) Courtesy of Agilent

Fundamentos de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Este curso le permitirá:

• Explicar los principios generales de los análisis de HPLC.

• Conocer las principales áreas de aplicación de HPLC.

• Identificar los componentes principales de un sistema HPLC y explicar sus principios de

Primero, ¿qué es la cromatografía líquida?

• La cromatografía líquida es una técnica de separación que implica:

• la colocación (inyección) de un pequeño volumen de muestra líquida

• en un tubo lleno de partículas porosas (fase estacionaria)

Nota: busque la comparación con HPLC en la página 7HPLC

Página 6Entonces, ¿qué es HPLC?

• Mejoras de finales de los años 70 en el material y la instrumentación de las columnas:

• HPLC es una técnica de separación que implica:

• la inyección de un pequeño volumen de muestra líquida

8Tiempo después de la inyección Se trata del cromatograma resultante de la inyección de un

9 ¿Cómo se ve un LC de alta presión? (1) Describiendo los 5 componentes principales de HPLC y

• Las velocidades de flujo normales en HPLC están en el rango de 1 a 2 ml / min.

• Los volúmenes de muestra típicos son de 5 a 20 microlitros (μL).

• Un muestreador automático es la versión automática para cuando el usuario tiene muchas

• Considerada el "corazón del cromatógrafo", la fase estacionaria de la columna separa los

• El detector proporciona una salida a un registrador o computadora que da como resultado el

Para qué se utiliza la HPLC Separación y análisis de compuestos no volátiles o térmicamente

Los compuestos no volátiles típicos son:

Fármacos como aspirina, ibuprofeno o acetaminofén (Tylenol)

Sales como cloruro de sodio y fosfato de potasio

Proteínas como la clara de huevo o la proteína de la sangre

 Productos químicos orgánicos como polímeros (por ejemplo, poliestireno, polietileno)

 Hidrocarburos pesados como asfalto o aceite de motor

Compuestos térmicamente inestables como trinitrotolueno (TNT), enzimas

inyección ¿Para qué se utiliza la HPLC? Análisis cualitativo HPLC

12 La identificación (ID) de compuestos individuales en la muestra;

• Dependiendo del detector utilizado, el ID del compuesto también se basa en la estructura

1) determinación de la altura del pico de un pico cromatográfico medida a partir de la línea de

¿Para qué se utiliza la HPLC?

Preparación de compuesto (s) puro (s)

- Recogiendo los picos cromatográficos a la salida del detector,

- y concentrar el compuesto (analito) eliminando / evaporando el disolvente,

estudios, estudios de toxicología, etc.).

Esta metodología se denomina cromatografía preparativa.

Recoger pico puro de preparativa cromatografía columna

• la determinación de compuestos traza es muy importante en estudios farmacéuticos, biológicos,

• en un cromatograma, las sustancias traza pueden ser difíciles de separar o detectar;

• Se requieren separaciones de alta resolución y detectores muy sensibles.

Ejemplos de diferentes instrumentos y configuraciones HPLC

16Sistema HPLC modular: configuración básica con bomba isocrática,

Sistema modular de HPLC: configuración de gama alta con bomba

Sistema HPLC integrado “todas las piezas en una caja”: diferentes

Tipos de módulo de bomba:

• Bomba isocrática: proporciona una composición constante de la fase móvil;

• el disolvente debe estar premezclado;

• bomba de menor costo

• Bomba de gradiente: proporciona una composición variable de la fase móvil;

–Bomba de gradiente binaria –proporciona dos disolventes

– Bomba de gradiente cuaternario –cuatro

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