Plasmids101 Ed4 2023 9 31.en - Es

Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.
com
CAPÍTULO 1|¿QUÉ ES UN PLASMIDO?
Una breve historia de los plásmidos

Por Marcy Patrick | octubre 2015
B ¿ioblastos? ¿Plasmagenes? En las décadas de 1940 y 1950, los científicos

trabajaban para comprender los factores citoplasmáticos genéticos que
podían transferirse entre células. En su momento, estos
Se pensaba que los agentes extranucleares de la herencia abarcaban todo, desde
parásitos hasta simbiontes y genes, y las etiquetas que se les aplicaban eran vagas
o contradictorias, debido en parte al hecho de que se sabía muy poco sobre el
papel que desempeñaban estos factores dentro de un organismo.
Entonces, ¿cómo obtuvieron los plásmidos su nombre?
En 1952, Joshua Lederberg se propuso aclarar la clasificación de estos factores

de herencia citoplasmática. Propuso el término general "plásmido" derivado
como un híbrido de "citoplasma" e "id" (en latín, 'eso'), como
"un término genérico para cualquier determinante hereditario extracromosómico".
Plásmidos 101 4ta edición 9

Sin embargo, su propuesta fue básicamente ignorada. Unos

años más tarde, Élie Jacob y François Wollman propusieron
un término separado, "episoma", definido como "un
elemento genético no esencial que podría existir de forma
autónoma o integrada en el cromosoma", y se convirtió en
el nombre ampliamente adoptado para estos elementos. En
aquel momento, el uso del episoma parecía apropiado,
sobre todo porque se observó que el factor de fertilidad o
factor F descubierto por Ester Lederberg en 1952 se
integraba en algunos casos en el cromosoma de E. coli. Esta
terminología se mantuvo hasta la década de 1960, cuando
los científicos comenzaron a estudiar otras partículas
extracromosómicas, en particular la resistencia o los
factores R. Al igual que los factores F, los factores R podrían
transferirse entre bacterias mediante el contacto de célula a
célula; sin embargo, los científicos observaron que, a
diferencia de los factores F, la evidencia no apoyaba la idea
de que los factores R pudieran integrarse en el cromosoma. el primer experimento de “clonación” de plásmidos. El Dr.
Por lo tanto, el término "episoma" finalmente se eliminó y Cohen y sus colegas trataron un plásmido resistente a la
¡hemos estado usando "plásmido" desde entonces! tetraciclina, pSC101, y un plásmido resistente a la
kanamicina recientemente desarrollado, pSC102, con EcoRI
y seleccionaron transformantes de E. coli que eran
DE SERVILLETAS A CUADERNOS resistentes a ambos. Cuando esto tuvo éxito, pSC101 se

convirtió en el primer vector de clonación de plásmidos y la
Aunque se descubrieron a principios de la década de 1950, hubo biología molecular nunca volvió a ser la misma.
que esperar hasta la década de 1970 para que los plásmidos
ganaran prominencia en la comunidad científica. Antes de esto, los Durante los años siguientes, se clonaron genes de
bacteriófagos, especialmente lambda, eran la herramienta elegida diferentes especies bacterianas (y eventualmente de
por los biólogos moleculares que querían estudiar la genética mamíferos) en plásmidos y nuevos vectores de clonación
bacteriana. Todo esto cambió gracias, en parte, a una colaboración como pBR322, pACYC ypuc se desarrollaron para
iniciada en una tienda de delicatessen hawaiana en 1972. Utilizando proporcionar vectores con mayor número de copias que
una servilleta de delicatessen como papel, un pequeño grupo de pudieran usarse en estos experimentos de clonación.
científicos, entre ellos Stanley Falkow, Stanley Cohen, Herbert Boyer
y Charles Brinton, idearon una idea descabellada de utilizar la Aunque los plásmidos comenzaron como un área de investigación de
enzima EcoRI recientemente descubierta (y su sitio de corte cierto nicho, ahora se los considera una herramienta ubicua que puede
predecible) para desarrollar aplicarse de manera diversa a muchos campos diferentes.

experimentos. Addgene se fundó con el fin de almacenarlos, biología molecular y han sido clave en el avance de
controlarlos, seleccionarlos y distribuirlos todos con el fin de nuestro conocimiento en áreas como la conjugación y
facilitar un poco a los científicos la realización de sus recombinación bacteriana, la replicación y topología, y
investigaciones. Desde su descubrimiento en la década de la clonación y expresión genética.norte
1950, los plásmidos han impactado muchas áreas de
Lectura adicional
Reunión CSHL: Plásmidos: Historia y Biología TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA A LOS MEDICAMENTOS

MEDIADA POR EPISOMAS EN ENTEROBACTERIACEAE VIII.:Factor
Los documentos de Joshua Lederberg R de resistencia a seis fármacos. Watanabe, Tsutomu, Chizuko
Ogata y Sachiko Sato. Revista de Bacteriología 88.4 (1964): 922–928.
Perspectiva personal de Joshua Lederberg: plásmido PMID de PubMed: 14219055 .
(1952-1997)
Resistencia transmisible a los medicamentos en una
Clonación de ADN: una visión personal después de 40 cepa epidémica de Salmonella Typhimurium.Datta,
años.Cohen, Stanley N. Actas de la Academia Nacional de Noemí. El Diario de Higiene 60.3 (1962): 301–310. PMID
Ciencias de los Estados Unidos de América. 110,39 (2013): de PubMed: 14025218 .
15521-15529PMID de PubMed: 24043817 .
Construcción de plásmidos bacterianos
Genética celular y simbiosis hereditaria Lederberg, biológicamente funcionales in vitro.Cohen, Stanley N.
Joshua. Reseñas fisiológicas 32.4 (1952) 403-430. y col. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los
Estados Unidos de América 70.11 (1973): 3240–3244.
Compatibilidad sexual en Escherichia coli.Lederberg, PMID de PubMed: 1422013.
Joshua, Luigi L. Cavalli y Esther M. Lederberg. Genética 37.6
(1952): 720–730.PMID de PubMed: 17247418 . Nomenclatura uniforme para plásmidos bacterianos: una
propuesta.Novick, RP y cols. Reseñas bacteriológicas 40.1
(1976): 168–189.PMID de PubMed: 16350226 .

¿Qué es un plásmido?
Por Margo R. Monroe y Marcy Patrick | abril 2020
A En su nivel más básico, los plásmidos

son pequeños trozos circulares de ADN
que se replican independientemente del
ADN cromosómico del huésped. Se encuentran
principalmente en bacterias, pero también existen de forma
natural en arqueas y eucariotas como levaduras y plantas.
En la naturaleza, los plásmidos proporcionan uno o más
beneficios funcionales al huésped, como resistencia a los
antibióticos, funciones degradativas y/o virulencia. Todos los
plásmidos naturales contienen un origen de replicación (que
controla el rango de huéspedes y el número de copias del
plásmido) y normalmente incluyen un gen que es ventajoso
para la supervivencia, como un gen de resistencia a los
Gateway, Gibson, etc.). En última instancia, el método de
antibióticos.
clonación se elige en función del plásmido en el que desea
Por el contrario, los plásmidos utilizados en el laboratorio suelen ser clonar. Independientemente, una vez que se completan los
artificiales y están diseñados para introducir ADN extraño en otra célula. pasos de clonación, el vector que contiene el gen recién
Como mínimo, los plásmidos creados en laboratorio tienen un origen de insertado se transforma en células bacterianas y se cultiva
replicación, un marcador de selección y un sitio de clonación. La selectivamente en placas de antibióticos.
facilidad para modificar los plásmidos y la capacidad de los plásmidos
para autorreplicarse dentro de una célula los convierten en Es importante destacar que, debido a que las bacterias de las que
herramientas atractivas para los científicos biológicos o los se aíslan los plásmidos crecen rápidamente y producen más
bioingenieros. plásmidos a medida que crecen, los científicos pueden producir
fácilmente grandes cantidades de plásmidos para manipularlos y
utilizarlos en trabajos posteriores.
¿CÓMO SE CONSTRUYE UN PLASMIDO EN EL

LABORATORIO?
¿CÓMO UTILIZAN LOS CIENTÍFICOS LOS PLASMIDOS?
Debido a su naturaleza artificial, los plásmidos de laboratorio se
denominan comúnmente "vectores" o "construcciones". Para Generalmente, los científicos utilizan plásmidos para manipular
insertar un gen de interés en un vector, los científicos pueden la expresión genética en las células diana. Características como
utilizar uno de una variedad de métodos de clonación (enzima flexibilidad, versatilidad, seguridad y rentabilidad permiten a los
de restricción, ligación independiente, biólogos moleculares analizar ampliamente

utilizar plásmidos en una amplia gama de aplicaciones. • Producir enzimas que realizarán cambios específicos y
Algunos tipos de plásmidos comunes incluyen plásmidos de controlados en el genoma de un organismo
clonación, plásmidos de expresión, plásmidos de (ingeniería genómica)
eliminación de genes, plásmidos indicadores, plásmidos
virales y plásmidos de ingeniería genómica. • Producir virus sintéticos que puedan usarse en
investigación o con fines terapéuticos.
Algunas de las muchas cosas para las que se pueden utilizar los
plásmidos incluyen: Addgene ha recopilado varios recursos educativos para
facilitar el uso de plásmidos en el laboratorio. Addgene
• Producir grandes cantidades de proteína para que los científicos Referencia de biología molecular Incluye información
puedan purificarla y estudiarla en un entorno controlado. sobre clonación molecular, cómo elegir un vector
plasmídico, herramientas y referencias de biología
• Producir proteínas que brillen para que los científicos puedan molecular y cómo mantener sus existencias de
rastrear su ubicación o cantidad dentro de una célula. plásmidos. La guía también contiene múltiples
protocolos y consejos de resolución de problemas para
• Monitorear el nivel de una sustancia química en un que el uso de plásmidos sea lo más simple y directo
ambiente particular posible.norte
Tabla 1.1 - Elementos del vector plásmido

Elemento vectorial Descripción
Secuencia de ADN que permite el inicio de la replicación dentro de un plásmido mediante el reclutamiento de
Origen de replicación (ORI)
proteínas de la maquinaria transcripcional.
Resistencia a los antibióticos Permite la selección de bacterias que contienen plásmidos.
Sitio de clonación múltiple Segmento corto de ADN que contiene varios sitios de restricción que permiten la fácil inserción del
(MCS) ADN. En los plásmidos de expresión, el MCS suele estar aguas abajo de un promotor.
Insertar Gen, promotor u otro fragmento de ADN clonado en el MCS para su posterior estudio.
Impulsa la transcripción del gen diana. Componente vital para los vectores de expresión: determina en
Región promotora
qué tipos de células se expresa el gen y la cantidad de proteína recombinante producida.
El gen de resistencia a los antibióticos permite la selección en bacterias. Sin embargo, muchos plásmidos también tienen
Marcador seleccionable
marcadores seleccionables para su uso en otros tipos de células.
Una secuencia corta de ADN monocatenario que se utiliza como punto de inicio para la amplificación o secuenciación por
Sitio de unión del cebador
PCR. Los cebadores se pueden aprovechar para la verificación de secuencias de plásmidos.

Origen de la replicación
Por Kendall Morgan y Marcy Patrick | febrero 2014
l Consideremos otro elemento básico de

cualquier plásmido: el origen de replicación
o “replicón”. El replicón está compuesto
del origen de replicación (ORI) y todos sus elementos de
control. El ORI es el lugar donde comienza la replicación
producirán muchas copias de plásmidos y otros
producirán solo unas pocas copias dependiendo de
cómo estén regulados. Generalmente, el control de la
replicación se denomina "relajado" o "estricto"
dependiendo de si el ORI está regulado positivamente
del ADN, lo que permite que un plásmido se reproduzca por ARN o proteínas, respectivamente. El número de
como debe para sobrevivir dentro de las células. copias de un plásmido tiene que ver con el equilibrio
entre regulación positiva y negativa y puede manipularse
Los replicones de los plásmidos son generalmente diferentes de con mutaciones en el replicón. Por ejemplo, el pMB1 ORI
los utilizados para replicar el ADN cromosómico del huésped, mantiene alrededor de 20 copias por célula, mientras
pero aún dependen de la maquinaria del huésped para realizar que pUC, que se diferencia solo por dos mutaciones,
copias adicionales. Las secuencias ORI generalmente tienen un producirá hasta 700 copias por célula.
alto contenido de As y Ts; Los pares de bases AT se mantienen
unidos mediante dos enlaces de hidrógeno en lugar de tres Entonces, ¿cómo eliges? Hágase estas preguntas:
como lo hacen los pares GC. Como resultado, los tramos de
ADN ricos en pares AT se funden más fácilmente a
temperaturas más bajas. Cuando el ADN se derrite, le da • ¿Se utilizará el plásmido exclusivamente en E. coli?
espacio a la maquinaria de replicación para entrar y ocuparse ¿Bacterias Gram negativas en general? ¿Tanto
de hacer copias. gramnegativos como grampositivos?
• ¿Tendrá sólo un tipo de plásmido en sus células

TANTOS ORÍGENES, TAN a la vez?
POCO TIEMPO
• ¿Quiere producir una gran cantidad de su plásmido? ¿Es el
Hay muchos ORI por ahí, por lo que, por ahora, hemos gen tóxico en grandes cantidades?
ignorado los utilizados en células y virus eucariotas y nos
hemos centrado únicamente en los que se encuentran en las Siempre es bueno tener en cuenta que los plásmidos con un
bacterias. Algunos de los más comunes que puede ver incluyen número de copias bajo a medio aún pueden expresar
ColE1, pMB1 (que viene en algunos derivados ligeramente cantidades masivas de proteína si se cuenta con el promotor
diferentes pero bien conocidos), pSC101, R6K y 15A. No todos adecuado (¡estén atentos!) y las condiciones de crecimiento.
los orígenes de replicación son iguales. Alguno

Tabla 1.2 - Origen de la replicación
Vectores comunes Número de copia* ORI Grupo de incompatibilidad Control
puc ~500-700 pMB1 (derivado) A Relajado
pBR322 ~15-20 pMB1 A Relajado
mascota ~15-20 pBR322 A Relajado
pGEX ~15-20 pBR322 A Relajado
pColE1 ~15-20 ColE1 A Relajado
pR6K ~15-20 R6K** B Riguroso
pacyc ~10 P15A B Relajado
pSC101 ~5 pSC101 do Riguroso
pBluescript ~300-500 ColE1 (derivada) y F1*** A Relajado
pGEM ~300-500 pUC y F1 A Relajado
* El número de copias real varía. .

* * Requiere gen pir para su replicación (referencia ).
* * * F1 es un ORI derivado de fagos que permite la replicación y empaquetamiento de ssDNA en partículas de fagos. Los plásmidos con ORI
derivados de fagos se denominanfagémidos .

ELEGIR SABIAMENTE EL el inserto

ORIGEN DE REPLICACIÓN Las bacterias tienden a mantener menos copias de plásmidos si
contienen inserciones grandes o genes que crean un producto
La mejor elección de ORI depende de cuántas tóxico.
copias de plásmido desea mantener, qué host o

hosts desea utilizar y si necesita o no considerar la ElEscherichia colicepa
compatibilidad de su plásmido con uno o más MayoríaEscherichia coliSe pueden utilizar cepas para propagar plásmidos,
plásmidos. En términos generales, los plásmidos pero el extremo A-Escherichia colison mejores para obtener altos
con los mismos ORI son incompatibles porque rendimientos de plásmidos.
competirán por la misma maquinaria, creando un

entorno inestable e impredecible. Como regla
general, los plásmidos del mismo grupo no deben CONDICIONES DE CRECIMIENTO
cotransformarse, por lo que si necesita dos
plásmidos para un experimento, asegúrese de que La cantidad de aireación, la temperatura, el volumen de
tengan ORI "compatibles". Consulte la siguiente cultivo, el antibiótico y el medio pueden afectar el
tabla para obtener más detalles. número de copias. Algunos ORI son sensibles a la
temperatura; Se puede “engañar” a otros ORI para que
La Tabla 1.2 destaca los vectores de clonación comunes, su amplifiquen más copias con la adición de cloranfenicol.
número de copias, ORI y grupo de incompatibilidad. Tenga ¡Asegúrese de que sus condiciones de crecimiento no
en cuenta que el grupo de compatibilidad AC es una estén en su contra!
designación arbitraria y los plásmidos del mismo grupo de
incompatibilidad no deben cotransformarse. .
EL INOCULO CULTURAL
OTROS FACTORES QUE AFECTAN EL Las bacterias recién sembradas tienen un mayor número de
NÚMERO DE COPIAS copias; para obtener resultados óptimos, elija siempre una sola
colonia y no subcultive directamente a partir de reservas de
Aunque la secuencia y regulación del ORI afectan glicerol, muestras de agar o cultivos líquidos. La incubación
dramáticamente el número de copias de un durante 12 a 16 horas tiende a dar números de copias más
plásmido, también contribuyen otros factores altos, ya que las bacterias acaban de alcanzar la fase
externos. Es especialmente útil tener en cuenta estacionaria, pero las células no han comenzado a morir.norte
estas consideraciones si planea purificar su ADN

plasmídico.

La Región Promotora
Por Kendall Morgan, A. Max Juchheim y Marcy Patrick | abril 2014
Ahora que podemos replicar nuestro plásmido y LAS ARN POLIMERASAS
norte asegurarnos de que las células lo mantengan, el

siguiente paso es lograr que el plásmido
expresar nuestro gen de interés. Ingrese el promotor,
El ARN se transcribe a partir del ADN mediante una ARN
polimerasa (RNAP). En las bacterias, esto se realiza mediante
el elemento responsable de iniciar la transcripción de una única enzima; sin embargo, los eucariotas tienen
su inserto. múltiples polimerasas, cada una de las cuales es
responsable de un subconjunto específico de ARN. Para
En la práctica, el término "promotor" describe la obtener esta especificidad, la RNAP eucariota puede
combinación del promotor (sitio de unión de la ARN reconocer y unirse a elementos promotores específicos.
polimerasa) y operadores (elementos de respuesta). Los Esto significa que el promotor presente en sucolumna
promotores tienen entre 100 y 1000 pares de bases de vertebral del plásmido debe ser compatible con el tipo de
largo y se encuentran aguas arriba de sus genes diana. ARN que se debe producir: si desea ARNm (para la expresión
La secuencia de la región promotora controla la unión de génica), debe utilizar un promotor RNAP II, mientras que los
la ARN polimerasa y los factores de transcripción; por lo ARN pequeños (como el shRNA) se transcriben a partir de
tanto, los promotores desempeñan un papel importante los promotores RNAP III. Esta sección presenta promotores
a la hora de determinar dónde y cuándo se expresará el para la transcripción general de RNAP II y RNAP III; sin
gen de interés. embargo, LTR virales como RNAP II
?
Factores de transcripción que se unen a la región promotora (púrpura) de un gen (azul).

Los promotores se emplean comúnmente en construcciones Para combatir esto, los científicos han creado promotores
lentivirales y retrovirales. Estos están cubiertos en nuestros sintéticos, que normalmente incluyen alguna combinación
recursos sobre vectores virales. de otros elementos promotores y tienden a estar regulados
más estrictamente.
ESPECIFICIDAD DEL PROMOTOR

PROMOTORES COMUNES PARA
Además de elegir un promotor según el tipo de EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS
transcripción de ARN, también deberá asegurarse de que su
plásmido tenga un promotor adecuado para funcionar en su Las tablas 1.3 y 1.4 enumeran algunos de los promotores
organismo huésped. Debido a que la maquinaria de bacterianos y mamíferos más comunes. Estas listas no son
transcripción difiere entre tipos de células u organismos, los de ninguna manera exhaustivas, pero deberían ser un buen
promotores deben ser igualmente variables. Los punto de partida al intentar elegir al promotor perfecto.
promotores bacterianos sólo funcionan en células norte
procarióticas y, por lo general, sólo en la misma especie o en

especies estrechamente relacionadas de las que derivan. De
manera similar, los distintos tipos de células eucariotas
(mamíferos, levaduras, plantas, etc.) requieren promotores
únicos y hay muy poco cruce. En términos generales, los
promotores de las bacterias son menos diversos y
complejos y tienen menos partes que los de las células
eucariotas. Algunos promotores están constitutivamente
activos y en todo momento, mientras que otros están
controlados más cuidadosamente.
Los promotores regulados pueden actuar sólo en ciertos tejidos

o en ciertos momentos del desarrollo o puede haber formas de
activarlos o desactivarlos a voluntad con una sustancia química,
calor o luz. En la célula, los propios promotores están
controlados por otros factores reguladores: potenciadores,
elementos límite, aislantes y silenciadores; sin embargo, puede
ocurrir alguna transcripción "con fugas". Normalmente, esto no
es un gran problema para las células, pero puede confundir los
resultados de la investigación o incluso matar las células si el
gen de interés es tóxico.

Tabla 1.3 - Promotores eucariotas
Promotor Ante todo ARN Descripción Expresión Consideraciones adicionales

Utilizado para Transcripción
Mamífero fuerte Puede contener un
General promotor de expresión región potenciadora.

CMV ARNm Constitutivo
expresión del humano Puede silenciarse en
citomegalovirus algunos tipos de células.
Mamífero fuerte Tiende a dar una expresión

General
EF1a ARNm expresión de humano Constitutivo consistente independientemente
expresión
factor de elongación 1 alfa del tipo de célula o fisiología.
Expresión de mamíferos
General Puede incluir un
SV40 ARNm promotor de la Constitutivo
expresión potenciador
vacuolización simia
Expresión generalizada,
PGK1 pero puede variar según el tipo de
(humano Promotor de mamíferos
General célula. Tiende a resistir la regulación
o ARNm gen de la fosfoglicerato Constitutivo
expresión
ratón) quinasa
negativa del promotor debido
a la metilación o
desacetilación.
Promotor de mamíferos
General Como su nombre lo indica, este
ubc ARNm del humano Constitutivo
expresión promotor está en todas partes.
gen de la ubiquitina C
Ubicuo. Pollo
humano
General Promotor de mamíferos La versión es comúnmente
beta ARNm Constitutivo
expresión del gen beta actina utilizado en promotor
actina
híbridos
Contiene potenciador CMV,

General Híbrido fuerte beta actina de pollo
CAG ARNm Constitutivo
expresión promotor de mamíferos promotor y aceptor de empalme
de beta-globina de conejo.


Normalmente contiene un
promotor mínimo con

inducible baja actividad basal y
General Respuesta a tetraciclina con varias tetraciclinas
TRE ARNm
expresión promotor de elementos tetraciclina o operadores. La transcripción
sus derivados se puede activar o desactivar
según el transactivador tet
que se utilice.
Promotor de Drosophila Requiere la presencia

General
UAS ARNm que contiene Gal4 Específico del gen Gal4 para activar el
expresión
sitios de unión promotor.
Fuerte promotor de insectos. Comúnmente utilizado en

General
ac5 ARNm del gen actina 5c de Constitutivo sistemas de expresión para
expresión
Drosophila Drosofila
Comúnmente utilizado en
poliedrina General Fuerte promotor de insectos. sistemas de expresión para

ARNm Constitutivo
expresión de baculovirus células de insectos
Utilizado para neuronas/SNC

Ca2+/calmodulina-
General expresión. Modulado
CamKIIa ARNm proteína dependiente Específico
expresión por calcio y
promotor de la quinasa II
calmodulina.
Inducible con se puede utilizar

Adyacente, divergentemente
General galactosa; independientemente o
GAL1, 10 ARNm promotores transcritos
expresión reprimible juntos. Regulado por
de levadura
con glucosa GAL4 y GAL 80.


Transcripción de levadura Análogo a

General
TEF1 ARNm factor de elongación Constitutivo mamífero EF1a
expresión
promotor promotor.
Fuerte promotor de levadura
General de gliceraldehído Muy fuerte, también

GDS ARNm Específico
expresión 3-fosfago llamado TDH3 o GAPDH.
deshidrogenasa
La versión de longitud
completa es fuerte con alto
General Promotor de levadura para reprimido por expresión. Truncado

ADH1 ARNm
expresión alcohol deshidrogenasa I etanol los promotores son
constitutivo de menor
expresión.
Fuerte promotor de plantas. Activo en dicotiledóneas, menos
General de la coliflor activo en monocotiledóneas, con

CaMV35S ARNm Constitutivo
expresión Virus del mosaico cierta actividad en células animales.
General Promotor de plantas de Da alta expresión en las

ubi ARNm Constitutivo
expresión gen de la ubiquitina del maíz plantas.
ARN pequeño
Puede tener una expresión
De lo humano
expresión ligeramente menor que U6.
H1 ARNhc ARN polimerasa III Constitutivo
Puede tener mejor expresión.
promotor
en las células neuronales.
ARN pequeño
También se utiliza Murine U6,
expresión Del pequeño promotor
U6 ARNhc Constitutivo pero puede ser menos
nuclear humano U6.
eficiente.

Tabla 1.4 - Promotores procarióticos
Promotor Ante todo Descripción Expresión Consideraciones adicionales

Utilizado para
in vitro
transcripción/ Promotor de T7 Constitutivo, pero Puede usarse para la transcripción in vitro
general bacteriófago requiere ARN T7 solo si hay 2 promotores de fagos
T7
expresión polimerasa. diferentes presentes en orientaciones
opuestas al gen.
basal insignificante
expresión cuando Se encuentra comúnmente en vectores pET.
Promotor de T7 no inducido. Muy estrictamente regulado por los

Altos niveles de bacteriófago más Requiere ARN T7 operadores de lac. Bueno para modular la
expresión genética
T7lac operadores lac polimerasa, que expresión genética a través de
también está controlado concentraciones variadas de inductores.
por el operador lac.

Puede ser inducido por
IPTG.
in vitro
transcripción/ Promotor de Sp6 Puede usarse para la transcripción in vitro
Constitutivo, pero
general bacteriófago solo si hay 2 promotores de fagos
Sp6 requiere ARN SP6
expresión diferentes presentes en orientaciones
polimerasa.
opuestas al gen.
Altos niveles de Promotor de E. Se apaga con altos niveles de

trp
expresión genética triptófano coli reprimible triptófano celular.
operón
Constitutivo en Promotor con fugas y expresión algo débil.

la ausencia del La mutación lacIq aumenta la expresión del
represor lac (lacI represor 10 veces, lo que refuerza la
General promotor de lac
laca o lacIq). Puede ser regulación del promotor lac. Bueno para
expresión operón
inducido por IPTG o modular la expresión genética a través de
lactosa. concentraciones variadas de inductores.
Contiene la región -35 de trpB y la región

Regulado como el -10 de lac. Regulación muy estricta. Bueno
General Promotor híbrido promotor lac para modular la expresión genética a

Ptac
expresión de lac y trp través de concentraciones variadas de
inductores. Generalmente mejor expresión
que la laca sola.

Tabla 1.4 - Promotores procarióticos
Promotor Ante todo Descripción Expresión Consideraciones adicionales

Utilizado para
Altos niveles de Promotor de puede ser

A menudo se combina con el represor cI857
pl expresión genética bacteriófago temperatura
sensible a la temperatura.
lambda regulable
Inducible por
arabinosa y
reprimido Más débil. Se encuentra comúnmente en
Promotor de vía catabolito vectores pBAD. Bueno para una regulación

General la arabinosa represión en el rápida y una expresión basal baja;
expresión
araBAD operón metabólico presencia sin embargo, no es muy adecuado para modular la
de glucosa o expresión génica a través de concentraciones
por competitivo variadas de inductores.
unión del
antiinductor
fucosa

Terminadores y señales Poly(a)
PAG
Por Julian Taylor-Parker | mayo de 2016
Los asmidos diseñados para expresar genes en un adicional postranscripcional de múltiples nucleótidos de
tipo de célula huésped determinado generalmente adenina (A) a la cola de una transcripción de ARN
se dividen en dos categorías amplias, mensajero. El propósito y el mecanismo de la
procariotas o eucariotas, según los elementos poliadenilación varían entre los tipos de células, pero la
funcionales que contengan. El ADN plasmídico, tanto en poliadenilación generalmente sirve para promover la
sistemas procarióticos como eucariotas, debe longevidad del transcrito en eucariotas y promover la
transcribirse en ARN. La transcripción se produce en tres degradación del transcrito en procariotas.
fases: iniciación, elongación y terminación.
Anteriormente discutimos el papel del promotor en el
paso de inicio de la transcripción genética; Aquí TERMINACIÓN PROCARIÓTICA
brindaremos una descripción general sobre cómo se
detiene o termina la transcripción. Los mecanismos de terminación de los procarióticos se
dividen en dos categorías generales: rhodependientes y
rhoindependientes. El factor Rho es una helicasa que
¿QUÉ ES TERMINACIÓN Y ayuda a la ARN polimerasa a terminar la transcripción.
POLIDENILACIÓN? Los terminadores dependientes de Rho generalmente no
se emplean en sistemas de expresión basados en
La función del terminador, que es un elemento basado en plásmidos, por lo que no se detallarán aquí, pero al final
secuencia, es definir el final de una unidad transcripcional se proporcionan referencias adicionales.
(como un gen) e iniciar el proceso de liberación del ARN
recién sintetizado de la maquinaria de transcripción. Los Casi todos los comunesplásmidos de expresión
terminadores se encuentran corriente abajo del gen que se bacteriana Utilice terminadores independientes de Rho,
va a transcribir y normalmente ocurren directamente que incluyen terminadores naturales, como T7 y rrnB, así
después de cualquier elemento regulador 3', como la señal como terminadores diseñados de alta eficiencia como
de poliadenilación o poli(A). Si bien muchos estudios se T0. La terminación independiente de Rho también se
centran en la fuerza del promotor como determinante de los conoce como terminación intrínseca y se basa en la
niveles de expresión genética, el terminador también formación de una horquilla rica en GC en la transcripción
desempeña un papel importante en el procesamiento del de ARN seguida de un tracto de poliuracilo débilmente
ARN y contribuye a la variabilidad de la vida media del ARN unido, como se muestra en la figura de la derecha. Se
y, en última instancia, a la expresión genética. cree que la estructura terciaria del complejo horquilla-
ADN desestabiliza el complejo de transcripción, iniciando
La poliadenilación, como su nombre lo indica, es la la escisión de la transcripción.

Ningún terminador es 100% eficiente para detener la

transcripción de la plantilla e iniciar el evento de escisión
deseado, aunque algunos terminadores diseñados se
acercan (>95%). Sin embargo, para la mayoría de los
propósitos, cualquier terminador común será suficiente.
Muchos vectores de expresión comerciales utilizan
terminadores dobles para reducir la traducción no
deseada de elementos posteriores. Aterminador de
alta afinidad puede ser deseable para construcciones
multicistrónicas donde es necesaria una alta eficiencia
de terminación para minimizar la lectura transcripcional.
El laboratorio de Chris Voigt ha caracterizado un
conjunto de terminadores procarióticos ydepositó
varios con Addgene .
POLIDENILACIÓN PROCARIÓTICA
Aunque en su mayoría se considera un proceso

específico de eucariotas, los procariotas también
añaden colas poli(A) a ciertos ARN. A diferencia del
Una estructura secundaria conservada predicha y una secuencia mecanismo eucariota que requiere una secuencia
conservada anotación de terminación independiente de Rho durante 90 consenso para la adición de una cola poli(A), la adición
elementos bacterianos.Por Ppgardne en Wikipedia en inglés , de una cola poli(A) en un transcrito procariótico no es
CC BY-SA 3.0 específica y se puede agregar a cualquier extremo 3'
accesible. La presencia de la cola poli(A) dirige el ARN al
degradosoma, que contiene enzimas que cortan el ARN
no protegido por la estructura secundaria. Debido a que
carece de especificidad, se cree que los poli(A) se utilizan
para controlar la concentración celular de

ARN reguladores y, además, puede actuar como un mecanismo Plásmidos de expresión de mamíferos.se utilizan
de control de calidad para eliminar los ARN mal plegados de la principalmente para crear ARNm y los terminadores de
célula. mamíferos comúnmente utilizados (SV40, hGH, BGH y rb-
Glob) incluyen el motivo de secuencia AAUAAA que
TERMINACIÓN EUCARIÓTICA Y promueve tanto la poliadenilación como la terminación.
POLIDENILACIÓN De los enumerados, se cree que el poliA tardío SV40 y el
poliA rbGlob son más eficientes para terminar la
A diferencia de los procariotas que tienen una única ARN transcripción debido a la presencia de secuencias
polimerasa para la transcripción, los eucariotas tienen auxiliares adicionales (Schek et. al., 1992; Gil et. al, 1987).
tres ARN polimerasas (Polimerasas I, II y III), cada una
responsable de la transcripción de diferentes tipos de
ARN: la Polimerasa I es responsable del ARN ribosómico, Como se mencionó anteriormente, la terminación y
la Polimerasa II es responsable del ARNm y miARN y la poliadenilación de los transcritos de la polimerasa II (y,
polimerasa III transcribe ARNt y otros ARN cortos. por lo tanto, de los ARNm) son procesos coordinados. La
Aunque no se han estudiado tan bien como la escisión entre el motivo de consenso y una región rica en
terminación procariótica, se comprenden los procesos GU aguas abajo (que se muestra en la figura siguiente)
básicos para la terminación eucariota y se ha observado libera el ARNm de la polimerasa y crea un extremo 3'
que cada ARN polimerasa eucariota termina de manera libre que ahora está disponible para la poliadenilación.
diferente. La polimerasa III, por ejemplo, se basa en una La adición de la cola poli(A) es importante para la
secuencia específica y una estructura secundaria de ARN estabilidad del ARNm, la protección contra la
para inducir la escisión del transcrito, similar a la degradación y también es parte integral de los procesos
terminación independiente de Rho que se encuentra en de traducción y exportación nuclear.norte
los procariotas. Esto es diferente a las polimerasas I y II,
que requieren la unión de factores de terminación.
Aunque ambas dependen del factor de terminación,

las polimerasas I y II emplean mecanismos diferentes
para terminar la transcripción. La polimerasa I utiliza
un proceso similar al mecanismo dependiente de Rho
procariótico, mientras que la terminación de la
polimerasa II es más compleja e involucra dos
proteínas asociadas a la ARN polimerasa, CPSF y CstF,
que son responsables de reclutar las enzimas de
escisión y poliadenilación, en un proceso que parece
acoplar la terminación con la poliadenlación.

Lectura adicional
Peters JM, Vangeloff AD, Landick R. Terminadores de ZuffereyR,DonelloJE,TronoD,HopeTJ.El elemento

transcripción bacterianos: las crónicas del extremo 3' regulador postranscripcional del virus de la hepatitis
del ARN. Revista de biología molecular. 2011. PubMed de la marmota mejora la expresión de transgenes
PMID: 21439297 . PMCID central de PubMed: administrados por vectores retrovirales. Revista de
PMC3622210 . Virología. 1999. PubMedPMID: 10074136 .PubMed
Central PMCID: PMC104046 .
Schek N, Cooke C, Alwine JC. Definición del elemento
de eficiencia aguas arriba de la señal de Wodrich H, Schambach A, Kräusslich HG. Múltiples copias
poliadenilación tardía del virus de los simios 40 del elemento de transporte de ARN constitutivo del virus
mediante análisis in vitro. Biología Molecular y del mono Mason-Pfizer conducen a una mayor expresión
Celular. 1992. PubMedPMID: 1333042 .PubMed de Gag del VIH-1 de una manera dependiente del
CentralPMCID: PMC360476 .. contexto. Investigación de ácidos nucleicos. 2000.
PubMedPMID: 10648781 . PubMed CentralPMCID:
Gil A, Proudfoot Nueva Jersey. Se requieren elementos de secuencia PMC102582 .
dependientes de la posición aguas abajo de AAUAAA para la
formación eficaz del extremo 3' del ARNm de beta-globina de
conejo. Celúla. 1987. PubMedPMID: 3568131 .
Hager S, Frame FM, Collins AT, Burns JE, Maitland NJ. Una
señal de poliadenilación interna aumenta sustancialmente
los niveles de expresión de los transgenes administrados por
lentivirus, pero tiene el potencial de reducir el título viral de
una manera dependiente del promotor. Hum Gene Ther.
2008. PubMedPMID: 18627247 .

Enzimas de metilación y restricción

Por Marcy Patrick | junio 2016
h ¿Alguna vez ha intentado hacer la digestión

con las enzimas de restricción XbaI o ClaI y
se ha vuelto inusual o inesperado?
¿resultados? O consideró por qué DpnI degradará su
ADN modelo a partir de unreacción de PCR ¿Pero no el
endonucleasas que reconocen y escinden la misma
secuencia de ADN si no está metilada (si proviene
de un fago, por ejemplo).
Además de los sistemas de modificación de restricción, la

producto recién sintetizado de un experimento de metilación del ADN también desempeña un papel
mutagénesis dirigida? La respuesta a ambas preguntas integral en la regulación de la replicación del genoma, la
es la misma: ¡metilación! Continúe leyendo para saber reparación de pares de bases no coincidentes o
cómo la metilación del ADN puede afectar sus pequeños indeles que ocurren durante la síntesis de ADN
resúmenes de restricción. y la promoción o represión de la expresión de proteínas.
Las metilasas involucradas en estos procesos (por
ejemplo, las metilasas Dam y Dcm) son independientes
de los sistemas de modificación de restricción, pero aún
¿POR QUÉ METILATO?
pueden afectar si ciertas enzimas de restricción pueden
escindir eficazmente el ADN.
Además de los sistemas de modificación de restricción, la
metilación del ADN también desempeña un papel
Las cepas comunes de laboratorio de E. coli K12, como la
integral en la regulación de la replicación del genoma, la
DH5alfa, contienen 3 metilasas que reconocen y metilan
reparación de pares de bases no coincidentes o
diferentes tramos de ADN:
pequeños indeles que ocurren durante la síntesis de ADN
y la promoción o represión de la expresión de proteínas.
• La dam metilasa añade un grupo metilo a la
Resulta que las enzimas de restricción son la mitad de los
adenina de los tramos GATC del ADN.
sistemas de modificación de restricción naturales que
utilizan los procariotas para protegerse del ADN extraño.
• La Dcm metilasa añade un grupo metilo a la
El otro componente de estos sistemas, las
segunda citosina del CCWGG
metiltransferasas, metilan el ADN en secuencias
particulares para evitar que sean degradados por las
• La EcoKI metilasa añade un grupo metilo a
endonucleasas de restricción. Un procariota
la adenina en AACNNNNNNGTGC o
determinado normalmente tiene genes que codifican
GCACNNNNNNGTT
uno o varios sistemas de modificación de restricción que
contienen metiltransferasas que añaden grupos metilo a
secuencias específicas de ADN y a sus acompañantes.

Figura 1
IMPACTOS EN LA CLONACIÓN Y LOS DIGESTOS ¡Sería difícil de interpretar o lo llevaría a concluir

que su plásmido no es correcto!
Aunque no todo el ADN procariótico está metilado

Por el contrario, enzimas como DpnI requieren
al mismo nivel, se debe considerar el potencial de
metilación en sus sitios de reconocimiento para poder
metilación al digerir el ADN. ¿Por qué? Bueno,
escindir el ADN de manera eficiente. DpnI se utiliza a
aunque los sitios de metilación Dam no están
menudo para mutagénesis dirigida al sitio. Durante
asociados específicamente con ningún sistema de
este proceso, la incorporación de una mutación
modificación de restricción, sus secuencias pueden
deseada en el plásmido de interés mediante PCR
superponerse con sitios de restricción, inhibiendo
genera plásmidos mutados sin metilación (no hay
enzimas como ClaI o XbaI o, por el contrario,
metiltransferasas en la reacción de PCR). El plásmido
activando enzimas como DpnI.
plantilla, por otro lado, debe derivar de una cepa de E.
coli dam+ y, por lo tanto, tendrá adeninas metiladas
Por ejemplo, la escisión por XbaI puede bloquearse
en cualquier secuencia GATC encontrada en el
debido a la metilación si el sitio de reconocimiento de
plásmido. Cuando los productos de la PCR se digieren
la enzima (TCTAGA) está precedido por GA o seguido
con DpnI, solo se destruye la plantilla metilada y no
por TC. Como se muestra en la Figura 1, un sitio de
mutada, dejando un conjunto de plásmidos mutados
reconocimiento de metilasa Dam (subrayado en rojo)
que luego pueden verificarse mediante secuenciación
se superpone con el sitio de corte XbaI (representado
de Sanger.
como una línea naranja) porque el sitio de restricción
va seguido de TC. La adición del grupo metilo en este
sitio bloquearía la enzima cortar el ADN allí, aunque
otros sitios de restricción (incluidos otros sitios XbaI ¿CÓMO PUEDO SABER SI MI ENZIMA
no precedidos por GA o seguidos por TC) se cortarían SE CORTA?
normalmente. Si no se tiene en cuenta, este sitio
bloqueado podría ofrecerle resultados que Por el contrario, enzimas como DpnI requieren

metilación en sus sitios de reconocimiento para

escindir eficientemente el ADN. DpnI se utiliza a
menudo para mutagénesis dirigida al sitio. Durante
este proceso, la incorporación de una mutación
deseada en el plásmido de interés mediante PCR
genera plásmidos mutados sin metilación (no hay
metiltransferasas en la reacción de PCR). El
plásmido plantilla, por otro lado, debe derivar de
una cepa de E. coli dam+ y, por lo tanto, tendrá
adeninas metiladas en cualquier secuencia GATC
encontrada en el plásmido. Cuando los productos
de la PCR se digieren con DpnI, solo se destruye la Imagen creada con Snapgene(R).
plantilla metilada y no mutada, dejando un
conjunto de plásmidos mutados que luego pueden
verificarse mediante secuenciación de Sanger. repurificándolo. Estas cepas especializadas de E. coli han
sido diseñadas específicamente para ser deficientes en
metilasa Dam y Dcm y, como tales, producen ADN que
CONTROLAR LA METILACIÓN no está metilado en esos sitios. Tenga en cuenta que las
cepas dam-/dcm- pueden tener una mayor tasa de
Ya sea que realice un resumen con fines de clonación o para mutación (ya que también serían deficientes en las
diagnóstico, sugerimos realizar una doble verificación para funciones de reparación de desajustes de Dam), por lo
asegurarse de que los resultados no se vean afectados por la que estas cepas no deben usarse para almacenamiento a
metilación. Convenientemente, la mayoría de las enzimas de largo plazo.norte
restricción utilizadas habitualmente en el laboratorio no tienen
sitios de reconocimiento que puedan superponerse con un sitio
de metilación. La siguiente tabla de referencia rápida enumera
10 enzimas comunes que pueden verse afectadas por la
metilación. Esta tabla no es de ninguna manera exhaustiva, por Lectura adicional
lo que es posible que desee consultar laREBASER base de datos
para obtener información más detallada. Revisión deSistemas de modificación de restricciones
Finalmente, puedes controlar la metilación alterando tu Recurso de NEB que describe las
elección de bacterias. Por ejemplo, si debe utilizar un metilasas Dam y Dcm
sitio de restricción que será bloqueado por la metilación
Dam o Dcm, puede asegurarse de que este sitio Descubrimiento de DpnI
permanezca desbloqueado clonando primero su ADN en

una cepa dam–/dcm– de E. coli comoJM110 y Revisión que describe dam-/dcm- E. coli

Tabla 1.5 - Enzimas de metilación Dam
Enzima metilación de la presa Metilación de dcm Metilación de EcoKI
apai No afectado Bloqueado por metilación superpuesta No afectado
BsaI No afectado Bloqueado por metilación superpuesta No afectado
Bloqueado por superposición

clai No afectado No afectado
metilación
DraI Bloqueado por superposición

No afectado No afectado
metilación

HpaI No afectado No afectado
metilación

MboI No afectado No afectado
metilación
MboI No afectado Bloqueado por metilación superpuesta No afectado

PmeI No afectado No afectado
metilación

XbaI No afectado No afectado
metilación
Requiere metilación
DpnI No afectado No afectado
para actividad

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CAPÍTULO 1|¿QUÉ ES UN PLASMIDO?

Una breve historia de los plásmidos

B ¿ioblastos? ¿Plasmagenes? En las décadas de 1940 y 1950, los científicos

Entonces, ¿cómo obtuvieron los plásmidos su nombre?

En 1952, Joshua Lederberg se propuso aclarar la clasificación de estos factores

Plásmidos 101 4ta edición 9

Sin embargo, su propuesta fue básicamente ignorada. Unos

DE SERVILLETAS A CUADERNOS resistentes a ambos. Cuando esto tuvo éxito, pSC101 se

predecible) para desarrollar aplicarse de manera diversa a muchos campos diferentes.

Plásmidos 101 4ta edición 10

Reunión CSHL: Plásmidos: Historia y Biología TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA A LOS MEDICAMENTOS

Plásmidos 101 4ta edición 11

A En su nivel más básico, los plásmidos

replicación, un marcador de selección y un sitio de clonación. La selectivamente en placas de antibióticos.

facilidad para modificar los plásmidos y la capacidad de los plásmidos

bioingenieros. plásmidos a medida que crecen, los científicos pueden producir

fácilmente grandes cantidades de plásmidos para manipularlos y

utilizarlos en trabajos posteriores.

¿CÓMO SE CONSTRUYE UN PLASMIDO EN EL

Plásmidos 101 4ta edición 12

Tabla 1.1 - Elementos del vector plásmido

Resistencia a los antibióticos Permite la selección de bacterias que contienen plásmidos.

Plásmidos 101 4ta edición 13

l Consideremos otro elemento básico de

• ¿Tendrá sólo un tipo de plásmido en sus células

Plásmidos 101 4ta edición 14

Tabla 1.2 - Origen de la replicación

Vectores comunes Número de copia* ORI Grupo de incompatibilidad Control

puc ~500-700 pMB1 (derivado) A Relajado

pBR322 ~15-20 pMB1 A Relajado

mascota ~15-20 pBR322 A Relajado

pGEX ~15-20 pBR322 A Relajado

pColE1 ~15-20 ColE1 A Relajado

pR6K ~15-20 R6K** B Riguroso

pacyc ~10 P15A B Relajado

pSC101 ~5 pSC101 do Riguroso

pBluescript ~300-500 ColE1 (derivada) y F1*** A Relajado

pGEM ~300-500 pUC y F1 A Relajado

* El número de copias real varía. .

Plásmidos 101 4ta edición 15

ELEGIR SABIAMENTE EL el inserto

La mejor elección de ORI depende de cuántas tóxico.

copias de plásmido desea mantener, qué host o

con los mismos ORI son incompatibles porque rendimientos de plásmidos.

competirán por la misma maquinaria, creando un

estas consideraciones si planea purificar su ADN

Plásmidos 101 4ta edición 16

Ahora que podemos replicar nuestro plásmido y LAS ARN POLIMERASAS

norte asegurarnos de que las células lo mantengan, el

Plásmidos 101 4ta edición 17

ESPECIFICIDAD DEL PROMOTOR

promotores bacterianos sólo funcionan en células norte

procarióticas y, por lo general, sólo en la misma especie o en

Los promotores regulados pueden actuar sólo en ciertos tejidos

Plásmidos 101 4ta edición 18

Tabla 1.3 - Promotores eucariotas

Promotor Ante todo ARN Descripción Expresión Consideraciones adicionales

Mamífero fuerte Puede contener un