Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

Laboratorio de Biología Molecular 2:

Extracción de ADN vegetal

Objetivos:
General: Extraer ADN genómico vegetal de buena calidad.

Objetivos específicos:
- Adquirir competencias y buenas prácticas asociadas con técnicas y protocolos básicos de extracción de ADN
genómico.
- Entender las bases moleculares que sustentan los diferentes pasos de un protocolo de extracción /purificación de
ADN, así como la función de algunos reactivos.
- Relacionar algunos pasos comunes a protocolos de extracción de ADN, con las propiedades del ADN vistas en clases
teóricas y taller.

Introducción:

Existen numerosas aplicaciones, tanto para investigación como en diagnóstico de enfermedades o control de calidad de
alimentos, análisis ambiental, etc…que requieren una extracción de ácidos nucleicos (ADN o ARN). Esta extracción se
puede realizar a partir de muestras de tejidos o fluidos humanos, de animales, plantas, microorganismos, alimentos,
fósiles , así como muestras ambientales (por ejemplo: agua, suelos y aire). Para la extracción del material genético se
emplean diferentes protocolos o métodos que varían de acuerdo con la característica de cada muestra, pero debido a la
universalidad del material genético y sus propiedades, también tienen muchos elementos en común. A continuación,
revisaremos los pasos principales en la extracción de material genético.

Generalmente los protocolos constan de los siguientes pasos:

• Obtención , liberación y/o concentración de las células, para obtener suficiente cantidad de células libres a
partir de las cuales se obtendrá ADN: puede ser por centrifugación o filtración (fluidos, cultivos en suspensión),
ruptura mecánica de paredes (p. e. por maceración en mortero) u otras matrices poliméricas que rodean las
células (tejidos vegetales o de insectos, hueso, dientes) o dispersión de células adheridas con diversos
tratamientos (tejidos blandos o mucosas de animales), entre otros.
• Lavado de células en solución isotónica (para evitar lisis celular en esta etapa) para eliminar contaminantes
extracelulares que puedan interferir.
• Lisis de membrana celular ( y pared de algunas bacterias) por agentes químicos (p.e. detergentes), a veces
combinados con métodos físicos (ultrasonidos, agitación de alta velocidad), o enzimáticos (p.e., empleo de
lisozima). La mayoría de los protocolos realizan este paso de ruptura celular en búfer de lisis que contienen
detergentes como SDS o CTAB que contribuyen a la lisis en presencia de EDTA. El EDTA es un quelante que
forma complejos con cationes, como Mg2+. Dado que el magnesio es un cofactor importante de las
nucleasas, el EDTA tienefunción inhibidora de DNAsas tanto endógenas como exógenas.
• Eliminación de impurezas principales: lípidos de membrana, proteínas, restos de pared y ARN. Este paso
puede hacerse también secuencialmente e incluir varios pasos, por ejemplo:
Para restos de lípidos y de pared, una simple centrifugación o filtrado puede eliminar esas impurezas
sólidas o insolubles en agua.
Para remoción de proteínas existen varias alternativas: Disociación de proteínas unidas al ADN (p.ej
histonas) con ayuda de SDS (desnaturaliza las proteínas) y altas concentraciones de sales (precipitación de
proteínas) seguido de remoción mediante centrifugación. Otra alternativa para remover proteínas es el uso
de proteasas (p. ej. proteinasa K), o el uso de extracciones con solventes orgánicos (fenol y cloroformo)
que permiten separar moléculas hidrofóbicas (lípidos y proteínas) de moléculas hidrosolubles (ácidos
nucleicos principalmente).
Para eliminar ARN (no siempre se requiere), se emplea un tratamiento con RNAsa o empleando un pH muy
básico (desnaturaliza el ADN pero degrada el ARN).

1
 Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

• Precipitación y lavado del ADN: este paso o pasos finales son comunes a la mayoría de protocolos y
consiste en una precipitación alcohólica (etanol o isopropanol) del ADN, seguido de lavado de sales con una
mezcla de alcohol con agua.
• Secado y suspensión del ADN en buffer acuoso o agua desionizada. Es el paso final, y se emplean
volúmenes reducidos de agua o bufer con el fin de concentrar la muestra de ADN extraído.

Prelaboratorio: actividad 1.

Identifique en el protocolo que emplearemos para extraer ADN genómico de soya situado al final de esta
guía, cada uno de los pasos anteriormente descritos

En esta práctica vamos a extraer ADN genómico de brotes o raíces de soya (hipocótilos). Con este ADN se
pueden hacer muchos estudios en esta especie, pero nosotros lo emplearemos más adelante como control
positivo para detectar presencia de soya en alimentos empleando la técnica de PCR. Esta detección se hace
en muchos países por las agencias de control y vigilancia de alimentos para su correcto etiquetado debido a
que existen muchas personas alérgicas a la soya. Lo mismo se hace para otras sustancias alergénicas de
importancia en la alimentación (maní, nueces u otras oleaginosas, entre otros). Existen varios protocolos de
detección de estas fuentes de alérgenos como las basadas en detección inmunológica (antígenos), pero la
PCR ofrece a veces mayor sensibilidad, confiabilidad y también puede dar información cuantitativa.

DNA vegetal.

El aislamiento y purificación de moléculas de ADN genómico a partir de tejidos vegetales presenta algunas
dificultades adicionales respecto a otros organismos eucariotas o procariotas:
• Riesgo de degradación parcial o completa de ADN por la acción de un gran número de nucleasas
endógenas normalmente dirigidas a defensa antiviral.
• Contaminación con otras moléculas abundantes en tejidos vegetales como polisacáridos, los cuales
pueden inhibir reacciones enzimáticas posteriores.
• Contaminación con ácidos orgánicos, polifenoles, látex y otros compuestos secundarios, que pueden
copurificarse con el ADN y/o oxidarlo y degradarlo, lo cual dificulta la obtención de un ADN puro y de
buena calidad e integridad (no degradado).

Dificultades similares pueden también presentarse en la extracción de ADN de muestras como suelo, heces,
alimentos, etc…como las que se emplean en estudios de microbiomas.

Dado que la composición química de los tejidos vegetales varía considerablemente según el tipo de planta,
es difícil disponer de un único protocolo para la extracción de ADN de diferentes especies de plantas
(herbáceas, leñosas, entre otras).

Los protocolos para extracción de ADN a partir de plantas difieren principalmente en aspectos como la
ruptura de los tejidos y células, la composición de los buffers de extracción, procedimientos de lisis y los
procesos para eliminar compuestos como proteínas, membranas, polisacáridos, o polifenoles.

En la mayoría de los métodos de extracción se recomienda que el tejido sea pulverizado con nitrógeno
líquido, utilizando un mortero o dentro del tubo Eppendorf. Es importante no permitir que la preparación se
descongele antes de agregar el buffer de extracción, para aumentar la eficiencia de la pulverización, así
como evitar la acción de las enzimas que degradan el ADN o su oxidación.
También puede emplearse tejido fresco, sin necesidad de usar nitrógeno líquido. En este caso, debe
macerarse directamente dentro del buffer de extracción, que es lo que emplearemos en este protocolo.
La lisis celular, combina generalmente una acción mecánica utilizando vórtex y calentamiento en baño
2
 Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

María, lo cual también contribuye a desnaturalizar proteínas como las DNAsas y otras fuertemente unidas
con el ADN como las histonas y otras proteínas nucleares.

El buffer de extracción contiene generalmente:

- Detergente catiónico (CTAB) o aniónico (SDS)

- Un estabilizador de pH (Tris generalmente) para mantener el pH del homogenizado a valores
básicos, incluso tras liberación de ácidos orgánicos, y evitar la degradación del ADN por acidez, así
como la actividad de enzimas degradantes (DNAsas).
- Altas concentraciones de sales (NaCl >1 M) para disociar proteínas nucleares (histonas), y mantener
los polisacáridos en solución durante la precipitación final del ADN con etanol
- Agentes antioxidantes como el β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), metabisulfito de sodio o ácido
ascórbico evitan degradaciones oxidativas del ADN.
- Agentes quelantes de cationes divalentes ( Mg++) como el EDTA, que inhiben la acción de DNasas
dependientes de dichos cationes.

Remoción de proteínas y RNA: las proteínas son disociadas del ADN y denaturadas por acción de detergentes
(SDS, CTAB…) en el buffer de lisis. Adicionalmente se logra una precipitación gradual de proteínas con altas
concentraciones de sales durante o después de la lisis. También pueden ser utilizados solventes orgánicos
como fenol o mezclas de fenol:cloroformo o de cloroformo:isoamilalcohol para lograr una mayor extracción
de proteínas, o inclusive un tratamiento con proteinasa K. En la mayoría de los casos la presencia de RNA
interfiere igualmente en algunas reacciones, por lo cual muchos protocolos constan de un paso de
tratamiento con RNAsa.

Remoción de polisacáridos: las plantas se caracterizan por contener altas concentraciones de polisacáridos y
es necesario eliminarlos o separarlos del ADN a extraer: el uso de altas concentraciones de sales desde la
lisis, ayuda a mantener solubles estos polisacáridos hasta el momento de la precipitación alcohólica del ADN.
Al adicionar alcohol en la precipitación final del ADN, los polisacáridos se mantienen solubles y, al no
precipitar con el ADN, se logra eliminarlos.

Otras alternativas de extracción de ADN incluyen el empleo de “Kits” comerciales aunque no siempre se
logra obtener ADN de buena calidad para todas las plantas.

3
 Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

Prelaboratorio: actividad 2.
Identifique ahora los componentes de los buffers que emplearemos en este protocolo y la función que
cumplen asociada al paso en el que se encuentran asociados.

Prelaboratorio Actividad 3:
-Basado en la composición del buffer de extracción (página siguiente), imagine que debe preparar 200 mL de
dicho buffer y se encuentra con las siguientes situaciones…realice los cálculos necesarios para poder
preparar esa cantidad de buffer de extracción:

o Situación 1 (dificultad intermedia):

Usted dispone de las siguientes soluciones madre o stock: Tris 1M (pH 8.0), EDTA 0.5 M, NaCl 5M,
Metabisulfito de sodio 1M, y SDS en polvo.

o Situación 2 (dificultad alta):

Usted dispone de todos los reactivos necesarios pero en sus respectivos frascos en polvo…en las etiquetas
encontrará los diferentes pesos moleculares (FW : Formula Weight) de cada uno así:
Tris: 121.4 g/mol; EDTA: 372.24 g/mol; NaCl: 58.44 g/mol; metabisulfito de sodio: 190.107 g/mol; SDS:
288.38 g/mol.

-Calcule ahora cómo preparar 50 mL de etanol al 70% (v/v) teniendo a mano etanol absoluto (puro) y agua
desionizada (dificultad baja).

4
 Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

ADVERTENCIA DE SEGURIDAD: ES INDISPENSABLE PARA EL INGRESO AL LABORATORIO EL USO DE

ELEMENTOS DE PROTECCION PERSONAL (GUANTES NUEVOS; TAPABOCAS NUEVOS; BATA DE MANGA
LARGA), ASI COMO USAR ZAPATOS CERRADOS Y TENER CABELLO RECOGIDO.
ESTOS PROTOCOLOS HACEN USO DE SUSTANCIAS ÁCIDAS e IRRITANTES: MANIPULAR CON CUIDADO
SIEMPRE ENCIMA DEL MESÓN Y LEJOS DE ELEMENTOS PERSONALES COMO CUADERNOS, CELULARES,
TABLETAS o COMPUTADORES.
EL LAVADO DE MANOS SE REALIZARÁ TANTO AL INGRESO COMO A LA SALIDA DE LA PRÁCTICA.
INTENTAR MANTENER DISTANCIAMIENTO DURANTE LA PRÁCTICA.

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción de DNA de brotes de soya:

Material vegetal: brotes de soya germinados.
Materiales necesarios: morteros en porcelana, espátulas delgadas, micropipetas, puntas y tubos
Eppendorf (1.5 mL) estériles, toallas de papel, recipientes colectores para desechos líquidos, neveras
con hielo.
Reactivos:
Buffer de Extracción (BE):
Tris HCl pH = 8.0 100 mM
EDTA 20 mM
NaCl 1 M
SDS 1.5% (p/v)
Metabisulfito de Sodio 20 mM

Acetato de potasio 5M.

Isopropanol frío (grado analítico) Etanol al 70 % (v/v) frío
H2O milliQ

Equipos: baño María, vortex, microcentrífuga refrigerada

Metodología: (las preguntas que aparecen se contestarán durante la realización de la práctica)

1. Colocar 2 brote de soya en un mortero, y añadir 1000 μl de buffer de extracción (BE) frío
2. Macerar rápidamente el tejido vegetal con ayuda del pistilo y por medio de movimientos circulares.
3. Transferir 500 uL del macerado a un tubo Eppendorf nuevo y añadir 250 uL de buffer BE. Mezclar
bien, agitando el tubo vigorosamente (vórtex).
4. Centrifugar a 13 000 rpm durante 3 minutos.
5. Recuperar el sobrenadante vertiéndolo a un tubo nuevo de un tubo a otro sin usar micropipeta (no es
necesario recuperarlo todo). ¿Observe que hay en el fondo del tubo: Qué cree que se logró separar
en este paso # 5?___________________________________________________________________
¿Qué cree que ocurrirá en el paso siguiente # 6?________________________________________

6. Incubar a 65ºC durante 10 minutos agitando cada 5 minutos en vórtex.

7. Agregar 100 μl de acetato de potasio 5 M, mezclar e incubar en hielo durante 5 minutos.
¿Qué cree que sucede en este paso?____________ ¿ Por qué incubar en hielo?________________
8. Centrifugar a 13 000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Observe qué se pudo formar al fondo del tubo.
¿Qué contiene el sedimento (pellet)? ______Qué contiene el sobrenadante?__________________
9. Recuperar el sobrenadante vertiéndolo a un tubo nuevo (no es necesario recuperarlo todo).
10. Añadir 0.6 mL de isopropanol frío. Mezclar por inversión e incubar en hielo por 5 minutos.
¿Qué hay en común con el paso 7 y qué sucede aquí? _____________________________________
¿Qué observa en el tubo tras los 5 minutos?_____________________________________________
11. Centrifugar a 13 000 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
5
 Biología molecular ID1261 - Departamento de Biología

¿Logra observar algún sedimento (pellet)? ____Qué contiene dicho pellet? _____¿ Y el sobrenadante?
12. Descartar el sobrenadante, eliminando remanente sobre toalla de papel.
13. Lavar el sedimento de ADN con 500 μl de etanol al 70% (v/v) frío.
14. Centrifugar a 13000 rpm durante 3 minutos a 4ºC.
15. Descartar el sobrenadante, eliminando remanente sobre toalla de papel.
16. Dejar secar bien el sedimento de ADN dejando los tubos invertidos durante 10 min. a temperatura
ambiente sobre una toalla de papel.
17. Resuspender en 50 μl de agua desionizada estéril.

Marcar sus tubos según instrucciones de su profesor.

Almacenar a -20 ºC y cuantificar por espectrofotometría (DO260/DO280) (monitora)

Evaluar calidad mediante electroforesis (se realizará en la siguiente práctica de electroforesis ).

Referencias:
Dellaporta, S.L., Wood, J. & Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation. Version II. Plant Molecular Biology
Reporter 1 (14): 19-21.
Mc Couch, S.R., Krochert, G., Yu, H., Wang, Z.Y., Khush, G.S., Coffman, W.R. &Tanksley, S.D. 1988. Molecular
mapping of rice chromosomes. Theor. Appl. Genet. 76:815-829.
Weising, K., Nybom, H., Wolf, K. & Kahl, G. 2005. DNA Fingerprinting in Plants. Principles, Methods and
Applications. Second Edition. Ed. Taylor & Francis Group. 444p