UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

CURSO GENÉTICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

DOCENTE ANDERSON RAMÍREZ AYALA
TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Las técnicas empleadas por la biología molecular se fundamentan todas en las

propiedades de los ácidos nucleicos tales como la desnaturalización, la renaturalización,
la complementariedad de bases entre moléculas del mismo tipo ( DNA_ DNA o
RNA_RNA ) o la complementariedad de bases de moléculas de diferente tipo ( DNA-
RNA), la presencia de las cargas negativas en los grupos fosfatos, la composición
química de algunos componentes de los ácidos nucleicos, el sentido antiparalelo.
Además se suelen aprovechar los conocimientos que se tienen de los componentes
celulares tales como la pared celular, o el comportamiento de la células frente a ciertos
compuestos químicos.

Los procedimientos de biología molecular realizados en el laboratorio pueden tener

múltiples propósitos tales como el diagnóstico de enfermedades genéticas humanas,
caracterización molecular de microorganismos patógenos de importancia humana,
animal o vegetal, comparaciones de secuencias de ácidos nucleicos con fines
evolutivos, la modificación genética de un organismo, la identificación de nuevos genes
responsables de ciertas características particulares, las pruebas de paternidad o la
solución de casos de interés forense, entre otros. Adicionalmente se pueden realizar
algunos procedimientos de laboratorio con el fin de hacer practicas académicas
demostrativas, que permitan reforzar los conceptos teóricos vistos en el aula de clase.

Los laboratorios de biología molecular deben tener una infraestructura apropiada, pues
debido a la abundante presencia de microorganismos en el ambiente, es muy probable
que se presente contaminación de las muestras que se deseen analizar. Por lo anterior es
recomendable emplear estos laboratorios para uso exclusivo, de tal forma que se
disminuya la probabilidad de contaminación de las muestras.

Las muestras biológicas que se pueden emplear para análisis molecular es muy diverso,
pues se no es indispensable el empleo de tejidos vivos. Algunas de las muestras que se
suelen analizar son: sangre, semen. Liquido cefalorraquideo, orina, heces fecales,
huesos, piel, músculo, alimentos, suelos, entre otros. A diferencia de otras técnicas en
las que se analizan proteínas, estas técnicas poseen la ventaja de poder utilizar muestras
de células muertas, incluso se pueden analizar tejidos embebidos en parafina.

El análisis de una muestra de ADN normalmente no requiere una sola técnica sino la
realización de un conjunto de técnicas complementarias, las cuales implican el
aprovechamiento de diferentes propiedades de los ácidos nucleicos.En la actualidad se
encuentra una estrecha relación entre la informática y la biología molecular, pues son
múltiples los programas existentes para el análisis de ADN por diferentes métodos.

Es de resaltar que las técnicas de biología molecular, no solo se están empleando para
campos de la biología o de la medicina sino también en campos que al parecer no
poseen una relación tan estrecha tales como el derecho y la antropología.
Las técnicas moleculares se caracterizan porque son mucho más sensibles, más
especificas y más rápidas que las técnicas convencionales. Algunos de los
inconvenientes encontrados frecuentemente son los costos y la capacitación del personal
que se vaya a encargar de los procedimientos del laboratorio.

Algunas de las razones para extraer ácidos nucleicos son:

- Caracterización molecular de microorganismos: virus, bacterias, parásitos,

hongos.

- Identificación de genes humanos responsables de patologías humanas y

animales.

- Determinación de mutaciones en posiciones específicas, las cuales pueden estar

implicadas en el nivel de daño de algunas patologías humanas o animales o
estar implicadas en el grado de patogenicidad de ciertos microorganismos.

- Determinación de la secuencia de ADN de un gen particular o de un genoma.

- Modificación genética de una célula o de un organismo a través de

procedimientos de ingeniería genética.

- Determinación de la identidad de seres humanos en casos forenses.

- Comparación de secuencias de ácidos nucleicos entre dos o más especies con el

fin de establecer relaciones filogenéticas, de tal forma que se pueda conocer la
distancia genética entre los organismos estudiados.

- Determinación de la expresión de algunos genes.

AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Los procedimientos para obtener ácidos nucleicos dependen de las propiedades de las
células de las cuales se desea extraer el ADN o el ARN, de tal forma que es necesario si
se trata de una célula procariotica o eucariótica, vegetal o animal, así por ejemplo si
desea extraer el ADN de una bacteria es necesario conocer si se trata de una bacteria
gram positiva o gram negativa, para utilizar una serie de reactivos específicos que
actúen a nivel de sus componentes determinados.

En el caso de los hongos, se suele empelar la quitinasa para eliminar el principal

componente de la pared celular de los hongos que posean este componente a nivel de la
pared celular. En el caso bacteriano se suele emplear la enzima lisozima para lisar la
pared celular bacteriana. También es necesario conocer el estado de organización del
ADN de la célula a estudiar. Es conocido que las células eucarióticas poseen las
proteínas llamadas histonas, responsables del enrollamiento del ADN para conformar
los cromosomas.

En algunas ocasiones se recurre a métodos que emplean soluciones sobresaturadas de

cloruro de sodio, la cual provoca la desnaturalización y precipitación de las proteínas
celulares. Todos los procedimientos de laboratorio que conducen a la extracción de los
ácidos nucleicos, tratan al máximo de eliminar sustancias que son considerados
contaminantes y que pueden interferir en el posterior análisis de estos. Algunos de los
compuestos que pueden actuar como contaminantes en la extracción del ADN son las
proteínas, los carbohidratos, y el RNA. El detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) es
empleado muy frecuentemente para lisar proteínas que hacen parte de las membranas
celulares. Adicionalmente se suele emplear la enzima proteinasa K, la cual se encarga
de lisar proteínas celulares y permitir la obtención de un ADN puro. Uno de los
métodos más empleados es el método fenol- cloroformo. El fenol desnaturaliza
proteínas , mientras que el cloroformo remueve lípidos. Sin embargo en el comercio se
dispone de una gran cantidad de kits comerciales para la extracción de ácidos nucleicos.

El ADN se debe proteger de la acción de ciertas desoxirribonucleasas , por lo tatnto se

suele emplear EDTA el cual actúa como un agente quelante ( ácido etilen –
diaminotetraácetico ), tiene la propiedad de unir iones de magnesio , el cual es
considerado un cofactor necesario para la mayoría de las nucleasas. Se emplean
alcoholes con el fin de separar el ADN de la fase acuosa de la solución en la cual se
encuentre, para esto se puede emplear el etanol o el isopropanol, que conducen a la
precipitación del ADN

La enzima RNAasa se suele emplear para degradar moléculas de RNA que pueden
interferir con el análisis de ADN.

Un aspecto importante que se debe tener en cuenta en el aislamiento de los ácidos

nucleicos es la contaminación de las muestras por polisacáridos, que no se pudieron
remover durante la extracción e influyen en la pureza del ADN. Estos carbohidratos
pueden influir en la actividad de ciertas enzimas tales como polimerasas, ligasas y
endonucleasas de restricción. Estas enzimas suelen ser muy empleads en
procedimientos de ingeniería genética, RFLP , entre otras.

Para evitar esta posible contaminación se debe tener en cuenta que la base para la
separación de los polisacaridos de los ácidos nuleicos es su diferencial solubilidad en
presencia de detergentes como el CTAB ( hexadecil trimetil bromuro de amonio ) así
como tambén emplear tampones con altas concentraciones de de NaCl ( 0.5- 3.0M) o
combinar el CTAB con un paso posterior de fenol cloroformo puede resultar apropiado
para eliminar complejos de carbohidratos presentes en el ADN extraído y de esta
manera garantizar que procedimientos posteriores con este ADN será apropiado.

REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIÓN DEL ADN

TRIS tampón biológico Mantiene estable el pH de la solución ( pH

7.0- 8.0.

EDTA Agente quelante toma iones Mg

Fenol solvente organico Desnaturaliza proteínas

Cloroformo solvente organico remueve lípidos, desnaturaliza proteínas,
Solubiliza fenol y lo elimina de la solución.

CTAB Detergente Catiónico solubiliza carbohidratos

SDS Detergente aniónico Solubiliza proteínas, tejidos y membranas

Acetato de sodio Sal precipita el ADN

Etanol- isopropanol alcoholes precipita ácidos nucleicos

( a bajas temperaturas ).

Finalmente se puede determinar la concentración del ADN obtenido a través de estudios

d espectrofotometría , en los cuales se puede determinar si la muestra está contaminada
por proteínas, o por RNA y además la cantidad de ADN obtenido.

Uno de los procedimientos para evaluar la presencia del ADN obtenido a partir de cada
una de las muestras de interés, es a través de la electroforesis de agarosa, procedimiento
que será descrito posteriormente. Por medio de esta técnica el ADN se tiñe con un
colorante apropiado, y emite un color naranja cuando se observa con luz ultravioleta:

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida comúnmente como PCR , ha sido la

de las técnicas que ha contribuido de gran manera para los conocimientos que se poseen
en la actualidad de genes y genomas de múltiples especies. Es un método usado para la
amplificación in vitro de un segmento específico de ADN. El término amplificación se
refiere al incremento en el número de copias del segmento que se obtiene, pues el
proceso se fundamenta en el proceso de replicación, produciéndose copias idénticas de
ADN, más no de todo el cromosoma sino del segmento seleccionado para la
amplificación. Para este procedimiento se requieren algunos componentes que son:

La reacción en cadena de la polimerasa se caracteriza por la especifidad , sensibilidad,

sencillez y versatilidad. La especificidad se refiere al procedimiento que sirve para
amplificar una secuencia preseleccionada de la molécula de ADN original. La
versatilidad de la técnica se relaciona con la aplicación de la técnica a todo tipo de
muestras biológicas.

Para realizar una PCR se requieren los siguientes componentes:

- ADN molde:

Corresponde a muestras de ADN de células de diferente fuente que se han seleccionado

para su análisis. Tal como se mencionó anteriormente estas muestras corresponden a
cualquier tipo de célula y/o tejido: cultivos bacterianos, plantas, tejidos animales,
alimentos , etc.

-primers:

Conocidos como oligos o iniciadores. Se definen como cortos segmentos de ADN

monocatenarios que flankean la región que se desea amplificar. Durante el proceso de
PCR, los primers se ubican en posiciones opuestas de las cadenas de ADN, por lo cual
se usa el término primer derecho y primer izquierdo. Dado que los genes poseen
secuencias diferentes, entonces los primers poseen también secuencias específicas, de
tal forma que un par de primers empleados para un gen, solo se unirán con la secuencia
complementaria a ese gen y no podrá unirse con otra región, a menos de que guarde una
alta homología con la secuencia diana.

- Enzima ADN polimerasa:

Una de la enzimas más empleadas en la PCR es la Taq polimerasa, la cual es obtenida

de la bacteria thermofílica Termus acuaticus. Por su naturaleza la enzima puede
sobrevivir a la exposición repetitiva de incrementos drásticos de temperatura necesarios
en la desnaturalización del ADN para que los primers se puedan unir.

-dNTPs:

Tal como se realiza la replicación adicionando nucleótidos por complementariedad de

bases, en la PCR se adicionan nucleótidos de A, T, C y G que serán adicionados por la
enzima ADN polimerasa.

MgCl2:
En los sistemas vivientes el proceso de la replicación es acompañado por la enzima
ADN polimerasa. Usando Mg +2 como cofactor, la enzima cataliza la dición de bases
al extremo 3’ del primer alineado.

Buffer:

El buffer tiene como función proporcionar un pH adecuado para que se lleve el proceso
de manera eficiente.

La mezcla de todos los componentes necesarios para la PCR recibe el nombre de mezcla
maestra ( master mix).

PASOS DE UN CICLO DE PCR

DESNATURALIZACIÓN:

Es la separación de las cadenas de ADN empleando temperaturas cercanas a los 90 oC

dependiendo de las cantidades de GC o de TA, pues ya se ha dicho que estas primeras
secuencias son mucho más estables que las últimas debido a la cantidad de puentes de
hidrógeno que se encuentran entre ellas.

ANILLAMIENTO:

Durante este paso los primers se unen por complementariedad de bases en la posición
correcta. Para esto se debe disminuir la temperatura que se empleó para la
desnaturalización.

EXTENSIÓN:
Se refiere al momento en el cual la enzima ADN polimerasa une nucleótidos por
complementariedad de bases en los sitios adyacentes al sitio de unión de los primers.

La desnaturalización el anillamiento y la extensión reciben el nombre de ciclo de PCR,

dado que se hacen múltiples ciclos en un procedimiento de PCR el número se
incrementa de manera exponencial, de tal forma que en un proceso en el que se inicia
con una sola molécula de ADN y se aplican 30 ciclos, se obtienen finalmente cerca de
un billón de copias, pues el proceso es exponencial.

El proceso de la PCR requiere de un equipo especializado que recibe el nombre de

termociclador, el cual se encuentra diseñado para que pueda recibir diferentes datos para
controlar los tiempos que debe permanecer la muestra en cada paso de los ciclos de
PCR, el número de ciclos en los que va a realizar el proceso y además las temperaturas
para cada paso de los ciclos de PCR. De acuerdo a lo anterior se puede percibir que son
muchas las propiedades del ADN que se aprovechan para la realización de la PCR:
complementariedad de bases, sentido antiparalelo, desnaturalización, renaturalización,
la replicación semiconservativa del ADN , entre otras.

TIPOS DE PCR MÁS EMPLEADOS.

Después de creada la técnica PCR por Karry Mullis en 1985, se hicieron modificaciones
a la técnica de tal forma que se ha hecho cada vez mayor los campos de aplicación de la
técnica, mejorando la eficiencia del procedimiento. Son múltiples las técnicas que se
han derivado de la PCR, sin embargo en este capítulo solo se describirán aquellas que
se consideran de mayor aplicación.

PCR MÚLTIPLE

Uno de los tipos de PCR más ampliamente utilizados es la PCR múltpiple, la cual se
caracteriza porque permite amplificar en forma simultánea varios genes o secuencias de
ADN en forma simultánea. Para que el proceso se pueda llevar a cabo se requiere
utilizar un par de primers por cada secuencia o gen que se desee analizar. Además se
requiere que las secuencias amplificadas posean tamaños diferentes, puesto que en el
momento de realizar la electroforesis, cada fragmento de ADN característico de una
secuencia amplificada debe quedar en una posición específica para poder ser
diferenciado de las demás secuencias que se encuentran corriendo en el mismo carril.

Esta técnica se suele emplear muy frecuentemente en pruebas de ADN para casos de
estudios de identidad y para pruebas de paternidad. De igual forma, se puede aplicar la
PCR para estudios microbiológicos, en los que se desea evaluar la presencia de varios
genes en un microorganismo o para determinar la presencia de varios microorganismos
en una misma muestra. A nivel humano se utilizan con fines forenses o de pruebas de
paternidad algunas secuencias que se conocen como moderadamente repetitivas o
altamente repetitivas.

Se amplifica 3 genes humanos polimorficos ( A, B y C ). El gen A posee 5 alelos, el B

posee 4 alelos y el C posee 6 alelos. Los tamaños de los alelos oscilan entre 330 y 345
pares de bases, con diferencias entre ellos de solo 5 pares de bases. El gen B amplifica
fragmentos con tamaños que oscilan entre 250 y 260 pares de bases con diferencias de
solo 5 pares de bases entre un alelo y otro. El gen C produce fragmentos con tamaños
que oscilan entre 180 y 205 pares de bases, también con diferencias entre dos alelos de
solo 5 pares de bases. En la grafica se observa tres tríos de paternidad. Se observa una
concordancia entre los alelos de un padre con un menor. Hay incompatibilidad entre
una caso de madre e hijo.

PCR – TRANCRIPTASA REVERSA (RT – PCR)

Este Tipo de PCR se fundamenta en la capacidad de los retrovirus de generar una copia
de ADN a partir de una secuencia de ARN, guardando la complementariedad de bases
UA , AT, CG, GC. Además de la DNA polimerasa, se requiere de la enzima
transcriptasa reversa o retro-transcriptasa, la cual se encarga de sintetizar el DNA a
partir del RNA. La RT-PCR no es exclusiva para analizar retrovirus sino que también
tiene gran aplicación para determinar la expresión de los genes en células o tejidos
específicos.
La sigla RFLP corresponde a las iniciales de Polimorfismo de la Longitud de los
fragmentos de restricción (Restriction Fragment Long Polimorphism). El
procedimiento permite reconocer pequeñas diferencias a nivel de las secuencias del
ADN, diferencias que reciben el nombre de polimorfismos. Los polimorfismos pueden
variar de una especie a otra, de un individuo a otro , de una cepa a otra, etc. El ADN se
caracteriza por que puede interactuar con ciertas enzimas que reconocen secuencias
determinadas, actuando sobre los enlaces fosfodiester y cortando el ADN. Estas
enzimas reciben el nombre de enzimas de restricción, las cuales se extraen de las
bacterias.

Para analizar secuencias de ADN por medio a través del estudio de los polimorfismos
generados por los cortes de las enzimas de restricción, es necesario extraer el ADN, se
amplifica por PCR , posteriormente se corta con una o varias enzimas de restricción
determinadas que actúen a nivel de ciertas secuencias de interés y finalmente el ADN
fragmentado en analizado en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio.

CUESTIONARIO
1. Mencione tres ventajas de las técnicas moleculares en el diagnóstico clínico, en
comparación a las técnicas convencionales.
2. En qué consiste un procedimieto de electroforesis?
3. Cuáles son los tipos más frecuentes de electroforesis?
4. Cual es el fundamento de la electroforesis?
5. Cuáles son las muestras biológicas más humanas empleadas en procedimientos
de biología molecular?
6. Cuáles son los requisitos que usted considera que debe cumplir una muestra
para ser analizada por técnicas de biología molecular. Justifique su respuesta.
7. Además de las muestras biológicas que se describen aquí, cuáles otras, propone
usted que se pueden analizar por biología molecular.
8. Simplifique la tabla mostrada en el texto, en el que se muestran los reactivos
necesarios para la extracción del ADN.
9. Cuáles son las propiedades del ADN que se emplean como fundamento de las
técnicas moleculares.
10. Qué es la PCR (reacción en cadena de la Polimerasa?
11. En que se fundamenta la PCR?
12. Qué es un ciclo de PCR. Esquematice los pasos de un ciclo de PCR.
13. Cuáles son los reactivos básicos que se requieren para un procedimiento de
PCR. Elabore una tabla, escribiendo el nombre del reactivo y la función
correspondiente.
14. Defina cada paso de un ciclo de la PCR, esquematice lo que se presenta en cada
uno de ellos.
15. Elabore un escrito acerca de los aprotes de Kary Mullis a la pandemia generada
por Covid19.
16. Cuales son los reactivos que se requieren para una PCR en tiempo real, y cual es
la función de cada uno de ellos..
17. Elabore un cuadro comparativo con secuencias de tres pares de primers
diferentes para tres genes humanos, destacando el nombre del gen para el cual se
usa cada uno de ellos, y el tamaño del amplicón que originan durante la PCR.
18. Consulte el nombre de dos virus de importancia clínica humana, que sean
analizados por RT PCR
19. Cuales son los pasos de una técnica de PCR RFLPs’ cómo se interpreta este tipo
de PCR?
20. Cual es la diferencia entre la PCR conveb y la PCR en tiempo Real? Como se
interpreta este último tipo de PCR?