TRANSCRIPCIÓN

• Variación en la composición del Core Prom

Martin Monte y PIC
[email protected] • Tipo de Promotores
• Reguladores de la transcripción

1
 VARIACIONES en la conformación del PIC
dependiendo de los elementos presentes
en el Core-Promoter

Regulación de la transcripción mediada por

elementos del PIC

Los Core Promoters difieren en sus elementos

(secuencias de DNA) TATA BREu BREd Irn DPE…

Los GTFs pueden unirse diferentemente dependiendo de los CProm

Los GTFs que se unen pueden tener distintas composiciones

2
CORE PROMOTER en METAZOOS

3
4
TATAWAWR
W: A o T
R: A o G

5
 (TAF1) (TAF1-TAF2)

6
 TBP-related factors (TRFs) o TBP-like factors (TBPLs)
TBP se une al DNA mediante su región C terminal.
Se identificaron proteínas con secuencias similares a la región CT de TBP con
capacidad de unir la secuencia TATA y a TFIIA y TFIIB:
TRF1: TBP Related Factor 1 (solo Drosophila y Anopheles)
TRF3: TBP Related Factor 3 (vertebrados)
 TBP-related factors (TRFs) o TBP-like factors (TBPLs)
TRF2: TBP Related Factor 2 (metazoos)

Es menos similar a TBP

No reemplaza a TBP en TFIID
Une TFIIA y TFIIB
No une TATA box
Se encuentra en los promotores TATA-less

8
Los Core Promoters difieren en su composición de elementos

9
Modelo: Drosophila
Genes & Dev 2014

10
LUC

LUC 11
12
 Ej de ChIP-seq de la proteína TF-x (en células de Drosophila)
DNA genómico
AGCCTTAGAGAGTCTACTCTAGCTTTTTCATACTCGGGGCTCTCTGGCCAGAGAGCCCCTTCTCTTCTCTC

TF-x TF-x

Y ATACTCGGGGCTCTC Y
TCTAGCTTTTTC
Crosslinking y fragmentación del DNA TGGCCAGAGAGCCCC
CCTTAGAGAGTCTAC
IP usando anticuerpo anti-TF-x TF-x
TF-x
Y
Y
Eliminar proteínas y secuenciar el DNA
asociado a la inmuno-purificación

Secuencias encontradas: CCTTAGAGAGTCTAC

TGGCCAGAGAGCCCC

Alinear sobre el genoma de referencia

CCTTAGAGAGTCTAC TGGCCAGAGAGCCCC
AGCCTTAGAGAGTCTACTCTAGCTTTTTCATACTCGGGGCTCTCTGGCCAGAGAGCCCCTTCTCTTCTCTC
GENOMA de REFERENCIA (por ej. la secuencia del genoma de Drosophila) 13
 Ej de ChIP-seq de la proteína TF-x en células de Drosophila

Sigo alienando todas las secuencias que me dio el secuenciador ya que

la ChIP la hice de una gran población de células

Estas son las secuencias leídas, “lecturas” o “reads”

CAGAGAG
CCAGAGAGC
CCAGAGAGCCC
CCAGAGAGCCC
CCAGAGAGCCC
CCAGAGAGCC
GCCAGAGAGCC
GCCAGAGAGCCC
GGCCAGAGAG
GCCAGAGAGCCC
GGCCAGAGAGCCC
GGCCAGAGAGCCCC
GAGAGT TGGCCAGAGAGCCCC
TGGCCAGAGAGCCCC
GAGAGTCTAC TGGCCAGAGAGCCCC
AGAGAGTCT TGGCCAGAGAGCCCC
TTAGAGAGTCTAC TGGCCAGAGAGCCCC
CCTTAGAGAGTCTAC TGGCCAGAGAGCCCC
AGCCTTAGAGAGTCTACTCTAGCTTTTTCATACTCGGGGCTCTCTGGCCAGAGAGCCCCTTCTCTTCTCTC
GENOMA de REFERENCIA (por ej. la secuencia del genoma de Drosophila) 14
Aunque se muestre el ejemplo
sobre dos genes, luego de una ChIP
se tienen datos de todo el genoma
15
 Heatmap
LADO TATA:
Se ordenaron 171 genes (apilados) en orden decreciente de intensidad de pico (o de las lecturas) de
Pol II y respetando la posición con respecto al TSS

A la intensidad más alta, se le pusieron color rojo, luego azul y se sigue hacia el blanco

En TBP y TRF2 se respeta el orden de los genes Pol II

Gen Z
Gen C.1 Zoom del heatmap
Gen MM 16
TSS
17
BTAF1 (o Mot1) se un a TBP y
lo desplaza de promotores TATA

La unión BTAF1-TBP se llama

B-TFIID y es inhibitoria en prom.
TATA

BTAF1 puede redistribuir a TBP

a prom. TATA less y activar la transcripción

18
DATO: TBP R188E no une BTAF1

Clustering o agrupamiento:
Agrupar de genes según
alguna característica detectada

En este caso se ordenaron, 23.630 genes

por intensidad de lecturas Pol II y por
sentido de transcripción (siempre
respetando la posición del TSS) y se
generaron los Clusters A, B, C, D y E

Heatmap en blanco y negro…

(negro más intenso – gris – blanco)

Experimento: RNA-seq comparando

células WT vs MUT
Resultado: solo el 4% de los genes
varían. 19
Expresión génica en cada una
de las líneas celulares

C) Verificación por RT-qPCR

Algunos genes aumentan, otros
disminuyen y otros quedan inalterados

20
Resultados de ChIP-seq en células de ratón

- Se llevan a cabo 4 experimentos independientes

utilizando anti-H3K4me3, anti-Pol II, anti TBP
y anti-GFP (control) en células TBP-WT
- Se repite lo mismo en células TBPmut R188E

Alinean las secuencias solo sobre el gen Rplp0

21
Resultados de ChIP-seq en células de ratón

- Se llevan a cabo 4 experimentos independientes

utilizando anti-H3K4me3, anti-Pol II, anti TBP
y anti-GFP (control) en células TBP-WT
- Se repite lo mismo en células TBPmut R188E

Alinean las secuencias solo sobre el gen Rspo2

22
Conclusión

23
TFIID es blanco de regulación
en la expresión génica

24
 TFIID en promotores con y sin TATA

Imagenes resueltas por cryo-EM de complejos TFIID–TFIIA–DNA permitieron crear este

modelo

Genes Dev. 2020 Apr 1;34(7-8):465-488. doi: 10.1101/gad.335679.119. 25

 Unión de TBP en distintos promotores

DBE: TFIID Binding Element (Inr, MTE, DPE…)

TBS: TBP Binding Site
DBS: TFIID Binding Site

26
Dist TBP a IID-C

CP (Core Prom) SCP (Super Core Prom) TFIID ILT (Initial TBP Loading)

27
28
En ambos casos se puede unir TBP al “TBS”
pero en los TATA-less, ocurre un reposicionamiento
de la polimerasa.

29
30
31
Core promoters eucariotas

32
Nature reviews 424 | JUNE 2007 | VOLUME 8
33
Promotores Bidireccionales

Transcripción Bidireccional, es una característica de genomas de mamíferos

A partir de dos core promoters de Pol II en posición “head to head” y regulados por el
mismo promotor, se generan dos genes que codifican para proteínas (mRNAs), un en
cada dirección.
Los core promoters pueden estar espaciados entre pocas bases (0-500) hasta 2000 bp.
Estimado: 10% de los genes que codifican para proteínas

34
 Promotores Bidireccionales
En este trabajo consideran promotores bidireccionales si la distancia entre TSSs es menor a 2kb

a) La mayoría están separados por 500 bp aprox.

35
Promotores Alternativos

UCSC annotations for human genes 36

Otros factores que afectan la formación y
funcionalidad de PIC:
- Activadores: HATs, HDACs, SAGA…
- El mediador de la actividad de la RNA pol II: Mediador (Mediator)
- Factores de Transcripción

37
Las modificaciones postraduccionales en la cromatina
(histonas) afectan la transcripción

38
Modificaciones en la cromatina (histonas) que afectan la
transcripción

Enzimas: kinasas, Enzimas: fosfatasas Proteínas que poseen

Acetil-transferasas Deacetilasas, un módulo para el
Metil-transferasas, Demetilasas, etc reconocimiento específico
etc de la modificación
Postraduccional. Por ejemplo
cromodominio, bromodominio,
dominio tudor, dominio 14-3-3

39
 Cromodominio

Tyr48

KD >1mM 96uM 15uM 10uM

Tyr24
Trp45

Jaula aromática/hidrofóbica
Cromodominio de HP1 (cintas
amarillas y rojas) interaccionando
con K9 trimetilada de histona H3

CHD, Chromodomain
CD, Chromodomain
 Modificaciones en la cromatina que afectan la transcripción
Múltiples modificaciones de histonas actúan en forma combinatorial o secuencial sobre
colas de histona y especifican una función

UNC School of Medicine

Strahl Lab: UNC Biochemistry and Biophysics 42
 Modificaciones en la cromatina que afectan y que varían
durante la transcripción

Figure 1. Genomic Localization of Histone H3 Modifications Associated with Active Transcription. Simplified illustration of histone
modification occupancy as defined by chromatin immunoprecipitation and sequencing (ChIP-seq) assays is presented. Regions in
color represent what a typical ChIP signal would look like at a given eukaryotic gene [teal, acetylation on H3 lysine 27 (H3K27ac);
purple, monomethylation on H3 lysine 4 (H3K4me1); light blue, acetylation on H3 lysine 9 (H3K9ac); green, trimethylation on H3
lysine 4 (H3K4me3); yellow/orange, di- and trimethylation on H3 lysine 79 (H3K79me2/3); pink/red, trimethylation on H3 lysine
36 (H3K36me3)]. H3K4me3 and H3K9ac are associated with transcriptionally active gene promoter regions, while H3K36me3 and
H3K79me3 are localized to gene bodies of actively transcribing genes. H3K27ac localizes to both active gene promoters and
enhancer regions, and H3K4me1 is predominantly enriched at enhancers

43
 Co-reguladores de la transcripción:

Co- Activadores o Co-Represores que modifican a las histonas

cercanas a zonas regulatorias (promotores, enhnacers, silenciadores, etc).

Los Co-Reg también pueden modificar otras proteínas como los GTFs o TFs, etc

Los cambios pueden derivar en la compactación de la cromatina

44
 AcetilTranferasas (HATs o KATs)
DesAcetilsas (HDACs o KDACs)

writer
eraser

Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 45

September 2013
MetilTransferasas: HMTs o KMTs
DeMetilasas: HDMs o KDMs

46
CREB-binding protein/p300 are
transcriptional coactivators of p65

47
 Complejo represor Polycomb

Polycomb-repressive complexes (PRCs) and their enzymatic activities. The PcG

transcriptional repressors are organized in two main PRCs, PRC1 and PRC2. PRC2 has
four subunits: the Su(var)3-9, enhancer-of-zeste, trithorax domain (SET) domain protein
EZH 1 or EZH2, the zinc finger protein SUZ12, the WD-repeat protein EED and the
48
histone-binding proteins RBAP46 and RBAP48
 HDACs forman parte de Complejos Represores

Histone H3 tail acetylation and HDAC complexes.

(A) Different acetylation sites on H3 N-terminal tail studied in this manuscript; (B)
Components of four well- established HDAC1 complexes CoREST (LSD1, HDAC1, CoREST1),
NuRD (MTA1, HDAC1, RBBP4), Sin3B (Sin3, HDAC1, RBBP4), MiDAC (MIDEAS, HDAC1,
DNTTP1), and one HDAC3 complex SMRT (GPS2-NCoR2 chimera, HDAC3, and TBL1 ).
49
50
Activación de la transcripción por CRISPR utilizando una HAT

51
SAGA
Stp
Ada
Gcn5
Acetyltransferase

52
53
54
An integrated SAGA and TFIID PIC assembly pathway selective for poised and
induced promoters
C.Mittal, et al
Genes & Dev 36: 985-1001, 2022

55
56
 MEDIADOR
Mediador interacciona con el TF por el módulo “Tail”

Factor de Transcripción

57
 MEDIADOR

Mediator comprises four distinct modules: a head module (in red), middle module (in yellow) and tail module (in
blue), which function as the main modules and the CDK8 kinase module (in green), which is transiently associated
with the complex The 10 Mediator subunits (of the 25 total) that are essential for viability in budding yeast are
indicated by asterisks.
58
Mediador interacciona con el PIC y colabora con el posicionamiento de CTD con Cdk7/CycH (TFIIH)

59
 Mediador cambia su conformación
por la unión a TFs y RNA Pol II
estabilizando su unión a cofactores
como Cohesina, CBP, p300 y SAGA

Mediator recruitment via interactions between activator proteins bound to UASs and the Med2-Med3-Med15 triad. Contacts between
Mediator and components of the general transcription machinery facilitate transit of Mediator to the proximal promoter region, and
stabilize association of both Mediator and GTFs.
60
Srb4=Med17

61
REGULACIÓN de la TRANSCRIPCION
Factores de Transcripción

62
REGULACIÓN de la TRANSCRIPCION
Factores de Transcripción
Los TFs se pueden activar por ligandos, estímulos, condiciones celulares, etc

63
 Takahashi M.U., Nakagawa S. (2017) Transcription Factor Genes.
Factores de
transcripción

Dominios
funcionales son
intercambiables
: quimeras

Modular domain structure of NRs. NTD that contains the Activation

Homodímeros Function 1 (AF-1) surface, a zinc finger DBD, a flexible hinge region,
o and a LBD that binds to ligands and interacts with co-regulator
proteins through the Activation Function 2 (AF-2) surface 64
Heterodímeros
Factores de Transcripción:
Ejemplo 1: el Receptor de Glucocorticoides

65
Factores de Transcripción: Receptor de
Glucocorticoides

66
Factores de Transcripción:
Ejemplo 2: el supresor tumoral p53

67
Estructura del supresor tumoral p53

68
Chip-seq de p53:
Inmunoprecipitación de p53 y secuenciación del DNA asociado

69
70
TAF1 es un componente
del Factor General de
Transcripción TFIID

K-Ac
Bromodominio
de TAF1

p53-Ac

71
 Bromodominio

O C

N
Asn (N)
N
O
C

Acetil lisina del péptido reconocida por

la asparagina (N) del bromodominio
 Glucosa

No Transcripción

Galactosa Transcripción

73
Objetivo:

TBP se une al promotor

cuando se activa el
activador?

Metodología:
Genes
control
ChIP
Promotor en
estudio

Figure 1 An in vivo crosslinking assay for measuring TBP–TATA-box interaction. a, GAL1, ADH1.
The locations of the primers used for PCR amplification of the immunopurified DNA fragments
are schematically shown. FA, formaldehyde. 74
Objetivo:
Correlación entre
UNION de TBP al
promotor y
actividad
transcripcional
Northern-blot

Objetivo:
Correlación entre
actividad
transcripcional y
unión de Pol II y
TFIIB Se recluta maquinaria de transcripción
Figure 2 a) Correlation between TBP binding and transcriptional activity in vivo. a, GAL1 transcriptional shut-off. TBP crosslinking
was carried out at different times (0, 5, 15 min) after glucose (2%) was added to cells grown in galactose containing medium. In
parallel, cells were collected, and total cellular RNA was prepared to analyse GAL1 transcripts by primer extension

Figure 3 a) Correlation between transcriptional activity and association of TFIIB and RNA polymerase II with
promoters
75