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en horticultura
Traducido de: In Horticulture

Chuansheng Mei

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 TRADUCCIÓN 1

en horticultura
Chuansheng Mei

Original Paper 

Abstracto
El Departamento de Energía de los EE. UU. ha centrado sus esfuerzos de investigación en
convertir el pasto aguja en una materia prima bioenergética, ayudando a compensar el uso de
combustibles fósiles no renovables y hacer que los EE. UU. sean más independientes
energéticamente. Se ha demostrado que los endófitos bacterianos, que residen dentro de los
tejidos de las plantas, aumentan el rendimiento y la resistencia al estrés en varias plantas. El
objetivo principal de esta disertación fue explorar el uso de endófitos para mejorar los
rendimientos de biomasa de pasto varilla en tierras no aptas para cultivos alimentarios y
comprender mejor los mecanismos subyacentes de la interacción plantendofitos. La
integración de esta investigación en la educación K-12 STEM para aumentar el interés en las
ciencias de las plantas y crear la próxima generación de científicos con la motivación de
ayudar a resolver los desafíos que enfrenta la sociedad en el siglo XXI fue el objetivo del
componente de divulgación de este proyecto. El capítulo uno demuestra la capacidad de la
cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans para colonizar el pasto varilla y promover el
crecimiento de las plantas en condiciones in vitro (aproximadamente un 50 % más altas) y en
condiciones de cámara de crecimiento e invernadero (48,6 % más de rendimiento de
biomasa). Los objetivos del Capítulo dos fueron determinar el establecimiento de rodales en
el campo con diferentes niveles de nutrientes. La bacterización con PsJN benefició
positivamente el crecimiento y el desarrollo de las plántulas de switchgrass en el campo con
un contenido de nutrientes bajo y alto. Se registró una estimulación altamente significativa
(p<0,001) del crecimiento de raíces y brotes, la formación de raíces laterales y el número de
hijos en suelos con baja fertilidad. La bacterización con PsJN también mejoró la acumulación
de biomasa durante las dos temporadas de crecimiento tanto en suelos pobres (p<0,001)
como ricos (p<0,05), lo que indica el potencial para el uso de PsJN en un sistema de
producción de materia prima de pasto aguja de bajos insumos. El capítulo tres describe las
diferencias en los patrones de expresión génica tras la bacterición, entre el cv. Alamo, y un cv
que no responde. Cueva-en-Roca. Utilizando microarrays EST y PCR cuantitativa, se
identificaron genes regulados hacia arriba y hacia abajo en ambos cultivares. Uno de los
genes clave identificados fue un miembro de la clase tau, la glutatión S-transferasa (GST). Se
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sabe que las enzimas GST están involucradas en las respuestas de las plantas al estrés.
Mediante el uso de técnicas de sobreexpresión y knockout/knockdown, demostramos que
GST probablemente esté involucrado en la promoción del crecimiento temprano de plantas
inducida por la bacterización en switchgrass. El capítulo cuatro describe el potencial para la
utilización de DEDICACIÓN beneficiosa Dedico esta disertación a mis padres

endófitos bacterianos capaces de fijar nitrógeno atmosférico en un estado de vida libre

en el desarrollo de sistemas de producción de materia prima de pasto varilla de bajos
insumos. Sphingomonas sp. La cepa NSL aislada de tejido de switchgrass fue capaz de
crecer en medio libre de nitrógeno y estimuló el crecimiento de switchgrass cv. Álamo en
condiciones de deficiencia de nitrógeno. La capacidad de fijar nitrógeno atmosférico también
se transfirió a la cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans a través de la transferencia
horizontal de genes de la leguminosa Burkholderia phymatum nodulante. El PsJN
transformado pudo fijar nitrógeno y promover el crecimiento de las plantas en condiciones
limitadas de nitrógeno. En cada paso de la investigación descrita en esta disertación se
hicieron esfuerzos para incluir sus elementos en la educación K-12. El capítulo cinco
describe cuatro estudios de casos que tienen como objetivo mejorar el interés de los jóvenes
en las ciencias de las plantas en las áreas socioeconómicamente deprimidas de Southside
Virginia. Figura 1.1 Imágenes de microscopía confocal de raíces...........................................
...............................46 Figura 1.2 Efectos de la inoculación de PsJN en pasto varilla cv.
Crecimiento de Álamo in vitro ..........................47 xvii Tablas Tabla 1. .................. ..167 Tabla
4.3 Descripción general de los genes de nodulación y fijación de nitrógeno en B.
phymatum..................168 que arroja una plétora de datos sobre el crecimiento de las plantas
y resistencia al estrés. Como especie C4, el pasto varilla es eficiente en la conversión de la
energía del sol en compuestos de carbohidratos, y combinado con ser perenne, la planta
ofrece una gran promesa para la futura producción de biomasa a gran escala, lo que ayuda a
compensar el uso de combustibles fósiles. De hecho, el pasto varilla rindió el 504 % de la
energía consumida en un estudio grande de múltiples granjas en las Llanuras Centrales
(Schmer et al., 2008), y los rodales pueden producir durante más de una década. Además, en
comparación con otros cultivos bioenergéticos, el cultivo de pasto varilla es relativamente
simple y no requiere equipo especializado por parte del productor. Si bien los rendimientos
son altos, se podría mejorar mucho más con fines bioenergéticos.

Lista de Figuras

Lista de
Las interacciones beneficiosas entre plantas y microbios, un campo de estudio que
generó mucho interés en las últimas dos décadas, ofrecen nuevas soluciones para mejorar
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los rendimientos de biomasa, la tolerancia al estrés, el establecimiento en el primer año y la

sostenibilidad.

Tanto los microorganismos bacterianos como los hongos forman una simbiosis antigua
y mutuamente beneficiosa con las plantas, y los hongos micorrízicos en particular están
asociados con la colonización inicial de la tierra por parte de las plantas (Ryan et al., 2008;
Wang y Qiu, 2006). Un campo de cultivo de plantas representa una comunidad compleja de
microbios, que interactúan, compiten y, a menudo, ayudan a promover el crecimiento de las
plantas y la resistencia al estrés. En general, las interacciones beneficiosas entre plantas y
microbios promueven el crecimiento de las plantas a través de la producción de hormonas
vegetales, como la auxina, lo que ayuda en la resistencia al estrés abiótico, incluida la sequía
y la salinidad, la producción de compuestos antimicrobianos contra los patógenos de las
plantas y la adquisición de nutrientes como la fijación de nitrógeno atmosférico y
solubilización del fósforo en el suelo (Revisado en . Estas interacciones son intrincadas y
multifacéticas, a menudo dependen del tiempo de desarrollo, el genotipo, las condiciones
ambientales y las comunidades nativas del suelo. Aunque el pasto varilla se ha estudiado
intensamente, solo se han publicado unos pocos artículos centrados en los endófitos en
switchgrass y su influencia en la promoción del crecimiento Juntos, los microorganismos
benéficos podrían tener el potencial de ayudar en el desarrollo de un sistema de producción
de switchgrass sostenible y de bajos insumos (Nowak et al., 2011) y ofrecer una forma
práctica de mejorar el crecimiento y las enfermedades de las plantas resistencia.

Nomenclatura, diversidad y clasificación

El término 'endofito' se deriva del término griego 'endo' (dentro) y 'phyte' (planta), y puede
aplicarse tanto a los hongos como a las bacterias que residen en los tejidos de las plantas
durante todo o parte de su ciclo de vida y que no causan daño aparente. daño (Wilson, 1995).
Se estima que cada especie de planta tiene al menos un endófito bacteriano asociado
(Strobel et al., 2004) y pertenecen a diversas clases de bacterias, incluidas las
proteobacterias Alfa, Beta y Gamma, Firmicutes, Bacteroidetes y

Actinobacteria (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006). Estas bacterias prosperan

dentro de las plantas donde colonizan con éxito las raíces, se trasladan a las hojas, los tallos
e incluso a los órganos reproductivos donde pueden transmitirse verticalmente a la próxima
generación, asegurando una interacción estable con su planta huésped. La cantidad de
microorganismos presentes en los ecosistemas naturales es enorme; de hecho, las
estimaciones del número de bacterias endófitas en el bosque atlántico brasileño indican la
posibilidad de que existan entre 2 y 13 millones de especies solo en las partes aéreas de la
planta (Lambais et al., 2006). De las especies bacterianas identificadas, el 97% no estaban
descritas previamente. Una sola especie de planta también puede tener una amplia gama de
diferentes géneros bacterianos asociados. En el trigo, los estudios basados en cultivos han
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demostrado que 88 especies bacterianas que representan 37 géneros habitan en el tejido

vegetal de la superficie. Es probable que los estudios basados en cultivos subestimen la
cantidad de microorganismos, ya que los estudios moleculares arrojan números de población
mucho mayores (Rasche et al., 2006). Tanto los análisis basados en cultivos como los
basados en moléculas indican que las proteobacterias alfa y beta son los colonizadores más
numerosos de la filosfera (Thompson et al., 1993). En total, se aislaron 853 endófitos
bacterianos de partes aéreas de cuatro cultivos agronómicos y 27 plantas de pradera,
incluido el pasto varilla, y los aislamientos de Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium y
Microbacterium mostraron altos niveles de colonización y tenían la capacidad de persistir en
las plantas hospedantes (Zinniel et al. ., 2002).

Se han aislado bacterias diazotróficas, o fijadoras de nitrógeno atmosférico, de cultivos

bioenergéticos,

incluyendo Miscanthus spp. y Pennisetum purpureum, donde Herbaspirillum frisingense

sp.

nov. (Kirchhof et al., 2001), Azospirillum doebereinerae (Eckert et al., 2001) y

Herbaspirillum frisingense (Rothballer et al., 2008). De manera similar, diferentes bacterias
fijadoras de nitrógeno pertenecientes a los géneros Stenotrophomona, Pseudomonas y
Burkholderia fueron aisladas de pastos de dunas de arena (Ammophila arenaria y Elymus
mollis) en Oregón, que biológicamente pueden fijar nitrógeno y promover el crecimiento de
estas plantas en condiciones de suelo deficientes (Dalton et al. , 2004). También se han
aislado bacterias fijadoras de nitrógeno de diferentes especies de plantas, como la hierba
Kallar (Leptochoa fusa) que crece en los suelos altamente salinos del Punjab de Pakistán
(Reinhold-Hurek et al., 1993), el pino torcido (Pinus contorta), cedro rojo occidental (Thuja
plicata) (Bal et al., 2012) y álamo híbrido (Populous trichocarpa) (Taghavi et al., 2010). Si bien
se han realizado estudios generales de las poblaciones endófitas en el pasto varilla (Zinniel
et al., 2002), no hay un análisis detallado de las interacciones endofíticas bacterianas nativas
en el pasto varilla.

Las poblaciones endófitas de hongos también pueden ser sustanciales, particularmente

en plantas de vida más larga, ya que se recuperaron 340 taxones genéticamente distintos de
dos especies de plantas del sotobosque tropical (Arnold et al., 2000). Los hongos endófitos
también pueden tener un impacto beneficioso significativo en el rendimiento del pasto varilla
(Kleczewski et al., 2012). Si bien se ha puesto mucho énfasis en el estudio de endófitos
fúngicos de la familia Clavicipitaceae (Neotyphodium/Epichloë) con pastos de estación fría y
cálida (Rodríguez et al., 2009), 2 encuestas recientes de endófitos de switchgrass no han
logrado identificar miembros de esta familia (Ghimire et al., 2011b; Kleczewski et al., 2012),
lo que sugiere que los principales hongos endófitos que habitan en el pasto varilla son del
tipo no clavicipitáceo, y representan principalmente hongos ascomicetos (Kleczewski et al.,
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2012). Estos endófitos pueden encontrarse colonizando tejidos por encima y/o por debajo
del suelo (Rodríguez et al., 2009). Recientemente,

Se aislaron 18 órdenes taxonómicos de endófitos fúngicos de plantas de pasto varilla en

el norte de Oklahoma pertenecientes a los géneros Alternaria, Codinaeopsis, Fusarium,
Gibberella, Hypoerea y Periconia, y los tejidos de brotes de pasto varilla mostraron una
diversidad significativamente mayor de especies endófitas fúngicas en comparación con los
tejidos de la raíz (Ghimire et al., 2011b). Se aislaron géneros endófitos fúngicos similares,
como Alternaria, Epicoccum, Phoma, Phaeosphaeria y Stagonospora, de plantas de pasto
varilla que crecen en una variedad de hábitats en Indiana e Illinois (Kleczewski et al., 2012).
Debido a que el pasto varilla es uno de los cultivos bioenergéticos más prometedores, varios
laboratorios en los EE. UU. han estado trabajando en el aislamiento y la caracterización de
bacterias y hongos endofitos del pasto varilla. Identificar y aprovechar los microorganismos
endófitos beneficiosos que tienen un amplio espectro de características de promoción del
crecimiento de las plantas y poseen varios mecanismos para la tolerancia al estrés puede
ayudar en el desarrollo de un sistema de producción de materias primas de pasto varilla
sostenible y de bajos insumos, particularmente en tierras marginales.

Colonización de tejidos y órganos vegetales por bacterias.

La capacidad de algunos endófitos para colonizar el xilema brinda la oportunidad de su
propagación sistémica por el resto de la planta, a través de la corriente de transpiración en la
luz del xilema.

Sin embargo, no todos los endófitos son capaces de colonizar las partes aéreas de las
plantas. Esto puede reflejar la incapacidad de algunos para adaptarse y sobrevivir a los
diferentes nichos representados por los tejidos y órganos aéreos (Compant et al., 2010). En
switchgrass, los títulos de la cepa PsJN de B. phytofirmans fueron más altos en la raíz que en
las hojas 7 días después de la inoculación de las raíces. A los 14 días después de la
inoculación, los títulos fueron más altos en las hojas y las vainas que en las raíces, lo que
indica una translocación a estos tejidos. En general, se informa que los títulos de endófitos
bacterianos en los tejidos aéreos de las plantas son más bajos que en la raíz (Rosenbleuth y
Martínez-Romero, 2006; además, se puede observar una gran cantidad de variación en estos
tejidos. informaron que se podría encontrar PsJN en solo 10-60% de los tallos de
inflorescencia de uva y bayas de uva después de la inoculación inicial de las raíces. Estos se
localizaron en los vasos del xilema, y solo se observaron una o pocas células. Estos
resultados indicaron aún más la importancia del xilema para la propagación sistémica de
endófitos. , permitiéndoles llegar hasta los tejidos reproductivos.

Sin embargo, esta propagación fue muy lenta, tardando 5 semanas en llegar a los tejidos
de la inflorescencia. Los títulos muy bajos de PsJN que terminaron en estos tejidos se
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atribuyeron a la competencia con otros endófitos co-localizados, que pueden habitar

diferentes tejidos y órganos, reflejando diferentes nichos de colonización (Compant et al.,
2011). La colonización bacteriana, en general, varía de un cultivar a otro y depende de
muchos factores. Por ejemplo, en la soja, el genotipo de la planta, la edad del tejido, la
temporada de aislamiento y la aplicación de herbicidas, todos afectaron la colonización.

Promoción del crecimiento vegetal

Una de las asociaciones entre bacterias y endófitos mejor estudiada es la fijación de
nitrógeno atmosférico por endófitos específicos. Esta simbiosis es bien conocida en las
leguminosas (Stacey et al., 2006) donde las bacterias del suelo Rhizobia infectan las raíces
de las plantas hospederas, induciendo la formación de nódulos donde fijan el nitrógeno
atmosférico y se lo proporcionan a la planta hospedera a cambio de carbono. compuestos
(Lodewyckx et al., 2002). Sin embargo, también se pueden observar asociaciones
mutualistas a través de la fijación de nitrógeno en plantas no leguminosas, como arroz, maíz
(Montañez et al., 2012), caña de azúcar (Oliveira et al., 2009), trigo (Webster et al., 1997),
fresas (de Melo Pereira et al., 2012) y pastos (Kirchhof et al., 2001;Reinhold-Hurek et al.,
1993). Las bacterias fijadoras de nitrógeno se han estudiado ampliamente en el cultivo
bioenergético de la caña de azúcar e incluyen Gluconacetobacter spp., Azospirillum spp.,
Herbaspirillum spp. y Burkholderia spp. (de Carvalho et al., 2012;James et al., 2001;Montañez
et al., 2012;Suman et al., 2005). De hecho, el cultivo de caña de azúcar en Brasil, cuando se
combina con el uso de bacterias fijadoras de nitrógeno, utiliza solo una pequeña cantidad de
fertilizante (de Carvalho et al., 2011) sin mostrar síntomas de deficiencia de nitrógeno
(Rosenblueth y Martinez-Romero, 2006), y hay evidencia de que una cantidad significativa de
nitrógeno se obtiene de plantas asociadas con endófitos bacterianos (de Carvalho et al.,
2011). En switchgrass, plántulas jóvenes del cultivar Alamo inoculadas con la cepa PsJN de
Burkholderia phytofirmans, aisladas de raíces de cebolla por , mostraron una promoción
significativa del crecimiento con un aumento en la longitud de raíces y brotes de 35.6 % y
32.8 %, respectivamente, así como un aumento de peso de 83.6 % en comparación con las
plantas testigo (no inoculadas) después de un mes en condiciones in vitro). El mismo patrón
se observó en condiciones de cámara de crecimiento e invernadero, donde las plantas
inoculadas con la cepa PsJN de B. phytofirmans mostraron un vigor de crecimiento
persistente con aumentos significativos en los pesos fresco y seco, y un aumento en el
número de macollos tempranos. Además, los resultados mostraron que la cepa PsJN de B.
phytofirmans tiene potencial en el desarrollo de un sistema de producción de materia prima
de pasto varilla sostenible y de bajos insumos en tierras marginales, ya que se observaron
mayores rendimientos de biomasa en condiciones subóptimas con plantas inoculadas con
PsJN en comparación con el control. Sin embargo, la promoción del crecimiento de PsJN es
específica del genotipo en el pasto varilla, ya que el cultivar de tierras altas, Cave-in-Rock, no
respondió a la inoculación.
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Los endófitos fúngicos se encuentran más comúnmente viviendo en los tejidos de las
plantas sobre el suelo y ocasionalmente en las raíces (Saikkonen et al., 1998). Las plantas
infectadas con hongos endófitos obtienen promoción del crecimiento, tolerancia al estrés,
eficiencia en el uso del agua y protección contra herbívoros vertebrados y nematodos de las
raíces (Rodriguez et al., 2008;Rodriguez et al., 2009;Schardl et al., 2004). Durante la
interacción, los endófitos obtienen refugio, nutrición y diseminación a través de los
propágulos de las plantas hospederas (Schardl et al., 2004). Al igual que los endófitos
bacterianos, los endófitos fúngicos también promueven el crecimiento de la planta
hospedante, como un mayor crecimiento de las raíces y pelos radiculares más largos
(Malinowski et al., 1999), lo que puede contribuir a una mayor absorción de nutrientes. Por
ejemplo, la biomasa de raíces y brotes de álamo, maíz, tabaco, bacopa, artemisia y perejil se
duplicó en comparación con sus respectivos controles después de cuatro semanas de
inoculación con Piriformospora indica (Varma et al., 1999).

Los hongos endófitos del género Neotyphodium (una forma asexual de Epichloë spp.)
han sido bien estudiados por sus asociaciones simbióticas con diferentes especies de
gramíneas, especialmente la familia Pooideae, que incluye muchas especies importantes de
gramíneas forrajeras y césped (Clay, 1990; Schardl et al. al., 2004; Sugawara, 2011). A través
de esta simbiosis, los pastos han exhibido un mayor crecimiento,

reproducción, tolerancia al estrés y resistencia a los herbívoros (Faeth et al., 2010;

Schardl et al., 2004). Por ejemplo, el crecimiento de las plantas, el rendimiento de la biomasa
y el número de macollos aumentaron cuando se inoculó al ryegrass (Lolium perenne) con N.
lolii (Spiering et al., 2006), y al centeno silvestre de Dahurian (Elymus dahuricus) con
Neotyphodium spp. (Zhang et al., 2007). Las plantas infectadas con endófitos mostraron una
mayor tasa de supervivencia, tasa de rebrote y mayor producción de semillas de biomasa en
comparación con las plantas no infectadas después de un año en el campo (Iannone et al.,
2012). En switchgrass, NF/GA-993 (un cultivar sintético de switchgrass de tierras bajas)
inoculado con seis cepas de hongos endófitos Sebacina vermifera mostró un aumento en el
crecimiento de la planta, la longitud de la raíz y la producción de biomasa (Ghimire et al.,
2009a). Recientemente, Sasan et al. (2012) encontraron que el endófito fúngico Metarhizium
robertsii fue capaz de colonizar endófitamente las raíces del pasto varilla y promovió el
crecimiento y aumentó la densidad de los pelos radiculares. Sin embargo, los endófitos
fúngicos recientemente aislados de las plantas de pasto varilla tuvieron efectos tanto
beneficiosos como perjudiciales en los rendimientos de biomasa de la hierba varilla en
condiciones de invernadero.

Phaeosphaeria pontiformis, Epicoccum nigrum, Alternaria spp y Colletotrichum spp.

aumentó la biomasa total en un 25-33%, Stagonospora spp. aumento de la biomasa de

brotes en un 22%, y
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Colletotrichum sp. aumentó la biomasa de la raíz en un 45 %, pero más del 60 % de los

aislamientos evaluados redujeron el crecimiento del pasto varilla (Kleczewski et al., 2012).

Muchos factores relacionados con los microorganismos afectan la promoción del

crecimiento de las plantas porque las plantas existen en una comunidad de bacterias,
hongos, algas y/o virus (Rodríguez et al., 2008) y las plantas pueden estar asociadas con
más de un microorganismo. La inoculación de plántulas de switchgrass con múltiples tipos
de microflora de la rizosfera aumentó el rendimiento de brotes y raíces hasta 15 veces y
también aumentó la absorción de nitrógeno 6 veces y la absorción de fósforo 37 veces, en
comparación con las plantas de control infectadas solo con bacterias de la rizosfera (Brejda
et al. al., 1998). Los factores ambientales, como los nutrientes y el estrés, también influyen en
la simbiosis entre los endófitos y las plantas hospedantes. En condiciones de alta
disponibilidad de nutrientes, el simbiótico Neotyphodium occultans -Lolium multiflorum
mostró un mayor peso de semilla que el de las plantas no simbióticas (Gundel et al., 2012).

Tolerancia al estrés abiótico

El crecimiento de las plantas suele estar limitado por el estrés abiótico. El estrés abiótico
incluye varios tipos de estrés ambiental, como la sequía, la temperatura, la salinidad, la
contaminación del aire, los metales pesados, los pesticidas y el pH del suelo. Se ha
demostrado que las relaciones simbióticas con los endófitos aumentan la tolerancia al estrés
en las plantas hospedantes (Gibert et al., 2011). La sequía es uno de los estreses abióticos
más extendidos y comunes y causa pérdidas económicamente importantes en los cultivos
agrícolas y forestales cada año.

La simbiosis mutualista entre los endófitos bacterianos o fúngicos y las plantas

hospedantes podría mejorar la tolerancia a la sequía de las plantas hospedantes. El árbol de
hoja perenne Theobroma cacao infectado con el hongo endófito Trichoderma hamatum
aislado DIS 219b exhibió estrés por sequía retardado por cambios en la conductancia
estomática, el potencial hídrico y la fotosíntesis neta (Bae et al., 2009). En las gramíneas, las
asociaciones endófitas también aumentaron la tolerancia a la sequía, ya que algunas
accesiones de ballica perenne (Lolium perenne) infectadas por N. lolli mostraron más hijos,
mayor longitud de los hijos y mayor biomasa que las plantas no infectadas (Kane, 2011). La
inoculación endofítica de Epichloë festucae en Fetusca eskia mejoró la supervivencia de las
plántulas en condiciones de sequía (Gibert et al., 2011). Una gramínea perenne, Achnatherum
sibiricum, infectada con hongos endófitos, mostró una relación raíz/vástago y una tasa
fotosintética neta más altas que las plantas no inoculadas en condiciones de sequía (Han et
al., 2011). La simbiosis entre Agrotis hyemalis y Epichloe amarillans, en condiciones de
sequía, produjo un 40 % más de inflorescencias, una floración más temprana y una mayor
masa de semillas que las plantas no inoculadas (Davitt et al., 2011). Sin embargo, cuando las
plantas de Panicum rigidulum se sometieron a condiciones de sequía, las plantas infectadas
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con endófito Balansia benningsiana no mostraron ninguna ventaja sobre las plantas de
control durante el estrés por sequía, pero la infección con endófito ayudó a que las hojas
volvieran a crecer rápidamente durante la recuperación (Ren y Clay, 2009).

Los suelos cultivados se están volviendo más salinos debido al uso excesivo de
fertilizantes, el uso de aguas residuales de áreas urbanas y periurbanas y el drenaje agrícola,
así como los procesos de desertificación (Bashan et al., 2010). Las bacterias promotoras del
crecimiento vegetal ofrecen el potencial para reducir el impacto de este estrés. Por ejemplo,
las plantas de pepino inoculadas con Paecilomyces formosus mostraron una mayor longitud
de los brotes en comparación con las plantas no inoculadas en condiciones de alta salinidad
(Khan et al., 2012). En estudios con Salicornia brachiata, la especie de planta más tolerante a
la sal entre Salicornia spp., Brachybacterium saurashtrense y Pseudomonas sp. los endófitos
bacterianos aumentaron significativamente el crecimiento de las plantas en condiciones de
estrés salino. La inoculación de las bacterias Pseudomonas putida y P. pseudialcaligens
aumentó el crecimiento de las plantas de garbanzos en condiciones salinas en experimentos
en macetas (Patel et al., 2012).

La fitorremediación es el proceso mediante el cual las plantas pueden absorber,

acumular o metabolizar compuestos tóxicos, como metales pesados y otros compuestos, del
suelo contaminado (Kumar et al., 1995). La asociación planta-endofito se ha utilizado en
sitios de fitorremediación para degradar compuestos tóxicos para uso práctico (Van Aken et
al., 2004). Brassica juncea inoculada con una bacteria promotora del crecimiento de las
plantas, cepa A3R3, mostró un aumento en el peso fresco y seco de las plantas cuando se
cultivó en suelo a diferentes concentraciones de níquel, con aumentos de peso fresco y seco
de 50 y 45 %, respectivamente, a 450 mg Ni/kg de suelo. en comparación con plantas no
inoculadas (Ma et al., 2011). Muchos endófitos que promueven el crecimiento de las plantas
podrían aliviar el estrés de las plantas causado por los contaminantes al degradarlos y, a
cambio, podrían proporcionar los productos para uso de las plantas (Weyens et al., 2009a,b).
Para la fitorremediación de metales tóxicos, los endófitos pueden tener un sistema de
secuestro o resistente a los metales y podrían reducir la toxicidad de los metales e influir en
la translocación de metales a las partes aéreas de la planta. Se han encontrado bacterias
endófitas resistentes a los metales en los géneros Pseudomonas, Methylobacterium,
Microbacterium y Burkholderia (Weyens et al., 2009a). En festuca alta (Lolium arundinaceum)
cultivada bajo condiciones de invernadero en una solución contaminada con cadmio, la
infección por hongos endófitos (Neotyphodium coenophialum) aumentó la acumulación de
cadmio y aumentó el transporte de cadmio desde las raíces hasta los brotes (Ren et al.,
2011). En dos especies de gramíneas, Festuca arundinacea y Festuca pratensis, cultivadas en
condiciones de alto contenido de cadmio, los resultados mostraron una mayor producción de
biomasa y mayores niveles de acumulación de cadmio en las raíces y brotes de plantas
infectadas con endófitos en comparación con plantas no infectadas (Soleimani et al., 2010).
En condiciones de invernadero, las plántulas de cultivares de pasto guinea (Panicum
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maximum) inoculadas con Pantoea spp. Jp3-3 exhibió un alivio significativo del efecto
negativo causado por el estrés del cobre 300 μM (Huo et al., 2012).

Tolerancia al estrés biótico

Biótico se refiere a los organismos vivos que causan enfermedades, como patógenos
bacterianos y fúngicos, plagas, insectos, virus y nematodos. Los endófitos inhiben el
crecimiento de patógenos de plantas y previenen o reducen el desarrollo de enfermedades a
través de la producción de alcaloides tóxicos o al ocupar el mismo nicho ecológico que el
patógeno (Clay, 1990). Los estudios encontraron que tres cepas de Bacillus y dos

Las cepas de Pseudomonas fluorescens disminuyeron hasta en un 60% los síntomas de

la enfermedad causados por

Pseudomonas syringae, oídio y mancha foliar angular, y aumentó el peso fresco de las
plantas de melón inoculadas en comparación con los controles no inoculados (García-
Gutiérrez et al., 2012). En plantas de tomate, se probó el biocontrol de Bacillus subtillis S499
para determinar el antagonismo contra Fusarium spp. al tratar las semillas con un polvo
formulado que contenía diferentes concentraciones de esporas viables de B. subtillis S499, y
los resultados mostraron que todos los tratamientos redujeron significativamente la
gravedad de la enfermedad hasta en un 65-70 % en comparación con las plantas de control
(semillas no inoculadas) (Nihorimbere et al., 2010).

Dado que los endófitos tienen la capacidad de inhibir o prevenir el crecimiento de

patógenos, se los ha considerado como agentes de control biológico. En la interacción del
raigrás italiano (Lolium multiflorum Lam) con el endófito fúngico Neotyphodium, el raigrás
exhibió una mayor resistencia a Trigonotylus caelestialium (Shiba et al., 2011). Además, el
pulgón de la avena del cerezo (Rhopalosiphum padi), una notoria plaga de pastos forrajeros y
cereales, mostró una preferencia por las plantas no infectadas de Alpine timothy (Pleum
alpinum) sobre las plantas infectadas con Neotyphodium spp. (Clement et al., 2011). Las
plantas de ballica perenne (L. perenne) colonizadas por N. lolii exhibieron poblaciones
reducidas de áfidos y, en algunos casos, los áfidos exhibieron una vida adulta y una
fecundidad reducidas (Meister et al., 2006). Las plantas altas de festuca inoculadas con
Neotyphodium coenophialum redujeron la tasa de supervivencia y la alimentación del
escarabajo pulga del maíz, Chaetocnema pilucaria (Ball et al., 2011). Se observaron
preferencias similares en Achnatherum inebrians (hierba de caballo borracha)

donde las plantas infectadas con Neotyphodium gansuense disminuyeron la preferencia

de los herbívoros como el pulgón de la avena de las aves (Rhopalosiphum padi), el ácaro
carmín (Tetranychus cinnabarius),
 TRADUCCIÓN 11

saltamontes (Oedaleus decorus) y hormiga recolectora de semillas (Messor aciculatus)

debido a los altos niveles de ergina, ergonovina y alcaloides del cornezuelo del centeno
producidos por el endófito fúngico (Zhang et al., 2011). Recientemente, las bacterias
endófitas aisladas del tejido de la raíz de seis plantas que crecían en un área de marea baja
de Corea mostraron un potencial antagónico hacia los hongos oomicetos patógenos
Phytophtore capsici y Pythium ultimim, y algunos de ellos fueron capaces de degradar
biopolímeros, como celulosa y β-1, 3-glucano, que son componentes principales de la pared
celular de los oomicetos (Bibi et al., 2012). En la producción de switchgrass, se encontró que
la plantación a gran escala de switchgrass podría ser devastada por Puccinia emaculata
Schwein, un hongo de la roya (Zhao B.

http://hayandforage.com/biofuels/rust-resistent-switchgrass-research-goal-0323). En el
futuro, puede ser posible identificar endófitos que produzcan compuestos antifúngicos para
ayudar a compensar las pérdidas causadas por el estrés biótico.

Mecanismos de promoción del crecimiento

Dado que las plantas son organismos sésiles, la amplia diversidad de interacciones
planta-microbio mutuamente beneficiosas representa una antigua asociación evolutiva, que
ayuda a la planta huésped a sobrevivir y prosperar, incluso en algunos de los entornos más
duros del planeta. Los mecanismos de promoción del crecimiento por endófitos bacterianos
y fúngicos se han investigado en las gramíneas durante décadas, y varios mecanismos
juegan un papel en la promoción del crecimiento y desarrollo de las plantas. Los endófitos
bacterianos son capaces de producir o regular hormonas vegetales, ayudar a adquirir
nutrientes vitales y biocontrolar patógenos (revisado en ). Además, un endófito bacteriano en
particular puede utilizar uno o más mecanismos para promover el crecimiento de las plantas
e incluso puede utilizar diferentes mecanismos en varios puntos durante el ciclo de vida de
las plantas Si bien está claro que los endófitos pueden beneficiar a la planta huésped de
muchas maneras, establecer una promoción clara del crecimiento en el campo puede ser
difícil debido a una serie de factores que incluyen la diversidad de microorganismos nativos
en el suelo y las condiciones del suelo. Una comprensión más profunda de estos
mecanismos está permitiendo a los científicos descubrir nuevas formas de integrar su uso
en el aumento de los rendimientos de cultivos bioenergéticos como el pasto varilla. Además,
mediante el uso de herramientas de biología molecular moderna y genómica funcional para
comprender la complejidad de la promoción del crecimiento. a nivel genético, se arrojará luz
adicional sobre estas complejas interacciones.A medida que se aprenda más sobre la
bioquímica, la biología molecular y la fisiología de las interacciones microbio-planta, es
evidente que los microorganismos bacterianos y fúngicos serán componentes importantes
para la materia prima bioenergética sostenible. producción en el futuro.

La promoción del crecimiento de las plantas generalmente se puede lograr directamente

 TRADUCCIÓN 12

mediante interacciones entre el microorganismo y el huésped y/o indirectamente a través de

la actividad antagónica contra patógenos ambientales y de plantas. En esta sección,
discutiremos ambos mecanismos y cómo diferentes microbios beneficiosos pueden trabajar
juntos para beneficiar a la planta huésped simultáneamente (Muller et al., 2009), así como
también cómo los microorganismos, especialmente las bacterias, pueden compartir
mecanismos de acción genéticamente a través de genes horizontales. transferir.

Producción y regulación de fitohormonas

Los tejidos vegetales producen o regulan diferentes hormonas para responder a señales
internas y externas durante prácticamente todos los aspectos del crecimiento y desarrollo de
las plantas. Los endófitos bacterianos tienen la capacidad de producir hormonas vegetales y
también de regular su equilibrio. Las auxinas, un grupo de hormonas asociadas con la
promoción del crecimiento de las plantas, influyen en muchas funciones celulares de las
plantas y son importantes reguladores del crecimiento y desarrollo. Los endófitos
bacterianos suelen ser capaces de producir auxina que, a nivel genético, puede expresarse de
manera constituyente o ser inducible. Los endófitos bacterianos productores de auxina
aumentaron el número y la longitud de las raíces laterales en el trigo (Barbieri et al., 1993). Se
observó un aumento en la longitud de la raíz, el área de la superficie de la raíz y el número de
puntas de la raíz en álamos híbridos inoculados con bacterias productoras de auxina, lo que
resultó en una mayor absorción de nitrato y fósforo y aumentó la biomasa en un 60% en
comparación con las plántulas no inoculadas (Taghavi et al., 2009). Pseudomona
fluorescens incrementó significativamente el crecimiento de las radículas de las plantas de
maíz en condiciones de laboratorio a través de la producción de auxina (Montañez et al.,
2012). Hasta la fecha, se han identificado múltiples vías de biosíntesis de auxinas en
bacterias, y su regulación está influenciada por varios factores genéticos y ambientales
diferentes (Bertalan et al., 2009). La producción de auxina nativa, ácido indol-3-acético (IAA)
por bacterias ha sido documentada en especies como las familias Rhizobium, Pseudomonas,
Azospirillum, Azotobacter y Bacillus (Hayat et al., 2010).

Las citoquininas son una amplia gama de compuestos que, al igual que otras hormonas
vegetales, están involucradas en muchas actividades del crecimiento y desarrollo de las
plantas. Como grupo, se ha demostrado que regulan la división celular, la latencia y la
germinación de las semillas, la senescencia, la formación de nuevos brotes y la expansión de
las hojas. También juegan un papel en el control del desarrollo de los órganos de la planta,
mediando las respuestas a varios factores extrínsecos y la respuesta al estrés biótico y
abiótico (revisado en Spichal, 2012). Los investigadores han demostrado que ciertas
bacterias endófitas pueden producir citoquininas y promover el crecimiento de raíces
laterales (Senthilkumar et al., 2009). La zeatina, una hormona promotora del crecimiento
vegetal nativa, perteneciente a la familia de las citoquininas, se ha encontrado en niveles
significativamente más altos en las bacterias beneficiosas B. subtilis y P. putida (Sgroy et al.,
 TRADUCCIÓN 13

2009).

Las giberelinas son hormonas promotoras del crecimiento vegetal nativas. Muchos
endófitos que promueven el crecimiento de las plantas también producen giberelinas para
mejorar el crecimiento de las plantas hospedantes (Fernando et al., 2010; Joo et al., 2009).
Por ejemplo, un aislado de Penicillium citrinum, IR-3-3 de la flora de las dunas de arena,
produjo giberelinas fisiológicamente más activas y estimuló el crecimiento de plántulas de
arroz Waito-c y Atriplex gemelinii. Los niveles de GA3 también fueron altos en las bacterias
asociadas a plantas Lysinibacillus fusiformis, Achromobacter xylosoxidans, Brevibacterium
halotolerans y Bacillus licheniformis (Sgroy et al. 2009).

Se piensa comúnmente que el etileno, una molécula orgánica simple (CH 2 =CH 2 ), es
una hormona inhibidora del crecimiento. Típicamente se produce cuando las plantas están
expuestas a estrés ambiental, reprimiendo el crecimiento y desarrollo de la planta hasta que
el estrés desaparece o los niveles de etileno disminuyen (Gamalero et al., 2012). El etileno
inhibe el alargamiento del tallo, promueve la hinchazón lateral de los tallos y hace que los
tallos pierdan su sensibilidad a la estimulación gravitrófica (revisado en Glick, 2005).

En la producción de biomasa, como en la agricultura en general, es importante mantener

el etileno bajo para maximizar los rendimientos. Una enzima, 1-aminociclopropano-1-
carboxilato (ACC) desaminasa producida por bacterias, interfiere con los procesos
fisiológicos de la planta huésped al disminuir los niveles de etileno (Hardoim et al., 2008)
mediante el metabolismo de ACC, un precursor del etileno. Al metabolizar este precursor, los
niveles de etileno se reducen en las plantas, lo que reduce los efectos del etileno.

La actividad de la ACC desaminasa es una característica común que se encuentra en las

bacterias promotoras del crecimiento vegetal como Enterobacter, Pseudomonas y
Burkholderia (Govindasamy et al., 2008;Sessitsch et al., 2005b;Shah et al., 1998). La cepa
PsJN de Burkholderia phytofirmans estimula el crecimiento de muchas especies de plantas,
incluidas la papa, el tomate, la vid y el pasto varilla, y se informó que tiene una alta actividad
de ACC desaminasa (Sessitsch et al., 2005a). También se ha demostrado que los endófitos
que producen ACC desaminasa aumentan el crecimiento de la planta huésped en suelos con
alta salinidad (Egamberdieva, 2012; Siddikee et al. 2012) y aumentan la tolerancia a la sequía
(Arshad et al., 2008; Belimov et al., 2009).

La cepa A3R3 de Pseudomonas mostró una mayor actividad de ACC desaminasa y un

mayor crecimiento de las plantas en suelos contaminados con Ni (Ma et al., 2011).

El ácido abscísico (ABA) está involucrado en las respuestas al estrés ambiental como el
calor, el agua y la sal, y también lo producen los endófitos. Las cepas bacterianas endófitas
SF2, SF3 y SF4 aisladas de girasoles (Helianthus annuus) tenían la capacidad de producir
 TRADUCCIÓN 14

ABA y ácido jasmónico (JA), que aumentaron en condiciones de sequía (Forchetti et al.,
2007), lo que implica que estos endófitos mejoran la tolerancia al estrés de plantas
hospederas. Dos cepas de Azospirillum brasilensis, utilizadas con éxito para aumentar el
rendimiento de maíz y trigo en condiciones de campo, fueron capaces de producir diferentes
reguladores del crecimiento de las plantas, como IAA, GA3, zeatina y ABA (Perrig et al., 2007),
destacando la capacidad de endófitos para conferir múltiples mecanismos de promoción del
crecimiento.

Fijación de nitrógeno atmosférico

Las bacterias endófitas que viven libremente en los tejidos internos de las plantas y no
causan daño aparente tienen una amplia gama de mecanismos de promoción del
crecimiento, incluida la fijación de nitrógeno en los pastos.

Aunque el 78 por ciento de la atmósfera terrestre es nitrógeno, el nitrógeno suele ser un

factor limitante en la agricultura, ya que no está fácilmente disponible para las plantas. Las
bacterias y Archea son los únicos organismos que pueden fijar el nitrógeno atmosférico,
haciéndolo así disponible para el crecimiento de las plantas. Esta actividad se denomina
fijación biológica de nitrógeno (BNF) y es catalizada por la enzima nitrogenasa sensible al
oxígeno para convertir el N2 en NH3 biodisponible. Las nitrogenasas son metaloenzimas
complejas con características estructurales y mecánicas altamente conservadas (revisadas
en . La enzima es sensible al oxígeno, lo que impone restricciones fisiológicas en el
organismo. Además, la enzima tiene un tiempo de renovación relativamente lento (Thornely y
Lowe, 1985), lo que requiere la microbio para sintetizar grandes cantidades de la proteína,
hasta el veinte por ciento de la proteína en la célula (revisado en Dixon y Khan, 2004).
Además, la conversión de dinitrógeno atmosférico a una forma que pueda ser utilizada por
las plantas requiere 16ATP para reducir una molécula de N2, lo que la convierte en una de las
reacciones con mayor demanda de energía identificadas en organismos bacterianos
(Thornely y Lowe, 1985). Juntos, la cantidad de energía, el bajo requerimiento de oxígeno y la
cantidad de proteína requerida para crear la enzima nitrogenasa, colocar una gran carga
sobre un endófito fijador de nitrógeno. Como resultado, la síntesis del complejo nitrogenasa
está estrictamente regulada a nivel genético (Dixon y Khan, 2004). Se ha sugerido que los
endófitos bacterianos se colocan en un entorno más favorable en comparación con a las
bacterias rizosféricas porque son menos vulnerables a la competencia de las bacterias
nativas del suelo y están protegidas de varios estreses bióticos y abióticos (Reinhold-Hurek
et al., 1998). Quizás la hierba más estudiada inoculada con endófitos fijadores de nitrógeno
de vida libre es la caña de azúcar.

Las plántulas de caña de azúcar inoculadas con Burkholderia MG43 produjeron un

aumento del 20 % en el rendimiento sobre el control sin inocular, y se demostró que del 60 al
80 % del nitrógeno acumulado en la caña de azúcar provenía de la fijación del nitrógeno
 TRADUCCIÓN 15

atmosférico. Los autores también señalaron que los agricultores en Brasil han observado
algunas variedades de caña de azúcar cultivadas en los campos durante décadas, incluso
hasta un siglo sin mostrar ninguna disminución en la reserva de N del suelo o el rendimiento,
a pesar del déficit de suministro de nitrógeno. El arroz también ha sido estudiado en el
contexto de su relación con Burkholderia spp. En un experimento de campo, el 31 % del
nitrógeno vegetal se derivó de BNF, y la inoculación resultó en un aumento de hasta un 69 %
en la biomasa en comparación con el control no inoculado.

Los investigadores también encontraron que las plántulas de arroz inoculadas con
Burkholderia vietnamiensis aumentaron el rendimiento en un 5,6 a 12,16 %, y el 42 % del
nitrógeno encontrado en las plantas inoculadas provino de la fijación de nitrógeno
atmosférico. Además del arroz, se encontró que Burkholderia se encontraba entre los
aislados fijadores de nitrógeno más comunes de las plantas de maíz cultivadas en México, y
se informó que muchos eran especies nuevas (Estrada et al., 2002). Estos hallazgos
respaldan el uso de endófitos fijadores de nitrógeno de vida libre en un esfuerzo por reducir el
uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos y ofrecen esperanza en la creación de sistemas
de producción agrícola de alto rendimiento y bajos insumos.

Biocontrol de patógenos
Otro mecanismo de promoción del crecimiento vegetal por endófitos es el biocontrol de
patógenos.

Los endófitos han desarrollado una amplia gama de mecanismos de control biológico
que incluyen la producción de antibióticos, tanto antifúngicos como antibacterianos, la
secreción de sideróforos y la producción de enzimas (revisado por Compant et al., 2005b).
Juntas, estas propiedades de control biológico permiten que los endófitos superen a los
patógenos por su nicho y limiten los daños causados por los fitopatógenos, además de
proteger a su planta huésped, lo que resulta en una mayor supervivencia y crecimiento.

La colonización endofítica fúngica confiere un impacto positivo en la resistencia a

plagas, ácaros y nematodos en gramíneas (Schardl et al., 2004). Las plantas de ballica
perenne (L. perenne) colonizadas por N. lolii redujeron las poblaciones de áfidos, la vida
adulta y la fecundidad (Meister et al., 2006).

Neotyphodium spp. forman asociaciones mutualistas con varios géneros de gramíneas y

producen una variedad de agentes de control biológico, algunos de los cuales tienen
propiedades insecticidas mientras que otros están asociados con problemas de salud y
bienestar para los animales de pastoreo. A través de la selección, varios endófitos novedosos
que producen predominantemente agentes de control biológico insecticidas ahora se han
comercializado con éxito en muchas áreas de pastizales templados en Nueva Zelanda,
 TRADUCCIÓN 16

Australia, EE. UU. y América del Sur (Easton, 2007).

Uno de los mecanismos de biocontrol más comúnmente reconocidos asociados con

bacterias y hongos promotores del crecimiento vegetal endófito es la producción de
antibióticos. Los agentes producidos incluyen, entre otros, pirrolnitrina, fenazinas, herbicolina
y oomicina. Además, muchos organismos endófitos son capaces de producir múltiples
agentes, que tienen propiedades biocidas frente a diversos organismos. Se demostró que la
pirrolnitrina, un metabolito secundario aislado de B. cepacia, tiene actividades contra hongos
y bacterias fitopatógenos (El-Banna et al. 1998).

El grupo de genes que regula la producción de pirrolnitrina es similar al grupo de genes

en Pseudomonas y se sugirió que se adquirió mediante transferencia horizontal de genes. Se
informó que otras cepas de Burkholderia producen una gran variedad de agentes
antifúngicos, como occidiofungina y burkholdines (Tawfik et al., 2010).

Burkholderia MP-1 produce al menos cuatro compuestos antifúngicos que incluyen ácido
fenilacético, ácido hidrocinámico, ácido 4-hidroxifenilacético y éster metílico de 4-
hidroxifenilacetato. El pequeño tamaño de los genes que codifican agentes antibacterianos y
el número relativamente pequeño de genes en bacterias y hongos pueden permitir que los
genes que codifican agentes antibióticos se transformen en varios endófitos promotores del
crecimiento.

Secreción de sideróforos
El hierro, uno de los minerales más abundantes del planeta, no está fácilmente
disponible para las bacterias porque su forma más común, el hierro férrico (Fe+3), es solo
ligeramente soluble y está estrechamente unido a muchas partículas en el suelo. Para
recolectar el hierro necesario para el crecimiento, las bacterias y los hongos secretan
compuestos de bajo peso molecular llamados sideróforos. Los sideróforos bacterianos
generalmente actúan para inhibir hongos patógenos como resultado de que sus sideróforos
tienen más afinidad por el hierro que los sideróforos fúngicos (Ordentlich et al., 1988). Al
igual que muchos mecanismos de acción en bacterias y hongos, los factores ambientales
como el pH y los niveles de nutrientes, incluido el hierro, pueden afectar la síntesis de
sideróforos. Se ha confirmado la secreción de sideróforos en varios taxones bacterianos,
incluidos Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Serratia, Obesumbacterium y Lysinibacillus
(Czajkowski et al., 2012), así como en los actinomicetos fúngicos endofitos (Nimnoi et al.,
2010).

Los genes que codifican sideróforos pueden ser más difíciles de introducir en otros
endófitos que promueven el crecimiento de las plantas, ya que los estudios han demostrado
que están ubicados en múltiples loci (Osullivan et al., 1990) y tienen mecanismos de control
 TRADUCCIÓN 17

complejos (Ovadis et al., 2004). (Bae et al., 2009).

Mecanismos de tolerancia al estrés abiótico

Los endófitos pueden modificar el metabolismo de los carbohidratos, la fotosíntesis o
producir compuestos beneficiosos para mejorar la tolerancia al frío en la planta huésped.
Cuando las plantas de vid se expusieron durante cinco días a condiciones de frío, la
fotosíntesis neta fue mayor en comparación con los niveles de las plantas de control, lo que
les ayudó a soportar largos períodos de exposición al frío (Fernández et al., 2012a).
Recientemente, se encontró que B. phytofirmans PsJN modificó el metabolismo de la
trehalosa puede ser parte del mecanismo por el cual B. phytofirmans PsJN aumentó la
tolerancia al frío en la vid, que fue mayor en las raíces y hojas de las plantas bactericidas, en
comparación con las plantas no bactericidas (Fernández et al. al., 2012b). Los microbios
beneficiosos podrían ofrecer tolerancia a la alta salinidad de la planta huésped para ayudar
en el crecimiento de la planta. Para lograr una mayor tolerancia a los suelos de alta salinidad,
los organismos beneficiosos, tanto bacterianos como fúngicos, pueden mostrar una
combinación de características como la producción de IAA, la solubilización de fosfato, la
producción de sideróforos y la actividad de ACC desaminasa (Jha et al., 2011). El aislado de
Azospirillum brasilenses tolerante a la sal NH produjo IAA en condiciones de estrés salino, y
se cree que la producción de este regulador del crecimiento de las plantas puede contribuir al
aumento de la tolerancia a la sal de las plantas de trigo inoculadas (Nabti et al., 2010).

En condiciones similares, las cepas endófitas B. subtilis, B. pumilus y P. putida aisladas

de las raíces de Prosopis strombulifera (frijol tornillo argentino) produjeron un IAA
significativamente mayor (Sgroy et al., 2009).

Modificaciones genéticas y genómica funcional

Tanto las interacciones bacterianas como fúngicas entre plantas y endófitos implican
modificaciones de la expresión génica de la planta y la fisiología/bioquímica general de la
planta para impactar beneficiosamente el crecimiento y la tolerancia al estrés. Mientras
monitoreaban la expresión génica específica durante las interacciones beneficiosas entre el
endófito y la caña de azúcar, Arencibia et al. (2006) (Podile y Kishore, 2007) en la producción
de switchgrass.

Además, aunque los estudios con endófitos y otros microorganismos promotores del
crecimiento vegetal en laboratorios han sido alentadores, también ha habido informes de una
disminución general en el rendimiento del laboratorio al campo). Al igual que con cualquier
ecosistema, las variables de las condiciones de campo y las poblaciones microbianas
nativas deberán abordarse para maximizar los efectos beneficiosos de las bacterias y los
 TRADUCCIÓN 18

hongos. Por lo tanto, la selección de endófitos que tengan un amplio espectro de promoción
del crecimiento que continúe a lo largo de la vida de la planta será otro tema para la
aplicación de endófitos.

Las respuestas específicas del genotipo de las plantas huésped a los endófitos también
son una gran barrera en la aplicación.

Por ejemplo, en el álamo, diferentes cultivares tuvieron diferentes respuestas a

diferentes endófitos (Taghavi et al., 2009). Una de las bacterias promotoras del crecimiento
vegetal más estudiadas, B.

phytofirmans cepa PsJN, tiene un efecto beneficioso en muchas especies, como la papa,
el tomate y la uva. Sin embargo, PsJN también es específico de genotipo. En switchgrass,
PsJN promovió el crecimiento del cultivar de tierras bajas Alamo pero no del cultivar de
tierras altas Cave-in-Rock.

Comprender estas diferencias también ayudará a desarrollar un espectro más confiable,

estable y amplio de promoción del crecimiento en las plantas.

La comprensión completa de los mecanismos de varias simbiosis beneficiosas es la

base para la aplicación eficaz de estos microorganismos en una producción sostenible de
materia prima de pasto varilla y para lograr sus actividades sinérgicas (Podile y Kishore,
2007). A medida que se aprenda más de la genómica funcional de los microorganismos
endófitos en la promoción del crecimiento, será posible compartir estos importantes genes
entre microorganismos similares a través de la transferencia horizontal de genes mediante
transformación, conjugación o transducción, todos fenómenos comunes en el mundo
bacteriano.

Los investigadores informaron por primera vez sobre la transferencia horizontal de

genes en la planta en el álamo híbrido de cultivo bioenergético cuando encontraron que
Burkholderia cepacia VM1468 transfirió su gen de degradación de tolueno a otros endófitos
(Taghavi et al., 2005). Esto sugiere que dicha transferencia puede usarse para modificar y
mejorar los efectos de promoción del crecimiento de otros endófitos a través del intercambio
de genes. El fenómeno de la transferencia horizontal de genes también puede ocurrir en la
naturaleza entre diferentes géneros, ya que el gen que codifica el agente antifúngico
pirrolnitrina en Burkholderia probablemente se transfirió horizontalmente de Pseudomonas.

En comparación con la ingeniería genética de plantas, es mucho más fácil modificar

genéticamente los microorganismos. Uno podría transformar fácilmente algunos genes
extraños útiles en bacterias u hongos. Por ejemplo, los genes chiA de Bacillus thuringiensis
cry1Ac7 y Serratia marcescens se transformaron en bacterias endófitas asociadas a la caña
 TRADUCCIÓN 19

de azúcar, lo que ayudó a aumentar la tolerancia de la planta de caña de azúcar al barrenador

de la caña de azúcar Eldana saccharina (Downing et al., 2000). Estas aplicaciones indican
que es posible que podamos diseñar genéticamente endófitos con genes útiles, como el gen
de la toxina Bacillus thuringiensis, para proteger las plantas hospedantes de los insectos
herbívoros, genes de resistencia a herbicidas para impartir resistencia a los herbicidas a las
plantas hospedantes y genes relacionados con la tolerancia al estrés abiótico. para mejorar
la tolerancia de la planta huésped al estrés abiótico. Un método eficiente de transformación
de endofitos por Agrobacterium fue desarrollado por Abello et al. (2008), que ayudará en la
transferencia y expresión de genes importantes en las plantas huésped a través de endófitos.
A medida que avanza continuamente la investigación de la genómica funcional, los
científicos comprenderán mejor los mecanismos mediante los cuales los microorganismos
beneficiosos promueven el crecimiento de la planta huésped y mejoran la tolerancia al estrés
para utilizar de manera efectiva estos microbios en la producción de cultivos bioenergéticos.
Por ejemplo, los endófitos que tienen la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico podrían
combinarse con los endófitos que tienen la capacidad de mejorar la tolerancia de la planta
huésped al estrés abiótico o inhibir el crecimiento de patógenos o mejorar la absorción de
nutrientes o, posiblemente, todos podrían combinarse.

Desde 1999, se han registrado más de 15 nuevas patentes para endófitos microbianos).
El mercado mundial de inoculantes microbianos está experimentando una tasa de
crecimiento anual de aproximadamente el 10%. 2,3 y Chuansheng Mei 1,2,3 (Publicado en
2012 en Biotechnology for Biofuels 5:37). *Contribuciones de los autores: SK y SL realizaron
experimentos y redactaron el manuscrito.

Abstracto
Switchgrass es uno de los candidatos de cultivos bioenergéticos más prometedores para
los EE. UU. Da un rendimiento de biomasa relativamente alto y puede crecer en tierras
marginales. Sin embargo, el rendimiento de la biomasa varía de un año a otro y de un lugar a
otro. Es imperativo desarrollar un sistema de materia prima de pasto varilla sostenible y de
bajos insumos. Una de las formas más prácticas y factibles de aumentar el rendimiento de la
biomasa es utilizar endófitos beneficiosos. Demostramos que uno de los endófitos
bacterianos promotores del crecimiento vegetal más estudiados, Burkholderia phytofirmans
cepa PsJN, es capaz de colonizar y promover significativamente el crecimiento de
switchgrass cv. Álamo en condiciones in vitro, cámara de crecimiento e invernadero. En
varios experimentos in vitro, el peso fresco promedio de las plantas inoculadas con PsJN fue
aproximadamente un 50 % mayor que el de las plantas no inoculadas. Cuando se cultivaron
plántulas de un mes de edad en una cámara de crecimiento durante 30 días, las plantas de
Álamo inoculadas con PsJN tenían una biomasa de brotes y raíces significativamente mayor
en comparación con los controles. El rendimiento de biomasa (peso seco) promediado a
partir de cinco experimentos fue un 54,1 % mayor en el tratamiento inoculado en
 TRADUCCIÓN 20

comparación con el control no inoculado. Se obtuvieron resultados similares en

experimentos de invernadero con trasplantes cultivados en macetas de 4 galones durante
dos meses. Las plantas inoculadas exhibieron macollos más tempranos y un vigor de
crecimiento persistente con un 48,6 % más de rendimiento de biomasa que los controles.
También encontramos que PsJN podría promover significativamente el switchgrass cv.
Crecimiento de Álamo en condiciones subóptimas. Sin embargo, también encontramos que
la promoción del crecimiento mediada por PsJN en switchgrass es específica del genotipo.

Palabras clave: interacciones entre plantas y microbios, promoción del crecimiento,

endófito, pasto varilla, cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans

Introducción
La creciente preocupación por los suministros de energía extranjeros, las emisiones
globales de gases de efecto invernadero y la necesidad de un desarrollo económico rural ha
impulsado el interés en la producción sostenible de biomasa como materia prima para la
bioenergía y los bioproductos. Se ha sugerido que para 2025, la demanda mundial de energía
probablemente aumentará en más del 50 % (Erahin et al., 2011).

Esta demanda y las preocupaciones de la sociedad sobre el impacto ambiental de la

quema de combustibles fósiles son factores clave que estimulan el desarrollo de estrategias
nacionales y regionales dirigidas al crecimiento de las fuentes de energía renovable,
enfocadas principalmente en los biocombustibles. Para reducir la dependencia de los
combustibles fósiles, EE. UU., el principal consumidor de energía del mundo, publicó la Ley de
Seguridad e Independencia Energética de 2007 que proyecta un aumento en la producción de
combustibles renovables de 9.000 millones de galones en 2008 a 36.000 millones de galones
para 2022 (Sissine , 2007). El reciente Plan Nacional de Acción de Biocombustibles del
USDA/DOE (http://www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/nbap.pdf) ha ayudado a delinear las
áreas prioritarias requeridas para acelerar el desarrollo sostenible de la industria de
biocombustibles.

Dentro de este documento, el Área de Acción 2 se identificó como producción y mejora

de materia prima.

Varias materias primas, como los pastos rizomatosos perennes, pueden proporcionar
fuentes de biomasa lignocelulósica, sirviendo como nuevas fuentes de crecimiento de
cultivos e ingresos para los agricultores regionales.

Una de las materias primas más prometedoras capaz de contribuir a la realización de los
objetivos de energía renovable de EE. UU. es el pasto perenne común, el pasto aguja
(Panicum virgatum L.). Esta gramínea de pradera nativa, que consta de un germoplasma
 TRADUCCIÓN 21

diverso (McLaughlin y Kszos, 2005), puede crecer en tierras marginales con bajos aportes de
agua y agroquímicos (Hill et al., 2006), de modo que su cultivo no compite con los cultivos
alimentarios por tierra. Debido a su gran sistema de raíces y su rápido rebrote, el pasto varilla
tiene otros efectos ambientales positivos, incluida la prevención de la escorrentía superficial
y la erosión del suelo, el secuestro de carbono y la provisión de un hábitat para la vida
silvestre (Humphreys, 1999). Las tierras cultivadas con pasto varilla también tuvieron mucho
depósitos de carbono orgánico total en el suelo más altos que las tierras cultivadas con
cultivos anuales, como el maíz y el trigo (McLaughlin et al., 2002; Liebig et al., 2005).

La economía de la producción de biocombustibles depende en gran medida del costo de

la materia prima y de la tecnología de conversión (McLaughlin y Kszos, 2005). El desarrollo
de variedades mejoradas de pasto varilla para una producción de bajo costo en tierras
marginales es un requisito previo para el éxito del programa de bioenergía (Dyer et al., 2008).
Uno de estos enfoques implica el uso de microorganismos beneficiosos, como los endófitos,
que forman asociaciones íntimas con las plantas (Sturz el al., 2000). Los endófitos, tanto
fúngicos como bacterianos, han sido considerados como mecanismos para mejorar las
características de las plantas para usos comerciales. La colonización de pastos por hongos
endófitos para mejorar el rendimiento está bien documentada (Funk et al., 1993), incluido su
uso con switchgrass.

Sin embargo, hasta donde sabemos, solo se ha informado de un estudio sobre la

promoción del crecimiento de un pasto como materia prima bioenergética (plántulas de
Miscanthus x giganteous) por un endófito bacteriano (Herbaspirillum frisingense) (Kahn et al.,
2008). Un componente clave de nuestro programa de investigación de cultivos
bioenergéticos involucra la utilización de endófitos bacterianos beneficiosos que forman
asociaciones estables y persistentes con el pasto varilla, como mecanismo para mejorar el
rendimiento de biomasa y mejorar la tolerancia al estrés en sistemas de producción de bajos
insumos (Nowak et al., 2011) . Aunque los mecanismos moleculares de la interacción
benéfica entre el endófito y la planta huésped se desconocen en gran medida, varios estudios
han demostrado que los endófitos pueden promover el crecimiento de las plantas al mejorar
la capacidad de la planta para adquirir nutrientes, mejorar el manejo del agua y/o la
resistencia al estrés abiótico y biótico a través de la regulación de hormonas Welbaum et al.,
2004;. Por ejemplo, la desaminasa del ácido 1-aminociclopropano-1carboxílico (ACC)
producida por los endófitos reduce los niveles de etileno en las plantas hospedantes,
reduciendo su respuesta al estrés abiótico y biótico, y cambiando la morfología de la raíz, lo
que conduce a la promoción del crecimiento de la planta Glick et al., 1998;Glick, 2004).
Muchos endófitos conocidos también promueven el crecimiento de las plantas mediante la
producción de ácido giberélico (GA3), ácido indol-3-acético (IAA) o citoquininas (Arshad y
Frankenberger, 1991; Lazarovits y Nowak, 1996).

Se ha descubierto que la cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans es un endófito

 TRADUCCIÓN 22

bacteriano promotor del crecimiento vegetal muy eficaz, con una amplia gama de huéspedes
que incluye papas, tomates y vides (Lazarovits y Nowak, 1996; Conn et al., 1997; Barka et al.,
2000; Nowak et al., 2003; Wang et al., 2006). Además, recientemente se ha secuenciado su
genoma, lo que proporciona los recursos genómicos necesarios para desarrollar una
comprensión de los mecanismos asociados con la capacidad de este endófito para
promover el crecimiento de las plantas. PsJN produce un alto nivel de ACC desaminasa,
mejora la tolerancia al estrés por frío y calor de la planta huésped (Bensalim et al., 1998),
mejora el manejo del agua y la resistencia de la planta a los patógenos. En este estudio,
reportamos la promoción del crecimiento de switchgrass cv. Alamo de Burkholderia
phytofirmans cepa PsJN en condiciones in vitro, cámara de crecimiento e invernadero. Hasta
donde sabemos, este es el primer informe que detalla la interacción switchgrass-PsJN.

Materiales y métodos

Materiales vegetales
Pasto varilla (Panicum virgatum L.) cvs. Las semillas de Álamo y Cave-in-Rock se
compraron de Warner Brothers Seed Co. (Lawton, OK), y el Dr. Bingyu Zhao (Departamento de
Horticultura - Virginia Tech, Blacksburg, VA) proporcionó amablemente otras semillas de
pasto varilla. Las semillas de switchgrass se esterilizaron superficialmente mediante
tratamiento con etanol al 70 % durante 2 min, se enjuagaron 3 veces con agua destilada, se
descascararon durante 30 min con H2SO4 al 60 % con agitación, se lavaron 3 veces con
agua destilada, se esterilizaron con hipoclorito de sodio 0,4 M (50 % solución de lejía
comercial que contiene hipoclorito de sodio al 6 %) que contiene Triton 100 al 0,1 % durante
30 min, seguido de enjuague 5X con agua destilada, desionizada y estéril (ddH2O).

Endófitos bacterianos y condiciones de cultivo.

La cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans y su derivado PsJN-GFP se obtuvieron de la
Dra. Angela Sessitsch (Instituto Austríaco de Tecnología, Seibersdorf, Austria). Los cultivos
se sembraron en medio sólido King's B (KB) como se describe en . El inóculo se produjo
transfiriendo un asa de PsJN de cultivos de 2 días a 5 ml de caldo KB en un tubo de cultivo de
15 ml, seguido de incubación a 28 °C en un agitador (150 rpm) durante la noche. Se
añadieron cinco ml del cultivo de PsJN durante la noche a 45 ml de caldo KB en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml y se cultivaron hasta una DO600 de 0,7. A continuación, las células
bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 3500 rpm durante 7 minutos a 4 °C y se
resuspendieron en tampón PBS (NaH2PO4 10 mM que contenía NaCl al 0,8 %, pH 6,5),
después de lo cual se ajustó la DO 600 con tampón PBS a 0,5, a menos que se describa lo
contrario.
 TRADUCCIÓN 23

Inoculación de plántulas con PsJN y respuestas de crecimiento de

plantas
Semillas esterilizadas superficialmente se germinaron en placas de Petri durante 7 días
a 25 ˚C, bajo luz fluorescente blanca (67 µmol m-2s-1), fotoperíodo de 16 h, en un medio de
crecimiento de switchgrass compuesto por sales MS y vitaminas (Murashige y Skoog, 1962),
30 g/l de maltosa y 3 g/l de fitogel, pH 5,8. Las puntas de las raíces de las plántulas jóvenes
se cortaron antes de la inoculación con PsJN para facilitar la penetración bacteriana. Para la
inoculación directa de semillas, las semillas esterilizadas en la superficie se colocaron en
papel de filtro húmedo durante 3-5 días en una incubadora a 25 ˚C con un fotoperíodo de 16 h
(bombillas fluorescentes blancas a 67 µmol m-2s-1) seguido de remojo en suspensión de
PsJN (0,5 de OD 600 ) (aprox. 10 8 cfu) durante 1 min. Las plántulas/semillas de control se
trataron con tampón PBS solo. Las plántulas/semillas tratadas se secaron con una toalla de
papel estéril, se colocaron en medio de crecimiento de pasto varilla en recipientes GA7
Magenta (Sigma-Aldrich) que contenían 50 ml de medio y 5 plántulas o semillas en
germinación por recipiente, y se cultivaron durante un mes en la incubadora. como
anteriormente. Luego se determinaron la longitud de raíces y brotes y el peso fresco de las
plántulas, y las plantas se transfirieron a una mezcla de suelo compuesta por 2/3 de mezcla
para macetas Miracle-Gro® (Scotts Miracle-Gro Company, Marysville, Ohio) y 1/3 de medio
de cultivo Arabidopsis. (Semillas Lehle, Round Rock, Texas). Las plantas se cultivaron en
charolas de 72 cavidades en una cámara de crecimiento a una temperatura de 28/22°C
día/noche, fotoperíodo de 16 h (focos fluorescentes blancos a 88 µmol m-2s-1) durante 30
días, o en macetas de 4 galones en el invernadero.

Colonización de PsJN
Las plantas inoculadas con PsJN-GFP se examinaron con un microscopio
estereoscópico fluorescente (Modelo SZX-ILLD2-100; Olympus, Tokio, Japón) equipado con
un filtro GFP (BP460-490, Olympus, Tokio, Japón) y el escáner confocal de escaneo láser
Zeiss 510. microscopio (LSCM) (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) para observar la
colonización.

Para los bioensayos, el control y las plantas inoculadas con PsJN-GFP se esterilizaron
superficialmente con hipoclorito de sodio 0,032 M durante 1 min, luego se lavaron 4X con
agua destilada estéril. Cincuenta µl del lavado final se sembraron en medio KB sólido para
confirmar la eficacia de la esterilización superficial. A continuación, se separaron las partes
de la raíz, la hoja y la vaina, se pesaron cada una y se molieron con mortero en 1 ml de agua
destilada estéril. A continuación, los homogeneizados se centrifugaron a 2000 rpm durante 3
min y el sobrenadante se diluyó en serie con agua destilada. Cincuenta µl de muestras de las
soluciones diluidas en serie se esparcieron en medio KB sólido. Las placas se incubaron
durante 3 días a 28 °C en la oscuridad y se determinó el número de colonias positivas para
 TRADUCCIÓN 24

GFP mediante estereomicroscopía de fluorescencia como se describe anteriormente.

Resultados

Asociación endofítica de PsJN con Switchgrass Alamo

La colonización endofítica de switchgrass por la cepa PsJN-GFP de Burkholderia
phytofirmans se visualizó mediante microscopía confocal (Figura 1.1). Bajo la iluminación
apropiada, el PsJN-GFP pudo observarse claramente dentro de las raíces de las plantas
inoculadas con PsJN 3 días después de la inoculación, mientras que no se observó
fluorescencia en las raíces de las plantas de control inoculadas con tampón.

El título de PsJN-GFP en plantas inoculadas también se determinó usando

homogeneizados de tejido de varios tejidos (raíz, hoja y vaina) en diferentes momentos
(Tabla 1.1). El endófito inicialmente infectó y colonizó las raíces de las plantas, y siete días
después de la inoculación, los títulos de PsJN aún eran más altos en la raíz. Sin embargo, los
títulos aumentaron significativamente en otros tejidos el día 14, lo que indica una
translocación a hojas y vainas.

Efectos de PsJN en el crecimiento de Alamo in vitro

Las plántulas jóvenes de switchgrass se prepararon e inocularon como se describe en
Materiales y

Los métodos y las plantas no inoculadas e inoculadas se analizaron después del

crecimiento in vitro durante un mes. El resultado mostró que PsJN promovió significativa y
repetidamente el crecimiento de raíces y brotes de Alamo, con un aumento del 35,6 % en la
longitud de los brotes, un aumento del 32,8 % en la longitud de las raíces y un aumento del
83,6 % en el peso fresco, en comparación con las plantas no inoculadas (Figura 1.2).
Después de varias repeticiones, el peso fresco promedio de las plantas inoculadas con PsJN
siempre fue aproximadamente un 50 % mayor que el de las plantas no inoculadas.

Efectos de PsJN en el crecimiento de Alamo en un entorno de

cámara de crecimiento
Como se describió anteriormente, PsJN mejoró significativamente el pasto varilla cv.
Álamo crecimiento in vitro. A continuación, evaluamos el impacto de PsJN en el crecimiento
en condiciones de suelo. Álamo de un mes de edad cultivado in vitro (control y plántulas
 TRADUCCIÓN 25

inoculadas con PsJN) se transfirió a un piso con 72 cavidades llenas de tierra y se cultivó en
una cámara de crecimiento a temperaturas de 28/22°C día/noche con un período de luz de
16 h durante un mes. Las plantas inoculadas con PsJN mostraron aumentos de crecimiento
significativos en comparación con las plantas de control en cuanto a la longitud de los brotes
y los pesos fresco/seco (Figura 1.3). Los experimentos de la cámara de crecimiento se
repitieron 5 veces, y los datos promedio de 5 experimentos mostraron una promoción
significativa del crecimiento por parte de PsJN, con un 46,3 % y un 54,1 % de aumento en el
peso fresco y el peso seco, respectivamente. El aumento de peso seco total (54,1%) por
PsJN fue mayor que el aumento de peso fresco total (46,3%), lo que indica que las plantas
inoculadas con PsJN acumularon más biomasa.

Efectos de PsJN en el crecimiento de Alamo en el invernadero

Las plantas no inoculadas y las inoculadas con PsJN también se cultivaron en
condiciones de invernadero para determinar la persistencia de la mejora del crecimiento. Las
plantas inoculadas con PsJN y cultivadas in vitro durante 25 días se transfirieron a macetas
de 4 galones con 5 plantas en cada maceta y se cultivaron en el invernadero. Las plantas
inoculadas con PsJN exhibieron un vigor de crecimiento sostenido, ya que eran
significativamente más altas y desarrollaron más macollos antes que las plantas de control
no inoculadas (Figura 1.4). Después de un mes de crecimiento en el invernadero, las plantas
inoculadas con PsJN tenían un 76,2 % más de hijos que las plantas de control. Las plantas se
cosecharon después del crecimiento durante dos meses y se determinó el rendimiento de
biomasa (Figura 1.5). Las plantas inoculadas con PsJN fueron repetidamente
significativamente más altas en rendimiento de biomasa, con un aumento del 36,8 % en el
peso fresco y un aumento del 57,1 % en el peso seco.

Efectos de PsJN en el crecimiento de Alamo en condiciones

subóptimas
Con el fin de desarrollar un sistema de producción de materia prima sostenible y de
bajos insumos utilizando el endófito bacteriano beneficioso, probamos el rendimiento de
crecimiento de plantas inoculadas con PsJN con suelo de campo sin fertilizar, en un
invernadero en condiciones ambientales durante el otoño, cuando la temperatura no era
óptima para crecimiento de pasto varilla. Los resultados mostraron que las plantas
inoculadas con PsJN produjeron el doble de la biomasa total de los controles (Figura 1.6).

Inoculación directa de semillas de switchgrass con PsJN

Con el fin de explorar una forma práctica de inocular el pasto varilla con el endófito
 TRADUCCIÓN 26

bacteriano, esterilizamos las semillas de la hierba varilla como se describe en Materiales y

Métodos, colocamos las semillas esterilizadas en papel de filtro húmedo durante 3 a 5 días
en una incubadora a 25 °C y luego las inoculamos. las semillas en germinación con
diferentes concentraciones de inóculo endófito para determinar la concentración de
inoculación óptima (OD600 a 0,1-0,5). Las plantas inoculadas con PsJN a OD600 de 0,1, 0,25
y 0,5 exhibieron aumentos de peso seco del 28,7 %, 55,0 % y 80,1 %, respectivamente, en
comparación con las plantas no inoculadas después de crecer in vitro durante 25 días y en la
cámara de crecimiento durante otro mes. Una concentración de PsJN de 0,5 fue la más
efectiva para promover el aumento de biomasa (Figura 1.7), y no se observó diferencia de
biomasa entre el tratamiento de 0,1 y el control.

La infección por endófitos y la colonización de las semillas dependen de la

concentración de endófitos y del estado de imbibición de las semillas. Entonces, para facilitar
la infección y colonización por el endófito bacteriano, las semillas esterilizadas se
embebieron en agua durante 1, 2, 3 o 4 días y luego se inocularon con PsJN a una DO600 de
0,5 o 1,0, ya que una DO600 de 0,5 fue el más efectivo como se describió anteriormente. Las
semillas inoculadas con PsJN se colocaron en una incubadora a 25 °C con un período de luz
de 16 h durante 25 días, se transfirieron al suelo y se cultivaron en una cámara de
crecimiento durante 30 días. Los resultados indicaron que las plantas de las semillas
embebidas durante 2 días y luego inoculadas con una DO600 de 0,5 tenían el peso seco más
alto, con un aumento del 55 % en comparación con las plantas de control no inoculadas
(Figura 1.7).

Respuestas genotípicas a PsJN

Como se describió anteriormente, PsJN pudo estimular el crecimiento en switchgrass cv.
Álamo. Para evaluar la influencia del genotipo de la planta en esta respuesta, se probaron
otras siete variedades de pasto varilla para determinar sus respuestas de crecimiento a
PsJN. Como se muestra en la Tabla 1

Discusión
En el presente estudio, demostramos la capacidad de B. phytofirmans PsJN para
colonizar y promover el crecimiento en switchgrass cv. Álamo. Tres días después de la
inoculación de PsJN, pudimos visualizar claramente la colonización de células bacterianas
dentro de las raíces bajo microscopía confocal. La población bacteriana dentro de las raíces
fue inicialmente mucho mayor que la de las hojas y las vainas, y el endófito bacteriano se
transmitió posteriormente verticalmente a las hojas superiores a través de la vaina de la hoja.
Estos resultados fueron similares a los reportados para vid y papa (Reiter et al., 2002), donde
el PsJN fue transportado a través del sistema vascular interior, desde los vasos del xilema de
 TRADUCCIÓN 27

la raíz hasta las partes superiores de las plantas. Este es un primer paso crítico en la
interacción bacteria-planta endófita (Whipps, 2001). Se observó una importante promoción
del crecimiento del cv. Alamo por PsJN, tanto en condiciones in vitro como de suelo. Nuestro
estudio mostró que el peso fresco total y el peso seco total de las plantas inoculadas
aumentaron en un 45 % y un 55 % respectivamente en comparación con las plantas de
control no inoculadas cuando las plántulas inoculadas se cultivaron in vitro y luego se
transfirieron al suelo y se cultivaron en una cámara de crecimiento durante un mes. Se han
obtenido resultados similares en macetas de 4 galones bajo nuestras condiciones de
invernadero. Otros estudios han informado niveles de promoción del crecimiento por PsJN,
mostrando la vid un aumento de 6 veces en la biomasa total (Barka et al, 2006) y la patata
mostrando un aumento de aproximadamente 2 veces en la biomasa de raíces y tallo sobre
los controles. El mecanismo de crecimiento de las plantas por B.

phytofirmans PsJN ha sido reportado y atribuido a la capacidad de PsJN para producir

altos niveles de actividad de ACC desaminasa, que degrada ACC a amoníaco y αcetobutirato
(Long et al., 2008), que es una característica común de las bacterias promotoras del
crecimiento vegetal. ACC es el precursor del etileno, una hormona del estrés vegetal; por lo
tanto, el nivel reducido de etileno en las plantas colonizadas con PsJN promoverá el
crecimiento de las plantas. Según el informe de Penrose y Glick (2003), la actividad de ACC
por encima de 20 nmol de α-cetobutirato/h/mg es suficiente para promover el crecimiento de
la planta huésped, y se ha demostrado que PsJN contiene 308 nmol de α-cetobutirato/h/mg
de ACC actividad desaminasa. Aunque varios estudios han reportado la interacción entre
este endófito y las plantas hospederas para promover el crecimiento, la mayoría de los
estudios han reportado datos in vitro Lazarovits y Nowak, 1996;Conn et al., 1997;. Nuestros
resultados con suelo de campo sin fertilizar, en un invernadero bajo condiciones ambientales
durante el otoño, cuando la temperatura no era óptima para el crecimiento del pasto varilla
(Figura 1.6) implicaron el beneficio potencial del pasto varilla inoculado con PsJN para el
crecimiento en tierras marginales y condiciones de crecimiento subóptimas.

Si bien nuestros estudios iniciales se realizaron con el cv. Alamo, probamos la utilidad de
PsJN como un endófito promotor del crecimiento con otros cultivares de switchgrass.
Nuestros resultados indicaron que existían efectos de genotipo específicos, con algunos
genotipos altamente sensibles a los efectos de promoción del crecimiento de PsJN, y otros
no. Otros efectos de genotipo similares han sido informados. Se informó que la respuesta de
la papa a PsJN implica alguna forma de control genético, ya que algunos cultivares de papa
muestran una respuesta beneficiosa al endófito, mientras que otros no (Bensalim et al, 1998;
Nowak et al., 1998; Nowak et al. , 2007). El fenotipo in vitro típico para un cultivar fuertemente
receptivo se caracterizó por un sistema radicular masivo y bien ramificado y después de las
primeras 3-4 semanas en cultivo, la plántula estaba más avanzada en su desarrollo que los
controles no bacteriizados. Los tallos eran más resistentes, con más depósitos de lignina
alrededor del sistema vascular, más pelos radiculares y más y más tricomas en las hojas
 TRADUCCIÓN 28

(Nowak et al., 1998). También notamos que las plantas de switchgrass inoculadas con PsJN
tenían un desarrollo avanzado (datos no publicados). Estas mejoras no fueron evidentes para
los cultivares con poca respuesta. También observamos algunas de estas diferencias
fenotípicas entre cultivares de switchgrass sensibles a PsJN y no sensibles. Un trabajo
adicional que ilustra el control genético de la respuesta beneficiosa al endófito usó líneas
monoploides derivadas del cultivo de anteras de un clon diploide adaptado de Solanum
phureja, BARD 1-3 (Nowak et al., 2007). El donante de antera diploide, BARD 1-3, exhibió una
respuesta de bacterización comparable a Red Pontiac, mientras que las líneas monoploides
exhibieron una respuesta a PsJN que va de favorable a desfavorable a neutral.

La suposición aquí fue que el rango de respuesta de la población monoploide se debió a

la segregación de alelos para genes involucrados en la regulación de la interacción positiva o
negativa con PsJN.

Los estudios de papa/PsJN han sido los más caracterizados y se han llevado a cabo con
material propagado clonalmente a través de secciones nodales, en los que una sola
inoculación es suficiente para iniciar la colonización a través del tejido del xilema,
extendiéndose finalmente a las hojas superiores.

Los niveles bacterianos deben alcanzar un umbral de población dentro de la planta antes
de que sean efectivos con una relación directa entre la mejora del crecimiento de las
plántulas y la colonización de PsJN tanto en las superficies interiores como exteriores
(Nowak et al., 2007). Este estudio sienta las bases para desarrollar un sistema de producción
de materia prima de pasto varilla sostenible y de bajos insumos en tierras marginales
utilizando este y otros endófitos bacterianos beneficiosos.

Resultados obtenidos con pasto varilla cv. La promoción del crecimiento de Álamo por B.
phytofirmans PsJN en diferentes condiciones, particularmente en condiciones subóptimas,
indica que podríamos aplicar el endófito bacteriano beneficioso en el manejo práctico del
pasto varilla para ayudar al establecimiento del pasto varilla en el primer año y en el
desarrollo de una materia prima sostenible y de bajos insumos. sistema de producción. En el
futuro, los mecanismos de promoción del crecimiento deben dilucidarse con biología
molecular y genómica funcional. Nuestros resultados muestran que la cepa PsJN de B.
phytofirmans promueve significativamente el pasto varilla cv. Crecimiento de Álamo bajo
diferentes condiciones, especialmente en las primeras etapas de crecimiento que producen
macollos más tempranos, lo que puede beneficiar el establecimiento del pasto varilla en el
primer año. Además, PsJN podría estimular significativamente Switchgrass cv. Crecimiento
de Álamo en condiciones subóptimas, lo que indica el uso del endófito bacteriano
beneficioso para impulsar el crecimiento del pasto varilla en tierras marginales y para
desarrollar un sistema de producción de materia prima sostenible y de bajos insumos. Las
plántulas se inocularon con PsJN y se cultivaron in vitro durante un mes, luego se
 TRADUCCIÓN 29

transfirieron a macetas de 4 galones con 5 plantas/maceta y se cultivaron en invernadero

durante dos meses. El peso seco se determinó después de que las muestras se secaron en
un horno a 65°C durante un día. El número de muestra fue 25 y ** significa una diferencia
significativa a un nivel de 0,01 entre PsJN y el control usando la prueba T de Student. Las
semillas se infectaron con diferentes concentraciones de PsJN y se cultivaron in vitro
durante 25 días, luego se transfirieron a bandejas de 72 cavidades y se cultivaron en una
cámara de crecimiento durante 37 días. El número de muestra fue de 72 para cada
tratamiento. * y ** diferencia significativa media a niveles de 0,05 y 0,01, respectivamente,
entre PsJN y el control utilizando la prueba T de Student.

Figuras y Tablas

Introducción
Los combustibles fósiles han impulsado la economía mundial desde el comienzo de la
revolución industrial.

Sin embargo, su suministro es limitado y se estima que ya pasó el pico de producción de

petróleo (Murray y King, 2012). Avanzando hacia el futuro, el acceso a los combustibles
fósiles será cada vez más difícil de mantener, ya que se estima que la demanda mundial de
energía aumentará en más del 50 % en las próximas dos décadas (revisado en ). Además, el
creciente uso de combustibles fósiles afectará aún más el cambio climático a través de
emisiones de gases de efecto invernadero. El desarrollo y uso de formas renovables de
energía, incluidas la solar, la eólica y la bioenergía, se convirtió en uno de los principales
impulsores de la innovación en nuestra generación. En los Estados Unidos, el pasto varilla
(Panicum virgatum L.)

ha sido identificado como un cultivo bioenergético renovable modelo (Wright, 1994)

debido a su alta eficiencia en el uso del agua, buena capacidad de secuestro de carbono y
capacidad para crecer en tierras marginales con bajos insumos de agroquímicos
(McLaughlin y Kszos, 2005). La evaluación en finca de la producción de pasto aguja en el
Medio Oeste destacó el potencial de producción en tierras marginales de 10 fincas separadas
y demostró que el pasto aguja producía un 504 % más de energía de la que consumía. Los
autores estimaron que era probable que se lograran más aumentos con la expansión de los
programas de reproducción y una mejor gestión (Schmer et al., 2008).

Debido a la economía y la logística del transporte, es probable que las industrias de

biocombustibles sean regionales, y la materia prima principal cultivada será adecuada para
un lugar en particular (Bouton, 2004). Por lo tanto, el desarrollo de la producción de pasto
 TRADUCCIÓN 30

varilla en tierras marginales sin competencia por suelos fértiles utilizados para cultivos
alimentarios también puede beneficiar potencialmente a los productores agrícolas. Sur y
Centro

Virginia tiene una rica tradición agrícola, basada principalmente en la producción de

tabaco. La demanda mundial de tabaco ha caído drásticamente en las últimas décadas,
dejando muchos campos vacíos y, a menudo, sin nutrientes. El campo emergente de la
producción de materias primas bioenergéticas puede utilizar estos campos, con poca
inversión en maquinaria nueva, ya que se puede utilizar equipo de forraje agrícola
convencional (McLaugnlin y Kszos, 2005).

Se han utilizado endófitos bacterianos beneficiosos (endofitos) para aumentar la

producción de otros cultivos bioenergéticos de gramíneas, como el maíz y la caña de azúcar
(Boddey, 1995;).

Los endófitos son microorganismos naturales del suelo que pueden penetrar las raíces
de las plantas y trasladarse a los órganos de la superficie y, tras la colonización, afectan el
crecimiento, la salud y la productividad de las plantas (Revisado en Welbaum et al., 2004;.

En los últimos 30 años se han informado múltiples mecanismos de promoción del

crecimiento vegetal por endófitos bacterianos beneficiosos que incluyen, en general, la
producción de hormonas vegetales para estimular directamente el crecimiento, la síntesis de
compuestos antimicrobianos para aumentar la resistencia a los patógenos de las plantas y
ayudar a la planta huésped a adquirir nutrientes a través de mecanismos como la fijación de
nitrógeno atmosférico y la secreción de sideróforos (revisado en ). Un endófito particular
también puede transmitir múltiples mecanismos de mejora del crecimiento. Por ejemplo,

Se ha demostrado que la cepa PsJN (PsJN) de Burkholderia phytofirmans secreta

sideróforos para la adquisición de hierro, induce la resistencia al estrés de la planta huésped
a través de la producción de trehalosa y ACC desaminasa, y estimula el crecimiento de la
planta mediante una mayor producción de fitohormonas; . PsJN también coloniza
eficazmente los tejidos de una amplia gama de plantas, incluidos el tomate (Nowak et al.,
2004; papa, pimiento dulce (Nowak et al., 2004) y vid. En condiciones de sequía, la
inoculación de PsJN aumenta la fotosíntesis, el contenido de clorofila, y la eficiencia del
fotosistema II en comparación con el tratamiento de control (Naveed et al., 2013).

En pasto varilla cv. Se demostró que Alamo, PsJN aumentó el peso fresco en un 57, 46 y
37 % en condiciones in vitro, de cámara de crecimiento e invernadero, respectivamente. En el
campo, sin embargo, la gran abundancia y diversidad de bacterias nativas del suelo pueden
superar a los microorganismos introducidos y disminuir las ganancias que a menudo se
observan en el laboratorio.
 TRADUCCIÓN 31

Materiales y métodos

Material vegetal y bacterizacion

Semillas de Switchgrass (Panicum virgatum L.) del cv. Alamo se adquirieron de Warner
Brothers Seed Co. (Lawton, OK). Las semillas se esterilizaron superficialmente como se
describió anteriormente y se germinaron durante 5 a 7 días en papel de filtro estéril en placas
de Petri a 25 °C. La cepa PsJN de B. phytofirmans se obtuvo de la Dra. Angela Sessitsch
(Instituto Austríaco de Tecnología, Seibersdorf, Austria). Los cultivos de PsJN se sembraron
en medio sólido King's B (KB) como se describe. El inóculo se produjo transfiriendo un asa de
bacterias de cultivos de 2 días a 5 ml de caldo KB en un tubo de cultivo de 15 ml, seguido de
incubación a 28 °C en un agitador (220 rpm) durante la noche. Se añadieron cinco ml del
cultivo de toda la noche a 45 ml de caldo KB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se
cultivaron hasta 0,7 OD600. A continuación, las células bacterianas se recogieron mediante
centrifugación a 3500 rpm durante 7 min a 4 °C y se resuspendieron en tampón PBS (NaH 2
PO 4 10 mM que contenía NaCl al 0,8 %, pH 6,5), después de lo cual se ajustó la DO 600 con
tampón PBS. a 0,5 (aprox. 108 cfu). plantadas a principios de primavera (17/05/2012) y dos
cosechas posteriores de biomasa aérea se realizaron cortando plantas a una altura de
rastrojo de 5 cm en parejas; la primera fue durante el crecimiento vegetativo a principios del
verano (7/6/2012, n=25), y la cosecha final se completó al final de la temporada de
crecimiento en plena latencia (1/10/2013, n=50 ). El peso fresco y el número de macollos se
registraron después de la primera cosecha. El material vegetal se secó durante 2 semanas a
70°F antes de tomar los pesos secos. Las cosechas del segundo año se realizaron el 5 de
junio (n=23) y

20 de noviembre 20/11/2013 (n=75). Los pesos secos se determinaron como antes.

Las parcelas experimentales 1 y 2 de Danville se plantaron el 20/8/2012. La Figura 2.1b

ilustra las distribuciones y diseños de las parcelas. Las plantas de la parcela 1 fueron
bactericidas el 3/7/2012 y las plantas de la parcela 2 fueron bactericidas el 21/6/2012. La
altura de cada macollo y el número de macollos se midieron al final de la temporada de
crecimiento (26/11/2012). Durante el segundo año, se determinó el crecimiento de raíces y
brotes durante el crecimiento vegetativo desenterrando toda la planta (17/6/2013, n=10) y

lavar las raíces de las plantas con agua del grifo. Se determinaron los pesos frescos y
las plantas se dejaron secar en una habitación con control de humedad durante 3 semanas.
Luego se registraron los pesos secos de raíces y brotes, y se realizó un análisis estadístico
utilizando la prueba t de Student. La cosecha final del segundo año se realizó el 04/12/2013
después de que las plantas estuvieran inactivas. Catorce pares de plantas se cosecharon al
azar de la parcela 1 y 12 pares de plantas de la parcela 2 al azar. Las plantas latentes se
 TRADUCCIÓN 32

excavaron en un diámetro de 18 pulgadas alrededor de las raíces y 10 pulgadas de

profundidad. Las raíces se lavaron con agua del grifo como se describió anteriormente y las
plantas enteras se dejaron secar durante dos semanas. Se cortaron las raíces de los brotes y
cada uno se etiquetó y pesó.

Se registraron los valores y se realizó el análisis estadístico como se describe

anteriormente. Los valores se asignaron a cada grupo y se informaron con niveles de
confianza del 95 %, 99 % o 99,9 %. Las diferencias numéricas biológicamente interesantes
también se presentan y etiquetan con el valor p. El diseño experimental fue emparejado y las
plantas se compararon una al lado de la otra para determinar los efectos de la bacterición. Se
seleccionaron sitios para realizar el rendimiento del pasto varilla en suelo con alto contenido
de nutrientes versus suelo con bajo contenido de nutrientes para probar la hipótesis de que la
inoculación de PsJN promovería el crecimiento en el campo bajo diversas condiciones de
suelo.

Experimentos en macetas de suelo de campo

Para probar el efecto de la bacterización con PsJN sobre el crecimiento y desarrollo del
pasto varilla cv. Álamo en un invernadero en macetas de 4 galones llenas de tierra de campo
de nivel nutricional medio (Tabla 2.1) Las plántulas se bactericieron como se indicó
anteriormente y se trasplantaron cinco plantas por maceta, un total de 11 macetas por
tratamiento, el 17/9/2011 y se cultivaron en Lynchburg Grows invernadero a temperatura
ambiente. Las macetas se regaron por igual con un sistema de rociado sobre el suelo cada
tres días, suministrando 50 ml de agua del grifo por maceta. Las etapas de crecimiento se
determinaron utilizando el método de Sanderson (1992).

Experimento de morfología de la raíz

Para determinar el efecto de la bacterición con PsJN en el crecimiento y la morfología de
las raíces, los trasplantes bactericidos y los controles no bacteriizados se plantaron en
macetas de 4 galones que contenían mezcla de suelo Miracle Gro ® el 28/3/2013 en un
invernadero con temperatura controlada y se cosecharon el 14/5 /2013.

Se recogieron las plantas enteras y se lavaron las raíces. Los pesos frescos y secos de
raíces y brotes se determinaron como se describe anteriormente. Se determinó el número de
raíces seminales y se contaron las raíces laterales en cada raíz seminal hasta 3 cm desde la
parte superior.

Fotosíntesis
 TRADUCCIÓN 33

Se realizaron cuatro mediciones de fotosíntesis en la segunda hoja completamente

formada desde la parte superior (Exp. A; n = 10, Exp. B; n = 10, Exp. C; n = 10, Exp. D; n = 20)
usando Li -Sistema de fotosíntesis COR (Li-COR ® Lincoln, Nebraska) a luz de 1500 µMol/m 2
.segundo, 380 ppm CO 2 25C.

Resultados
Prueba de campo de Lynchburg en suelo con alto contenido de nutrientes

Pruebas de campo de Walden Farm en suelo con bajo contenido de

nutrientes
Para probar los efectos de la bacterización con PsJN en switchgrass cv. Alamo en el
campo con suelo bajo en nutrientes (Tabla 2.1), se establecieron dos parcelas en una antigua
granja de tabaco en el sur de Virginia. Las parcelas se sembraron en agosto de 2012 y se
tomaron medidas de macollos y altura después de dos meses de crecimiento. El número de
hijos (Figura 2.6) fue significativamente mayor en la parcela 1 (p<0,01, n=73) y en la parcela
2 (p<0,001, n=32) para las plantas bactericidas con PsJN. La altura de cada macolla también
se registró y se sumó para obtener una estimación de la biomasa, que se conoce como suma
de macollas o altura total (Figura 2.7). Las alturas totales de las plantas bactericidas con
PsJN fueron significativamente mayores en la parcela 1 (p<0,001, n=73) y en la parcela 2
(p<0,001, n=32

Producción de motocultores en diferentes condiciones.

Para explorar los efectos de la bacterición con PsJN en el establecimiento del pasto
varilla, se registró la producción de macollas después de 3 meses de crecimiento. La Figura
2.12 ilustra que la bacterización aumenta significativamente el número de macollos durante
la etapa temprana de crecimiento vegetativo en diferentes niveles de nutrientes del suelo
(consulte la Tabla 2.1). La prueba de campo en Lynchburg claramente produjo más macollos
en comparación con las macetas con tierra de campo, y la prueba de campo en la granja de
Walden, con casi 5 veces el número de macollos producidos en plantas bactericidas con
PsJN en suelo rico en nutrientes en Lynchburg. Todas las plantas bactericidas con PsJN
produjeron significativamente más macollos en comparación con las plantas de control, y los
resultados son similares a los registrados en la cámara de crecimiento y el invernadero.

Etapa de crecimiento
 TRADUCCIÓN 34

Las etapas de crecimiento acelerado del pasto varilla sobre el suelo se registraron
durante dos experimentos para determinar si se produjo un crecimiento acelerado en plantas
bactericidas con PsJN a los 2,5 meses de crecimiento (Figura 2.13). Durante la prueba de
promoción del crecimiento en macetas con suelo de campo, se midió el estado de
crecimiento por el número de hojas formadas y la madurez de la hoja nueva según el método
de Sanderson (1992). Durante la prueba, se registraron avances significativos (p<0,001) en
las etapas de crecimiento en plantas bactericidas con PsJN con casi una nueva hoja entera
formándose en el tratamiento con PsJN. Se repitió el estudio para confirmar los resultados.
La Figura 2.14 representa los resultados de un estudio de maceta de 2,5 meses en un
invernadero con temperatura controlada para determinar los efectos de la inoculación de
PsJN en el crecimiento de las raíces. Las plantas se cultivaron en mezcla para macetas
Miracle-Gro®. Se observaron aumentos significativos (p<0,001) en el peso de las raíces
frescas y secas, así como en la longitud de las raíces. Estos resultados confirmaron estudios
anteriores que también demostraron aumentos significativos en el peso y la longitud de las
raíces. Para estudiar más a fondo la morfología de las raíces, se contó el número de raíces
seminales en PsJN y las plantas de control, así como el número de raíces laterales por cm en
las raíces seminales, se estimó contando las raíces laterales en una porción de 3 cm de una
raíz seminal seleccionada al azar y dividiendo por 3. La Figura 2.15 ilustra estos hallazgos
junto con fotos como referencia. Las plantas bactericidas con PsJN produjeron
significativamente más raíces seminales (p<0,001) y las raíces seminales produjeron
significativamente más raíces laterales por cm en comparación con las plantas de control
(p<0,001). Juntos, estos resultados indican que el pasto varilla bactericido con PsJN puede
tener una mayor capacidad para acumular humedad y nutrientes.

Crecimiento y morfología de las raíces.

Tasas de fotosíntesis
Las tasas de fotosíntesis se midieron en plantas control y bactericidas con PsJN en
macetas con suelo de campo y en el campo (Figura 2.16). Si bien las tasas no fueron
significativamente diferentes, las tasas de fotosíntesis fueron más altas en PsJN en los
cuatro experimentos en comparación con los controles.

Discusión
Los cambios en los patrones globales de temperatura y suministro de agua combinados
con la disminución de los suministros de combustibles fósiles no renovables han despertado
el interés en el pasto varilla, una planta perenne nativa de estación cálida capaz de crecer con
pocos insumos, como un cultivo bioenergético potencial para compensar el uso de
 TRADUCCIÓN 35

combustibles fósiles en un manera sostenible. Los estudios han demostrado que las
bacterias que residen en los tejidos internos de las plantas sin causar daño aparente,
conocidas como endófitos, tienen la capacidad de promover el crecimiento de una serie de
cultivos energéticos de gramíneas (Boddey, 1995; Flinn, 2010), incluido el pasto varilla Gagne-
Bourgue et al., 2012; Xia et al., 2013). Switchgrass se divide taxonómicamente en dos
ecotipos: tolerantes al frío de tierras altas, que son de baja estatura y producen menor
biomasa, y cultivares de tierras bajas, que se encuentran en áreas húmedas más templadas y
son mayores productores de biomasa (Vogel, 2004). Tierra baja cv. Alamo es un candidato
principal para la producción de bioenergía en el sureste de los EE. UU. debido a su alta
producción de biomasa (Bouton, 2002). Sin embargo, el establecimiento del pasto aguja,
como el de la mayoría de las plantas perennes de estación cálida, es un desafío principal
durante los dos primeros años debido a la latencia de las semillas y la competencia de
malezas (Moser y Vogel, 1995). Por lo tanto, es fundamental mejorar el establecimiento del
pasto varilla durante los dos primeros años para lograr un desarrollo y una economía
saludables en general (Parish y Fikes, 2005).

Se ha demostrado que los endófitos bacterianos naturales, aislados del pasto aguja que
crece en el campo, promueven el crecimiento del pasto aguja (Gagne-Bourgue et al., 2012; Xia
et al., 2013). Se demostró que el endófito bacteriano beneficioso bien estudiado, Burkholderia
phytofirmans cepa PsJN, aislado de raíces de cebolla, aumenta el crecimiento y el desarrollo
de macollos de switchgrass cv. Alamo en cámara de crecimiento e invernadero), pero no fue
investigado en campo. El objetivo de este estudio fue explorar los efectos de la bacterización
de la cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans en el pasto varilla cv. Plántulas de Álamo
durante los primeros dos años de crecimiento en el campo, incluido el impacto en el número
de macollos y la biomasa aérea y subterránea en dos condiciones de suelo; uno estaba en un
campo con tierra de primera y el otro estaba en un antiguo campo de tabaco común en el sur
de Virginia. En los dos sitios, la biomasa aérea general fue significativamente mayor a mitad
de temporada, durante el crecimiento vegetativo y antes de la extracción de semillas y en el
segundo año de crecimiento (p<0,05).

En el sitio de suelo con alto contenido de nutrientes en Lynchburg, se realizaron dos

cosechas durante diferentes etapas de desarrollo de la planta para determinar si la
promoción del crecimiento era persistente en el campo. Otros experimentos han demostrado
que cuanto más tiempo se cultiva el pasto varilla en el campo, más bacterias endófitas se
asocian con él (Gagne-Bourgue et al., 2012). Con base en estas observaciones, la promoción
del crecimiento que se observa con las inoculaciones de una sola bacteria endofítica puede
disminuir cuando la planta se cultiva en el campo durante más tiempo. Sin embargo, en
suelos con alto contenido de nutrientes, el peso fresco fue significativamente mayor durante
la primera temporada, en cada una de las dos cosechas.

Los efectos más altos de la bacterización con PsJN para el peso fresco y seco se
 TRADUCCIÓN 36

registraron en el primer submuestreo durante el crecimiento vegetativo (52 días de

crecimiento, p=0,002). Cabe señalar que el pasto varilla cv. Alamo tiene variaciones genéticas
altas para el rendimiento (Burton, 2002), lo que hace que la significación estadística sea más
difícil de lograr. En la cosecha final, que se llevó a cabo después de que la planta había
completado la senescencia y permanecía principalmente tejido seco, reveló un aumento
pequeño pero significativo (p<0.05, n=50) en la biomasa aérea. Durante el segundo año, se
realizó una cosecha durante el crecimiento vegetativo a mitad de temporada, y los resultados
mostraron un aumento significativo (p<0,05) tanto en el peso fresco como en el seco. La
cosecha final al final de la segunda temporada también demostró una diferencia significativa
en los pesos de las plantas bactericidas con PsJN frente a los controles. Juntos, estos datos
indican que en suelo de campo fértil, el pasto varilla cv. El crecimiento de Álamo aumenta
durante el establecimiento de plántulas en el primer año y persiste hasta el segundo año.

Tanto en suelo de primera calidad como en suelo de una antigua granja de tabaco, el
número de macollos aumentó significativamente incluso cuando las plantas se trasplantaron
en diferentes momentos y en diferentes lugares.

El aumento del número de macollos es importante durante el establecimiento como un

indicador temprano del potencial futuro de producción de biomasa en los sistemas de
gramíneas perennes (Boe y Beck, 2008). Por ejemplo, se ha observado un mayor número de
hijos en trigo de invierno inoculado con A. brasilense (Dobbelaere et al., 2001). En el campo
de tabaco con suelo marginal, cuando se midió la altura de los macollos para cada macollo y
se sumaron para obtener una medida de la altura total de la planta, las plantas bactericidas
con PsJN superaron claramente (p<0,001) a las plantas de control, lo que indica ayuda en el
establecimiento durante el primer año. de crecimiento Durante el segundo año de
crecimiento, para determinar la biomasa tanto aérea como subterránea, se excavaron,
lavaron y pesaron plantas enteras. En experimentos anteriores, el tamaño y el peso de las
raíces aumentaron significativamente en macetas con tierra de campo. En ambas parcelas,
las plantas bactericidas con PsJN produjeron una biomasa de raíces frescas y secas
significativamente mayor, lo que indica que la bacterición aumenta el tamaño de las raíces, lo
que permite que la planta tenga acceso a más nutrientes y agua, lo cual es importante para el
establecimiento. Los pesos de los brotes secos también aumentaron significativamente en el
submuestreo del segundo año, lo que indica un aumento en la biomasa. La única
comparación que no logró un valor de p <0,05 fue el peso fresco de los brotes en la parcela 1
que, durante este período de crecimiento vegetativo, logró un valor de p de 0,07, un número
biológicamente importante, probablemente debido al pequeño tamaño de la muestra de la
cosecha. Sin embargo, el peso de los brotes de la parcela 2 alcanzó un valor
estadísticamente significativo de p = 0,02.

Se demostró que la bacterición con PsJN acelera el desarrollo en Arabidopsis (Poupin et

al., 2013).
 TRADUCCIÓN 37

Los datos del experimento de la maceta con suelo de campo respaldan esta hipótesis, ya
que la etapa de crecimiento avanzó en las plantas bactericidas con PsJN (Figura 2.13). Para
confirmar los hallazgos en el campo con respecto al crecimiento de las raíces y para explorar
más a fondo los efectos de la bacterición con PsJN en el desarrollo de las raíces, se inició un
estudio de 2,5 meses en macetas con mezcla para macetas Miracle-Gro ® en el invernadero
(Figura 2.15). Este estudio indicó que la bacterización con PsJN aumentó significativamente
el peso de la raíz (p<0.001) como se encontró en la prueba de campo. La morfología de la
raíz también cambió, ya que las plantas bactericidas con PsJN tenían más raíces seminales y
más ramas de raíces laterales por cm en comparación con los controles, lo que respalda los
hallazgos anteriores de una mayor ramificación lateral de las raíces en Arabidopsis (Poupin
et al., 2013). Estos datos indican que PsJN no solo aumenta el tamaño de la raíz, sino que
también cambia la morfología para permitir que la planta penetre en el suelo de manera más
completa para obtener un mejor acceso a los nutrientes y al agua a través del aumento de las
raíces laterales y el aumento del número de raíces seminales. Estos cambios morfológicos
podrían ayudar a la planta a tolerar la sequía en comparación con los controles, un efecto que
se ha demostrado que ocurre en el maíz inoculado con PsJN (Naveed et al., 2013). Se ha
informado sobre la promoción del crecimiento de raíces en otras plantas con el uso de
bacterias que producen sustancias similares a IAA (Glick, 1995). De manera similar, se
demostró un aumento del peso seco de la raíz en estudios de invernadero con maíz por
bacterias que producen compuestos similares a IAA (Mehnaz y Lazarovits, 2006).
Recientemente, se informó que un mayor desarrollo de raíces contribuye a un mayor número
de brotes en el campo en switchgrass inoculado con una mezcla de endófitos (Ker et al.,
2012).

En general, Burkholderia phytofirmans cepa PsJN bacterización de switchgrass cv.

Alamo resulta en la promoción del crecimiento en el campo, en diferentes tipos de suelo,
durante el primer año de establecimiento. Los efectos de promoción del crecimiento se
mantienen durante el segundo año en suelos con niveles de nutrientes altos y bajos.
Potencialmente, como resultado del mayor crecimiento de las raíces, se produjeron más
macollos y se adelantó la etapa de crecimiento. Otros estudios han demostrado que una
mezcla de bacterias promotoras del crecimiento de las plantas, originalmente aisladas del
pasto varilla, aumentó la producción en un 40 % en comparación con las bacterias solas (Ker
et al., 2012). La mezcla de bacterias que usaron los autores tenía una gama de capacidades
de promoción del crecimiento, incluida la capacidad de solubilizar P, producir sustancias
similares a IAA y, potencialmente, fijar el nitrógeno atmosférico. En este estudio,
caracterizamos la morfología de la raíz además de la biomasa, la producción de macollos y
la aceleración de la etapa de crecimiento mediante la bacterición con una sola bacteria capaz
de múltiples mecanismos de acción. En el futuro, se realizará un seguimiento continuo de la
producción para confirmar la producción sostenida. Las interacciones entre un endófito y su
planta huésped son complejas, y se necesita más investigación de campo y multidimensional
para comprender cómo el uso de estos microorganismos beneficiosos beneficiará a la
 TRADUCCIÓN 38

agricultura sostenible. 3 Resumen de los pesos secos de las dos cosechas de pasto varilla en
Lynchburg. Las plantas se dejaron secar durante 2 semanas a 70°F antes de medir el peso
(**p<0,01, *p<0,05). Las mediciones se registraron el 17/06/2013. Diez pares de plantas
fueron excavadas por completo; las raíces se lavaron y se dejaron secar, y luego se separó y
etiquetó la parte aérea. Se tomaron pesos frescos dentro de las 8 horas y las plantas se
secaron a 28°C durante dos semanas. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba
T de Student pareada (**p<0,01, *p<0,05). Figura 2.9 Cosecha de mitad de temporada del
segundo año de la parcela 2 de Walden Farm. Se cosecharon diez pares de plantas de
switchgrass el 28/06/2013. Diez pares de plantas fueron excavadas por completo; las raíces
se lavaron y se dejaron secar, y luego se separó y etiquetó la parte aérea. Se tomaron pesos
frescos dentro de las 8 horas y las plantas se secaron a 28°C durante dos semanas. El
análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student (**p<0,01, *p<0,05).

Figuras y Tablas

Figura 2.10
Walden Farm, parcela 1, cosecha de fin de temporada del segundo año. Se cosecharon
14 pares de plantas de switchgrass el 04/12/2013. Las plantas fueron excavadas por
completo; las raíces se lavaron y se dejaron secar, y luego se separó y etiquetó la parte aérea.
Los pesos secos se registraron después de que las plantas se secaron durante dos semanas.
El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student (***p<0,001). Se cosecharon
12 pares de plantas de switchgrass el 04/12/2013. Las plantas fueron excavadas por
completo; las raíces se lavaron y se dejaron secar, y luego se separó y etiquetó la parte aérea.
Los pesos secos se registraron después de que las plantas se secaron durante dos semanas.
El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student (***p<0,001). 16 Mediciones
de tasas de fotosíntesis. Experimento A, n=10, plantas de 3 meses, sembradas en macetas
con suelo de campo en un invernadero: Experimento B, n=10, plantas de 3 meses, sembradas
en suelo de primera calidad USDA: Experimento C, n=10, 5 meses plantas viejas, sembradas
en suelo de primera calidad del USDA: Experimento D, n=20, plantas de 3 meses de edad,
sembradas en suelo de primera calidad del USDA. Los experimentos se realizaron con el
estudiante graduado Bingxue Wang.

Abstracto
Los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los endófitos
bacterianos promotores del crecimiento y sus plantas huésped durante la colonización y el
crecimiento temprano no se conocen bien. Para identificar los determinantes moleculares de
estas interacciones, responde cv. Álamo y cv no responde.
 TRADUCCIÓN 39

Cave-in-Rock se inoculó con la cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans y se

determinaron las respuestas específicas del genotipo. El perfil de expresión génica global
comparativa se realizó mediante el uso de microarrays EST en colaboración con Genomics
Core Facility en la Fundación Noble. Se seleccionaron aproximadamente 50 genes en base a
las aparentes diferencias en los niveles de expresión entre estos dos genotipos. Uno de los
genes clave, un miembro de la clase tau de la glutatión S-transferasa (GST), una enzima que
se sabe que está involucrada en las respuestas al estrés en las plantas, fue seleccionado
para estudios funcionales utilizando técnicas de sobreexpresión y eliminación/desactivación
de ARNi. La línea 26 de sobreexpresión de GST había estimulado significativamente el
crecimiento un mes después de la bacterización con PsJN (p<0,01) en comparación con los
controles de la línea 26 o los controles p1300S que también se habían bactericido. Todas las
líneas GST RNAi exhibieron una promoción de crecimiento reducida en comparación con los
controles.

Juntos, estos resultados indican que la enzima GST probablemente esté involucrada en
la colonización temprana y la promoción del crecimiento en cv. Álamo.

Introducción
Los endófitos bacterianos residen en los tejidos vegetales durante todo o parte de su
ciclo de vida y no causan daño aparente (Wilson, 1995). Estos diminutos organismos están
muy extendidos ya que se estima que cada especie de planta tiene al menos un endófito
asociado (Strobel et al., 2004), y son diversos, perteneciendo a múltiples clases de bacterias
(Rosenblueth y Martinez-Romero, 2006).

Además, una sola especie de planta puede albergar una variedad de endófitos. Por
ejemplo, se demostró, a través de estudios basados en cultivos, que los tejidos de plantas de
trigo sobre el suelo estaban ocupados por 88 especies bacterianas que representan 37
géneros. La investigación ha revelado que las interacciones entre la planta huésped y sus
endófitos son diversas y multifacéticas, a menudo.

Funcionalmente, las GST son una clase antigua de proteínas catalíticas y de unión, a
menudo asociadas con la tolerancia al estrés e inducidas por una amplia variedad de
estreses bióticos y abióticos. Los GST también tienen la capacidad de desintoxicar
herbicidas, contaminantes y toxinas, a menudo en concierto con la reacción de estrés de la
planta (revisado por Frova, 2003) al catalizar la adición nucleófila de glutatión (GSH) a una
variedad de moléculas, orientándolas así hacia las vacuolas. para la destrucción (Armstrong,
1997). Las glutatión-S-transferasas (GST) vegetales también están involucradas en la
señalización inducida por el estrés, y su expresión génica puede ser sensible al estrés (Loyall
et al., 2000). En las plantas, hay seis clases distintas reconocidas (phi, tau, theta, zeta,
lambda y dehidroascorbato reductasa), muchas similares a las que se encuentran en otros
 TRADUCCIÓN 40

organismos, y dos, phi y tau, se encuentran solo en las plantas (Dixon et al. , 2002). Los
genes de diferentes isoformas de la familia tau GST también pueden expresarse de manera
constituyente o inducirse solo en respuesta al estrés (Lo Piero et al., 2009). Si bien la mayoría
de las GST de plantas pertenecen a las clases tau y phi, la identidad de secuencia puede ser
inferior al 50 % dentro de una clase y, sorprendentemente, inferior al 25 % entre clases, a
pesar del reconocimiento de que la estructura de la proteína se conserva (Dixon et al., 2002).
Las GST más comunes en las plantas son citosólicas y pueden representar hasta el 2% de las
proteínas solubles (Scalla y Rulet, 2002). Genéticamente, se ha demostrado que las GST de
las plantas aumentan en respuesta a los factores de nodulación secretados por
Sinorhizobium meliloti (anteriormente Rhizobium meliloti) durante la colonización de la
leguminosa Medicago truncatula (Ramu et al., 2002).

Las complejas interacciones entre un endófito y su huésped pueden ser muy específicas,
incluso a nivel del genotipo del huésped. La especificidad del genotipo se ha documentado en
las interacciones entre la cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans y diferentes genotipos de
patata (Conn et al., 1997; Frommel et al., 1993), tomate y pasto varilla. En

Materiales y métodos

Preparación de material vegetal y bacterización de PsJN

Semillas de Switchgrass (Panicum virgatum L.) de cvs. Alamo y Cave-in-Rock se
compraron a Warner Brothers Seed Co. (Lawton, OK). Las semillas se esterilizaron
superficialmente como se describió anteriormente y se germinaron durante 5 a 7 días en
papel de filtro estéril en placas de Petri a 25 °C. B.

Las cepas de fitofirmans PsJN y PsJN-GFP se obtuvieron de la Dra. Angela Sessitsch

(Instituto Austríaco de Tecnología, Seibersdorf, Austria). Los cultivos de PsJN se sembraron
en medio sólido King's B (KB) como se describe. El inóculo se produjo transfiriendo un asa de
bacterias de cultivos de 2 días a 5 ml de caldo KB en un tubo de cultivo de 15 ml, seguido de
incubación a 28 °C en un agitador (220 rpm) durante la noche. Se añadieron cinco ml del
cultivo de toda la noche a 45 ml de caldo KB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se
cultivaron hasta una DO 600 de alrededor de 0,7.

A continuación, las células bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 3.500

rpm durante 7 minutos a 4 °C y se resuspendieron en tampón PBS (NaH 2 PO 4 10 mM que
contenía NaCl al 0,8 %, pH 6,5) y se ajustó la DO 600 a 0,5 (aprox. 10 8 ufc). ). Las semillas
germinadas se bactericieron como se describió anteriormente y se transfirieron a
contenedores GA-7 Magenta con sales basales de Murashige y Skoog más vitimans (MS + V)
 TRADUCCIÓN 41

(M519, Phytotech Labs, Shawnee Mission, KS) con 3% de maltosa (RPI Inc.) y Phytagel al
0,3% (Phytotech labs) pH 5,8. Las plántulas se cultivaron en contenedores GA-7 Magenta a 25
°C (fotoperíodo de 16 h, luz fluorescente a 67 µmol m-2 s-1).

aislamiento de ARN
Tanto las plántulas de Alamo como las de Cave-in-Rock se inocularon y cultivaron como
se describe anteriormente, y los tejidos se recolectaron a los 0,5, 2, 4 y 8 días con controles
inoculados con tampón PBS solo y recolectados a los 0 días. Se usaron tres réplicas
biológicas para cada punto de tiempo. Los tejidos se congelaron inmediatamente en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. El ARN total se extrajo utilizando el
minikit Qiagen RNeasy Plant siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA).

Análisis de micromatrices
El ARN purificado (500 ng) se amplificó y marcó utilizando el kit IVT Express (Affymetrix,
Santa Clara, CA). Los chips de micromatrices se hibridaron, lavaron y tiñeron siguiendo las
recomendaciones del fabricante. La normalización de datos se llevó a cabo utilizando el
promedio robusto de múltiples matrices (RMA) (Irizarry et al., 2003). El chip de microarrays
EST switchgrass de la plataforma Affymetrix fue desarrollado por BESC (el Centro de
Ciencias de Bioenergía del DOE, Zhang et al., 2013). Este chip contiene más de 100.000
conjuntos de sondas para genes putativos. Los genes expresados diferencialmente entre los
grupos de muestra se seleccionaron mediante el análisis asociativo descrito por Dozmorov y
Centola (2003) utilizando un valor de corte de expresión de 2 y un valor p corregido de
Bonferroni de 4,0659E-07, que se deriva de 0,05/N donde N es el número de sonda
establecida en el chip que para el chip switchgrass es 122,972. Para cada grupo de muestras,
las muestras tratadas se compararon con las muestras de control no tratadas para
seleccionar genes significativos. La relación generada al comparar el tratamiento inoculado
con PsJN con el control se sometió al Log2 de la relación y luego se trazó en el software
MapMan (Usadel et al., 2005) para la visualización de las rutas metabólicas. Además, se
utilizó PageMan (Usadel et al., 2006) para mostrar genes regulados hacia arriba y hacia abajo
significativos. La herramienta de diagrama de Venn generó el número de genes totales, o
genes únicos que estaban regulados hacia arriba o hacia abajo en las vías específicas en el
umbral de ± 1.0 del software MapMan. Las sondas de pasto varilla seleccionadas se
anotaron utilizando los identificadores de mapa "Oryza sativa, OSA_AFFY_150909"
descargados del sitio web de MapMan (mapman.gabipd.org).

verificación qPCR
 TRADUCCIÓN 42

El ARN se extrajo como se describe anteriormente después de la bacterición con PsJN a

los 0, 0,5, 2, 4 y 8 días y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Los cebadores de genes
específicos de GST se diseñaron utilizando la secuencia proporcionada por la Fundación
Noble (CCGN10868.b1 CCGN Panicum virgatum etiolated plantones) con el software Primer
3 (Untergrasser et al., 2012) (Tabla 3.1). El tratamiento con ADNasa se realizó con un kit libre
de ADN (Ambion; Foster City, CA). La síntesis de ADNc se realizó utilizando SuperScript III
(Invitrogen; Carlsbad, CA, EE. UU.) a partir de 1 µg de ARN total siguiendo el protocolo del
fabricante. El volumen final se ajustó 1:10 (cDNA:H 2 O) y se almacenó a -20 °C hasta su uso.
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se realizó con cebadores
específicos de genes (Tabla 3.1) con cantidades iguales de ADNc utilizando el método 2 -
ΔΔC T (Livak y Schmittgen, 2001). La expresión del gen de la ubiquitina se utilizó como
normalizador. La qPCR se realizó con un sistema de detección de PCR en tiempo real
multicolor Bio-Rad iQ ™ 5.

Generación de plantas transgénicas GST

Síntesis del gen GST

El gen GST descrito anteriormente fue sintetizado por GENEWIZ, Inc. (Plainfield, NJ, EE.
UU.) con los sitios de las enzimas Kpn I y Sal I diseñados en los terminales N y C,
respectivamente, para la clonación.

Sobreexpresión y creación de construcciones de ARNi

Para la sobreexpresión de GST, el gen sintetizado de 732 pb se insertó en el vector
pCAMBIA1300S (amablemente proporcionado por el Dr. Yinong Yang en la Universidad
Estatal de Pensilvania) con las enzimas Kpn I y Sal I. Tanto el vector pCAMBIA1300S como el
fragmento del gen GST en pUC57 se digirieron con KpnI y SalI, se extrajeron en gel usando un
kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Chatsworth, CA) y se ligaron con ligasa de ADN T4
(New England Biolabs, Ipswich, MA, UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las
construcciones ligadas se transformaron en células competentes de la cepa DH5α de
Escherichia coli mediante choque térmico (42 °C, 90 s), se sembraron en caldo Luria (LB)
más kanamicina (50 mg/l) más agar al 1,5 % para el crecimiento durante la noche a 37 °C. .
Las colonias se recogieron y se cultivaron durante la noche en LB más kanamicina (50 mg/L)
durante la noche a 37°C. Con el kit Quicklyse Miniprep (Qiagen, Chatsworth, CA), se aisló el
ADN del plásmido y se digirió con Kpn I y Sal I para confirmar la presencia del gen.

Para el desarrollo de construcciones de RNAi, los cebadores de RNAi se diseñaron

usando el mismo software que se describió anteriormente con el fragmento más largo que
 TRADUCCIÓN 43

tenía sitios de enzimas BamH I y Kpn I y el fragmento más corto contenía sitios de enzimas
BamH I y Sal I (Tabla 3.1). Después de lo cual, los fragmentos más largos y más cortos se
amplificaron por PCR con los cebadores anteriores, respectivamente. Luego, el fragmento
más corto se clonó en el plásmido p1300S con las enzimas BamH I y Sal I, seguido de la
clonación del fragmento más largo en p1300S más el fragmento más corto con las enzimas
BamHI y Kpn I.

Tanto la construcción de sobreexpresión como las construcciones de ARNi se

transformaron luego en la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens utilizando el método
de congelación-descongelación. Brevemente, se añadió 1 µg de cada uno de los plásmidos
de ADN a células EHA105 competentes descongeladas, la mezcla se colocó en hielo durante
5 min, seguido de nitrógeno líquido durante 5 min y 37 °C durante 5 min, y luego se añadieron
700 ul de LB. se añadió y la mezcla se incubó a 28°C durante 2-4 horas para su recuperación.
A continuación, la solución se centrifugó a 7000 rpm durante 3 min para sedimentar,
resuspender y se sembró en placa sobre LB más kanamicina (50 mg/l) y se cultivó a 28 °C
durante 2-3 días. A continuación, se eligieron las colonias, se colocaron en 5 ml de KB más
50 mg/l de kanamicina y se cultivaron durante la noche a 28ºC mientras se agitaban a 220
rpm. Los plásmidos se aislaron como se describe anteriormente y se digirieron con las
enzimas apropiadas para confirmar las inserciones.

Secuenciación para confirmar la presencia de genes GST

Los genes se secuenciaron para confirmar que el gen correcto estaba presente usando
GenomeLab ™ Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start Kit siguiendo el protocolo de
los fabricantes en un sistema de análisis genético Beckman Coulter CEQ ™ 8800 (Brea, CA).
Se utilizaron aproximadamente 30 ng de plantilla de ADN para la reacción de secuenciación.

Inducción y mantenimiento de callos

Las semillas de switchgrass se esterilizaron superficialmente mediante tratamiento con
etanol al 70 % durante 2 min, se enjuagaron 3 veces con agua destilada, se descascararon
durante 30 min con H2SO4 al 60 % con agitación, se lavaron 3 veces con agua destilada, se
esterilizaron con hipoclorito de sodio 0,4 M (50 % solución de lejía comercial que contiene
hipoclorito de sodio al 6 %) que contiene Triton 100 al 0,1 % durante 30 min, seguido de
enjuague 5X con agua destilada estéril (ddH2O). Las semillas esterilizadas superficialmente
se colocaron en un medio de inducción de callos (4,43 g/L MS +V (Phytotech Labs# M519,
Shawnee Mission, KS), 45 µM 2,4-D, 5 µM BA, 30 g/L maltosa, 3 g /L Phytagel ® ) durante un
mes. A continuación, se eligieron los callos con formación de tejido embriogénico y se
colocaron en medios de mantenimiento de callos (igual que el medio de inducción excepto
por 2,4-D 22,5 µM) y se subcultivaron mensualmente en condiciones de oscuridad.
 TRADUCCIÓN 44

Transformación de switchgrass utilizando el método mediado por

agrobacterium
Las células de la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens que contenían la
sobreexpresión o la construcción de ARNi se sembraron como se describe anteriormente y
se incubaron a 28ºC durante 48 horas. A continuación, se recogieron colonias frescas y se
inocularon en 5 ml de medio LB más 50 mg/l de kanamicina y se agitaron a 220 rpm durante
la noche. Al día siguiente, se añadieron 5 ml del cultivo de toda la noche a 45 ml de medio LB
en un matraz estéril, se incubó a 28 °C y se agitó a 220 rpm, hasta que se alcanzó una DO 600
de 0,5 a 0,7. A continuación, las células se sedimentaron mediante centrifugación a 4 °C,
3000 rpm, durante 15 min. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en
aproximadamente 20 ml de medio de suspensión (4,43 g/l de MS+V, 30 g/l de maltosa, pH
5,5 que contenía acetosiringona 100 µM) en tubos estériles de 50 ml.

Pasto varilla embriogénico de crecimiento reciente cv. Se añadieron callos de álamo y se

agitaron suavemente durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, los callos se secaron
en toallas de papel estériles para eliminar el exceso de bacterias y se colocaron en medio de
cocultivo (4,43 g MS+V, 30 g de maltosa, 22,5 µM 2,4D, 5 µM BA, 100 µM acetosiringona, 3
g/L Phytagel ® , pH 5,5) durante 5-7 días. Los callos cocultivados luego se lavaron en ddH2O
estéril y se transfirieron al medio de selección (igual que el medio de inducción con la adición
de 300 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de higromicina) durante un mes. A continuación, los
callos resistentes a la higromicina se transfirieron a un medio de regeneración. Las plántulas
se transfirieron a un medio líquido de multiplicación de brotes para su propagación. El vector
pCambia1300S vacío también se transformó en cv. Alamo, y se usó como control en
experimentos de sobreexpresión y ARNi. Los eventos de transformación individuales se
etiquetaron y luego se usaron para determinar la expresión relativa.

Análisis de expresión génica GST de plantas transgénicas con qPCR

El ARN se extrajo como se describe anteriormente y se almacenó a -80 °C hasta su uso y
se realizó qPCR como se describe anteriormente.

Respuesta de líneas transgénicas a la bacterización con PsJN

Promoción del crecimiento

Después de la confirmación de los niveles de expresión relativos, se eligieron líneas
transgénicas para experimentos de promoción del crecimiento de PsJN. La bacterizacion con
PsJN se realizo como se describio anteriormente, y se eligieron de treinta a sesenta plantulas
 TRADUCCIÓN 45

uniformes de ambas lineas transgenicas de ARNi y sobreexpresion.

Las plántulas se recortaron a aproximadamente 2,5 cm de longitud y se sumergieron en

el tampón PsJN o PBS solo durante un minuto, se secaron con una toalla de papel estéril y se
colocaron en medio de crecimiento de pasto varilla en recipientes GA7 Magenta (Sigma-
Aldrich) que contenían 50 ml. de medio (4,43 g/L MS +V, 30 g/L de maltosa y 3 g/L de fitogel,
pH 5,8), con 5 plántulas por recipiente, y cultivadas durante un mes en la incubadora como
antes. Luego se determinaron las longitudes de raíces y brotes y los pesos frescos de las
plántulas.

ensayo GST
Tanto el ARNi transgénico bactericido (PsJN) como el tratado con tampón (CK) y las
líneas de sobreexpresión se analizaron para determinar la actividad de GST en los días 0, 2 y
7 después del tratamiento utilizando el kit de ensayo de actividad colorimétrica GST (KT-204,
Kamiya Biomedical Company, Seattle, EE. WA, EE. UU.). Los tejidos se trituraron con un motor
y una maja con 2 ml de tampón GST por gramo de tejido. A continuación, las muestras se
centrifugaron a 10 000 g, 4 °C durante 15 min, y el sobrenadante se retiró y se colocó en un
tubo nuevo. El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos por duplicado, según el protocolo
del fabricante. La absorbancia se midió a 340 nm a los 0, 5, 10, 15 y 20 minutos después del
inicio de la reacción. Se trazaron los valores de absorbancia y se determinó la pendiente
(velocidad) para la parte lineal de la curva (ΔA340). La actividad de GST se calculó utilizando
el coeficiente de extinción de GS-DNB a 340 nm 0,0096 µM-1 cm-1. Este valor ha sido
ajustado para la longitud del camino de la solución del pozo (0,262 cm) con un volumen de
0,1 mL). La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad
usando BSA como estándar.

Resultados

Expresión de GST: datos de microarrays

Para identificar cambios importantes en la expresión génica durante la colonización y la
promoción del crecimiento temprano, se eligieron dos cultivares de switchgrass, Alamo
sensible y Cave-in-Rock no sensible, para comparaciones de perfiles de expresión génica
global basadas en resultados anteriores con la cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans. Se
tomaron muestras a los 0 (control), 0,5, 2, 4 y 8 días después de la inoculación de PsJN, y se
realizó un análisis de expresión génica global en Genomics Core Facility en Noble Foundation
utilizando microarrays EST. A partir de los datos de la micromatriz, se eligieron inicialmente
aproximadamente 50 genes que mostraban diferencias aparentes en los niveles de expresión
 TRADUCCIÓN 46

entre Alamo inoculado con PsJN y Cave-in-Rock. Entre estos genes, se seleccionó la
glutatión S-transferasa (GST) para realizar más estudios funcionales utilizando técnicas de
sobreexpresión y eliminación/desactivación de ARNi (Figura 3.1). Estos datos indican que la
expresión de GST está regulada al alza en el cv. Alamo a los 0,5 días y continuó aumentando
en los niveles de expresión a los 2 y 4 días, y permaneció alto a los 8 días después de la
bacterición. En contraste, la expresión de GST en switchgrass cv. Cave-in-Rock no se reguló
después de la bacterición con PsJN. A continuación, se exploró el gen GST utilizando la
alineación Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) que reveló la coincidencia más cercana con
la proteína GST en el maíz (Zea mays) de la subfamilia tau, específica de las plantas (Figura
3.2a y b), y se diseñaron cebadores para estudios posteriores (Tabla 3.1).

Confirmación por PCR en tiempo real de la expresión del gen GST

Dado que los datos del microarray indicaron cv. La expresión de Alamo GST aumenta en
respuesta a la bacterición, este patrón de expresión génica se verificó mediante PCR
cuantitativa (qPCR) (Figura 3.3). Los patrones de transcripción relativa de qPCR fueron
similares a los datos de microarray informados. Las diferencias más grandes observadas
entre Cave-in-Rock y Alamo fueron inmediatamente posteriores a la bacterición y luego, en un
nivel menor, en el día 8.

Plantas transgénicas GST Sobreexpresión y generación transgénica

de RNAi
Para estudiar el papel de GST durante la promoción del crecimiento por PsJN, se crearon
construcciones de ARNi y sobreexpresión del gen GST para la transformación de switchgrass
(Figura 3.4). Ambas construcciones (Figura 3.5 y 3.6) se usaron para transformar
switchgrass cv. Se generaron callos embriogénicos de Álamo y plantas transgénicas.

Análisis qPCR de líneas transgénicas

Se generaron un total de 3 líneas transgénicas de ARNi y 8 líneas de sobreexpresión, y se
realizó qPCR para determinar los niveles de expresión génica en relación con las plantas de
control, que se transformaron solo con el vector p1300S. Todas las plantas transgénicas GST
RNAi (Figura 3.7) tenían niveles de expresión más bajos en comparación con las plantas de
control en aproximadamente el 20 % de los niveles de las plantas de control. Las líneas de
sobreexpresión de GST exhibieron más variación (Figura 3.8) con las líneas #33 y #26
mostrando los niveles de expresión más altos (9.1 y 8.7 veces respectivamente); líneas #7,
17 y 29, niveles de expresión intermedios, que oscilan entre niveles de expresión de 5 a 2,8
veces; y las líneas #9, 6 y 36 que exhiben solo 1.3 a 2 niveles relativos de expresión de GST,
 TRADUCCIÓN 47

en comparación con las plantas de control. líneas y líneas de plantas transformadas con un
vector p1300S vacío. En general, las tendencias son similares a los datos de expresión
génica encontrados en el análisis de microarrays y qPCR. El primer punto de tiempo en el día
dos fue más bajo en general que el siguiente punto de tiempo en el día 7 después de la
bacterición. Finalmente, el último punto de tiempo medido en el día 14 fue similar al día 7, lo
que indica que la actividad se había estabilizado. Curiosamente, la actividad de la enzima
GST en las líneas RNAi #2 y 3 fue mayor que las plantas transgénicas de control p1300S y
las plantas con sobreexpresión, que fueron similares al control.

Actividad de la enzima GST de plantas transgénicas después de ser

desafiadas con PsJN

Experimentos de crecimiento de plantas transgénicas después del

desafío con PsJN
Los experimentos iniciales se realizaron con un grupo de plantas de las líneas de
sobreexpresión combinadas. Los datos de biomasa (Figura 3.10) indicaron que el grupo no
mostró diferencias en las tendencias de crecimiento en comparación con las plantas
inoculadas con tampón o las plantas transgénicas de control p1300S. Sin embargo, cuando
se midieron las longitudes de los brotes y las raíces, las longitudes de los brotes de las
plantas con sobreexpresión de GST fueron significativamente más largas en comparación
con los controles (Figura 3.11). Para explorar más a fondo estas diferencias, se llevaron a
cabo estudios de bacterición con PsJN con clones de líneas de plantas transgénicas tanto
con RNAi como con sobreexpresión. Los resultados de las líneas de sobreexpresión de GST
con bacterización fueron algo diferentes (Figura 3.13),

con todas las líneas probadas excepto una mostrando un mayor crecimiento en
comparación con el control en las mismas líneas transgénicas. Las plantas de la línea 26
crecieron significativamente más que p1300S después de la inoculación con PsJN.

Discusión
Las GST de clase Tau, una de las GST específicas de plantas más prominentes, juegan
un papel importante en las respuestas de estrés a una variedad de desafíos tanto endógenos
como exógenos, incluido el ataque de patógenos, heridas y estrés oxidativo y de temperatura
(revisado en Frova, 2003). La clase de enzimas en general responde a diversos desafíos
bióticos y abióticos, y existe una característica común importante, la generación de especies
de oxígeno activo (Revisado en Marrs, 1996). Esto está respaldado por los hallazgos de que
 TRADUCCIÓN 48

las GST de las plantas también tienen actividad de peroxidasa dependiente de GSH, están
ampliamente distribuidas entre las plantas y se encuentran en cada tejido examinado y en
cada etapa del desarrollo de la planta (Cummings et al., 1999). Durante la colonización
endófita de la planta huésped, se ha demostrado que algunas de estas mismas vías están
involucradas en la colonización exitosa y/o el reconocimiento de patógenos (Ramu et al.,
2002). Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la expresión de GST en las
plantas aún se desconocen en gran medida (revisado en Frova, 2003). Debido a estos
factores, el gen GST que se demostró que estaba regulado al alza en el pasto varilla cv. Se
seleccionó Álamo durante la colonización y durante las primeras etapas de la promoción del
crecimiento para una mayor caracterización. Con base en las alineaciones (Figura 3.2b), la
enzima tau GST parece ser una enzima dimérica donde el dominio N-terminal de una
subunidad es adyacente al dominio N-terminal de su pareja, y los dímeros de clase tau son
hidrofílicos (Armstrong, 1997).

Nuestros resultados del análisis de micromatrices indicaron que, en switchgrass cv.

Álamo, la expresión del gen GST posterior a la bacterición con PsJN aumenta los días 0,5, 2 y
4 y luego disminuye ligeramente el día 8 en comparación con cv. Cave-in-Rock, que no mostró
respuesta en la expresión génica (Figura 3.1).

Los datos de la PCR en tiempo real fueron similares a los hallazgos de los microarrays
(Figura 3.3). Juntos, este informe indica que GST puede estar involucrado en la colonización
exitosa y la promoción del crecimiento temprano de una manera específica de genotipo en
switchgrass cv. Álamo en comparación con el cv. Cueva-en-Roca. Cuando se crearon plantas
transgénicas que sobreexpresaban (Figura 3.8) y disminuían la expresión (Figura 3.7) y
posteriormente se bacterizaron con PsJN, se observó un rango de actividad de GST tanto en
la sobreexpresión como en las líneas de ARNi, lo que indica que las plantas pueden estar
compensando cualquiera de los cambios en la expresión génica. ya que los cambios
artificiales en la expresión génica pueden provocar efectos secundarios pronunciados en el
genoma (Teng et al., 2013). Para probar si la sobreexpresión o las líneas transgénicas de
ARNi mostraban cambios en la promoción del crecimiento mediante la bacterición con PsJN,
las tres líneas transgénicas de ARNi y las cuatro líneas de sobreexpresión se bacterizaron, se
cultivaron durante un mes y se determinó el peso fresco (Figura 3.12 y 3.13,
respectivamente). Las plantas transformadas con un vector vacío también se probaron con
PsJN y demostraron las respuestas normales de promoción del crecimiento que se observan
típicamente con la bacterización con PsJN. Las líneas de ARNi generalmente demostraron
pérdida de capacidad en la promoción del crecimiento por parte de PsJN en comparación
con las plantas transgénicas p1300S de control. Las dos líneas de sobreexpresión con los
niveles más altos de expresión (n.º 33 y n.º 26) se desempeñaron de manera similar o
superaron a los controles, respectivamente. La línea 26 fue significativamente más grande
después de la bacterización con PsJN (p<0,01) en comparación con los controles de la línea
26 o los controles p1300S que también se habían bactericido.
 TRADUCCIÓN 49

Gran parte de los aumentos que impulsaron estas diferencias se debieron al crecimiento
de las raíces. Sin embargo, las líneas de sobreexpresión con niveles moderados de
sobreexpresión (#7 y #29) mostraron una disminución en la respuesta en comparación con
las plantas transgénicas p1300S de control. Juntos, este informe demuestra que la glutatión-
S-transferasa de la clase tau puede tener un efecto genotípico en la colonización temprana y
la promoción del crecimiento observada entre los cultivares de pasto varilla Alamo y Cave-in-
Rock. Se necesita más trabajo para aclarar estas observaciones. Estadísticamente
significativo (p<0,05)

Figuras y Tablas

Introducción
Si bien la Revolución Verde produjo aumentos significativos en la producción de plantas
en los últimos cincuenta años, basados en avances en el mejoramiento de cultivos para
sistemas de producción de altos insumos, se prestó poca atención al impacto del uso
excesivo de fertilizantes e irrigación en el medio ambiente (Rejesus y Hornbaker, 1999). Se
estima que entre el cincuenta y el sesenta por ciento de la aplicación de fertilizante
nitrogenado sintético en la superficie del suelo no es utilizada por las plantas objetivo, lo que
contamina el ecosistema circundante a través de la escorrentía superficial y la erosión en los
arroyos, lo que provoca zonas muertas eutróficas (Tonitto et al., 2006; Rejesus y Hornbaker,
1999) y a través de la desnitrificación, que contribuye a los efectos invernadero (Tilman et al.,
2002). Las plantas utilizan varias formas diferentes de nitrógeno, incluido el nitrato (NO 3 ), el
amonio (NH 4 ) y el nitrógeno orgánico (C-NH 2 ), pero no pueden romper el fuerte enlace
triple del N 2 atmosférico. De los aproximadamente 170 Tg (teragramos) de nitrógeno total
de las tierras agrícolas que se utilizan cada año, solo alrededor de 40 Tg provienen de la
fijación biológica de nitrógeno (FBN); el resto viene producido sintéticamente por el proceso
Haber-Bosch (revisado en Fields, 2004), minería de minerales (Erickson, 1983) y minería de
guano (Clark y Foster, 2009). Además, los precios de los fertilizantes nitrogenados están
vinculados a los precios de los productos básicos que probablemente provocaron un fuerte
aumento de los precios en 2007 (FAO, 2009) y el guano, que es muy apreciado en el mercado
de fertilizantes orgánicos, ha visto duplicarse recientemente los precios y es probable que los
suministros se reduzcan. agotarse en las próximas dos décadas (Clark y Foster, 2009). Cada
vez es más claro que las futuras prácticas agrícolas sostenibles deben reducir el uso de
fertilizantes nitrogenados sintéticos (Donner y Kucharik, 2008; Weekley et al, 2012) y
desarrollar sistemas de cultivo que integren mejor la fijación biológica de nitrógeno (BNF), el
principal proveedor de nitrógeno. en el ecosistema natural del mundo, debería ser un objetivo
principal (Roesch et al., 2008).
 TRADUCCIÓN 50

Los procariotas son los únicos organismos que pueden fijar el nitrógeno atmosférico
(Markmann, 2009) y ponerlo a disposición de las plantas y pueden ser simbióticos, de vida
libre o asociativos, formando asociaciones casuales con las plantas (revisado en Welbaum et
al., 2004). ). Las bacterias fijadoras de nitrógeno endófitas asociativas, que residen en los
tejidos internos de las plantas, pueden mejorar el crecimiento de las plantas mediante el
suministro de cantidades pequeñas pero adecuadas de nitrógeno fijado directamente a la
planta (revisado en Welbaum et al., 2004). Mientras que las bacterias que forman nódulos en
una relación simbiótica con las plantas son las asociaciones fijadoras de nitrógeno más
estudiadas, el estudio de los endófitos fijadores de nitrógeno asociativos continúa cobrando
impulso (Riggs et al., 2002). Las bacterias fijadoras de nitrógeno también viven en asociación
con plantas en la rizósfera, donde intercambian nitrógeno fijado por compuestos de carbono
en los exudados de las raíces (revisado en Cocking, 2003).

Las nitrogenasas, las enzimas utilizadas por los procariotas para convertir el N 2
atmosférico en NH 3 , que pueden utilizar las plantas, son metaloenzimas complejas con
características estructurales y mecánicas altamente conservadas (revisadas en . La enzima
contiene dos componentes; el componente más pequeño, codificado por el El gen nifH,
conocido como proteína Fe, es un dímero y un donante de electrones dependiente de ATP, y
el componente más grande, codificado por nifDK, conocido como proteína MoFe, es un
heterotetrámero que contiene el sitio catalítico de la enzima (revisado por . Las secuencias
del operón de la enzima nitrogenasa están ubicadas en un grupo nif conservado e incluyen
más de 50 genes involucrados en su expresión, biosíntesis, maduración y ensamblaje
(Menard et al., 2007).

La nitrogenasa está limitada por varias limitaciones fisiológicas importantes. Primero, la

proteína Fe, una de las dos subunidades que forman la enzima nitrogenasa, es
desnaturalizada por el oxígeno (Thornely, 1985); sin embargo, los endófitos han desarrollado
compuestos como los triterpenos, involucrados en la protección de la nitrogenasa de la
oxidación en un estado libre. estado de vida (Santhi et al., 2012). En segundo lugar, la enzima
nitrogenasa tiene una tasa de renovación relativamente lenta (Thornely, 1985), lo que
requiere que las bacterias sinteticen grandes cantidades, que comprenden hasta el veinte por
ciento de la proteína total en la célula (revisado en ). requiere 16ATP, lo que la convierte en
una de las reacciones con mayor demanda de energía identificadas en organismos
bacterianos (Thornely, 1985).Todo combinado, la cantidad de proteína requerida para formar
un complejo enzimático activo, su protección contra el oxígeno y el alto requerimiento de
energía para impulsar el nitrógeno fijacin colocan una gran carga sobre las bacterias
fijadoras de nitrgeno.Por lo tanto, la sntesis y la subsecuente activacin de la enzima
nitrogenasa est estrictamente regulada a nivel gentico (revisado en Raymond et al., 2004).Si
bien la nitrogenasa es sensible al oxgeno, el oxgeno es requerido para La producción de ATP,
por lo tanto, la concentración intercelular de O2 está regulada por la respiración mitocondrial
y la protección conformacional de la enzima nitrogenasa debido a la ubicación de la
 TRADUCCIÓN 51

nitrogenasa dentro de la membrana celular (Gausch et al., 2001).

Para beneficiarse de los endófitos capaces de la fijación biológica de nitrógeno (BNF), se

pueden emplear varias estrategias para asegurar la presencia de BNF en la planta, y cuando
se combinan con programas de mejoramiento que enfatizan BNF, juntos pueden aumentar la
sostenibilidad de la agricultura al reducir la dependencia del N sintético. fertilizante. En este
estudio se exploran dos estrategias en particular:

1) transmisión vertical de endófitos BNF de vida libre a través de las semillas, y 2)

intercambio de genes implicados en BNF con otros endófitos bacterianos a través de la
transferencia horizontal de genes. (Cankar et al., 2005), eucalipto (Ferreira et al., 2008),
tabaco (Mastretta et al., 2009) y arroz (Mukhopadhyay et al., 1996). Taxones bacterianos
como Bacillus, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas, Cytophaga, Leuconostoc,
Micrococcus y Xanthomonas fueron aislados de semillas esterilizadas superficialmente de
una variedad de plantas en estudios anteriores (Mundt and Hinkle, 1976; Bacon and Hinton,
1996). En semillas de picea de Noruega, se aislaron Pseudomonas y Rahnella (Cankar et al.,
2005). Los géneros bacterianos aislados de las semillas de pícea de Noruega y eucalipto
diferían, lo que indica que diversas poblaciones bacterianas pueden habitar semillas de
diferentes especies (Cankar et al., 2005). Estas interacciones probablemente sean complejas
y variadas, y el papel de los endófitos en las semillas puede ser controvertido (Hallmann et
al., 1997).

El primer paso para comprender la transferencia vertical, particularmente con endófitos

que pueden ocupar el tejido embrionario interno de la semilla, es estudiar los mecanismos de
establecimiento de la población de semillas. Gran parte del trabajo relacionado con esta
cuestión se ha centrado en los microorganismos patógenos de plantas y humanos que se
transfieren verticalmente a la descendencia de la planta huésped.

Además, varios factores complican esta comprensión, incluido el bajo porcentaje de

bacterias cultivables en general, el hallazgo de que algunos patógenos transmitidos
verticalmente pueden permanecer asintomáticos durante todo el ciclo de vida de los
huéspedes (Darrasse et al., 2007), el bajo número de microorganismos que se encuentran a
menudo en semilla (Lemaire et al., 2011), y eficiencia inconsistente o imperfecta de
transmisión vertical (Mundt y Hinkle, 1976). Sin embargo, si la investigación revela los
mecanismos esenciales de la transferencia vertical, ya sea con microorganismos patógenos
o beneficiosos, puede ser posible seleccionar organismos que brinden ventajas consistentes,
incluida la promoción directa del crecimiento, la resistencia al estrés y el control biológico.

Aunque poco trabajo hasta la fecha se ha centrado en la transmisión vertical, se ha

demostrado que las bacterias endófitas aisladas de semillas de pícea de Noruega
recolectadas en diferentes lugares ocupan los mismos géneros, lo que indica endófitos
 TRADUCCIÓN 52

establecidos y transmitidos verticalmente para esta especie in vivo (Cankar et al., 2003). ).
Estas observaciones son consistentes con los hallazgos de las interacciones endófito-
huésped en general, ya que debido al metabolismo secundario y la morfología específicos,
las bacterias muestran un cierto grado de especificidad para cada especie de planta, incluso
diferentes genotipos dentro de la misma especie (Berg y Smalla, 2009). En un estudio más
amplio, el 15 % de las semillas esterilizadas superficialmente de plantas herbáceas, incluidas
la okra, la papaya, el rábano, la calabaza, el maíz, la cebada, el centeno y el trigo, y el 16 % de
las semillas de plantas leñosas produjeron bacterias cultivables (Mundt y Hinkle, 1976).
También se identificaron bacterias en el 30-40% de semillas de maíz y guisantes (Samish et
al., 1963) y semillas de café (Vega et al., 2005).

Es importante destacar que la investigación ha demostrado que los endófitos

transmitidos verticalmente pueden permanecer en el suministro generación tras generación
(Bacon et al., 2001). Pantoea agglomerans, una bacteria endofítica asociada con el
suministro de beneficios a las plantas, aislada de semillas de eucalipto esterilizadas en la
superficie, se marcó con gfp, se inoculó en semillas y se volvió a aislar de las plántulas
(Ferreira et al., 2008). Cuando los endófitos se transmiten fielmente de padres a
descendientes, generalmente pueden estar bajo presión de selección para mantener e
incluso mejorar sus contribuciones a la promoción del crecimiento de las plantas y el control
biológico porque también dependen del rendimiento de su planta huésped (Darsonval et al.,
2008). Por extensión, las propiedades, incluido el control biológico, asociadas con
poblaciones endófitas fielmente transmitidas pueden mejorar con el tiempo cuando estas
poblaciones florecen (Struz y Matheson, 1996). Como resultado, los endófitos transmitidos
verticalmente pueden exhibir múltiples mecanismos de acción. Cuando se aislaron endófitos
de semillas de 12 cultivares de soja diferentes, el 18% de ellos fueron capaces de inhibir el
crecimiento de hongos patógenos, el 39%

fueron capaces de ayudar a adquirir fosfatos a través de la solubilización, y el 100%

pudieron producir IAA, una hormona promotora del crecimiento vegetal (Assumpcao et al.,
2009). Rahnella aquatilis fue aislada de semillas de Brassica napus y demostró la capacidad
de fijar nitrógeno atmosférico (Grane'r et al., 2003). Rahnella y Pseudomonas se aislaron de
semillas de pícea de Noruega esterilizadas en la superficie, y cada una se ha asociado con
actividades de promoción del crecimiento de las plantas y control biológico (Katarina et al.,
2005). Los tubérculos, otro recipiente potencial para la transmisión vertical, también albergan
bacterias beneficiosas, ya que se aislaron 11 endófitos diferentes de batatas traídas de la
tienda, y los mecanismos de promoción del crecimiento identificados incluyeron la
producción de BNF e IAA (Kahn y Doty, 2009). En tomate, aproximadamente el 20% de las
plántulas derivadas de las semillas de una planta madre que contiene endófitos fijadores de
nitrógeno fueron capaces de fijar nitrógeno atmosférico 2 meses después de la germinación
(Varga et al., 1994). Algunos casos de dependencia de las interacciones endófito-huésped
son extremos, como en las interacciones entre Psychotria leptophylla y su nódulo foliar
 TRADUCCIÓN 53

endosimbionte, donde la transferencia vertical es fundamental para el crecimiento adecuado

de la planta, con plántulas libres de endófito que dan como resultado un fenotipo enano
(Miller, 1990) . Estas plántulas libres de endófitos se desarrollaron normalmente hasta que
emergió el cuarto par de hojas y, en esa etapa, cesó la diferenciación y las puntas de los
brotes degeneraron en callos. Las plantas permanecieron en esta etapa durante varios años
hasta que perecieron (Miller, 1990).

También se han identificado semillas que albergan múltiples bacterias endófitas. Se

aislaron Bacillus, Enterococcus, Paenibacillus y Methylobacterium de semillas y plántulas de
10 especies de Eucalyptus y dos híbridos (Ferreira et al., 2008). Las semillas de picea de
Noruega contenían Pseudomonas y Rhanella sp. identificado por 16s rDNA (Cankar et al.,
2005). En estudios anteriores, el cinco por ciento de las semillas de papa contenían múltiples
bacterias cultivables (Hollis, 1951). Los endófitos transmitidos verticalmente pueden
finalmente ser capaces de entregar genes deseables a otros endófitos de la planta huésped o
viceversa, a través de la genómica lateral, una ocurrencia común en las poblaciones
microbianas y una perspectiva que se ha identificado en condiciones experimentales
(Taghavi et al., 2005).

Endófito bacteriano y condiciones de cultivo.

Se usaron dos tipos de cepas para experimentos de promoción del crecimiento y
transferencia horizontal de genes.

El primero estuvo compuesto por 2 cepas tipo y de referencia pertenecientes a la

especie Burkholderia;

Burkholderia phytofirmans cepa PsJN, una bacteria endofítica aislada de raíces de

cebolla por Jerzy Nowak Todos los cultivos se sembraron en medio sólido King's B (KB)
como se describe. El inóculo se produjo transfiriendo un asa de bacterias de cultivos de 2
días a 5 ml de caldo KB en un tubo de cultivo de 15 ml, seguido de incubación a 28 °C en un
agitador (220 rpm)

durante la noche. Se añadieron cinco ml del cultivo de toda la noche a 45 ml de caldo KB

en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se cultivaron hasta 0,7 OD600. A continuación, las
células bacterianas se recogieron mediante centrifugación a 3500 rpm durante 7 min. a 4 °C,
y se resuspendió en tampón PBS (NaH 2 PO 4 10 mM que contenía NaCl al 0,8 %, pH 6,5),
después de lo cual se ajustó la DO 600 con tampón PBS a 0,5 (aprox. 10 8 ufc), a menos que
se indique lo contrario .
 TRADUCCIÓN 54

Experimentos de mesa hidropónica sin nitrógeno

Las semillas recolectadas de Kentland Farm se estratificaron en frío húmedo para
romper la latencia colocándolas en tubos Falcon de 15 ml durante la noche a 5 ° C para
enfriar, luego cada tubo se llenó con H 2 O estéril y se colocó nuevamente a 5 ° C durante 24
horas. Luego se eliminó el agua con una pipeta y el tubo de 15 ml se colocó a 5°C durante 2
semanas. Luego se quitaron las tapas de los tubos de 15 ml y se dejaron secar durante 5
días. La superficie de las semillas se esterilizó mediante tratamiento con etanol al 70%
durante 2 min, se enjuagó. El cruce de población fue exitoso y las semillas se recolectaron
para su posterior análisis. Cien semillas F1 se estratificaron en húmedo/frío frío como se
describió anteriormente, y se realizó una prueba de germinación para determinar la viabilidad
de las semillas colocando 25 semillas en cada placa de Petri que contenía dos papeles de
filtro con 5 ml de H2O esterilizada durante 1 semana.

Análisis de poblaciones de endófitos de tejidos y semillas.

Aproximadamente dos gramos de tejidos recolectados de plantas F1 cultivadas a partir
de semillas esterilizadas en la superficie en medios libres de N durante 2 meses y plantas del
segundo experimento de mesa hidropónica se esterilizaron en la superficie como se
describió anteriormente. Las muestras de hojas y raíces se recolectaron, pesaron,
etiquetaron y colocaron en tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml. Las muestras se lavaron con
1 ml de hipoclorito de sodio al 1 % más Triton X-100 al 0,05 % durante 2 min. Las muestras
de tejido se lavaron dos veces con 1 ml de agua estéril y luego se sumergieron durante 1 min
en H 2 O 2 al 15 %. Las semillas de Switchgrass se esterilizaron superficialmente como se
describe anteriormente. Semillas esterilizadas superficialmente de P1

y F1 también se homogeneizaron en tubos estériles de 1,5 ml con 1 ml de H2O

esterilizada y se sembraron en placas en diluciones en serie junto con el lavado final como se
describe anteriormente en Norris Glucose Nitrogen Free Medium M712. El crecimiento en la
placa se volvió a sembrar dos veces para confirmar. Finalmente, la mejor colonia en
crecimiento se colocó en stock de glicerol para uso futuro y también se envió para su
identificación a MIDI LABS (Newark, DE).

Inoculación de plántulas y respuesta al crecimiento de las plantas

Las semillas esterilizadas superficialmente se germinaron en placas de Petri durante 7
días a 25 ˚C, bajo luz fluorescente blanca (67 µmol m-2s-1) con un fotoperíodo de 16 h
seguido de remojo en suspensión de PsJN durante 1 min. Las plántulas/semillas de control
se trataron con tampón PBS solo. Las plántulas/semillas tratadas se secaron con una toalla
de papel estéril, se colocaron en medios que consistían en medios libres de nitrógeno
 TRADUCCIÓN 55

Hoagland premezclados (bio-World.com, Dublin Ohio) 1,9 g/l, fitogel 3 g/l y sulfato de
amonio. a 10 -375 mg/L, pH 5,8 en recipientes GA7 Magenta (Sigma-Aldrich)

que contiene 50 ml de medio y 5 plántulas, y cultivadas durante un mes en la incubadora

como se indicó anteriormente.

Establecimiento de una curva de crecimiento de nitrógeno de

switchgrass cv. Álamo
Los experimentos iniciales demostraron que el pasto varilla cv. El crecimiento de Alamo
en medios de Hoagland libres de N sin adición de nitrógeno fue muy limitado,
independientemente de la inoculación bacteriana. Sin embargo, cuando se agregaron 200
mg/L de sulfato de amonio, el crecimiento del pasto varilla durante un mes fue igual al
producido con un medio que contenía el nitrógeno adecuado. Con el fin de determinar
cuándo el crecimiento del switchgrass es limitado y cómo el estrés por bajo nivel de
nitrógeno afecta el crecimiento de la planta, se desarrolló un experimento para evaluar el
crecimiento en un rango de niveles de nitrógeno. La prueba incluyó la medición de la
biomasa de raíces y brotes a los 1,5 meses en niveles de nitrógeno (mg/L) a 0, 10, 25, 50, 75,
100, 125, 250, 375 y 500 agregados a Nitrogen Free Media de Hoagland premezclado como
se describe anteriormente.

Resultados -Transferencia vertical

Experimentos de mesa hidropónica e identificación de bacterias.

Para determinar si las accesiones de semillas de pasto varilla albergan endófitos
fijadores de nitrógeno transmitidos verticalmente, en el otoño de 2009 se recolectaron
semillas de 168 accesiones de pasto varilla de tierras altas y bajas en la granja Kentland en
Virginia Tech y se examinaron para ver si crecían en medios libres de nitrógeno. Durante la
recolección, se calificó la altura de las plantas de cada accesión en una escala del uno al
diez, y se tomó en cuenta el número de macollos como una estimación de la producción
potencial de biomasa (Figura 4.1). las semillas de las 48 accesiones mejor calificadas se
estratificaron en frío húmedo para romper la latencia, se esterilizaron en la superficie y se
sembraron en vermiculita. Se construyó una mesa hidropónica para evaluar el crecimiento de
un gran número de plántulas de switchgrass en medios libres de N (Figura 4.2) (Figura 4.3).
Se seleccionaron las accesiones con mejor desempeño (073, 037, 066 y 070) y se recolectó
tejido para su análisis. Se trasplantaron cuatro plantas de cada accesión en macetas de 3
galones para un cruce de población. Los tejidos de hojas y raíces de cada accesión se
 TRADUCCIÓN 56

lavaron y se esterilizaron superficialmente como se describe, y el extracto se sembró en

placas en medio Norris Glucose N-free, sin que se formaran colonias.

Se llevó a cabo un segundo experimento de mesa hidropónica durante el cruce de

poblaciones descrito anteriormente para determinar la variación del crecimiento dentro de las
accesiones. Esto se hizo para determinar si los endófitos transmitidos verticalmente pueden
estar presentes solo en un pequeño número de plantas de la misma accesión. Sesenta
plantas de cada una de las accesiones 006, 009, 014, 013, 016 y 005 se cultivaron a partir de
semillas esterilizadas en la superficie durante 3 meses y se clasificaron por altura (Figura
4.4) y tasa de supervivencia (Figura 4.5). Las tres mejores plantas de crecimiento fueron
seleccionadas de cada accesión y replantadas juntas en macetas de un galón con cinco
plantas cada maceta, en vermiculita y se les permitió continuar creciendo para pantallas de
tejido vegetal para endófitos fijadores de nitrógeno. Después de 6 meses de crecimiento en
vermiculita y solo regado con medio libre de N de Hoagland de concentración media, se
recolectó el tejido, se esterilizó la superficie como se describe y se sembró en medio Norris
Glucose N-Free. No se produjeron colonias después de tres repeticiones. Se continuó
regando las plantas y seguían creciendo después de 1,5 años en vermiculita sin adición de
nitrógeno, lo que indica que las plantas pueden estar obteniendo nitrógeno de la atmósfera a
través de BNF, aunque las bacterias fijadoras de nitrógeno no se pudieron cultivar (Figura
4.6).

A continuación, se diseñó un experimento para determinar si las semillas F1 o las

plantas de pasto varilla cultivadas a partir de semillas F1 resultantes de un cruce de las
accesiones de mejor rendimiento en el primer experimento de mesa hidropónica libre de N
albergan endófitos fijadores de nitrógeno atmosférico. Las semillas F1 se esterilizaron en la
superficie, se germinaron en un entorno estéril como se describe y se plantaron en macetas
de un galón con vermiculita, se regaron con medio libre de N de Hoagland de concentración
media para el análisis de la presencia de endófitos fijadores de N. Después de 6 meses de
crecimiento, se recogió el tejido vegetal y se esterilizó la superficie como se describe.
Simultáneamente, las semillas F1 se esterilizaron superficialmente y se molieron con una
maja pequeña en tubos de 1,5 ml. El extracto de ambos se sembró en medios Norris Glucose
N-free. Después de 5 días de incubación, del tejido vegetal F1 resultaron 4 colonias de dos
morfologías. Estas colonias se volvieron a sembrar en placas separadas sin N, con solo una
morfología de colonia sobreviviendo a dos cultivos adicionales. La morfología de la colonia,
después de repetir el cultivo en placas en medios libres de N, se cultivó durante la noche en
medios KB, se colocó en stock de glicerol y se envió para su identificación (adjuntar
identificación). FAME Matches identificó a la bacteria como Sphingomonas herbicidavorans,
una especie con la capacidad común de fijar nitrógeno atmosférico. Luego, la bacteria se
probó para promover el crecimiento de las plantas en medios libres de N.
 TRADUCCIÓN 57

Experimentos de promoción del crecimiento del nivel de nitrógeno

de Switchgrass
La morfología y la biomasa de raíces y brotes de las plantas cambiaron en los rangos de
niveles de nitrógeno (Figura 4.7) con las raíces haciendo la transición obvia de rojo a verde
entre 100 mg/L y 125 mg/L, coincidiendo con el cambio en la biomasa mencionado
anteriormente. El peso de los brotes aumentó a lo largo de la curva, excepto entre 125 mg/L y
250 mg/L. El peso de la raíz aumentó de 0 mg/L a 100 mg/L y luego disminuyó de 100 mg/L
a 125 mg/L y permaneció casi igual de 125 mg/L a 500 mg/L (Figura 4.8). Además, aunque el
peso total de las plantas cultivadas en 100 mg/L no fue significativamente diferente en
comparación con 500 mg/L, la diferencia en la morfología de la planta fue clara ya que los
brotes eran mucho más altos en este último.

Promoción del crecimiento bajo un rango de niveles de nitrógeno

Para determinar los efectos de la bacterición del aislado de S. herbicidavorans (NSL) en
el crecimiento del pasto varilla (Figura 4.9), las plántulas se probaron en tres niveles de
nitrógeno; 10 mg/l, 75 mg/l y 375 mg/l. Los resultados de la prueba de 10 mg/L no
demostraron diferencias significativas entre los tratamientos, probablemente debido a la
duración de la prueba o porque la deficiencia de nitrógeno anula los efectos que
normalmente observan estas bacterias. NSL superó al control (CK) tanto en nitrógeno
deficiente (75 mg/L) como en niveles adecuados de nitrógeno (375 mg/L), lo que indica que
esta bacteria puede tener múltiples mecanismos de acción, una característica observada en
diazotrofos aislados de pastos por otros autores (Riggs et al. ., 2002). Se llevó a cabo una
segunda prueba, similar al primer experimento, donde se midió la biomasa de raíces, brotes y
total al mes con resultados similares (Figura 4.10). Se realizó una tercera prueba con pesos
totales registrados después de un mes con resultados similares (Figura 4.11).

Discusión -Transferencia vertical

Los microbios endófitos pueden habitar en varias partes de la planta, como la raíz, el
tallo y las hojas, y también se pueden encontrar en flores, frutos y semillas (Zakria et al.,
2008;Rodriguez et al., 2009;Compant et al., 2011;. Los microorganismos, incluyendo virus,
hongos y bacterias, pueden ser transmitidos a la semilla internamente por el xilema huésped
y posteriormente a través del hilio (Agarwal et al., 1987). Burkholderia fitofirminas cepa
PSJN, un endófito bacteriano beneficioso bien caracterizado, fue marcadas con proteína
verde fluorescente y visualizadas microscópicamente extendiéndose a través de tallos de vid,
pedicelos y bayas inmaduras a través de los vasos del xilema (Compant et al., 2007). Lo que
complica el asunto de determinar los mecanismos de transmisión vertical es el hecho de que
la mayoría de las bacterias no son cultivables en En general, y en el caso de los nódulos
 TRADUCCIÓN 58

bacterianos foliares, la pareja bacteriana no se pudo cultivar en absoluto, lo que sugiere que
los endosimbiontes pueden depender de su huésped para crecer (Lebard y Belin-Depoux,
2003).

Esta investigación destaca métodos potenciales para aislar y utilizar microorganismos

transferidos verticalmente como una aplicación externa alternativa de microorganismos
benéficos, ya que el inóculo aplicado externamente puede cambiar la composición del suelo
(Conn y Franco, 2004), o es incapaz de colonizar y promover el crecimiento de manera
efectiva. plantas objetivo.

Por el contrario, la identificación de microorganismos que se transmiten fielmente de

forma vertical, generación tras generación, brinda la oportunidad de introducir efectos
estables y predecibles en el campo, independientemente de la población nativa del suelo.
Como el conocimiento de la transferencia vertical de bacterias es limitado, se debe
desarrollar un enfoque para aislar un organismo modelo, que se sabe que ocupa y se
transmite constantemente a la siguiente generación. Se deben tener en cuenta otras
condiciones, como la composición del suelo, la temperatura, el genotipo de la planta y el
estrés, para garantizar la consistencia de la transmisión, incluso en condiciones adversas.
Una vez establecidas, las características beneficiosas podrían transferirse naturalmente a
través de la genómica lateral al organismo modelo y seguirse a lo largo de su ciclo de vida.
Transferencia y simbiosis de genes de ADN vegetal (González, 2006). A medida que avanza
el análisis de genomas bacterianos completos, el operón nitrogenasa (nif) y el conjunto
asociado de proteínas involucradas en la regulación y activación de la enzima nitrogenasa en
diversos géneros bacterianos están saliendo a la luz (Revisado en Bently y Parkhill, 2004).

Para explorar la transferencia horizontal de genes entre endófitos, se eligió el taxón

Burkholderia bien documentado debido a sus interacciones endofíticas beneficiosas
comprobadas con una variedad de plantas y es comúnmente capaz de BNF. En general,
Burkholderia son beta-proteobacterias gramnegativas compuestas por más de 50 especies
que se encuentran comúnmente en el medio ambiente y pueden colonizar el suelo, el agua,
las plantas y los animales (revisado en . Además de las bacterias capaces de BNF, también
se conoce Burkholderia sp. para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas, la resistencia a
las enfermedades, ayudar a la absorción de nutrientes y mejorar la capacidad de sus
huéspedes para la adaptación metabólica a diversos entornos (revisado en . Algunas de
estas respuestas están vinculadas a la producción y secreción bacteriana de sideróforos,
solubilización de fosfato de roca, ACC actividad desaminasa, actividad de quinolinato
fosforribosil transferasa y producción de fitohormonas Bhattacharjee et al., 2008). La
Burkholderia endofítica de vida libre puede habitar prácticamente en todas las partes de la
planta (De Costa y Erabadupitiya, 2005; por ejemplo, B. tropica se encontró en el tallos y
raíces de piñas (Cruz et al., 2001), B. gladioli en raíces, tallos, semillas y bayas de café (Vega
et al., 2005), y B.
 TRADUCCIÓN 59

La cepa PsJN de phytofirmans, aislada de cebollas, fue capaz de colonizar varias

especies de cultivos no relacionados (revisado en Nowak y Shulaev, 2003).

Interacciones entre Burkholderia sp. y su huésped vegetal puede ser obligado, donde la
planta sufre mucho en su ausencia. Por ejemplo, los cultivos de tejido vegetal de Psychotria
que no contienen endófito de Burkholderia tenían hojas distorsionadas, retraso en el
crecimiento y no podían sobrevivir a largo plazo (Van Oevelen, 2003). También se ha
encontrado que Burkholderia forma nichos extendidos en hongos. Por ejemplo, el hongo
micorrícico arbuscular Gigaspora margarita tiene una población residente de hasta 250 000
Burkholderia spp. en el citoplasma de una sola célula fúngica (Ruiz-Lozano y Bonfante, 2000).
Una bacteria fijadora de nitrógeno estrechamente relacionada con Burkholderia (Bianciotto et
al., 1996) ha sido descubierta dentro de las esporas de Gigaspora margarita (Jargeat et al.,
2004), donde se estima que más de 20.000 individuos habitan cada espora (Bianciotto et al. .,
2004), lo que indica la importante capacidad evolutiva de transferirse verticalmente a la
siguiente generación y garantizar una interacción estable.

Desde el punto de vista ecológico, la versatilidad de Burkholderia probablemente se deba

a su gran genoma, cuyo tamaño oscila entre 4,7 y 9 Mb (Bellenger et al., 2011), o el doble del
tamaño de Escherichia coli (Parke y Gurian-Sherman, 2001). Más del 20 por ciento de sus
secuencias de ADN pueden haber sido adquiridas por transferencia horizontal de genes
(Chain et al., 2006), un mecanismo de adaptación impulsado por elementos de bacteriófagos
y transposones (Konstantinidis y Tiedje, 2005). Para determinar la adaptabilidad de un
organismo con un genoma tan grande, los investigadores adaptaron experimentalmente 12
poblaciones de B.

cenocepacia a un medio de cebolla durante 1000 generaciones (Ellis y Cooper, 2010).

Descubrieron que el 78 por ciento de todas las poblaciones aumentaron en aptitud física en
comparación con sus antepasados, y se observaron variaciones significativas entre las
líneas. Las poblaciones también variaron en varios fenotipos relacionados con la asociación
con el huésped, incluida la función de detección de quórum, la motilidad y la formación de
biopelículas (Ellis y Cooper, 2010).

La secuenciación completa del genoma de otros endófitos bacterianos junto con el

análisis genético que lo acompaña ha llevado a diferentes conclusiones sobre la estabilidad y
las diferencias genéticas de estas diversas bacterias. Por ejemplo, la secuencia del genoma
de Azoarcus BH72 reveló un genoma relativamente estable, atribuido a la adaptación de las
bacterias al entorno interno estable de las plantas (Krause et al., 2008). Por el contrario, la
secuencia y el análisis comparativo de Gluconacetobacter diazotrophicus Pal5, una bacteria
fijadora de nitrógeno asociada con la caña de azúcar, revela una gran cantidad de elementos
transponibles, una indicación de un cuello de botella evolutivo reciente posiblemente debido a
un cambio reciente en el nicho (Bertalan et al., 2009). Esta última bacteria también tenía
 TRADUCCIÓN 60

múltiples propiedades promotoras del crecimiento de las plantas en comparación con su

contraparte del suelo, lo que indica que los elementos transponibles podrían haber sido
adquiridos de otras bacterias que habitan en el mismo ambiente a través de la genómica
lateral, lo que nuevamente indica la ocurrencia común de la transferencia horizontal de genes
(Bertalan et al. ., 2009).

Burkholderia endófito de vida libre capaz de BNF puede colonizar órganos de plantas y
tejidos internos de una amplia gama de especies de plantas no leguminosas (Elliott et al.,
2007; Bontemps et al., 2010; Martinez-Aguilar, 2008). Se ha sugerido que los endófitos de
vida libre capaces de BNF se ubican en un ambiente más favorable en comparación con las
bacterias rizosféricas de vida libre porque son menos vulnerables a la competencia con las
bacterias nativas del suelo y están protegidos de varios estreses bióticos y abióticos
(Reinhold-Hurek y Hurek, 1998). El ambiente bajo en oxígeno creado en el tejido vegetal
también optimiza la actividad de la nitrogenasa, la enzima responsable del BNF. BNF de vida
libre Burkholderia spp. han sido identificados en tomate cultivado en campo (B. tropica y B.
xenovorans) y sorgo (Wong-Villarreal 2010) donde B. tropica se encontró casi
exclusivamente.

La estructura del genoma y la eficiencia de fijación de nitrógeno de 7 rizosféricos y

endófitos de vida libre

Se analizó Burkholderia (B. unamae, B. tropica, B. silvatlantica, B. xenovorans, B.

vietnamiensis, B. kururiensis y B. sacchari) (Martines-Aguilar, 2008). Los autores notaron que
el gen nifH estaba ubicado en diferentes cromosomas, que iban del 2 al 5, y que las
secuencias del gen mostraban grupos apretados y eran claramente diferentes de otras
bacterias fijadoras de nitrógeno. Para confirmar la fijación de nitrógeno atmosférico, los
autores utilizaron el ensayo de dilución isotópica de 15 N 2 y encontraron que las cantidades
de N fijado oscilaban entre menos de 100 ng y más de 3000 ng en B. vietnamiensis.

Incluso cepas dentro de especies como B. unamae exhibieron una diferencia de 20 veces
en la cantidad de N 2 fijada. En B. vietnamiensis G4, NtrB es parte de un sistema de dos
componentes, probablemente involucrado en la respuesta reguladora al estado de nitrógeno
y oxígeno (Mendard et al., 2007).

Juntos, el genoma grande y dinámico, su capacidad para ocupar muchos nichos, la

evidencia de ocurrencias comunes de transferencia horizontal de genes, sus múltiples
mecanismos probados de promoción del crecimiento, incluido el BNF de vida libre, múltiples
genomas secuenciados y la disponibilidad de cepas, todo indicaba que Burkholderia ser un
buen taxón para estudiar la posible transferencia horizontal de genes de BNF. El método de
congelación y descongelación artificial que utiliza gDNA de una bacteria capaz de BNF y el
cocultivo natural con una bacteria capaz de BNF se exploran a continuación para introducir
 TRADUCCIÓN 61

BNF en B. phytofirmans PsJN, una cepa con su genoma secuenciado que carece de la
capacidad de fijar nitrógeno.

Materiales y métodos -Transferencia horizontal de genes

Material vegetal
Se compraron semillas de pasto varilla (Panicum virgatum L.) del cultivar Alamo de
Warner Brothers Seed Co. (Lawton, OK).

Endófito bacteriano y condiciones de cultivo.

Se usaron dos tipos de cepas para experimentos de promoción del crecimiento y
transferencia horizontal de genes.

El primero consistió en cepas de referencia pertenecientes a la especie Burkholderia;

Burkholderia phytofirmans cepa PsJN, una bacteria endofítica aislada de raíces de cebolla
por Jerzy Nowak y la segunda, Burkholderia phymatum STM 815, una bacteria formadora de
nódulos aislada de Mimosa (Elliott et al., 2007 Francia. Todos los cultivos fueron sembrados
en King's B (KB) medio sólido como se describe El inóculo se produjo transfiriendo un asa de
bacterias de cultivos de 2 días a 5 ml de caldo KB en un tubo de cultivo de 15 ml, seguido de
incubación a 28 °C en un agitador (220 rpm) durante la noche. Se añadieron cinco ml del
cultivo de toda la noche a 45 ml de caldo KB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se
cultivaron hasta 0,7 DO 600. A continuación, las células bacterianas se recogieron mediante
centrifugación a 3500 rpm durante 7 min a 4 °C y se resuspendieron en Tampón PBS
(NaH2PO4 10 mM que contiene NaCl al 0,8 %, pH 6,5) con OD 600 a 0,5 (aproximadamente 10
8 ufc), a menos que se indique lo contrario.

Análisis del genoma de Burkholderia

La búsqueda de genomas de Burkholderia publicados se realizó con la herramienta de
alineación BLAST utilizando Burkholderia vietnamenisis como cepa de referencia debido a
sus capacidades documentadas para fijar el dinitrógeno atmosférico y contribuir con
nitrógeno fijo al crecimiento de las plantas en un estado de vida libre.

Transformación de gDNA de B. phymatum STM 815 a B.

 TRADUCCIÓN 62

phytofirmans cepa PsJN

Se añadieron tres µl de ADNg de B. phymatum STM 815 a 100 µl de células PsJN de la
cepa B. phytofirmans competente y se colocaron en hielo durante 5 min. A continuación, la
mezcla se colocó en nitrógeno líquido durante 5 min y luego se incubó a 37 ºC durante 5 min.
A continuación, se añadieron 700 µl de LB para recuperación durante 4

horas a 28ºC en agitador a 220 rpm. A continuación, la suspensión se centrifugó a 7000

rpm durante 3 min para sedimentar. Se decantó todo menos 100 µl y el sedimento se
resuspendió y se sembró en placa sobre LB sólido durante 2-3 días.

Aislamiento de ADN genómico bacteriano

El ADN genómico bacteriano se aisló (Lemanceau et al., 1995) cultivando durante 21
horas a 28ºC en un agitador a 220 rpm en medio Luria-Bertani (LB) (Miller, 1972). Las células
se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 10 min, se lavaron
resuspendiendo en H2O estéril y repitiendo la centrifugación a 4000 rpm durante 10 min. A
continuación, el sedimento final se suspendió hasta una densidad óptica de 2 a 600 nm
mediante dilución con H2O destilada estéril. Luego, en un tubo de 1.5 ml, se agregaron 100 ul
de Tris-HCL 10 mM (pH 8.3) y 13 ul de proteinasa K (1 mg/ml en H2O)(Sigma) a 100 ul de
suspensión de células bacterianas y se incubó a 55ºC. durante la noche. La proteinasa K se
inactivó por incubación de la suspensión celular durante 10 min a 100ºC. El ADNg se
almacenó a -20ºC hasta su uso.

Los cebadores se diseñaron para B. Phymatum STM 815 NifH: Cebador directo: 5'-
GGGTGTGATCCAAAGGCTGA-3', Cebador inverso: 5'-ATTCGTCAGGCGGTCAGTTC-3'.

Los oligonucleótidos fueron sintetizados por IDT. La PCR se llevó a cabo con alícuotas
de 5 ul de suspensión celular en condiciones de PCR; 25 ul: 50 pmol de cada cebador, DNTP
1,25 mM y ADN polimerasa Taq 2U. Ciclos de la siguiente manera: 1 ciclo a 95ºC por 7 min,
30 ciclos a 94ºC por 1 min, a 52ºC por 1 min, y a 65ºC por 8 min; 1 ciclo a 65ºC durante 16
min y un paso final a 4ºC. Se corrieron 10 ul de productos de PCR en un gel de agarosa al 1%,
se tiñeron con verde cibernético y se fotografiaron.

Inoculación de plántulas y respuesta al crecimiento de las plantas

Las semillas esterilizadas superficialmente se germinaron en placas de petri durante 7
días a 25 ˚C, bajo luz fluorescente blanca (67 µmol m-2s-1) con un fotoperíodo de 16 h. Las
semillas esterilizadas superficialmente se colocaron en papel de filtro húmedo durante 3 a 5
días en una incubadora a 25 ˚C con un fotoperíodo de 16 h (bombillas fluorescentes blancas
 TRADUCCIÓN 63

a 67 µmol m-2s-1) seguido de remojo en solución de PsJN (0,5 de OD600) durante 1 min.

Las plántulas/semillas de control se trataron con tampón PBS solo. Las

plántulas/semillas tratadas se secaron con una toalla de papel estéril, se colocaron en
medios que consistían en medios libres de nitrógeno Hoagland premezclados (bioWorld #
30630038-2) 1,9 g/L, fitogel 3 g/L y sulfato de amonio a 10 - 375 mg/L, pH 5,8 en recipientes
GA7 Magenta (Sigma-Aldrich) que contenían 50 ml de medio y 5 plántulas, y se cultivaron
durante un mes en la incubadora como se indicó anteriormente.

Establecimiento de una curva de crecimiento de nitrógeno

Los experimentos iniciales demostraron que el pasto varilla cv. El crecimiento de Alamo
en medios de Hoagland libres de N sin adición de nitrógeno fue muy limitado,
independientemente de la inoculación bacteriana. Sin embargo, cuando se agregaron 200
mg/L de sulfato de amonio, el crecimiento del pasto varilla durante un mes fue igual al
producido con un medio que contenía el nitrógeno adecuado. Con el fin de determinar
cuándo el crecimiento del switchgrass es limitado y cómo el estrés por bajo nivel de
nitrógeno afecta el crecimiento de la planta, se desarrolló un experimento para evaluar el
crecimiento en un rango de niveles de nitrógeno. La prueba incluyó la medición de la
biomasa de raíces y brotes a los 1,5 meses en niveles de nitrógeno (mg/L) a 0, 10, 25, 50, 75,
100, 125, 250, 375 y 500 en medio libre de nitrógeno de Hoagland premezclado como se
describe anteriormente.

Resultados -Transferencia génica horizontal

Estudio del genoma de Burkholderia para posibles plásmidos

simbióticos
Con el aumento reciente en la secuenciación del genoma bacteriano, hay mucha más
información disponible sobre el rango de tamaño total de los genomas y el número relativo
de cromosomas y plásmidos presentes en una especie como Burkholderia (Tabla 4.1). En un
esfuerzo por identificar otras Beta-proteobacterias que sean capaces de fijar nitrógeno
atmosférico, y si estas bacterias contienen un plásmido SYM potencialmente capaz de
compartir esta propiedad, se realizó un estudio del gen nifH en los genomas de Burkholderia
publicados utilizando BLAST. Los resultados indicaron que varias especies de Burkholderia
poseían el gen nifH con una alta identidad con el de B. vietnamiensis, una conocida bacteria
fijadora de nitrógeno de vida libre, y por lo tanto potencialmente tienen la capacidad de fijar
nitrógeno atmosférico (Tabla 4.2). Lo que es más importante, estas encuestas indicaron que,
 TRADUCCIÓN 64

de los tres Burkholderia con genomas secuenciados identificados para poseer el gen NifH, B.
phymatum STM 815 tenía el gen ubicado en un plásmido. Luego, este plásmido se exploró
más utilizando la característica del genoma anotado en la base de datos NCBI.

Análisis del gen simbiótico del plásmido pBPHY02

B. phymatum, una bacteria altamente efectiva en la nodulación de Mimosa, también ha
sido la primera Beta-proteobacteria reportada capaz de fijar dinitrógeno atmosférico ex
planta, en un estado de vida libre (Elliott et al., 2007). A diferencia de muchas bacterias
noduladoras, incluidas otras Burkholderia, B.

Se encontró que phymatum STM815 nodula una amplia gama de leguminosas

importantes (revisado por Gyaneshwar et al., 2011). En experimentos de promoción del
crecimiento, B. phymatum STM 815 aumentó el peso seco de las plantas de Mimosa
inoculadas de 5 a 6 veces más que los controles (Elliott et al., 2007).

La secuencia completa del genoma de B. phymatum STM815 se publicó en 2008

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi). Se compone de un cromosoma

grande de 3,5 Mb, dos cromosomas más pequeños (2,7 Mb y 1,9 Mb) y un plásmido de 595
Kb. El análisis del plásmido pBPH02 de B. phymatum de 595 Kb anotado reveló que muchos
genes simbióticos,

incluidos los genes responsables de la nodulación, la fijación de nitrógeno y la

conjugación estaban presentes (Figura 4.12) (Tablas 4.3 y 4.4).

Los genes de nodulación en el rango pBPHY02 de B. phymatum oscilan entre 480 Kb y

489 Kb y están ubicados aguas arriba del operón fijador de nitrógeno. Los seis genes en esta
región están involucrados en la nodulación (incluyendo nodT), exportación de proteínas
(nodJI) y en la secreción de moléculas señal por bacterias noduladoras (nodSAH) en
respuesta a señales de la planta hospedante (Debelle et al., 2001). El complejo de transporte
de membrana está codificado por nodI y nodJ (Fernandez-Lopez, 1996). Juntos, los genes
son necesarios para las respuestas simbióticas para una infección exitosa. Las moléculas de
señalización confieren diferentes niveles de especificidad entre las bacterias noduladoras y
la planta huésped. En un análisis de secuencias nodC de 143 cepas de Burkholderia aisladas
de 47 plantas hospedantes de Mimosa en Brasil, los investigadores informaron un origen
monofilético que sugiere una sola adquisición de estos genes conservados (Bontemps et al.,
2010).

Los genes responsables de la fijación de nitrógeno se encuentran en el fragmento de 492

Kb a 588 Kb del plásmido pBPHY02 de B. phymatum e incluyen el conjunto completo de
 TRADUCCIÓN 65

genes nifHDKEN que codifican el heterotetrámero de nitrogenasa (revisado por Dixon y Kahn,
2002). Con una longitud de 96 Kb, este operón es el doble de largo que otros reportados para
Burkholderia (Menard et al., 2008). El gen nifA, implicado en la regulación transcripcional de
la producción de nitrogenasa, se encuentra aguas arriba de los genes nif restantes y aguas
abajo de los genes nod implicados en la nodulación. El gen nifB está separado de nifA por al
menos 6 genes, una configuración similar a la disposición en B. tuberum pero difiere de la de
otras especies de Burkholderia. donde los genes están ubicados uno al lado del otro
(revisado en Gyaneshwar et al., 2011). Los genes nifEN también están separados por una
serie de genes de nifHDK que difieren de la disposición en otras bacterias fijadoras de
nitrógeno. Una duplicación aguas abajo de la región nifHDK incluye genes nifH, así como nifT
y nifZ, implicados en la biosíntesis, y también existe la maduración de la proteína FeMo. La
región también contiene el dominio de señalización PAS implicado en la detección del estado
del nitrógeno celular (Menard et al., 2008) y genes que codifican el sistema de transducción
sensorial de la proteína LuxR de dos componentes (Birck et al., 2002) que también se ha
implicado en la detección de quórum (Pappas et al., 2004).

Al igual que el plásmido inductor de tumores en A. tumefaciens, comúnmente utilizado

como plásmido modelo en la investigación de biología molecular, y el plásmido p42a de la
proteobacteria alfa nodulante Rhizobia etli, el plásmido de B. Phymatum contiene genes que
codifican la proteína VirB involucrada en el tipo IV ' sistema de conjugación adaptado para la
transferencia de T-DNA a la célula huésped de la planta, y los genes Tra y Trb esenciales para
la transferencia horizontal de ADN en la conjugación bacteriana (Chen et al., 2002;Gonzalez
et al., 2006). En las bacterias gramnegativas, los sistemas de conjugación constan de dos
moléculas de superficie, el canal de apareamiento para la translocación de ADN y proteínas, y
el pilus conjugal para contactar con la bacteria receptora (revisado por Christie et al., 2000).
Las proteínas VirB, involucradas en la transferencia horizontal en Alpha-proteobacteria,
incluyen tres grupos funcionales; proteínas extracelulares que forman el pilus y las
estructuras adhesivas, el canal de apareamiento y ATPasas localizadas en la membrana
citoplasmática (revisado por Christie et al., 2000). El plásmido pBPHY02 de B. phymatum
contiene cuatro homólogos de virB; 6, 8, 9 y 11. Los genes presentes relacionados con la
actividad del fago también indican el potencial de transferencia horizontal de genes
(González, 2006).

Introducción del plásmido B. phymatum a B. phytofirmans PSJN

Para probar el potencial de transferencia génica horizontal de B. phymatum STM 815
pBPHY02, que contiene el operón Nif, se introdujo ADN genómico (ADNg) de esta bacteria en

La cepa PsJN de Burkholderia phytofirmans, uno de los endófitos bacterianos

beneficiosos más estudiados, demostró promover el crecimiento del pasto varilla bajo
niveles normales de nitrógeno. La transformación de B.
 TRADUCCIÓN 66

phymatum gDNA se realizó como se describe y la bacteria resultante se sembró en

medio libre de nitrógeno Norris. Las colonias exitosas se colocaron en stock de glicerol y se
denominaron PsJN + (más la capacidad de fijar nitrógeno). En un experimento separado, B.
phymatum STM815 se cocultivó con B. phytofirmans cepa PsJN con una etiqueta de proteína
verde fluorescente (GFP) (PsJN-GFP) en 5 ml de medio KB líquido durante la noche, las
suspensiones de células bacterianas se centrifugaron y lavaron dos veces con H2O, diluido
en serie de 1:10 a 1:10,000 con agua estéril y luego sembrado en placa en medio libre de
Norris N. Después de 4 días de crecimiento, se observaron dos tipos de colonias; uno que
poseía GFP y el otro no (Figura 4.13). La proporción contada de colonias GFP frente a
ausencia de GFP fue de aproximadamente 1 a 100. Las colonias que contenían GFP se
volvieron a colocar en placas y se aislaron para un análisis posterior.

Para determinar si el gen nifH, un gen necesario para la fijación de nitrógeno (Dixon y
Khan, 2002), estaba presente en la cepa PsJN de B. phytofirmans mediante cocultivo o
transformación, se diseñaron cebadores de PCR para nifH en B. phymatum STM 815 (
GenBank n.º CP001043.1). Genómica (Figura 4.14).

Efecto de las concentraciones de nitrógeno en el crecimiento

Los experimentos iniciales demostraron que el pasto varilla cv. El crecimiento de Alamo
en medios de Hoagland libres de N sin adición de nitrógeno fue muy limitado,
independientemente de la inoculación bacteriana. Sin embargo, cuando se agregaron 200
mg/L de sulfato de amonio, el crecimiento del pasto aguja al mes estuvo cerca del producido
con un medio que contenía nitrógeno completo (500 mg/L). Con el fin de determinar cuándo
el crecimiento del switchgrass es limitado y cómo el estrés por bajo nivel de nitrógeno afecta
el crecimiento de la planta, se diseñó un experimento para evaluar el crecimiento en un rango
de niveles de nitrógeno. La prueba incluyó la medición de la biomasa de raíces y brotes a 1,5
meses en niveles de nitrógeno (mg/L) 0, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 250, 375 y 500. La
morfología de las plantas también cambió a lo largo de la curva. (Figura 4.7) con raíces
haciendo la transición obvia de rojo a verde entre 100 mg/L y 125 mg/L, coincidiendo con el
cambio en la biomasa señalado anteriormente. El peso de los brotes aumentó a lo largo de la
curva, excepto entre 125 mg/L y 250 mg/L. El peso de la raíz aumentó de 0 mg/L a 100 mg/L
y luego disminuyó de 100 mg/L a 125 mg/L y permaneció casi igual de 125 mg/L a 500 mg/L.
(Figura 4.8). Además, aunque el peso total entre 100 mg/L y 500 mg/L no fue
significativamente diferente, la diferencia en la morfología de la planta fue clara ya que los
brotes fueron mucho más altos en este último.

Experimentos de promoción del crecimiento

Con el fin de determinar los efectos de los endófitos con o sin genes Nif sobre el
 TRADUCCIÓN 67

crecimiento, B.

phytofirmans cepa PsJN, PsJN+, B. phymatum STM 815 se probaron en tres niveles de
nitrógeno:

10 mg/l, 75 mg/l y 375 mg/l. (Figura 4.15) PsJN+, y ambos fueron significativamente
más altos en comparación con el control. Para confirmar estos efectos en mayor número, las
pruebas se repitieron en 75 mg/L y 375 mg/L con PsJN, PsJN+ y control (Figura 4.16) con
resultados similares. Se llevó a cabo una prueba final, similar al segundo experimento,

donde se midió la biomasa de raíces y brotes al mes con resultados similares (Figura
4.17).

El cambio porcentual promedio frente al control se determinó y se ilustró en la Figura

4.18. Este gráfico muestra claramente el efecto de la inoculación con PsJN + en
comparación con PsJN sin la capacidad de fijar nitrógeno en 75 mg/L o en circunstancias de
deficiencia de nitrógeno. Las tres pruebas demuestran esta capacidad.

Sin embargo, los cambios porcentuales promedio con estos dos se probaron en 375
mg/L, o niveles adecuados de nitrógeno, fueron muy similares (Figura 4.19). Estos resultados
se demostraron en los tres experimentos realizados. Juntas, estas pruebas indican que
PsJN+ supera a PsJN solo cuando se cultiva en medios deficientes en nitrógeno. Este
beneficio se pierde cuando se suministra nitrógeno adecuado.

Discusión -Transferencia horizontal de genes

A medida que se aprenda más sobre la genética de Burkholderia, será posible compartir
estos importantes genes entre organismos similares a través de la transferencia horizontal
de genes mediante transformación, conjugación o transducción, todos fenómenos comunes
en el mundo bacteriano. Los investigadores informaron por primera vez sobre la
transferencia horizontal de genes in planta en álamos híbridos entre bacterias asociadas a
plantas cuando encontraron que Burkholderia cepacia VM1468 transfirió su gen de
degradación de tolueno a otros endófitos endógenos (Taghavi et al., 2005). Esto sugiere que
tal transferencia puede usarse para modificar y mejorar los efectos de promoción del
crecimiento de otros endófitos a través de la transferencia de genes. El fenómeno de la
transferencia horizontal de genes también puede ocurrir entre Burkholderia y diferentes
géneros. Los investigadores sugirieron que el gen que codifica el agente antifúngico
pirrolnitrina en Burkholderia se transfirió horizontalmente de Pseudomonas.

Burkholderia representa un grupo notablemente diverso de bacterias asociadas a

plantas con genomas inusualmente complejos y plásticos (Parke y Gurian-Sherman, 2001;
 TRADUCCIÓN 68

Ellis y Cooper, 2010). Esta característica aumenta su capacidad de adaptación a diversos

entornos y ayuda a explicar por qué se han encontrado ocupando una variedad de nichos, que
incluyen suelo, agua, plantas, animales y rizosfera (Coenye y Vandamme, 2003). A medida
que se descubren más Burkholderia fijadoras de nitrógeno de vida libre, y se las considera
como la evolución aparente de la especie a partir de un ancestro diazotrófico común
(Bontemps et al. 2010), la investigación puede llevar a que la especie ayude a disminuir el uso
de fertilizantes nitrogenados sintéticos, lo que en a su vez ayudará a mantener la
productividad de las tierras de cultivo. Esta revisión respalda la exploración del uso de
endófitos fijadores de nitrógeno de vida libre como una opción en el esfuerzo por reducir el
uso de fertilización nitrogenada sintética y ofrece esperanza en la creación de sistemas de
producción agrícola de alto rendimiento y bajos insumos que no dañan el ecosistema.

Perspectivas de futuro
En un esfuerzo por mejorar la agricultura sostenible en el futuro, los microorganismos
benéficos pueden ayudar a aumentar el rendimiento al mismo tiempo que disminuyen el uso
de fertilizantes y pesticidas químicos, cada uno de los cuales se sabe que tiene efectos
perjudiciales para el medio ambiente. Si bien la promoción del crecimiento utilizando estos
organismos ha sido bien documentada en el laboratorio, los experimentos de campo a
menudo demuestran resultados disminuidos o ninguna promoción del crecimiento. El inóculo
aplicado al suelo tampoco ha logrado promover el crecimiento de manera constante en la
medida necesaria. Este artículo destaca el potencial de utilizar microorganismos transferidos
verticalmente como una alternativa a los enfoques mencionados anteriormente, ya que el
inóculo aplicado externamente puede cambiar la composición del suelo (Conn y Franco,
2004), o no puede colonizar y promover el crecimiento de las plantas objetivo de manera
efectiva. . Por el contrario, la identificación de microorganismos que se transmiten fielmente
de forma vertical, generación tras generación, brinda la oportunidad de introducir efectos
estables y predecibles en el campo, independientemente de la población nativa del suelo.
Como el conocimiento de la transferencia vertical de bacterias es limitado, se debe
identificar un enfoque para identificar un organismo modelo, que se sabe que ocupa y se
transmite constantemente a la próxima generación. Se deben tener en cuenta otras
condiciones, como la composición del suelo, la temperatura, el genotipo de la planta y el
estrés, para garantizar la consistencia de la transmisión, incluso en condiciones adversas.
Una vez establecidas, las características beneficiosas podrían transferirse naturalmente a
través de la genómica lateral al organismo modelo y seguirse a lo largo de su ciclo de vida. El
fitomejoramiento y la genómica también se pueden emplear para identificar huéspedes con
compatibilidad genotípica con el endófito. Juntos, dicho sistema puede generar datos
valiosos para contribuir a la comprensión de este fenómeno poco estudiado. Además,
apuntar a bacterias particulares que comúnmente se transmiten verticalmente a la progenie
puede permitir la entrega de ciertos rasgos, como la fijación de nitrógeno atmosférico, de
manera consistente. Estos organismos endófitos pueden luego compartir estos rasgos en la
 TRADUCCIÓN 69

planta con otros microorganismos endófitos, especialmente en condiciones difíciles. La

transmisión vertical con otros endófitos también es una opción para mantener poblaciones
naturales estables. El hongo micorrizal arbuscular (AM) Gigaspora margarita, tiene una
población residente de hasta 250.000 Burkholderia spp. en el citoplasma de una sola célula
fúngica (Ruiz-Lozano y Bonfante, 2000). El gen involucrado en esta interacción es vacB y
puede usarse para identificar otras bacterias que podrían introducirse en la AM. Se han
descubierto bacterias fijadoras de nitrógeno estrechamente relacionadas con Burkholderia
(Bianciotto et al., 1996) dentro de las esporas de Gigaspora margarita (Jargeat et al., 2004),
donde se estima que más de 20.000 individuos habitan cada espora vegetativa (Bianciotto et
al. ., 2004), lo que indica la importante capacidad evolutiva para transferirse verticalmente a
la siguiente generación que puede ocurrir entre AM, un endosimbionte obligado en sí mismo,
y sus bacterias intercelulares obligadas. Todas estas interacciones brindan potencial para
comprender mejor y mejorar la estabilidad de las relaciones endosimbióticas entre los
endófitos y sus huéspedes.

Desde 1999, se han registrado más de 15 nuevas patentes para inoculantes microbianos
y el mercado mundial está experimentando una tasa de crecimiento anual de
aproximadamente el 10 %. El uso de inoculantes microbianos es una parte importante del
esfuerzo por disminuir el uso de fertilizantes químicos y satisfacer la demanda mundial de
cultivos agrícolas para alimentos, piensos y combustibles, que están aumentando a un ritmo
acelerado (Edgerton, 2009). Está claro que estos pequeños organismos contribuyen y pueden
utilizarse para ayudar a mantener o aumentar la productividad de las tierras de cultivo.

La identificación de endófitos bacterianos de vida libre, fijadores de nitrógeno, que se

transfieren verticalmente de la planta a la semilla, podría aumentar el crecimiento de las
plantas en tierras marginales de una manera confiable y predecible, al tiempo que reduce la
necesidad de fertilizantes sintéticos. El mejoramiento en el contexto de BNF y la
transferencia horizontal de genes que codifican propiedades beneficiosas, incluida la fijación
de nitrógeno atmosférico, también se pueden utilizar para introducir la propiedad en un
endófito que se transfiere verticalmente a través de semillas. Desde asociaciones que
forman nódulos con la leguminosa común Mimosa hasta bacterias endófitas que viven
libremente en los tejidos de las plantas (Elliott et al., 2007; Bontemps et al., 2010), las
bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico ofrecen esperanza en el esfuerzo por mejorar
las prácticas agrícolas en el siglo XXI al reducir el uso de fertilizantes nitrogenados
sintéticos. .9 Prueba 1 de promoción del crecimiento por aislamiento NSL. El crecimiento fue
de 10 mg/L (niveles muy bajos de nitrógeno), 75 mg/L (nitrógeno deficiente) y 375 mg/L
(nitrógeno adecuado). Se sembraron 20 plantas por tratamiento en diferentes niveles de
nitrógeno en medio libre de nitrógeno de Hoagland. Las plantas se cultivaron durante un mes
y se cosechó toda la planta. El aislado promovió el crecimiento bajo niveles de nitrógeno
deficientes y adecuados. 10 Prueba 2 de promoción del crecimiento por aislamiento NSL. El
crecimiento fue de 75 mg/L (nitrógeno deficiente) y 375 mg/L (nitrógeno adecuado). Se
 TRADUCCIÓN 70

plantaron veintiocho plantas por tratamiento en diferentes niveles de nitrógeno en medio

libre de nitrógeno de Hoagland. Las plantas se cultivaron durante un mes y se cosechó toda
la planta y se determinaron los pesos de raíces, brotes y totales TraG es esencial para la
transferencia de ADN en la conjugación bacteriana (Tomb et al., 1997) VirB 11 1038 345
VirB11) -una proteína que se encuentra en el locus vir de los plásmidos de Agrobacterium Ti
donde participa en el sistema de conjugación tipo IV para la transferencia de ADN (Li et al.,
1999) Trb1 1362 453

Figuras y Tablas
En el plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens, el operón virB es
necesario para la transferencia de ADN a la planta huésped y los sistemas tra/trb son
necesarios para la transferencia conjugada del plásmido Ti entre células de Agrobacterium
(Wood et al. ., 2001 Escinde el ADN mediante una serie de cortes escalonados y los une
covalentemente al ADN a través de un residuo de tirosina catalítico al final de la alineación
(Kwon et al., 1997) Transposasa 1209 402 Necesario para la transposición eficiente de la
secuencia de inserción o transposón de ADN (Richter et al., 1998) Transcriptasa inversa 1512
503 Utiliza una plantilla de ARN para producir ADN para la integración en el genoma del
huésped y la explotación de una célula huésped Ocurre en una variedad de elementos
móviles, incluidos los retrotransposones, los intrones del grupo II y los msDNA bacterianos
(Green et al., 1986) Transposasa IS31/IS911

154
Consta de varios elementos de inserción y otras transposasas bacterianas y se ha
demostrado que media la oligomerización de los componentes de la transposasa en IS911
(Haren et al., 1999) Introducción La ciencia, la ingeniería y la tecnología tienen las claves para
abordar los grandes desafíos que enfrenta nuestra nación en el siglo XXI, incluida la escasez
proyectada de agua, alimentos y energía. Sin embargo, la mayoría de los ciudadanos
estadounidenses carecen de un conocimiento y una apreciación fundamentales de la
maravilla y la belleza de estos campos. Hace tiempo que se estableció la conexión entre
cada uno, con el reconocimiento de que todos han contribuido a los avances mutuos y todos
están vinculados casi a la perfección en la vida cotidiana (Wells, 2010; NAS, 2011). La
reforma educativa está impulsando la enseñanza y el aprendizaje de estas materias de
manera integrada con un enfoque en los procesos y prácticas. La Junta Nacional de Ciencias
(2007) establece claramente, en su memorándum del presidente, que la nación no está
satisfaciendo las necesidades de educación STEM de los estudiantes estadounidenses y
abordarlas es "absolutamente esencial para el éxito económico continuo de la nación y su
seguridad nacional". ".
 TRADUCCIÓN 71

Las universidades, las agencias de subvenciones del gobierno, los museos, las
sociedades profesionales y las corporaciones están enfatizando que los científicos ayuden y
participen en la educación K-12 (Andrews, et al., 2004) y

las universidades están cambiando sus sistemas de recompensas para los profesores a
fin de fomentar la participación del público en su investigación (Lally et al., 2007).

Antecedentes educativos STEM K-12

De las materias STEM, solo las ciencias y las matemáticas son áreas de contenido
básico establecidas, mientras que la tecnología y la ingeniería se consideran electivas y
existe un fuerte sesgo hacia la enseñanza de las dos primeras y entre el valor percibido de
cada una (Wells, 2010). Además, la cantidad de investigación sobre la enseñanza y el
aprendizaje de las ciencias y las matemáticas, la cantidad de investigadores, la cantidad de
revistas, la cantidad de maestros que enseñan cada una y, nuevamente, el valor percibido de
estas áreas centrales demuestran enfoques anteriores en la educación K-12. Sin embargo, a
pesar de este fuerte enfoque en la "S" en STEM, en 2001 el Departamento de Educación de
EE. UU. emitió la Evaluación Nacional del Progreso Educativo (NAEP) en ciencias, que reveló
que las calificaciones promedio en ciencias de los estudiantes del último año de secundaria
continuaban disminuyendo (Departamento de EE. UU. de Educación, 2001). En el documento
A Framework for K-12 Science, creado por la Academia Nacional de Ciencias, se reconoce
que en los documentos de contenido científico creados a mediados de la década de 1990
había mucho espacio para mejorar. También reconocieron que el porcentaje de estudiantes
motivados por sus experiencias en la escuela para seguir carreras en ciencias e ingeniería es
demasiado bajo para satisfacer las necesidades de la nación. Tal vez contribuyendo a estas
observaciones, la enseñanza tradicional de las ciencias ha sido disciplina específica en el
nivel de la escuela secundaria, como en biología, física o química, centrada en hechos en
lugar de profundidad de comprensión, carente de compromiso y cómo se hace la ciencia
(Abell y Lederman, 2007). ). De hecho, en 1996, el Centro Nacional de Investigación (NRC, por
sus siglas en inglés) condenó el énfasis tradicional en la memorización y la recitación de
hechos y, en cambio, hizo un llamado a la educación K-12 para que se centre en una
comprensión conceptual más profunda con un mayor compromiso con las prácticas
científicas auténticas (NRC, 1996). .

En su raíz, el enfoque reciente en la educación STEM comenzó con el Movimiento de

Excelencia en 1983 y destacó un enfoque de "Regreso a lo básico", parcialmente impulsado
por el documento de base política Una nación en riesgo: el imperativo de la reforma educativa
de la Comisión Nacional de Excelencia en la Educación (NCEE). Diez años después, se
publicaron los importantes documentos Science for all Americans (SfAA) y Benchmarks for
Science Literacy (BfSL) (AAAS, 1993) y destacaron el enfoque integrador en ciencia,
matemáticas y tecnología (SMT). La educación STEM integradora se define como "la
 TRADUCCIÓN 72

aplicación de enfoques pedagógicos basados en el diseño de tecnología/ingeniería para

enseñar intencionalmente el contenido y las prácticas de la educación en ciencias y
matemáticas al mismo tiempo que el contenido y los procesos de la educación en
tecnología/ingeniería. La educación STEM integradora es igualmente aplicable en las
intersecciones naturales de aprendizaje dentro del continuo de áreas de contenido, entornos
educativos y niveles académicos".

(http://www.soe.vt.edu/istemed/). A diferencia de la enseñanza y el aprendizaje de

hechos y contenido aislado (el enfoque de la educación en ciencias y matemáticas en el
pasado), la literatura respalda el aprendizaje integrador y experiencial como una coincidencia
con la forma en que el cerebro organiza la información de forma natural (Bruning et al., 2004;
Zapatero, 1991). Además, Satchwell y Leopp (2002) encontraron que los estudiantes STEM
integradores estaban más motivados para aprender cuando el contenido se basaba en
escenarios de la vida real. Aprender de esta manera proporciona una mejor comprensión de
los conceptos, no solo de los hechos memorizados, y subraya la importancia de un enfoque
integrador de la enseñanza y el aprendizaje. La comprensión de las relaciones por parte de
los estudiantes también es importante en la resolución de problemas (Benjamin, 1989) y es
un principio fundamental en el desarrollo reciente del plan de estudios STEM (NAS, 2011;

Wells, 2010) y seguramente ayudará a preparar la fuerza laboral del mañana. Las
pruebas estandarizadas y otras medidas muestran que los estudiantes en aulas integradoras
superan a los estudiantes en aulas tradicionales (Hartzler, 2000;Drake, 2003;Fruger, 2002).
Además, la aplicación de estos conceptos desde el jardín de infantes hasta el grado 12,
donde los estudiantes participan activamente en el proceso y las prácticas científicas,
transversales a las disciplinas STEM, agregará profundidad a su comprensión de los
principios básicos de cada campo (NAS, 2011).

Si bien el nuevo marco para la educación científica K-12 de la Academia Nacional de

Ciencias pone énfasis en las prácticas de la ciencia, se debe reconocer que, históricamente
hablando, la educación tecnológica tiene sus raíces en el aprendizaje práctico y el diseño
tecnológico es un buen - abordar los ecosistemas artificiales, como la acuicultura, donde los
peces y las plantas se cultivan juntos y los productos de cada uno apoyan el crecimiento del
otro. Estos estudiantes también cubren el uso de desechos agrícolas y biocombustibles y que
muchos procesos en la agricultura requieren diferentes procedimientos, productos o
sistemas. En los grados 6-8, los estudiantes comienzan a aprender y comprender cómo la
tecnología ha ayudado a reducir las horas de mano de obra y disminuir la cantidad de tierra
necesaria para cultivar. A esta edad, los estudiantes también deben comenzar a comprender
que los humanos pueden manipular organismos vivos para beneficiarnos a nosotros
mismos. La causa y la acción también se enfatizan en este nivel y pueden incluir la
escorrentía agrícola y la contaminación de los ecosistemas. Finalmente, los grados 9-12
comienzan a usar su conocimiento de los principios subyacentes de la tecnología para
 TRADUCCIÓN 73

comprender el diseño y los sistemas. Los estudiantes pueden considerar los efectos
posteriores de la contaminación en los ecosistemas acuáticos, la biorremediación y los
instrumentos utilizados para probar diferentes parámetros. Los estudiantes también
comienzan a explorar los principios comerciales. Mientras los estudiantes participan en
ejercicios basados en diseño, se desarrollan muchas habilidades adicionales, fuera del
campo de STEM, incluidos los enfoques grupales para la resolución de problemas, una
habilidad importante para el éxito en el futuro. También desarrollan habilidades de
presentación y organización mientras comparten sus resultados. Al mismo tiempo,
desarrollan la escritura y habilidades analíticas más profundas, a menudo más difíciles de
cuantificar.

Juntos, los planes de estudios STEM integrados y basados en el diseño desarrollan al

estudiante en su totalidad, en lugar de solo a un guardián de los hechos. Con este enfoque,
los docentes que intentaban enseñar diseño no comprendían la interconexión entre la ciencia
y la tecnología y no entendían el proceso de diseño y, como resultado, intentaron enseñarlo
como un currículo lineal y libre de contexto. , sin tener en cuenta el contexto. Como resultado,
los estudiantes no pudieron transferir su aprendizaje de la ciencia (Sidawi, 2009). Para
complicar el problema de la aceptación de la indagación está la creencia subyacente de
muchos profesores de ciencias de que el equilibrio entre la enseñanza de la indagación y el
contenido es una meta inalcanzable (Edelson, 2001). Sin embargo, el desempeño deficiente
de los estudiantes estadounidenses en el pasado y los nuevos estándares que enfatizan la
práctica de la ciencia ejercen presión sobre la educación K-12 para alejarse de la enseñanza
de hechos y la memorización (Sidawi, 2009) Asociaciones K-12 con investigadores para
mejorar la educación STEM

Las recomendaciones de A Framework for K-12 Science Education (NAS, 2011 p.17)
incluyen tres dimensiones importantes: 1) Prácticas científicas y de ingeniería; 2) conceptos
transversales que unifican el estudio de la ciencia y la ingeniería a través de su aplicación
común en todos los campos, y; 3) Ideas centrales en cuatro áreas disciplinarias: ciencias
físicas; Ciencias de la vida; ciencias de la tierra y del espacio; e ingeniería, tecnología y
aplicaciones de la ciencia. Además, el documento establece que "para apoyar el aprendizaje
significativo de los estudiantes en ciencias e ingeniería, las tres dimensiones deben
integrarse en los estándares, el plan de estudios, la instrucción y la evaluación".

Presentar temas STEM juntos, de manera integradora, refleja la importancia de

comprender el mundo hecho por el hombre y reconocer el valor de enseñar estos temas, que
impregnan e influyen en todos los aspectos de nuestras vidas, juntos (NAS, 2011 p.17). El
documento reconoce constantemente la importancia de la participación activa de los
estudiantes con conceptos transversales desde los primeros grados para lograr un
conocimiento profundo para cuando se gradúen de la escuela secundaria. Finalmente, el
documento establece que las "experiencias de aprendizaje brindadas a los estudiantes deben
 TRADUCCIÓN 74

involucrarlos con las preguntas fundamentales sobre el mundo y con cómo los científicos
han investigado y encontrado respuestas a esas preguntas. A lo largo de los grados K-12, los
estudiantes deben tener la oportunidad de llevar a cabo investigaciones científicas y
proyectos de diseño de ingeniería relacionados con las ideas centrales de la disciplina". (NAS,
2011 p.9). Es en este contexto que los científicos e ingenieros profesionales, tanto en la
industria como en la academia, deben ser llamados a hacer un esfuerzo concertado para
tener presencia en la educación K-12, ayudar a capacitar a los maestros, involucrar y explicar
a los estudiantes que la ciencia actual La comprensión del mundo es el resultado de cientos
de años de aplicación de la filosofía basada en el diseño.

Actualmente, las instituciones de educación superior están aumentando los esfuerzos

para trabajar con las escuelas K-12 para mejorar, ampliar y complementar los esfuerzos
educativos (Druckman, Peterson y Thrasher, 2002).

En ninguna parte es más evidente la necesidad que en las ciencias (National Academy of
Sciences, 2006). En resumen, el público está reconociendo cada vez más que estas agencias
de financiación deberían dedicar más dólares de los contribuyentes a ayudar a mejorar la
educación K-12 (que además beneficia a los científicos participantes).

Participación científica en el desarrollo docente

La investigación en las ciencias naturales generalmente comienza con una hipótesis y se
crea un diseño de estudio para controlar tantas variables como sea posible. Luego, la
hipótesis se prueba y se prueba o se demuestra que es falsa (Gay et al., 2009). Si bien este
enfoque es común en la forma en que un científico o un ingeniero aborda un problema todos
los días, la entrega del aprendizaje basado en el diseño (DBL) en el aula K-12 es un desafío
por varias razones, entre ellas; 1) falta de modelos, 2) preparación inadecuada con
conocimiento de contenido en las áreas STEM y, 3) falta de tiempo para preparación
adecuada y colaboraciones (Wells, 2010). Los programas deben abordar los "métodos" de
entrega tanto como el conocimiento del contenido, ya que este último no necesariamente
mejora las habilidades de enseñanza (Fennema y Franke, 1992). Roth et al., (1998) sugieren
que la mayoría de los docentes no están preparados para enseñar los principios científicos
defendidos por los documentos de reforma curricular, y citan ejemplos en los que los
docentes en formación no se desempeñan mejor que los estudiantes de 8º grado al explicar
cómo se aborda la ciencia.

Para mejorar el conocimiento y las experiencias en las prácticas científicas y de

ingeniería, un punto de vista emergente también es que los maestros deben tener una
experiencia de investigación para fomentar el comportamiento y el pensamiento científicos
(Melear, et al. 2000). En este caso, el papel del científico o ingeniero en la educación K-12
puede implicar el desarrollo docente en sus instalaciones o laboratorios, ya que se ha
 TRADUCCIÓN 75

demostrado que el desarrollo docente en métodos de enseñanza prácticos que se enfocan

en estas habilidades de pensamiento de orden superior aumentan el rendimiento de los
estudiantes en matemáticas. y ciencia (Wenglinsky 2002(Wenglinsky , 2000. El enfoque de la
investigación científica, la indagación y la razón está arraigado en un científico profesional
como resultado de muchos años de capacitación. Para enseñar estos principios en K-12 se
requiere el desarrollo de una mentalidad y, a menudo, crea tensión entre la enseñanza del
contenido versus las prácticas (NAS, 2011 p.41), pero el enfoque anterior en el contenido
lleva a los estudiantes a ver la ciencia como una colección de hechos, con una comprensión
deficiente del proceso de indagación (Schwab, 1962). una importancia de comprender cómo
los científicos e ingenieros practican la indagación (NAS, 2011 p.41). Para el desarrollo
docente, se puede considerar el enfoque de educación tecnológica: "El aprendizaje basado en
el diseño combina conocimientos prácticos y teóricos en una combinación de diseño
tecnológico y ciencia". consulta. Como resultado, los estudiantes tienen el reto de emplear
tanto el pensamiento vertical como el horizontal para sintetizar información dentro de
entornos de aprendizaje que se parezcan más al contexto de problemas basados en diseños
mal estructurados. De esta manera, el aprendizaje basado en el diseño crea la necesidad de
adquirir comprensiones integradoras de una manera que refleje los requisitos de
conocimiento en la práctica real" (Wells, 2010). Los impactos de estos enfoques se han
correlacionado positivamente con un mayor rendimiento, interés, motivación, actitudes, y
habilidades para resolver problemas (revisado en Wells, 2010).Un científico involucrado en la
formación de docentes puede ayudar a comunicar la práctica de la ciencia que tanto la
educación tecnológica como los planes de estudios recientes de educación científica
enfatizan en las Academias de Ciencias (2011).

Los científicos como modelos a seguir para compartir la maravilla

de la ciencia en el aula.
El modelo de "científico en el aula" también es un enfoque que busca traer a las escuelas
la experiencia en el contenido y el entusiasmo de los científicos profesionales para estimular
el aprendizaje de los estudiantes, el interés en la ciencia y la consideración de las carreras
científicas. Es otra oportunidad para aumentar el compromiso y compartir la maravilla. de la
ciencia (Laursen et al., 2007). Dichos programas pueden ofrecer visitas de corta duración al
salón de clases donde interactúan con los estudiantes y pueden describir lo que hacen en el
laboratorio, discutir sus carreras o dirigir una actividad práctica en el laboratorio. Incluso en el
contexto de esta breve visita, la realización de una actividad científica, como aislar el ADN de
una fresa, puede aumentar la curiosidad o el interés de los estudiantes y alentarlos a seguir
estudiando. Si bien tanto los estudiantes como los científicos a menudo están
entusiasmados con la participación (Koehler et al., 1999), hay pocos informes disponibles
que brinden datos concretos sobre los resultados porque las metas suelen tener un alcance
amplio y a largo plazo, como aumentar el número de estudiantes que eligen la ciencia como
 TRADUCCIÓN 76

carrera. Diseñar un estudio de este tipo, controlar todas las variables con múltiples grupos de
control, inscribir a un gran número de participantes y hacer un seguimiento de los
participantes a lo largo de la escuela secundaria y la universidad y en sus carreras llevaría
muchos años y sería excesivamente costoso con pocas posibilidades de asignar influencia a
cualquier resultado determinado (Laursen et al., 2007). Si bien pocos estudios, si es que hay
alguno, cumplen con los requisitos anteriores debido a la gran cantidad de variables que se
encuentran a lo largo de la educación K-12, una revisión de un programa a largo plazo
impartido por la Universidad de Colorado y financiado por el Instituto Médico Howard
Hughes, demostró que un científico en el programa de divulgación en el aula tiene beneficios
para los estudiantes y maestros de K-12 y "Los maestros se benefician al aprender contenido
nuevo y nuevas formas de enseñarlo, y se sienten apoyados por la presencia de personas
interesadas de la universidad. Concluimos que, cuando están bien dirigidos y
cuidadosamente estructurados, los programas de científico en el aula pueden tener un
impacto positivo en el interés de los estudiantes por la ciencia y, por lo tanto, en su
entusiasmo por aprenderla". (Laursen et al., 2007, p.62).

Para hacer que los programas sean más fáciles de impartir, con una audiencia más
amplia, el uso de tecnología moderna puede ser útil. El programa de divulgación del Proyecto
BioEYES también es un programa exitoso a largo plazo que presenta un plan de estudios de
pez cebra de una semana de duración, apropiado para el grado, práctico y basado en la
investigación que permite los estudiantes se conviertan en el científico principal, mientras
que los maestros enseñan conjuntamente con científicos de nivel universitario a estudiantes
graduados en todo el país e internacionalmente (Shuda y Keams-Sixsmith, 2009). Los
investigadores encontraron que los estudiantes, en todos los grados, mostraron marcadas
mejoras en la percepción de la ciencia, la investigación científica y las carreras científicas.
Los autores señalaron que el programa de 5 días “ofrece conexiones entre lo que se sabía y
lo que se va descubriendo”. Dado que el programa incluye un fuerte componente de
capacitación docente, los autores señalan que "Empoderar a los docentes para que aprendan
y realicen ciencias de forma independiente permite que muchos más estudiantes
experimenten el Proyecto BioEYES" (Shuda y Keams-Sixsmith, 2009). Este modelo de
"estudiante co-investigador" también es atractivo para los científicos porque se generan
datos que pueden ser útiles y es más probable que los estudiantes piensen fuera de la caja
en comparación con un científico que se ha centrado en el mismo problema durante años
con pocos aportes o ideas externas. inyectado en su investigación. A través de un enfoque
práctico de coinvestigador, los estudiantes deben aprender más sobre otros enfoques para
resolver problemas, como modelado, caracterización, basado en el descubrimiento y
reflexión, incluidas la crítica y la evaluación, todos los cuales no se enfatizaron en el pasado
(Schwarz et al., 2009). ;Abd-El-Khalick et al., 2004). Estos enfoques ilustran la importancia de
saber por qué la respuesta incorrecta es incorrecta puede ser más una experiencia de
aprendizaje que saber por qué la respuesta correcta es correcta. El científico también puede
explicar que practicar la ciencia es mucho más que el método científico típicamente
 TRADUCCIÓN 77

promovido, a menudo presentado en forma de lista de verificación donde se enfatiza la

verificación de etapas en lugar del proceso creativo que realmente es la práctica de la ciencia
(Taylor, 1962). De hecho, después

entrevistando a 52 científicos investigadores, Harwood et al. (2002) descubrió

rápidamente que los científicos practicaban la ciencia de maneras muy diferentes a las que
se enseñaban en los libros de texto y varios científicos incluso criticaron duramente el
método científico tradicional. Los científicos e ingenieros en ejercicio en el aula pueden
ayudar a los estudiantes de K-12 a darse cuenta de que su trabajo es de naturaleza creativa y
tiene el poder de cambiar el mundo (Petroski, 1996). Debe advertirse nuevamente que los
beneficios positivos de un "científico en el aula" son en gran medida especulativos, ya que la
mayor parte de la literatura publicada consiste en breves descripciones de programas de
divulgación y consejos de directores de programas experimentados (Dolan et al., 2004).
Estas descripciones son valiosas para ayudar a mejorar los programas existentes pero, de
nuevo, generalmente no están respaldadas por evidencia recopilada utilizando metodologías
y evaluaciones sólidas (Laursen et al., 2007).

La importancia de los experimentos prácticos en la educación STEM

K-12 en áreas económicamente deprimidas
Si bien la necesidad de mejorar e incluir STEM integrador práctico y basado en el diseño
se destaca en las llamadas recientes para mejorar la educación científica, el Farmework para
la educación científica K-12 establece que "las preocupaciones sobre la equidad deben estar
al frente de cualquier esfuerzo para mejorar la educación científica". objetivos, estructuras y
prácticas que apoyen el aprendizaje y el logro educativo de todos los estudiantes” (NAS, 2011
p.277). Esta necesidad de reforma educativa se ve exacerbada en las comunidades rurales y
económicamente deprimidas. Existen brechas significativas en los logros en ciencias tanto
en las evaluaciones nacionales como estatales para estudiantes de minorías y de bajos
ingresos, pero esto no debe considerarse una incapacidad de los estudiantes para aprender
temas complicados (NAS, 2011 p.280). "Nacer en un grupo mayoritario racial con altos
niveles de recursos económicos y sociales, o en un grupo que históricamente ha sido
marginado con bajos niveles de recursos económicos y sociales, da como resultado
experiencias de vida muy diferentes que incluyen oportunidades de aprendizaje desiguales,
desafíos y riesgos potenciales. para el aprendizaje y el desarrollo" (Banks et al., 2007). Los
estudiantes en tales localidades tienen menos probabilidades de estar expuestos a
programas innovadores de aprendizaje práctico de ciencias (Lareau, 2003), menos capital
social movilizado y, como resultado, a menudo ingresan a la educación formal con menos
vocabulario académico (Hart y Risley, 1995) en comparación a sistemas escolares mejor
financiados en la proximidad de áreas metropolitanas más prósperas. Proporcionar a todos
los estudiantes los fundamentos de la práctica científica les permitirá explorar temas
 TRADUCCIÓN 78

relacionados con sus comunidades y vidas personales, realizar investigaciones y comunicar

sus hallazgos a otros (McDermont y Weber, 1998). Sin embargo, las escuelas en estas
comunidades a menudo tienen bajas expectativas de aprendizaje y asumen poco interés en
materias como ciencia e ingeniería, restringiendo sus experiencias educativas (Malcom,
1994; Steele, 1997). Los estudios han demostrado que los niños que se identifican como "en
riesgo" debido a los bajos niveles de ingresos familiares a menudo responden a las
oportunidades educativas prácticas frente a los métodos tradicionales de libros y
conferencias (Mccan & Austin, 1988; Cardon, 2000) y se involucran más en sí mismos. -
Juego dirigido y creativo fuera del aula (Lareau, 2003).

A Framework for K-12 Science education señala en la página 280 que "si bien las
instituciones de ciencias o ingeniería pueden ayudar a las escuelas cercanas a brindar
experiencias de aprendizaje de alta calidad para sus estudiantes (p. ej., con expertos de la
industria que visitan el salón de clases, viajes de estudiantes a centros y acuarios,
participación docente en programas universitarios), el acceso a estos activos no puede
superar los efectos de la falta de equidad en los recursos escolares en todas las escuelas y,
de hecho, pueden reforzar esos efectos". Es importante destacar que los niños que ingresan
al jardín de infantes de todos los orígenes y niveles socioeconómicos son investigadores
naturales, observan cómo caen los objetos o crecen las plantas, tratando de comprender
cómo funciona el mundo de maneras sofisticadas, más de lo que alguna vez se reconoció
(NRC, 2007). Desafortunadamente, hay una ausencia casi total de educación científica en las
escuelas primarias con estudiantes que están en mayor riesgo académico, estudiantes que a
esta edad a menudo se sienten profundamente atraídos por el plan de estudios relacionado
con los mundos naturales y diseñados que proporcionan una base importante para el
aprendizaje de la ciencia. (CNR, 2009).

Los resultados de los programas que son administrados por un científico a los sistemas
escolares desfavorecidos no son prominentes en la literatura. Uno de estos estudios se
informó en 2007 e involucró a estudiantes de posgrado en ciencias que realizaron
actividades de extensión a corto plazo en ciencias para estudiantes de K-12 en escuelas con
más del 50 % de población minoritaria en Colorado (Laursen, et al., 2007).

Los investigadores utilizaron datos cualitativos en forma de entrevistas y optaron por

solicitar observaciones tanto de maestros como de científicos con respecto a las respuestas
de los niños al alcance. 14 de los 16 maestros estudiados informaron un mayor interés y
compromiso. Como evidencia de estos beneficios, los maestros

informaron comportamientos de los estudiantes, como concentrarse en las actividades,

hacer preguntas y manifestar su interés. Ningún maestro informó falta de compromiso o
interés. Además, el conocimiento previo de los profesores sobre sus alumnos les permitió
notar respuestas como el entusiasmo de un alumno que normalmente no está interesado en
 TRADUCCIÓN 79

la ciencia. Los científicos informaron sobre la disparidad de recursos educativos y

oportunidades para los estudiantes en las escuelas más desfavorecidas, así como la falta de
preparación para la universidad en estas mismas escuelas. Además, tanto los maestros
como los científicos informaron que los resultados de los estudiantes pueden ser más
importantes en estas escuelas de alta necesidad (Larsen et al., 2007).

Otros beneficios de un científico en el aula también se pueden realizar en estas

comunidades de estudiantes. Pueden ayudar a los estudiantes en riesgo a conectar la
ciencia con las prácticas culturales locales, con las circunstancias de sus propias vidas y con
intereses personales (Leuhmann, 2009; Tzou y Bell, 2010). Desafortunadamente, en las
escuelas con pocos recursos, la comprensión de las habilidades científicas básicas como la
microscopía puede ser una limitación en comparación con las escuelas con más recursos
que ya pueden saber cómo usar los instrumentos (Shuda y Keams-Sixsmith, 2009). La
distancia entre una escuela en un área económicamente deprimida y una universidad
también puede ser un obstáculo a superar.

Debido a esta situación, la tecnología, como la videoconferencia, puede acortar las

distancias entre escuelas con altas proporciones de estudiantes en riesgo que no se
encuentran cerca de universidades o instituciones de enseñanza, y puede brindar una
oportunidad para conectar estas dos entidades (Greenburg, 2005).

Independientemente de cómo se conecten, es evidente que esta población de

estudiantes no solo puede beneficiarse de un científico en el aula, sino que también pueden
beneficiarse al máximo de este tipo de asociaciones.

Programas en ciencia de las plantas

La logística de estudiar plantas con actividades prácticas es difícil debido al momento
del año escolar. El año típico comienza en septiembre y cuando los estudiantes y profesores
pueden iniciar un proyecto de biología vegetal, a menudo es octubre, que es un momento
muy difícil para comenzar casi cualquier tipo de investigación sobre plantas debido a la
reducción de la duración del día y las bajas temperaturas. Durante las largas vacaciones de
invierno, a menudo es difícil mantener el progreso de la investigación de plantas, ya que se
necesita un sistema de riego moderno y las luces para continuar los experimentos en el
semestre de primavera. Sin embargo, el estudio de la ciencia de las plantas en el aula K-12
tiene ventajas sobre los microbios, debido a problemas de contaminación e incrustaciones, y
los animales debido a problemas éticos, entre otros. Las plantas modelo, como Arabidopsis,
son fáciles de cultivar, tienen un ciclo de vida rápido y son fáciles de cuidar. El programa
PREP (Lally et al., 2007) es un programa grande y exitoso que permite a los estudiantes de
secundaria diseñar y realizar experimentos en líneas mutantes de Arabidopsis y analizar sus
fenotipos después de que crecen en una serie de condiciones de estrés. En asociación con
 TRADUCCIÓN 80

diferentes científicos, esto proporciona una experiencia de investigación genuina para

estudiantes y profesores de secundaria, al tiempo que permite a la comunidad científica
examinar y descubrir funciones de una gran cantidad de genes de plantas pobremente
caracterizados que de otro modo no se podrían descubrir en plantas cultivadas en
condiciones ideales.

A través de la experiencia de investigación interactiva, los estudiantes y profesores son

asesorados por científicos en una experiencia de 6 a 8 semanas desarrollada teniendo en
cuenta las realidades de la enseñanza (Lally et al., 2007). Los científicos de plantas están, por
lo tanto, en una excelente posición para conectarse con la comunidad educativa K-12 para
mejorar el conocimiento, aumentar el interés en la ciencia y ayudar a los estudiantes y
maestros a comprender la práctica de la ciencia, un enfoque y dirección destacados en Un
marco para K- 12 Educación en Ciencias (NAS, 2011). Los científicos de plantas que
participan y brindan conocimientos y experiencias positivas pueden ayudar a que la
investigación sea visible, accesible y significativa para los estudiantes (Wandersee y
Schussler, 2001).

Caso

Materiales y métodos
El primer plásmido de ADN aislado del participante, lo transformó en Agrobacterium y
luego lo inoculó en plantas de tabaco. Luego, los estudiantes observaron la proteína
fluorescente verde (GFP) expresada en células vegetales vivas. Las células vegetales
transformadas que expresan proteínas GFP luego se trataron con varios reactivos químicos y
los estudiantes observaron el cambio/movimiento de las proteínas GFP bajo microscopios.
En el laboratorio, los estudiantes aprendieron a usar un microscopio para observar proteínas
fluorescentes verdes expresadas en células vegetales vivas. Fuera del laboratorio, las
sesiones de conferencias cubrieron los principios de la microscopía, la clonación de genes, la
expresión génica transitoria, el cultivo de tejidos vegetales y la ingeniería genética con Gene
Gun y Agrobacterium. Para realizar estas tareas, los estudiantes trabajaron con herramientas
comunes en un laboratorio molecular, incluido pipeteo (Figura 5.1), electroforesis en gel
(Figura 5.2), cálculo de molaridad, microscopía (Figura 5.3) y aislamiento de ADN plasmídico.
Las encuestas, las anotaciones en el diario (Tabla 5.1) y las entrevistas se utilizaron
principalmente para recopilar datos sobre el interés de los estudiantes y el conocimiento del
contenido de la ciencia de las plantas antes y después del campamento. Se otorgó una beca
completa para alojamiento y comidas para traer a estudiantes de la zona económicamente
deprimida de Southside Virginia para participar en la investigación práctica y la experiencia
en el campus centrada en la ciencia molecular de las plantas. El Dr. Bingyu Zhao del
 TRADUCCIÓN 81

Departamento de Horticultura proporcionó los suministros de laboratorio, desarrolló planes

de estudio y protocolos de laboratorio y tres de sus estudiantes graduados trabajaron codo a
codo con los estudiantes. Además, los estudiantes recorrieron otros laboratorios,
invernaderos de investigación y ensayos de campo, donde recibieron presentaciones que
destacaban la importancia de la investigación en ciencias de las plantas en el contexto de los
grandes desafíos del siglo XXI (alimentos, piensos, combustible y agua) en el áreas de
bioenergía, genética molecular y bioinformática. Excursiones incluidas:

1) Kentland Farm de Virginia Tech es la ubicación de la investigación de campo de

Virginia Tech donde se cultivan y evalúan posibles cultivos de bioenergía, incluidos el pasto
varilla, el miscanthus y la caña gigante. Los cultivares de switchgrass por sí solos
ejemplificaron la variación observada en las poblaciones naturales de pastos nativos. Las
características contrastantes de las plantas se utilizaron para explicar la naturaleza regional
de la futura producción de bioenergía.

2) El Instituto de Bioinformática de Virginia (VBI) alberga tanto secuenciadores genéticos

de última generación de alta velocidad como supercomputadoras capaces de analizar las
grandes cantidades de datos generados por estas máquinas.

3) El Instituto de Investigación y Aprendizaje Avanzado (IALR) fue visitado el último día;

los estudiantes vieron las instalaciones de IALR en Danville para destacar la investigación
molecular avanzada de plantas y la producción comercial de plantas en su región.

Resultados y discusión
En total, 20 estudiantes de último año de secundaria en ascenso de Southside Virginia
económicamente deprimidos participaron en el campamento en 2012 y 2013. Los
estudiantes procedían de una variedad de escuelas, incluidas las escuelas públicas del
condado y de la ciudad y una academia privada cristiana y para niñas. Después de la
orientación y antes de que los estudiantes comenzaran el trabajo de laboratorio, se les
entregó un cuestionario cuantitativo con respuestas clasificadas del 1 al 5, según la
pregunta. Los estudiantes también recibieron diarios que se revisaron al final de la semana
para obtener datos cualitativos y comentarios. Durante el campamento, se hizo hincapié en
aumentar el interés en las carreras de ciencias de las plantas. Cuando se les preguntó antes
del campamento si los estudiantes estaban interesados específicamente en convertirse en
biólogos moleculares de plantas, solo se seleccionó un interés moderado para el grupo
(Figura 5.4), aunque un estudiante dijo que "ellos [los científicos de plantas] hacen mucho
más que mezclar compuestos y cultivar plantas, pueden interpretar sus investigaciones y
ayudar a mejorar la sociedad". Después del campamento, se detectó un ligero aumento en las
encuestas, aunque no significativo para el campamento 2013, posiblemente debido a la
menor cantidad de estudiantes participantes. También durante el campamento, se enfatizó la
 TRADUCCIÓN 82

importancia de la ciencia de las plantas en el futuro en el contexto de las necesidades

futuras de combustible, piensos y alimentos. La pregunta 2 fue diseñada para medir las
percepciones de los estudiantes sobre la importancia de los descubrimientos de la ciencia de
las plantas para los desafíos futuros de la humanidad (Figura 5.5). Las encuestas de los
campamentos de 2012 y 2013 indicaron que durante el campamento aumentó la conciencia
de los participantes sobre las oportunidades para hacer descubrimientos importantes en
biología molecular de plantas. Un estudiante comentó: "Hay muchas oportunidades para
nuevos descubrimientos en el campo de las ciencias de las plantas.

Este (el campamento) muestra que potencialmente podría haber carreras abiertas para
mí en el futuro relacionadas con la investigación práctica, original e interesante". Otro
estudiante registró: "Tengo curiosidad por saber qué depara el futuro para la biología de las
plantas". El campamento de 2013 todos calificaron esta pregunta con un 5 al final del
campamento, lo que indica que pensaban que había muchas oportunidades disponibles para
descubrimientos importantes en la ciencia de las plantas. La pregunta 3 evaluó el interés en
la ciencia molecular de las plantas antes y después del campamento (Figura 5.6). En ambos
campos, hubo un aumento en el interés y el resultado de cada campamento fue consistente
con el otro. El aumento más alto comparando antes y después de las encuestas del
campamento se logró con la pregunta 4 en el campamento de 2013, en la que los
estudiantes midieron su propio conocimiento de la ciencia molecular de las plantas (Figura
5.7) La Figura 5.8 combina las preguntas 5, 6 y 7. El 80 % de los estudiantes en 2012 y solo el
50 % de los estudiantes en 2013 respondieron que el campamento aumentó su interés en
seguir una carrera en ciencias moleculares de las plantas. interés en la biotecnología vegetal
y el 91% y 80 % respondieron que sí en 2012 y 2013 respectivamente. Un estudiante anotó en
su diario que "estaba fascinado de ver cómo la tecnología se desarrollaba a un ritmo tan
rápido". Finalmente, los estudiantes preguntaron si recomendarían el campamento a sus
compañeros, el 100% respondió que sí para ambos años. Es importante destacar que,
después del campamento, dos estudiantes buscaron más experiencia de laboratorio y ambos
trabajaron en el laboratorio el resto del verano.

También se observó la conexión del estudiante científico y un estudiante escribió en su

diario "Disfruté trabajar con mi mentor; fue un gran maestro y trabajó bien con nuestro grupo".
Uno de los mentores también comentó lo importante que era para él "practicar cómo explicar
mi investigación a personas ajenas a mi campo, estoy acostumbrado a las conversaciones
con personas que trabajan en mi laboratorio y en el mismo campo de investigación; [el
campamento] es una excelente oportunidad para comunicarse con personas que no están
familiarizadas con el campo". En general, los resultados de las encuestas cuantitativas y
cualitativas y las anotaciones en los diarios fueron similares entre los dos años de
campamentos. Todos los participantes dieron retroalimentación positiva con respecto a lo
que aprendieron y sus experiencias. Una vez que se completó el campamento, dos
estudiantes realizaron investigaciones y trabajaron en el laboratorio el resto del verano.
 TRADUCCIÓN 83

Según los resultados de encuestas, diarios, entrevistas y comentarios, aumentó el

interés de los estudiantes en la ciencia de las plantas y era más probable que siguieran
investigando en el campo. Los estudiantes también dieron comentarios positivos sobre sus
experiencias trabajando con estudiantes graduados en Zhao Lab para completar sus
proyectos.

Como la financiación del campamento era limitada, los métodos asequibles, como las
encuestas antes y después del campamento, generalmente solo pueden medir los cambios
de actitud. Si estos cambios son a largo plazo, permanentes o conducen a un cambio real, no
está dentro del alcance de este método de evaluación y tales evaluaciones "ideales" son
difíciles de administrar debido a una serie de razones. También es difícil determinar qué es lo
que realmente conduce a los cambios de actitud detectados porque las encuestas realizadas
al final de un campamento ocurren cuando los estudiantes están emocionados y pueden ser
más una medida de su disfrute del campamento y no una medida de si los objetivos
generales del campamento se cumplieron (Bogue, 2005).

De hecho, incluso los datos de encuestas que indican cambios de actitud pueden no ser
suficientes para establecer qué causó esos cambios (Lott, 2003),

Caso dos: Experiencias de investigación de liderazgo de estudiantes

de posgrado para estudiantes de secundaria
En 2010, una asociación de investigación entre un estudiante de posgrado que estudia
ciencias en el Centro de Estudios para la Paz y Prevención de la Violencia en Virginia Tech y
la Escuela de Ciencia y Tecnología del Gobernador de Virginia Central (CVGST) para que los
estudiantes se conviertan en co-investigadores del potencial cultivo bioenergético de pasto
varilla. Se dio una presentación a todos los estudiantes en la clase de investigación en
CVGST para medir el interés en la biotecnología vegetal y dos estudiantes optaron por
participar en el proyecto de un semestre. Durante el proyecto, los estudiantes y el mentor del
estudiante graduado construyeron dos mesas hidropónicas (Figura 5.9) para investigar el
crecimiento en medios hidropónicos bajos en nitrógeno y altos en sal. Los estudiantes
diseñaron el estudio con la ayuda del mentor, recopilaron datos semanalmente sobre el
crecimiento de los brotes en varios medios de crecimiento midiendo las alturas. Al final del
período de investigación, los estudiantes, con la ayuda de su mentor científico, compilaron
los datos y los presentaron en una conferencia estatal de la Escuela de Gobernadores. Los
estudiantes también dieron su opinión sobre sus experiencias con la investigación y la
ciencia de las plantas en general;

Investigación: "Este proyecto fue extremadamente interesante y agradable. Después de

trabajar tanto en el conocimiento previo, fue divertido ver crecer mis plantas y sacar
 TRADUCCIÓN 84

conclusiones. Este proyecto también me mostró cuán importante puede ser un tamaño de
muestra grande, especialmente con plantas".

Ciencia vegetal: "Disfruté la ciencia vegetal. Las plantas no toman sus propias
decisiones, por lo que parece un campo más controlado. Las mesas hidropónicas
definitivamente hicieron que estudiar plantas fuera más fácil y divertido".

Comentarios adicionales: "¡Muchas gracias por ayudarme! No puedo imaginar cómo

habría sido toda esta clase sin este proyecto. Ha sido muy interesante y estoy emocionado
de presentarlo en las ferias de ciencias". Escuela Técnica Superior de Enseñanza y
Aprendizaje. Juntos, estos programas llegan a más de 5000 estudiantes y adultos cada año
(Tabla 5.2).

Conclusiones
Desde las noticias nacionales hasta las agencias de financiación de subvenciones, hay
informes que destacan y promueven la importancia de la educación STEM. Sin embargo,
aunque se presenta como una necesidad urgente para aumentar la enseñanza y el
aprendizaje de STEM en el aula, el sistema educativo K-12 de EE. UU. no tiende a moverse
rápidamente y los cambios abruptos pueden estar fuera de discusión. Las múltiples razones
que subyacen a la dificultad de cambio en el sistema incluyen; los maestros deben estar
preparados en la entrega de contenido STEM, se debe desarrollar un plan de estudios
acordado y se debe asignar tiempo durante el día escolar. Por otro lado, la promoción del
acrónimo STEM y la financiación de actividades relacionadas han pasado a la vanguardia de
la educación, pero las mejoras medibles en el enfoque integrador de la enseñanza y el
aprendizaje aún están en duda. La adopción de nuevos planes de estudios cobra impulso a
medida que se aprobó la Ley de mejora de la educación en ciencia, tecnología, ingeniería y
matemáticas de 2008 (Ley eSTEM, H.R. 6104) que instituye entidades gubernamentales
relacionadas con la educación STEM, un consorcio, una cámara de compensación para
difundir programas e ideas creativas. en la enseñanza y el aprendizaje, y quizás lo más
importante, los estándares de contenido para K-12 STEM. Además, la financiación y las
iniciativas a nivel local, estatal, federal y de fundaciones privadas respaldan el crecimiento y
el énfasis de la educación STEM y se alienta a los profesores universitarios a participar y
conectarse con la educación K-12.

En el capítulo se enfatizan las actividades de duración a corto plazo, no los cambios

fundamentales como el currículo nacional o los ajustes del horario escolar, sino que brindan
la base y el apoyo para que tanto los educadores como los investigadores de K-12 combinen
fuerzas, con beneficios mutuos para ambos. Estas estrategias de intervención de corta
duración se basan principalmente en el modelo de cambio (Seymour, 2002) bajo el supuesto
de que desarrollar interés y entusiasmo por la ciencia puede incluir experiencias prácticas
 TRADUCCIÓN 85

breves con la ciencia, interactuar con científicos como modelos a seguir y aprender sobre
carreras científicas. y oportunidades para hacer una diferencia en el mundo. Juntas, estas
experiencias pueden contribuir más adelante a seguir una carrera en ciencias. Además, estos
programas pueden beneficiar más a los sistemas escolares de áreas económicamente
deprimidas, a menudo con menores recursos.

Independientemente de los antecedentes del estudiante, "las experiencias de aprendizaje

proporcionadas a los estudiantes deben involucrarlos con preguntas fundamentales sobre el
mundo y cómo los científicos han investigado y encontrado respuestas a esas preguntas. A
lo largo de los grados K-12, los estudiantes deben tener la oportunidad de llevar a cabo
investigaciones científicas". investigaciones y proyectos de diseño de ingeniería relacionados
con las ideas centrales disciplinares” (NAS, 2011, p.9).

Los científicos tienen la capacidad de ayudar a mejorar el desarrollo de los docentes y la

comprensión de los estudiantes de la práctica de la ciencia y con la entrega de programas de
extensión STEM integradores, basados en el diseño y basados en evidencia K-12 de calidad
de los que todas las partes pueden beneficiarse. Para los maestros, la experiencia en
investigación puede mejorar la confianza en el proceso científico y los científicos pueden
ayudar a explicar lo que hacen todos los días, todo lo cual puede mejorar la entrega de
lecciones diseñadas en el aula K-12. Para los estudiantes, el entusiasmo y la presencia de un
científico en el salón de clases, así como la participación o "hacer" ciencia pueden inspirar y
aumentar el interés en la ciencia como carrera. Para el científico, estos programas de calidad
crean una vía para compartir su investigación e incluso adquirir nuevos datos utilizando a los
maestros y estudiantes del aula como "co-investigadores" con perspectivas nuevas y frescas.
Juntos, "comprender la ciencia y los conocimientos extraordinarios que tiene .4 Pregunta 1
(P1) para medir el interés en convertirse en un biólogo molecular de plantas. Usando una
prueba de rangos con signos de Wilcoxon, hubo un aumento estadísticamente significativo
en el interés de los estudiantes en convertirse en un biólogo molecular de plantas. biólogo
durante el campamento de 2012 (Z = 1.896; p = .058) (Ningún interés = 1, Muy interesado =
5).

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Pathway for the synthesis of the Fe-Mo cofactor (Rangararj et al., 2001) hesB 399 132
Involved in Fe-S cluster biogenesis; expressed only under nitrogen fixation (Huang, 1999)
NifZ 423 140 Required for the maturation of the nitrogenase MoFe protein (Cotton et al.,
2009) NifT 219 72 Involved in biosynthesis of the FeMo cofactor (Stricker et al., 1997) NifH
882

Homo-dimer dinitrogenase reductase, or Fe protein (Fani et al., 2000) NifD 1464 487
Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain (Zher et al., 2003) NifK 1560 519
Nitrogenase molybdenum-iron protein beta chain (Zher et al., 2003) PAS 5430 1809 Signal
sensor domain for cell nitrogen status (Menard et al., 2004) LuxR 1275 423 1) Regulators
which belong to a two-component sensory transduction system (Birck, 2002)

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