Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Gentica microbiana
Prctica 1. Aislamiento y caracterizacin
del DNA
5QM1, Seccin 1
Equipo 2:
ngeles Espinoza Jos Ivn

Anguiano Avia Fernando

Introduccin
El DNA es un biopolmero lineal, helicoidal, bicatenario, antiparalelo formado
por desoxirribonucletidos unidos entr si por enlaces fosfodister y por
puentes de hidrogeno en la doble hlice, los cuales unes a las bases
nitrogenadas de la cadena.
Los desoxirribonucletidos son los monmeros de la molcula de DNA y estn
formados por un azcar (desoxirribosa), una base nitrogenada (Adenina,
Timina, Guanina, Citosina) la cual se une al grupo hidroxilo del carbono 1 de la
ribosa mediante un enlace N-glucosidico, y por un grupo fosfato esterificado en
el grupo hidroxilo del carbono 5 de la ribosa. Los nucletidos pueden ser
mono, di o tri fosfato dependiendo del nmero de grupos fosfato presentes en
la molcula. En la molcula de DNA los desoxirribonucletidos presentes son
mono fosfato (AMP, GMP, CMP, TMP) pero para la sntesis es necesario que
estos desoxirribonucletidos sean trifosfato (ATP, GTP, CTP, TTP).
La molcula de DNA presenta una estructura primaria la cual consiste en la
unin de desoxirribonucletidos mediante enlaces fosfodister. La estructura
secundaria fue elucidada por Watson y Crick en 1953,est se da por la unin de
dos hebras sencillas de DNA mediante enlaces por puente de hidrgeno en
bases complementarias, es decir, una base de una cadena se une nicamente
con otra base de la otra cadena, de modo que la Adenina se une nicamente
con la Timina por medio de dos puentes de hidrgeno, y la Citosina se une
nicamente con la Guanina formando por medio de tres puentes de hidrogeno.
La estructura terciaria de la molcula del DNA en clulas procariotas consiste
en un superenrrollamiento de tipo plectonmico, dado que la molcula de DNA
bacteriano est en forma circular cerrado covalentemente, est sufre
plegamientos sobre s misma enrollndose sobre su misma estructura sin
necesidad la presencia de protenas de tipo histona como ocurre en el DNA
eucaritico.
Debido a la presencia de dobles enlaces conjugados en las bases nitrogenadas
la molcula de DNA tiene la capacidad de absorber luz en la regin UV,
presentando su mayor absorbancia a una longitud de onda de 260 nm (pico
mayor) y una absorbancia menos a 230 nm (pico menor).
La desnaturalizacin del DNA consiste en el rompimiento de los puentes de
hidrgeno que unen a ambas hebras mediante la utilizacin de calor,

modificando el pH, por variaciones en las fuerzas inicas o por medio de

agentes desnaturalizantes, pero el ms comnmente utilizado es el calor. El Tm
de una molcula de DNA es la temperatura media de desnaturalizacin a la
cual el 50% de la molcula ha perdido su estructura secundaria, est valor de
temperatura es caracterstico para el DNA de cada organismo y depende en
gran medida del contenido de pares G-C presentes en la molcula.
Objetivos.

Aislar DNA de diferentes plsmidos a partir de un cultivo bacteriano.

Establecer el espectro de absorcin del DNA aislado.
Determinar la concentracin y grado de pureza del DNA obtenido.
Determinar la influencia de algunas caractersticas de la secuencia de
DNA sobre su desnaturalizacin. (Mediante la aplicacin del programa
DNAMAN.)

Resultados.
Tabla 1. Absorcin de luz a diferentes longitudes de onda (220-300nm) del DNA
de los plsmidos PCR TOPO 2.1 (T) y PCR TOPO-APE recombinante (A) aislados
de cepas diferentes de Escherichiacoli DH 105. Del equipo 2 de la seccin 1 del
grupo 5QM1.
Longitud de onda (nm)
220
230
240
250
260
270
280
290
300

Absorcin plsmido T
1.31
0.69
0.97
1.52
1.71
1.41
0.81
0.33
0.07

Absorcin plsmido A
3.73
2.36
3.37
5.11
5.75
4.58
2.64
1.02
0.19

1.8
1.6
1.4
1.2
1

Absorbancia 0.8
0.6
0.4
0.2
0
220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

Longitud de onda nm

Figura 1. Espectro de absorcin de DNA plsmidico PCR TOPO 2.1 (T) aislado
de una cepa de Escherichiacoli DH 105.
Para sacar la concentracin de DNA aislado se utiliz:
[DNA]=

As 260
Aexb

Donde:
Ae= ndice de absorcin especfica (22500 para el DNA)
b=paso de luz de la celda en centmetros
[]= concentracin (g/mL)
=

1.71
(22500)(0.1) =

2.6 x 104 g /mL

6

Para convertir g/mL a g/ mL multiplicamos x 1 x 10

=760g/mL de DNA aislado.
La pureza se calcul con la frmula:
de pureza.

As 260( cidosnucle icos)

=
As280 ( protenas)

1.71
0.81 = 2.11

7
6
5
4

Absorbancia

3
2
1
0
220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

Longitud de onda nm

Figura 2. Espectro de absorcin de DNA plsmidico PCR TOPO-APE (A)

recombinante aislado de una cepa de Escherichiacoli DH 105.
[DNA]= 2555.55g/mL
Pureza= 2.17
Desnaturalizacin del DNA
En el experimento de desnaturalizacin del DNA del bacterifago Q 9 (inciso D
de la prctica No. 1) se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 2. Absorcin de luz de 260nm por el DNA Q9 tratado a diferentes
temperaturas.
C

As 260nm

67
71
75
79
83
92

0.233
0.233
0.253
0.272
0.283
0.283

0.29
0.28
0.27
0.26
0.25

Absorcin 0.24
0.23
0.22
0.21
0.2
60

65

70

75

80

85

90

95

Temperatura C

Figura 3. Curva de desnaturalizacin del DNA de Q9

Para determinar la temperatura media de desnaturalizacin (tm) se realiz una
regresin lineal tomando en cuenta los nicos puntos que forman parte de la
recta, para as poder utilizar la ecuacin de la recta, la cual fue la siguiente.
y=0.0049x-0.113 despejando a x, x=

y + 0.113
0.0049 En donde: Y= la absorbancia,

X= la temperatura
x=

0.252+ 0.113
= 74.48C es la temperatura media de desnaturalizacin del
0.0049

DNA Q9
Oligonucletidos.
Tabla 3. Determinacin den la influencia de diferentes parmetros sobre la
desnaturalizacin del DNA.
Longit
ud

%
G/C

Peso
molecu
lar kD
12.39

Tm

Secuencia de Oligonucletidos

40

52.
5
35

68.9

12.24

61.8

12.31

66.9

40

47.
5
50

12.25

67.9

40

50

12.33

67.9

TAAAGGGCCGGCCATAATGCCCCGGGAAATTTA
ATGGGCA
GGGGAATTCCCCCATTATTAAAATTTAATTTTTG
GCCTTC
TTTTTAAAAAAAGGGGCCCTTAAATTAGGGCCC
CGGCCCT
CTCCGTAATTGGTATTAGCCCGTAGCCTTCGAGA
TCCTGA
CCCCCTTTTTGGGGGAAAAATTTATTTAATGGCC

40
40

GGGGCC
CTTCGAAGCTTCGAAGAGTCCTCTGAGAGATCC
TCTGAAC
10
50
3.05
30.4 CCGGCTATAT
12
50
3.54
38.7 CCCCGGTTTTAA
40
50
12.25
67.9 CCCGGGCCCGGGCCCGGGCCTTTTAAATTAAA
TTTAATTA
*NOTA: Se utiliz el programa DNAman para las determinaciones
40

50

12.27

67.9

Discusiones.
Para la determinacin del espectro de absorcin del DNA de los diferentes
plsmidos aislados se leyeron las muestras en un equipo Nano drop ASP-3700
que tiene una capacidad de 2L de muestra. La luz absorbida obtenida de los
dos plsmidos PCR TOPO 2.1 (T) y PCR TOPO-APE recombinante (A) oscilan
entre valores de absorbancia desde 0.007 (la ms baja) y 5.75 (la ms alta)
como se puede observar en la tabla 1. Estos valores obtenidos con respecto al
de otros equipos fue el ms bajo ya que los otros equipo reportaban
absorbancias mucho mayores a las obtenidas, incluso en algunas muestras se
tuvo que realizar una dilucin para logar la lectura en el equipo. Los valores tan
variados de las absorbancias de cada equipo pudo deberse a que en el botn
celular de las muestras de cada equipo no hayan tenido la misma cantidad de
clulas y por lo tanto la concentracin de los plsmidos haya variado
considerablemente. Otro punto que debemos de considerar para estos valores
es que en la extraccin no slo se aisl DNA sino que tambin RNA y la
presencia de ste pudo haber influido en las lecturas de la absorbancia. Sin
embargo como se esperaba, la absorbancias mximas se dio a una longitud de
onda de 260nm lo cual nos confirma que lo que se aisl fue realmente DNA y
esto debido a que El DNA absorbe en la regin ultravioleta debido a la
naturaleza aromtica heterocclica de sus constituyentes purnicos y
pirimidnicos. Aunque cada base tiene un espectro de absorcin nico, todas
las bases muestran mximos a 260nm, o prximos. Esta propiedad es
responsable de la absorcin del DNA a 260nm. (Devlin, 2000, p.578, 579.)
Para determinar la pureza del DNA se utiliz la absorbancia a 260nm, que es la
longitud de onda a la que ms absorben los cidos nucleicos, y a 280nm, que
es la longitud de onda a la que ms absorben las protenas con anillos
aromticos y sta se utiliza para saber si la muestra tiene cierta cantidad de
stas. El resultado de pureza de las muestras, tanto de plsmido PCR TOPO 2.1
(T) como del PCR TOPO-APE recombinante (A) dieron ambas con valores
mayores a 1.8, y de acuerdo con esto, stas soluciones son adecuadas para
trabajar por tener una mayor pureza o calidad.
La concentracin del DNA plsmidico no tiene valores fijos por lo cual,
dependiendo de la cantidad de clulas presentes para la purificacin del DNA,
dependern las concentraciones obtenidas.

El tamao del oligonucletido es de gran importancia cuando estos no llegan a

ser polmeros de alto peso molecular por lo que pudo observarse una variacin
de la Tm considerable entre los oligonucletidos con distinto nmero de bases.
La zonas altamente repetitivas dentro de una molcula de oligonucletidos
resulto ser de gran influencia haciendo variar la Tm en mayor proporcin que
las otras caracterizas observadas.
Otro aspecto que hay que considerar para la Tm, es que el par de bases
Guanina-Citosina forman 3 puentes de hidrgeno por lo cual al haber mayor
contenido de stos, se requiere de ms fuerza para poder romper stos
puentes de hidrgeno y por lo tanto en los oligonucletidos con mayor
contenido de Guanina-Citosina ciertamente se obtuvo una Tm mayor con
respecto a los oligonucletidos con una proporcin de Guanina-Citosina del
50%.

Conclusiones.

El material aislado fue DNA.

El mximo de absorcin del DNA se da a una longitud de onda de
260nm.
A mayor contenido de Guanina-Citosina mayor es su temperatura media
de desnaturalizacin.
El Tm no vara con la longitud, mientras ms grande la cadena de DNA
menos variacin habr en la TM.

Referencias bibliogrficas

H.V. Wyatt, When does information becomes knowledge? Nature vol.235:

86-89, 1972
M. G. Sevag, David B. Lackman, The isolation of the components of
streptococcal nucleoproteins in serologically active form j. biol. chem.
124: 425-436. 1938
Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid for
micro-organisms. J. Mol. Biol. 3:208-18, 1961
Bernstein, F. C., et al. (1977). The Protein Data Bank. A Computer-Based
Archival File for Macromolecular Structures. EuropeanJournal of
Biochemistry 80
Staden, R. (1977). Sequence data handling by computer.
NucleicAcidsResearch 4 (11). Pgs. 4037-4051
Sanger, F., et al. (1982). Nucleotide sequence of bacteriophage DNA.
Journal of Molecular Biology 162
Wilbur, W. J., Lipman, D. J. (1983). Rapid similarity searches of nucleic
acid and protein data banks. Proceedings of theNationalAcademy of
Sciences

Thomas M. Devlin, Bioqumica, libro de texto con aplicaciones clnicas.

3ra edicin, Editora Reverte 2000 p. 578-579.