VIROLOGÍA

✓Virus ADN
✓Virus ARN
✓Ingreso - Egreso viral
✓Genética y evolución viral. Antivirales
✓Manipulación y cuantificación viral
✓Virulencia y patrones de infección
✓Interacción virus - célula: oncogénesis, apoptosis,
mecanismos de evasión, modulación del SI.
✓Diagnóstico viral

M. Paula Fulgenzi-Las Tipas 2021

 CLASE 1 – INTRODUCCIÓN. ANATOMÍA VIRAL.
CLASIFICACIÓN DE VIRUS. REPLICACIÓN DE VIRUS ADN.

INTRODUCCIÓN
Hay muchas familias virales que pueden desde animales silvestres llegar hasta los humanos. Hay
mucha fauna silvestre que interviene en estas cadenas zoonóticas, por lo que hay que prestarles mucha
importancia.
“Hot spot” = puntos calientes en el mapa mundial en los que se supone que en algún momento van a
ocurrir eventos zoonóticos (pandemias emergentes), por la existencia de fauna silvestre con familias
virales desconocidas o poco estudiadas. El murciélago es fundamental en la cadena.

Un virus es, fundamentalmente, un ácido nucleico (ADN/ARN de

acuerdo al azúcar que constituya el nucleótido) (interior) + proteínas
(exterior).

El ácido nucleico puede ser degradado, por lo que tiene que estar
protegido por una cubierta proteica. Esta cubierta proteica se denomina
cápside y está formada por capsómeros. A veces también está
protegido por una envoltura.

→ Nucleocápside: es la proteína viral en estrecha relación con el ácido

nucleico. Es un concepto que se utiliza más en los virus de simetría helicoidal.

En el ácido nucleico está la información genética para que el virus haga nuevas copias.

Se llama virión a la nucleocápside (ácido nucleico + cápside) junto con su envoltura (si la tiene). Según
Racaniello este término está reservado a partículas infecciosas.

Componentes del virión

Cápside
Cubierta formada por capsómeros, integrados por unidades
estructurales: protómeros (de la misma o de diferentes
proteínas). En virus desnudos es la que contiene los sitios
que reconocen los receptores celulares.

Por ejemplo, parvo (que es muy pequeñito) tiene 20 caras con 3 proteínas,
dando un total de 60 unidades, existiendo una nomenclatura en virología, que
equivale a un T=1, y desde ahí, tenemos múltiples variaciones, y en mayores
tamaños.
Hay casos de viriones más grandes donde cada vértice no es un pentámero, sino que hay hexámeros
en el medio, como una pelota de fútbol, donde T=3, por lo que va a haber 180 unidades (proteínas).
Esta es la única manera que tienen los virus de aumentar su tamaño.

Envoltura
Bicapa de lípidos (la obtienen de la célula donde replican) y proteínas (virales: generalmente
glicoproteínas). Exteriormente están combinadas a oligosacáridos que reconocen receptores celulares y
son el target de la respuesta inmune.
Otras proteínas de la envoltura participan en la fusión de la misma con la membrana celular o con los
endosomas durante la entrada viral. Reconocer al receptor no es garantizarse el éxito de la replicación,
ya que todos los virus envueltos van a tener que fusionarse, para lo cual tienen que darse ciertas
características en la secuencia de las proteínas de superficie para que sea exitoso.
La envoltura se adquiere durante el budding (gemación) de las partículas virales desde la membrana
plasmática, nuclear, Golgi, o el retículo endoplasmático.
1
Estructura de un virión
Dos tipos de simetrías: helicoidal e icosaédrica.
Simetría icosaédrica:
Las estructuras virales son poliedros (lo que quiere decir que son cuerpos geométricos cuyas caras
son planas y encierran un volumen finito).

En esta imagen vemos un virus icosaédrico que tiene 20 caras triangulares y 12

vértices pentaméricos (juntando 5 caras se forma un vértice). Esta es la estructura
más pequeña y sencilla que puede tener un virus. A cada pared triangular la van a
integrar como mínimo 3 proteínas (iguales o diferentes), representadas por las
bolitas azules; el triángulo se llama protómero y el pentágono capsómero. Dentro
de este grupo se encuentran los adenovirus, que poseen una proteína de espícula
que termina en una proteína final, las cuales emergen de los vértices.

Esta cápside poliédrica icosaédrica puede estar rodeada por

una envoltura que proviene, en gran parte, de membranas
celulares de la célula infectada. A partir de esta, el virus va a
incorporar glicoproteínas virales. Por ejemplo, los virus
Herpes, tienen un espacio laxo entre la envoltura y la cápside
llamado tegumento, sobre el cual viajan componentes
celulares cuando el virus emigra de la célula, y puede
contener otros componentes importantes que participan, por
ejemplo, en la replicación.

En los virus desnudos (como los anteriores) los sitios de

reconocimiento de receptores están en la cápside.

Los virus no tienen mucha capacidad codificante (codificar: cuánto destinan del genoma para producir
una proteína), por lo que no van a tener un genoma muy largo para producir muchas proteínas
estructurales diferentes, si no más bien van a tener un genoma corto para una o dos proteínas y hacer
muchas copias de las mismas.
Un virus más grande, en cambio, puede tener un ácido nucleico más grande y producir más proteínas
estructurales.

Simetría helicoidal

A diferencia de la simetría anterior, el ácido

nucleico está fuertemente adherido a
múltiples copias de la misma proteína de la
cápside, que lo rodea y a la vez lo comprime
(como si fuese un resorte).
Este tipo de simetría se ve en virus ARN. El
más conocido es el virus del mosaico del
tabaco, porque fue el primero con el que se
empezó a trabajar.
No existe en virus animales un virus de
estructura helicoidal desnudo, pero sí los hay
en plantas. Siempre esta simetría va
acompañada de una envoltura.

El ingreso a la célula de un virus envuelto es totalmente diferente al ingreso de un virus desnudo.

Ejemplo: virus Influenza y Paramyxo.

2
https://talk.ictvonline.org/ En esta página web (ICTV – InteARNtional Committee on Taxonomy of
Viruses) podemos buscar como se clasifican los virus y más información sobre el tema. El ICTV utiliza
el sistema clásico de clasificación de virus.

Sistema clásico de clasificación

1. Órdenes/familias: basado en tres principios

❖ Consideran sólo el virus, no el hospedador.
❖ El tipo de ácido nucleico.
❖ Las características físicas del virión (simetría de la cápside, dimensiones, envoltura lipídica, etc).

2. Subfamilias/géneros: basado en otras características, antes biológicas, ahora genómicas y

moleculares (que generalmente coinciden con las características biológicas).

3. Especies/virus: una especie de virus se define como “una clase politética (definida por más de una
propiedad) de virus que constituye un linaje replicativo y ocupa un nicho ecológico particular”.

Ejemplo: BoHV-1/BoHV-5 están dentro del mismo género, ambos infectan al bovino, pero son
diferentes: BoHV-1 produce rinotraqueítis y BoHV-5 trastornos neurológicos. Un animal infectado con
BoHV-1 genera Ac que probablemente reconocerán al BoHV-5. Hay varios aislamientos de BoHV-5
pero todos son tipo 5 aunque tengan pequeñas diferencias (a nivel genómico) entre ellos, todos
producirán trastornos neurológicos y todos serán reconocidos por el mismo Ac monoclonal. Todos son
de la especie BoHV-5. Al virus se le pone el nombre del lugar donde fue aislado (por ejemplo BoHV-5
Buenos Aires 2005).
Ejemplo:
Orden: Herpesvirales
Familia: Herpesviridae
Subfamilia: Alphaherpesvirinae
Género: Mardivirus
Especie: Gallid alphaherpesvirus 2

Características biológicas para subdividir a la familia Herpesviridae

Alphaherpesvirinae Betaherpesvirinae Gammaherpesvirinae

- Rango de hospedadores - Rango de hospedadores más -Rango de hospedadores muy
variable (cruza especies). restringido. restringido.
- Ciclo reproductivo corto. - Ciclo reproductivo largo. -Infecta principalmente
- Destrucción de la célula - Citomegalia / dispersión más linfocitos y células epiteliales.
infectada / dispersión lenta en cultivo. -Poca producción de virus.
rápida en cultivo. - Latencia en muchos tejidos: -Asociado a tumores.
- Latencia en ganglios glándulas secretoras, riñón, -Latencia en linfocitos.
sensoriales. linfocitos en el caso de HHV-6 y -Ejemplo: virus de la fiebre
7. catarral maligna (BoHV-2),
virus del sarcoma de kaposi.

Realm Riboviria: incluye a todos los virus ARN y viroides que usan ARN pol ARN dependiente (grupos
III, IV y V de Baltimore).

3
Los virus no matan al hospedador, porque los mantiene vivos.

¿Qué pasa en el caso de la rabia? El humano/perro es un hospedador terminal (dead end), por eso
muere. Es decir, no es parte del ciclo de vida del virus. El murciélago es el responsable de mantener
vivo al virus, y es por eso que no muere al ser infectado.

Clasificación de Baltimore: la ruta hacia el mensajero

Está basada en las estrategias que usa cada grupo viral para
producir el mensajero. Esto se debe a que
independientemente del tamaño, la simetría, ácido nucleico,
y el resto de las características de cada virus, éste entra a la
célula para multiplicarse y para usurpar el sistema de
traducción. El principal objetivo del virus al entrar a la célula
es apoderarse del sistema de traducción para producir
proteínas: enzimas necesarias para generar nuevas copias
del ácido nucleico, y proteínas estructurales. Por esto, una
vez que el virus ingresa, va a tener que producir ARNm para
“convencer” a la maquinaria de síntesis proteica para que se
produzcan esas proteínas. Los virus son parásitos
obligatorios, que usurpan las maquinarias celulares.
El virus, por ende, generará moléculas que se parecerán a los mensajeros celulares (física o
funcionalmente). Ej: ARNm.
Dado que la célula sensa que hay algo pasando dentro, hay dos procesos importantes que los virus
manipulan durante el ciclo infeccioso:
- Respuesta inmune
- Apoptosis.

Curva de crecimiento viral de un solo paso

Período latente:
- Periodo de eclipse: el virus ingresa y
libera su ácido nucleico, se sintetizan
los componentes virales (estructurales
o no) y no se observan las partículas
virales dentro de la célula.
- Maduración viral: empiezan a
acumularse componentes virales y se
pueden observar partículas virales
intracelularmente.
Liberación viral: se empiezan a ver
partículas virales en el medio
extracelular.

Hay una primera división entre virus

ADN, virus ARN y virus que
retrotranscriben. Luego hay una subdivisión en siete grupos, dependiendo de la polaridad (+/-) y de si
es simple o doble cadena.
Los virus ADN (grupos I y II) son los que tienen menos problemas para producir el mensajero. Los que
tienen más problemas son los grupos III y IV.
Virus que retrotranscriben:
- Grupo VI: son ARN y producen ADN para insertarse en la célula y producir un nuevo ARN.
- Grupo VII: son ADN y producen ARN para insertarse en la célula y producir un nuevo ADN.
Independientemente de a qué grupo pertenezca el virus, siempre necesitará crear un mensajero para
poder utilizar la maquinaria de traducción de la célula infectada.
● Los virus ARN al producir ARN doble cadena activan la respuesta antiviral (IFN entre otros).
● Los virus tratarán de evitar que la célula se aniquile (apoptosis) o, si lo hace, que ocurra cuando al
virus le sea beneficioso.

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 Con los virus ARN hay otro problema. Hay virus ARN doble cadena y virus ARN simple cadena.
Los virus ARN simple cadena pueden tener polaridad positiva o negativa.
Aquel que tiene polaridad positiva es traducido directamente en proteínas. Ejemplo:
Picornavirus. Aquel que tiene polaridad negativa tiene que convertirse en un ARN con
polaridad positiva (mediante transcripción) y recién ahí podrá ser traducido. O sea, este no entra
a la célula como un mensajero, sino que tiene que convertirse en uno. A su vez, el ARN positivo
será el molde de nuevas moléculas negativas (replicación) que deberán pasar por el mismo
proceso para poder traducirse. Ejemplo: Rhabdovirus.
Todos los virus ARN tienen un momento donde van a producir una molécula doble cadena que será
censada por la célula.

https://viralzone.expasy.org/ En esta página web podemos obtener información de las distintas

familias de virus que se dan en clase.

Repasar: replicación, transcripción y traducción

RECORDATORIO DE GENÉTICA
El transcripto primario
(pre-ARNm) es el producto de
ARN que se obtiene
inmediatamente después de la
transcripción. Requieren de
modificaciones post
transcripcionales para la
obtención de moléculas de
ARN funcionales (ARNm). Está
formado por la unión de los
intrones (fragmentos no
codificantes) con los exones
(fragmentos codificantes). En
el proceso de maduración se
eliminan los intrones quedando
sólo los exones. Tras la
maduración, el ARNm maduro
es traducido a proteínas en los
ribosomas.

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 En general es correcto decir que el virus ADN
va a liberar su ácido nucleico en el núcleo.
Necesitan crear un mensajero (ARNm) a partir
de su transcripción, para lo que utilizan la
polimerasa celular, que está en el núcleo.

Ni bien el virus se pega a la célula, ésta ya

detecta que algo está mal (se dice que el virus
es “censado”). También hay un censado
temprano del ADN en el citoplasma, ya que la
célula no está acostumbrada a que el ADN esté
ahí. Esto activa una serie de mecanismos de
defensa en la célula.

La imagen ejemplifica lo que sucede una vez

que el ácido nucleico es liberado. A nivel del
núcleo los virus liberan el ácido nucleico, dando
comienzo a la etapa de transcripción temprana
o a la etapa de replicación.
La replicación, en donde se copia el ácido
nucleico, puede estar a cargo de proteínas del
virus o a cargo de ADN polimerasas de la
célula infectada.
Como resultado de la transcripción, se va a
producir un ARNm, que va a ir al citoplasma
para producir proteínas mediante su
traducción. Estas proteínas van a tener que
volver a ingresar al núcleo, que es donde está
ocurriendo todo, para continuar la formación
de la cápside. Algunas de estas proteínas no
son estructurales, sino que son enzimáticas (lo
que quiere decir que aparecen durante la replicación, ejercen su función, y después desaparecen).
Poxvirus es una de las excepciones de virus ADN. Replica en el citoplasma y no utiliza prácticamente
nada de la maquinaria del núcleo, sino propia (ADN polimerasas propias). Sin embargo para la
traducción los virus siempre utilizan maquinaria celular.

Virus ADN (compacto humano)

Poxvirus tiene una estructura compleja ya que es un virus ADN que replica en el citoplasma. Es por
esto que lleva una ARN polimerasa ADN dependiente en su virión → tiene su propia maquinaria para
sintetizar mensajero en el citoplasma. El virión “se lleva la enzima con él” para que ésta haga los
transcriptos en una etapa muy temprana, o sea, para que transcriba el genoma del virión y de inicio a
todo el proceso. Esto es así porque en el caso particular de la ARN polimerasa, para que ésta pueda
transcribir tiene que haber una polimerasa ya hecha. También va a tener que producir en algún
momento una ADN polimerasa ADN dependiente para la replicación.
Dentro de los virus ADN icosaedricos desnudos podemos tener virus simple cadena (+/-) o doble
cadena (circular o lineal). Los envueltos son doble cadena, también circular o lineal.
La transcripción se hace a partir de la cadena codificante del ADN, ésta es la cadena positiva. La
cadena opuesta es la cadena no codificante o negativa.

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 parvoviridae

● Es la familia de virus ADN más pequeños.

● Pertenece al grupo II (simple cadena)
● Dependen del status celular: no obliga a la célula a entrar
en división, directamente tiene tropismo por células en
división activa.

Género Protoparvovirus
❖ Parvovirus canino
❖ Virus de la panleucopenia felina
GENOMA
Esta molécula es una molécula de ADN simple cadena
positiva (codificante) lineal, ya que asumimos que tiene la
secuencia que posteriormente va a producir el mensajero.
El genoma de Parvo tiene algo muy particular en sus
extremos: terminan en forma de horquilla o loop dado por la
complementariedad que existe entre las bases → Sirve como
primer para que la polimerasa celular desde el extremo 3’
pueda hacer la copia genómica y completar la cadena simple
de ADN.
Los rectángulos están marcando los marcos de lectura (ORF:
Open Reading Frame). Hay un marco de lectura para el set de
proteínas no estructurales (gris), es decir, aquellas que
realizan una función durante el ciclo replicativo; y un marco de
lectura para el set de proteínas estructurales (verde).
Las dos flechas violetas que se ven en el genoma están
indicando donde están los promotores (promotor: región
regulatoria que estimula la transcripción). En estas flechas
inicia el transcripto (mensajero). Por cada promotor se obtiene
un set de transcriptos distintos. Y cada uno de ellos va a dar una gran variedad de ARNm luego del
splicing.
Los transcriptos tienen toda la apariencia de un mensajero celular y esto se debe a que es producido
por las polimerasas ADN dependientes (completan al mensajero mediante su replicación) y las ARN
polimerasas celulares (encargada de la transcripción).
Los ARN que se producen a partir del genoma son los mensajeros. Éstos tienen un cap en su extremo
5’ y una cola poliA en el 3’. El cap sirve para la traducción y la cola poliA para que no sea degradado
en el citoplasma. Se producen distintos mensajeros por la variación en el splicing de los mismos. Estos
darán lugar a proteínas ligeramente diferentes.
Por ejemplo, en la imagen vemos a los mensajeros antes de que pasen por el splicing: los tres primeros
mensajeros tienen una región no estructural (NS1) completa, mientras que los tres de abajo tienen
regiones incompletas (NS2P, NS2Y y NS2L), por lo que el splicing será distinto y darán origen a
distintas proteínas.
El splicing ocurre dentro del núcleo. El mensajero sale al citoplasma capeado, poliadenilado y
cercenado (cortado). Si un mensajero sale al citoplasma sin alguno de estos requisitos es eliminado.

Que hayan 2 promotores distintos para los sets de genes es una estrategia, y se regula la aparición de
diferentes transpcritos. Hay un mecanismo que activa los promotores en distinto tiempo (temporalidad)
para que primero aparezca un grupo de transcriptos y después el otro → las proteínas no estructurales
se sintetizan primero que las estructurales, estas van a participar en la síntesis de copias genómicas y
además, actúan como un factor de transcripción/ transactivador del segundo promotor o incluso, alguna
proteína, puede estimular a la célula a producir factores de transcripción para el segundo promotor, o
eliminar un represor (acción indirecta).

Algunos conceptos:
➔ Poco genoma y muchas proteínas: virus ADN pequeños, pero con muchas estrategias para obtener
muchas proteínas distintas. Estrategias durante la transcripción: splicing, diferentes promotores, y
7
 múltiples sitios de poliadenilación, para “sacarle el jugo” a un genoma muy pequeño.
➔ Proteínas estructurales y no estructurales producidas en distintos tiempos: concepto de
temporalidad.
➔ Proteínas virales multifuncionales (proteínas virales que también regulan promotores).
➔ Las estructuras secundarias sirven de señal para disparar procesos intracelulares cuando ingresen.
➔ Lo bueno de conocer las secuencias de ciertos virus es poder compararlas con las secuencias de los
mismos virus en otras partes del mundo y ver si en alguna región hubo algún cambio significativo.
Hay cambios que son más graves que otros.
➔ La parte más importante en la síntesis de proteínas, sean estructurales o no estructurales, es el
plegamiento. Es muy difícil conocer y recrear los plegamientos, sin embargo el de Parvovirus es
conocido.

Género Amdoparvovirus
❖ Aleutian mink disease virus: es un virus del visón.

En este caso también se generan diferentes

transcriptos obtenidos por tres factores:
- Hay un solo promotor a partir del cual se
obtienen distintos transcriptos que se producen
en diferentes tiempos. El promotor, cuando se
producen las no estructurales, apaga una porción
del mismo para estimular la síntesis de los
transcriptos siguientes.
- Hay splicing, cap y poliA. El virus manipula
el splicing y hace que este ocurra en distintos
momentos. Hay varias señales de
poliadenilación, ubicadas en diferentes sitios, y
puede ser que haya transcripción pero en ciertas
circunstancias se reconocen estos sitios ubicados
en distintas partes del transcripto. Al reconocerlo
se detiene la transcripción y queda más corto.
- Genoma lineal de ADNsc negativo.

Género Dependoparvovirus (incluye los adenoasociados)

Hay tres promotores, con lo cual se generan tres
ciclos de transcripción (sets temporales).
Se produce el fenómeno de leaky scanning, que
permite la síntesis de dos proteínas diferentes
utilizando una estrategia de traducción, a partir de un
mismo transcripto. El ribosoma ve un ATG primero y
después ve otro.
También hay splicing alternativo, pero en este caso
no es tan importante como en el anterior ya que
también hay más de un promotor. Este splicing es
más sencillo que el splicing del primer caso.
Hay un solo sitio de poliadenilación.
Dependen de otros virus (“virus helper”,
generalmente Adeno o Herpes) para completar su
replicación. Se utilizan en terapia génica.
Las proteínas del hospedador transcriben los
genomas en ARNm. La transcripción está regulada por los tres promotores P5, P19 y P40: las
transcripciones de P5 se expresan primero, seguidas por las de P19 y luego las de P40. El splicing
alternativo permite la expresión de tres ARNm diferentes para cada promotor. El ARNm se traduce en
VP2 o VP3 mediante leaky scanning.
Ocasionalmente este genoma viral se puede integrar al genoma del hospedador.

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 ¿Para qué sirven las proteínas no estructurales del virus si la encargada de replicar y de transcribir
su genoma es la polimerasa celular? Estas proteínas no estructurales no cumplen función de
polimerasas (porque para eso están las de la célula), sino que contribuyen al proceso de replicación
viral de otras formas. A su vez estas proteínas no estructurales son factores de transcripción del
promotor de las estructurales. Vamos a ver muchas proteínas con más de una función, y esto tiene
que ver con ser eficiente con poca secuencia codificante.
¿Cómo hace un virus para generar diferentes proteínas durante la transcripción? Diferentes
promotores, splicing, y diferentes sitios de poliadenilación. ¡Ojo! No hablar de Leaky Scanning ya
que este es un proceso involucrado en la traducción.

Replicación viral
El ciclo de replicación de los parvovirus varía
según se trate de Dependoparvovirus (lado
derecho) o un Parvovirus autónomo (lado
izquierdo).
Los parvovirus autónomos (Eritroparvovirus,
Protoparvovirus) necesitan de células que se
estén dividiendo constantemente para “robar”
polimerasas → afectan a las células
intestinales.
La unión a los receptores del hospedador inicia
la endocitosis del virión mediada por clatrina
en la célula hospedadora. El virión penetra en el
citoplasma mediante la permeabilización de la
membrana endosómica del hospedador. Luego
ocurre el transporte microtubular del virión hacia
el núcleo.
El virus ingresa prácticamente completo al
núcleo, pasando por el poro nuclear, donde
decapsida liberando el ácido nucleico (1) y la
molécula se completa con la cadena que le falta
(ya que la célula lo ve como incompleto,
entonces lo completa) (3) (es un virus simple
cadena y se tiene que convertir necesariamente en una doble cadena para producir el mensajero).
Se produce su transcripción temprana, ese primer set de transcriptos primarios maduran (splicing,
cap y poliadenilación), salen del núcleo (5) y se producen proteínas no estructurales.
Todas las proteínas que se sinteticen en el citoplasma luego tendrán que volver a entrar al núcleo (por
lo que tienen que tener una señal de localización nuclear). Notar que primero se sintetizan las proteínas
Rep 78/68 y luego el resto de las Rep. Esto tiene que ver con la temporalidad. La Rep 78/68 participa
en la síntesis de las copias genómicas doble cadena, para que haya más mensajeros y más
proteínas estructurales para formar la cápside.
La síntesis del ADN viral ocurre entre la síntesis de proteínas no estructurales (transcriptos tempranos)
y estructurales (tardíos), para tener mayor sustrato para la síntesis de mensajeros y de proteínas
estructurales. Es decir, primero se transcriben las no estructurales, que permiten la síntesis de más
copias genómicas del virus, para que haya más transcriptos tardíos que sinteticen las proteínas
estructurales. Entonces, la clave es que en vez de tener un solo molde ahora tenemos muchos moldes.
La replicación se produce a través del mecanismo de horquilla rodante, con la endonucleasa NS1
uniéndose covalentemente al extremo genómico 5'. Los genomas de ADNsc individuales se eliminan de
los concatémeros de replicación mediante un proceso llamado resolución de unión. Estos ADNsc recién
sintetizados pueden:
- Convertirse en ADNdc y servir como plantilla para la transcripción / replicación
- Encapsidarse para formar nuevos viriones que se liberan por lisis celular.
En el caso de los Dependoparvovirus, el virus ingresa y completa su genoma. Pero debe esperar al
ingreso de otro virus (virus helper) para que se realice la transcripción; si no está el helper el ADN se
incorpora al de la célula.

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Highlights
✓ El ADN viral es sintetizado por la ADN polimerasa celular con la ayuda de Rep (vía rolling
hairpin/horquilla rodante). Ver Viralzone.
✓ La síntesis de ADN viral ocurre entre la síntesis no estructural y estructural → disponibilidad de más
sustrato para la síntesis de mensajeros y por ende de proteínas.
✓ Algún componente de la ADN polimerasa celular no participa: posible origen de variantes (Rep está
relacionado).

Parvovirus es un virus muy estudiado y tiene una historia evolutiva muy importante, basada en su
proteína estructural VP2.
Estudiar una proteína estructural puede ser muy informativo ya que:
✓ Permite comparar secuencias (las diferencias están dadas por cambios en el ADN).
✓ Permite visualizar la historia evolutiva (ramas filogenéticas) de FPV-CPV: comenzó en felinos de vida
silvestre, luego pasó a caninos. Se generan pequeños cambios en las proteínas estructurales para que
el virus se acomode a su nueva realidad (cambio de hospedador).
✓ Permite analizar cómo los cambios en la secuencia de aminoácidos afectan la estructura terciaria de
VP2 y el reconocimiento del receptor celular. Si cambian las secuencias aminoacídicas, cambian los
plegamientos y al cambiar los plegamientos el espacio para reconocimiento del receptor se ve alterado
(el plegamiento determina la función de las proteínas).
El diagnóstico y tipificación se realiza por amplificación del gen VP2.

Polyomaviridae y Papillomaviridae
● Grupo I
● Virus pequeños.
● No dependen del status celular porque lo regulan ellos mismos.
● Doble cadena y circular.
● Ex Papovaviridae.
● Es bastante difícil que crucen de especie, están muy adaptados a su hospedador.

Polyomaviridae
Virus SV40, Virus JC, Virus BK y Merkel.
✓ A diferencia de Parvoviridae el ADN es circular y es doble
cadena.
✓ El ácido nucleico se combina con histonas para pasar
desapercibido en el núcleo de la célula.
● No suelen producir sintomatología en individuos
inmunocompetentes.
● Virus JC y Virus BK importantes en humanos. Pueden llegar a producir problemas en individuos
inmunosuprimidos.
● Virus SV40 tiene cierto potencial oncogénico.
● Merkel es el responsable de un carcinoma de piel descubierto hace poco.
● Transcripción en ambos sentidos (temprano de un lado y tardío del otro) → temporalidad.
● Hay un solo promotor que hace y regula todo (es además el origen de replicación).
● Codifica para la proteína LT, muy relacionada a oncogénesis (el virus necesita factores de
replicación, entre ellos la polimerasa).
● La integración al ADN celular no es necesaria y suele ser un accidente, desencadenando un
proceso oncogénico.
● La replicación del genoma ocurre en el núcleo celular.

En azul y celeste vemos el ADN doble cadena. Está combinado con

histonas (para engañar a la célula). Presenta una única región regulatoria
que contiene también el origen de replicación (Ori), marcado en rojo y
tiene una zona de transcripción temprana y otra tardía. A partir de la
región regulatoria, regula que zona se transcribe primero.
En verde vemos los transcriptos primarios que se generarán a partir

10
de la replicación del ADN doble cadena.
Podemos ver las flechitas apuntando para lados contrarios, lo que quiere decir que el virus está usando
las dos cadenas de su ácido nucleico para producirlos (y posteriormente proteínas).

La región regulatoria tiene:

✓ el origen de replicación
✓ secuencias regulatorias tempranas
(para la transcripción temprana del
punto 6) (muy cerca del Ori).
✓ promotor enhancer de secuencias
regulatorias tardías (para la
transcripción tardía del punto 11).

EXPRESIÓN GÉNICA
La transcripción es nuclear, en dos fases: temprano (replicación), tardío (ensamblaje / salida del virión).
Se expresan 5-9 proteínas a partir de los dos pre-ARNm mediante corte y empalme alternativo. Todos
los genes son transcritos por la ARN pol II del hospedador.

Transcripción temprana: la célula inicia todo este proceso, haciendo que la ARN polimerasa II celular
transcriba el ADN doble cadena en transcriptos primarios (6) al reconocer al promotor temprano de
la región regulatoria del virus mediante factores de transcripción; esto da origen al primer grupo de
ARNm (early mRNAs). En los transcriptos si no se produce splicing se genera una sola proteína (sT);
de producirse el splicing, se remueve un codón de stop, los exones se unen y se formará una proteína
más larga (LT). Esta proteína es muy compleja y multifuncional, participando de:
- Unión a la primasa de la polimerasa α celular.
- Unión al p-RB y p53 → relacionado a controlar el ciclo de replicación celular y el status activo celular
ya que induce a que la célula se encuentre en un estado activo de replicación (sin querer puede
producir oncogénesis).
- Unión al ADN.
- Unión de monómeros (rica en Zinc) → forma de hexámero.
- Actividad ATPasa → para cumplir la función de topoisomerasa.
- Función helicasa.
Todas estas colaboran con la polimerasa de la célula para hacer copias genómicas; una vez producidas
las LT va a regresar a la región regulatoria, apaga su propia transcripción y se une al TAg binding site,
activando la producción de moléculas de ADN. Ocurrido esto, actúa como transactivador de la
transcripción tardía (11), activando al promotor. Esto da origen al segundo grupo de ARNm (late
mRNAs) que generarán al segundo grupo de proteínas VP1, VP2 y VP3.

Notar que este virus, al igual que Parvovirus, hace uso de la temporalidad → sintetiza primero
proteínas tempranas que sirven para la creación de nuevas copias genómicas que posteriormente
darán origen a las proteínas tardías o estructurales. Como siempre, la razón de esto es tener más
ADN para poder producir más ARNm y así producir más proteínas.

sT tiene un rol durante la replicación del ADN.

Induce a la célula para que entre en fase S y
provea un pool de nucleótidos. Esto está muy
relacionado con la oncogénesis.
En esta imagen podemos ver como avanza la
duplicación del ácido nucleico y las dificultades
que tiene al ser un ADN circular.
La helicasa es la encargada de desenrollar al
ADN para que la polimerasa pueda avanzar.

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 1. SV40 (Simian Virus 40) se une a un MHC I en
la superficie de la célula.
2 y 3. Es endocitado (mediada por lípidos) y
transportado al retículo endoplasmático. Hay
reorganización de la cápside.
4 y 5. Es transportado al núcleo, donde se libera
el ADN doble cadena → solo ingresa el genoma.
6. Hay una transcripción temprana a cargo de la
ARN polimerasa II de la célula, que da origen a
los transcriptos primarios.
7. Los transcriptos primarios sufren
modificaciones post transcripcionales para
convertirse en ARNm y así salir al citoplasma.
8. Los ARNm son traducidos en proteínas
tempranas llamadas LT y sT (large T y small T).
9 y 10. LT vuelve a entrar al núcleo y se une al
Ori de SV40 para comenzar la síntesis de ADN.
Todos los otros componentes necesarios (aparte
de LT) para la replicación viral son provistos por la
célula (incluida la ADN pol). Los ADNs rojos se
destinarán a producir proteínas estructurales,
mientras que los celestes se combinarán con
histonas y formarán el futuro virión.
11. Aparte de participar en la replicación (10), LT
estimula la transcripción tardía de más transcriptos primarios de genes tardíos a partir de las copias
generadas en el punto 10.
12. Los transcriptos primarios sufren modificaciones post transcripcionales para convertirse en ARNm y
así salir al citoplasma.
13. Los ARNm del punto anterior son traducidos en las proteínas estructurales del virus: VP1, VP2 y
VP3.
14, 15 y 16. VP1, VP2 y VP3 vuelven al núcleo para formar los viriones que posteriormente serán
liberados por lisis celular.

Polyomavirus de periquitos (polyomavirus aviar).

En general esta enfermedad no es sintomática, pero sí existe una
presentación muy aguda en los periquitos.
Hay polyomavirus en todas las especies, y en teoría no cruzan de una
especie a otra.

Papillomaviridae
Morfología
- No envuelto.
- Pequeño, de unos 60 nm de tamaño.
- Cápside icosaédrica T=7, compuesta por 72 pentámeros.
● Al igual que Polyomavirus, es una sola molécula de ADN
doble cadena circular.
● Hay mucha variabilidad entre los Papillomavirus.
● Son muy específicos de especie, pero el papiloma bovino
puede cruzar a otras especies eventualmente, causando sarcoide equino, fibrosarcoma y sarcoides
en otras especies silvestres (ej: jirafas), tumores en felinos → Infección de tipo no productiva (no hay
producción de partículas virales), que produce una estimulación permanente en el tejido y que da las
lesiones características, y en algunos casos puede derivar en un proceso oncogénico. No es fácil
para un virus de una especie infectar de manera productiva otras especies (forma productiva: el virus
replica, deja progenie y se disemina), y cuando lo hace termina finalmente en una lesión oncogénica
o inflamatoria y no productiva.

12
EXPRESIÓN GÉNICA
Solo se transcribe una hebra del genoma y produce dos clases de proteínas expresadas por splicing
alternativo:
a) Proteínas tempranas: proteínas reguladoras no estructurales (E1-E7).
b) Proteínas tardías: proteínas estructurales L1 y L2.

● La transcripción es en un solo sentido (las flechitas van todas en una

sola dirección), lo que quiere decir que utiliza una sola cadena del
ácido nucleico (diferencia de Polyomavirus).
● Los transcriptos y/o proteínas surgen por splicing (hay mucho)
(muchas flechitas que se superponen) y, en otros casos, hay
promotores que son transactivados por otros genes virales.
● Varios promotores: transcripción temprana (enzimas) y tardía
(estructural). E6 y E7 son los promotores más importantes. Una de
las regiones regulatorias contiene el Ori.
● Rol importante de proteínas celulares activando/desreprimiendo
promotores virales (difícil establecer un cultivo celular que simule el
epitelio).
● Codifica varios genes también asociados a oncogénesis (la verruga es la manifestación física de
una división descontrolada de las células infectadas, pero no es un proceso oncogénico).
● Su ciclo de replicación depende del estatus celular.
● Los tipos de Papillomavirus están asociados a cuestiones serológicas y a secuencias que
corresponden a variaciones en L1.
● Las proteínas E son las proteínas tempranas (early) y las proteínas L son las proteínas tardías (late).
Hay 6 proteínas tempranas (siendo E6 y E7 las más importantes) y 2 proteínas tardías.
● Al igual que Polyomavirus, primero se sintetizan las proteínas tempranas, después se duplica el
ácido nucleico, y por último se sintetizan las proteínas tardías.

Función de las proteínas tempranas y tardías

Proteínas Tamaño aprox Función / actividad
virales (kDa)
E1 68,1 Reconocimiento del origen de replicación / Helicasa
E2 34,3 Reclutamiento de la E1 al Ori / Modulación de la transcripción de
los promotores tempranos.
E4 12,5 Función auxiliar en la salida viral
E5 5,2 Interacción y activación del receptor del factor de crecimiento
derivado de plaquetas β (PDGF-β) → No todos lo tienen, si lo
tienen tienden a ser más oncogénicos.
E6 15,8 Blanco en la proteína supresora de tumores p53
E7 13,6 Unión a proteínas de la familia retinoblastoma (pRB)
L1 55,5 Componente de la cápside viral
L2 50,5 Componente de la cápside viral

13
El ciclo de replicación de Papillomavirus es dependiente del status de diferenciación celular

A la derecha vemos un epitelio normal y a la izquierda un epitelio infectado con Papillomavirus. No se

puede hacer crecer Papilloma en el laboratorio porque no se puede replicar este proceso de
diferenciación de la epidermis que ocurre en un ser vivo*. El Papillomavirus está en la superficie, en la
piel, y necesita una lesión en un lugar en particular para que el proceso progrese.
En una situación normal, la diferenciación de las células del estrato basal comienza cuando la mitosis
se detiene, es así que puede avanzar a los siguientes estratos hasta llegar a la superficie.
Estratos: estrato basal → estrato de queratinocitos parabasales → estrato escamoso → estrato
de descamación.
El ciclo de infección del virus comienza al infectar una célula de los estratos más basales y avanza con
la célula infectada hasta que ésta llega al estrato final y finalmente es liberado. O sea, la célula
infectada es siempre la misma. La replicación viral se divide en dos pasos distintos relacionados con el
estado de diferenciación de la célula epitelial del hospedador:
1) Replicación del plásmido en las células del estrato basal. La infección primaria de estas células se
da, generalmente, por el ingreso del virus a través de una abrasión (si no es muy difícil que llegue a
los estratos basales). Este estadío corresponde a la replicación del ADN viral en sincronía con el
ADN de la célula hospedadora para asegurar un promedio de un genoma viral por célula basal.
- La unión de las proteínas virales a los receptores del hospedador media la endocitosis en
vesículas en la célula epitelial escamosa basal.
- Transporte al núcleo y desprendimiento del ADN viral.
- Transcripción y traducción de la región temprana de las proteínas tempranas E1 y E2
- Replicación nuclear del ADN viral en estado estacionario. Requiere el origen de la replicación
del ADN en cis y las proteínas virales E1 y E2 en trans.
2) Replicación vegetativa, que ocurre en queratinocitos diferenciados. En estas células, que ya no se
someten a la síntesis de ADN celular, hay una explosión de síntesis de ADN viral con producción
activa de viriones. A medida que la célula asciende para diferenciarse, cesa la división celular,
comenzando con la expresión de E6 y E7. Éstas últimas se unirán con p53 y con p-RB (proteínas
del Ori), modulando la actividad de la célula para activarla y que haya componentes celulares que
permitan duplicar el ácido nucleico. Se podría decir que E6 y E7 cumplen juntas la misma función
que cumple LT sola en Polyomavirus. En este momento el virus comienza a estimular a la célula
para que se active y prolifere cuando normalmente estaría frenando su mitosis. Se convierte en una
célula amplificadora.
- Síntesis de ADN viral vegetativo: la célula sigue avanzando (haya o no proliferación celular),
llega al estrato escamoso, y sigue habiendo episomas virales y expresión de E6 y E7, para
mantener a la célula en actividad.

14
 - Transcripción de la región tardía y síntesis de proteínas de la cápside L1 y L2: Ya llegando al
final, hay expresión de E4, que colabora con la liberación de los viriones y, finalmente, cuando
llega al estrato de descamación comienza a sintetizar proteínas tardías/estructurales (L1 y L2)
- Ensamblaje de cápside nuclear y liberación de virus.

Lo interesante de esto es que el virus

logró, a través de procesos
evolutivos, ir produciendo diferentes
proteínas a lo largo del proceso de
diferenciación de la célula para tener
finalmente las proteínas estructurales
en el último estrato y solamente
producir viriones cuando éstos
pueden ser liberados.
La manifestación de este ciclo es la
aparición de una verruga, y es un
proceso benigno. En todo este
proceso el virus está en estado
episomal/extracromosomal, o sea,
nunca se inserta en el genoma.

Entonces, en un proceso normal el virus está en estado episomal (en la imagen: “HPV episomal DNA”).

En un proceso oncogénico el virus se inserta en el genoma (en la imagen: “Integrated HPV DNA”).
En este proceso se mantienen activos E6, E7 y E2, que hacen que la célula se mantenga activa en
forma permanente sin ser eliminada por los mecanismos normales de apoptosis o de stop del ciclo
celular. Es un accidente, ya que matar al hospedador con un proceso oncogénico no le genera ningún
beneficio al virus.

Existen diferencias de patogenicidad según el tipo de Papillomavirus. Los tipos 16, 18, 31, 33, 35 y 39
están asociados a neoplasias por insertarse en el genoma.

Existe una vacuna: Vacuna Gardasil → presenta proteínas estructurales que simulan formar una
cápside (humanos).

*El ciclo Replicativo de los papilomavirus se caracteriza por realizarse en tejidos estratificados. En los
distintos estratos tisulares se realizan distintos eventos del ciclo replicativo de acuerdo con la
diferenciación celular propia del estrato. Como los cultivos son monocapas, todas las células son
iguales. El virus se va "armando" en etapas, en el estrato córneo recién se arma la cápside, se
necesitan distintos estados de diferenciación para que se forme el virus.

Adenoviridae
Género Mastadenovirus. Especie Adenovirus
canino tipo 1.
● Grupo 1
● ADN doble cadena lineal.
● Manipulan el sistema inmune.
● Codifican su propia ADN polimerasa.
● Utiliza mucho splicing y diferentes señales de
poliadenilación. Con este virus se descubrió el
splicing.
● La transcripción ocurre en los 2 sentidos, por lo que usa las dos cadenas (superior e inferior),
habiendo promotores de ambos lados.
● Rol TP/VA.
● Rol de algunas proteínas tempranas: E1A, E1B, E3, E4.

15
El ADN doble cadena está ejemplificado en azul y celeste.
En los extremos 5’ del ácido nucleico hay una proteína llamada TP o proteína terminal → Función:
esconder extremos libres de la degradación, y señalización de la polimerasa viral para hacer las copias
genómicas.
Las flechitas apuntan para ambos lados, lo que quiere decir que este virus utiliza las dos cadenas →
Hay transcripción en ambas direcciones.
Hace uso de la temporalidad.
Donde está la región codificante para POL (por ejemplo), también codifica para genes de la cadena
opuesta, por lo que el transcripto de una cadena es complementario con el de la otra. Estos dos, por
complementariedad son capaces de unirse; la célula puede censar el ARN doble cadena intracelular
iniciando una señal de alarma.
El hecho de que sea más grande y pueda hacer más proteínas hace que pueda dedicar ciertos genes a
hacer proteínas que manipulen el sistema inmune.

Hay transcriptos primarios tempranos y tardíos que darán origen a proteínas tempranas y tardías.
✓ E1 se divide en E1A y E1B. Son genes estimuladores del estatus celular (¿oncogenes?) en caso de
que la célula no esté replicándose, ya que si bien el virus tiene su propia polimerasa, en la célula tiene
que haber un pool de nucleótidos junto con otros factores necesarios para que el virus se replique
(misma función que E6 y E7 de Papillomavirus). En caso de que la célula esté activamente replicándose
estos genes no son esenciales.
✓ E2 se divide en E2A y E2B. Éstos son parte de la ADN polimerasa viral. Requiere de su propia
polimerasa porque tiene una estructura muy extraña como para engañar a la polimerasa de la célula.
✓ E3 inhibe la expresión de MHC-1.
✓ E4 inhibe la respuesta apoptótica celular capturando proteínas celulares.
✓ VA (“Viral Associated RNA”), se une a la enzima PKR e inhibe la producción de IFN. No da origen a
ninguna proteína, actúa en la célula directamente como el ARNm. Participa en un fenómeno llamado
“interferencia” en el que se degrada un ARNm mediado por otro ARNm → este ARNm producido por el
virus (VA) se pega por complementariedad al ARNm que codifica para el IFN y esta es la señal para
que la célula lo degrade y no haya producción de IFN.
Se podrían eliminar los genes de modulación de respuesta inmune, y el virus seguiría replicando,
aunque le costaría más → concepto de genes esenciales vs genes no esenciales. Por ejemplo, para
atenuar este virus, podría eliminar E3, lo que le resultaría en la expresión de MHC I, o VA, que no frena
al IFN.

¿Cómo se descubrió la función de VA?

Siempre que se quiera conocer la función de algún gen, y
si es esencial o no, se lo deletea y se observa que pasa.
Se corre el riesgo de deletear un gen esencial y no
observar nada (o también si se deletea un gen
multifuncional por ejemplo).
En este experimento se le agrega IFN al Adenovirus con
y sin VA y se observa si “se la banca o no se la banca”.

16
El eje X son las horas después de la infección con Adenovirus y el eje Y es el título viral. La flecha lila
marca la curva del virus wild-type (no deleteado) con y sin el agregado de IFN. Se mantiene igual,
prácticamente no hay diferencia entre ambas curvas → “se la banca” porque tiene VA.
La flecha rosa marca el virus deleteado con y sin el agregado de IFN. Podemos ver que cuando se le
agrega IFN la curva baja porque el virus, al no tener VA, no puede luchar contra el mismo.

Replicación
1 y 2. Adenovirus ingresa a la célula por
endocitosis.
3 y 4. Luego pierde su envoltura y su ADN
doble cadena lineal ingresa al núcleo de la
célula.
5. Hay una transcripción inmediata temprana a
cargo de la ARN polimerasa II celular, que da
origen a los transcriptos primarios E1A.
6. Los transcriptos primarios E1A sufren
modificaciones post transcripcionales para
convertirse en ARNm y así salir al citoplasma.
7. Los ARNm son traducidos en proteínas
inmediatas tempranas también llamadas E1A.
8 y 9a. E1A vuelve a entrar al núcleo para
estimular la transcripción temprana de más
transcriptos primarios, también a cargo de la
ARN pol II celular.
9b. En esta fase temprana de la infección
también se da la transcripción de los genes VA
por la ARN pol III celular.
10 y 11. Los transcriptos primarios sufren
modificaciones post transcripcionales para
convertirse en ARNm y así salir al citoplasma, donde serán traducidos en proteínas tempranas (entre
ellas están las polimerasas que participarán en la replicación viral).
12 y 13. Las proteínas tempranas son importadas nuevamente al núcleo para participar en la
replicación viral (utilizando la polimerasa viral) junto con otras proteínas celulares.
14. Por un lado, las nuevas moléculas ADN doble cadena sirven de molde para más replicación. A
estos genomas se une la proteína Pre-TP, ya que forma parte del método de copia del ácido nucleico de
la polimerasa viral, que debe reconocerla para iniciar la síntesis.
- La Pre-TP hace un reconocimiento de la proteína TP en el extremo del ácido nucleico, a la
que rápidamente se une.
- La POL se asocia a la Pre-TP iniciando la síntesis de la copia genómica, desplazando la
cadena que tiene la TP (proteína terminal). La cadena simple desplazada se une a la ADN
binding protein (DBP), que luego va a ser convertido en doble cadena.
15. Por otro lado, también sirven de molde para la transcripción tardía de más transcriptos primarios.
16. Los transcriptos primarios sufren modificaciones post transcripcionales para convertirse en ARNm y
así salir del citoplasma. Participan en este punto E1B y E4.
17. Los ARNm son traducidos en proteínas tardías o estructurales en el citoplasma. En este punto se
necesita de VA.
18. Las proteínas tardías entran al núcleo.
19. Se forman los viriones inmaduros no infecciosos a partir de las proteínas estructurales y de los
ADN doble cadena.
20 y 21. Se forman los viriones maduros infectantes y son liberados al destruir la célula.

17
Highlights del ciclo de replicación de Adenovirus
✓ La síntesis de ADN viral lo hace la polimerasa del virus (13).
✓ Transcripción más compleja y dividida en 3 etapas: inmediato temprano, temprano y tardío.
✓ La síntesis de ADN se realiza después de la etapa temprana y antes de la etapa tardía (13).

herpesviridae
BoHV-1, BoHV-5, EHV-1, EHV-4, CMV de diferentes
especies, OvHV-2 (Fiebre Catarral Maligna), Herpes
canino.
• ADN doble cadena lineal.
• Grupo I.
• Virus envuelto.
• Poco splicing.
• Timing y programa de síntesis similar a Adenovirus.
• Pueden hacer una infección lítica o una infección latente.

Herpesvirus tiene 135 genes.

Si bien Herpesvirus tiene un genoma lineal, se ejemplifica de manera
circular ya que cuando entra a la célula se circulariza. Esta estrategia
es para no mostrar extremos libres y así no ser degradado por la
célula.

Presenta
dos regiones: región única larga (UL) y región única chica (US). Cada
región está limitada por una secuencia repetitiva interna (IRL e IRS), y
por otra terminal (TRL y TRS).
Las flechitas apuntan para ambos lados, lo que quiere decir que hay transcripción de las dos
cadenas.
Hace uso de la temporalidad. Es tal la
magnitud de la transcripción que se divide en
inmediato temprano o α, temprano o β, y tardío
o Ɣ.
Al ser virus grandes, generalmente no hay
mucho splicing, sino que cada gen tiene su
propio promotor.

Infección lítica por Herpesvirus

O productiva, dado en muchos tipos celulares,
y también en las neuronas.
1, 2, 3 y 4. El virus se fusiona con la membrana
plasmática de la célula y es liberado al
citoplasma.
5a. La nucleocápside viral (con el AN en su
interior) se une a los microtúbulos y es
transportada al núcleo.
5b. Algunas proteínas (VP16) son
transportadas al núcleo.
6. Otras proteínas (Vhs) permanecen en el

18
citoplasma.
7. La nucleocápside viral se acopla a los poros del núcleo y libera su ADN doble cadena lineal al
interior del mismo.
8. VP16 interactúa con proteínas de la célula y estimula la transcripción inmediata temprana (reconoce
una región que es común a todos los promotores inmediatos tempranos) de transcriptos primarios,
llevada a cabo por la ARN polimerasa II celular.
9. Los transcriptos primarios sufren modificaciones post transcripcionales para convertirse en ARNm y
así salir al citoplasma, donde serán traducidos en proteínas inmediatas tempranas (proteínas α).
10. Las proteínas α entran al núcleo para activar la transcripción temprana de más transcriptos
primarios y también para regular la transcripción inmediata temprana del punto 8.
11. Los transcriptos primarios sufren modificaciones post transcripcionales (rara vez splicing) para
convertirse en ARNm y así salir al citoplasma, donde serán traducidos en proteínas tempranas
(proteínas β) (ej: ADN polimerasa viral).
12. Algunas proteínas β vuelven a entrar al núcleo para participar en la replicación de ADN, otras
quedan en el citoplasma.
13. Se inicia la replicación viral en forma de concatémeros, regulada por las proteínas β del virus que
actúan como ADN polimerasa.
14. Las nuevas moléculas ADN doble cadena sirven de molde para la transcripción tardía de más
transcriptos primarios.
15. Los transcriptos primarios sufren modificaciones post transcripcionales (rara vez splicing) para
convertirse en ARNm y así salir al citoplasma, donde serán traducidos en proteínas tardías (proteínas
Ɣ).
16a, 16b, 16c, 16d. Diferentes funciones de las proteínas Ɣ. Algunas van a ser sintetizadas por
polirribosomas libres, y otras deben ser modificadas en retículo endoplasmático y Golgi, ya que son
glicoproteínas. Estas son expresadas en la membrana nuclear, que luego el virus lleva cuando emigra.
17. Las proteínas Ɣ son proteínas estructurales, por lo que vuelven a entrar al núcleo para formar la
nucleocápside. Algunas permanecen en el citoplasma.
18. Los concatémeros de ADN se clivan individualmente para que vaya dentro del virión.
19, 20, 21, 22, 23 y 24. El virus sale del núcleo llevando la membrana nuclear con sus glicoproteínas,
transita por retículo endoplásmico, va intercambiado membranas hasta que finalmente ingresa al Golgi.
Acá algunas de las glicoproteínas son modificadas, y por último es liberado por exocitosis.

Highlights del ciclo de replicación de Herpesvirus:

✓ Timing y programación similar a Adenovirus.
✓ Poco splicing.
✓ Síntesis de ADN viral realizado por la polimerasa viral con cierta dependencia de factores celulares
(similar a Adenovirus).
La profesora dijo que nadie va a preguntar “¿Cuál es el gen inmediato temprano de Herpesvirus?”, sino que van a
preguntar, por ejemplo,”¿Cómo maneja Herpesvirus la temporalidad?”. La respuesta a esto sería que los genes
inmediatos tempranos tienen que sintetizarse para que se puedan sintetizar los genes tempranos, que a su vez
también son necesarios para la síntesis de genes tardíos.

Infección latente por Herpesvirus

Ocurre en neuronas del SN periférico.
Ganglio trigémino.
Pasos 1 al 7 son iguales que en la infección
productiva, con la diferencia de que el ADN
se circulariza en el núcleo en forma de
nucleosoma.
8. No se sabe si las proteínas VP16 son
transportadas al núcleo en este tipo de
infección.

19
9. No hay transcripción, excepto por un solo transcripto primario llamado LAT (Transcripto Asociado a
la Latencia).
10. El transcripto primario LAT sufre modificaciones post-transcripcionales (splicing), y un intrón
estable, en forma de lazo, llamado 2-kb LAT es mantenido en el núcleo.
11. Los ARNm maduros salen al citoplasma donde se cree que varios ORF (Open Reading Frames) son
traducidos en proteínas LAT (se cree que inhiben la apoptosis).

Que esté en LATENCIA quiere decir que está el ADN doble cadena y nada más. Está combinado con
histonas formando nucleosomas y es extracromosomal, o sea, no está integrado al genoma.

poxviridae
● Grupo I
● Virus ADN doble cadena lineal, envuelto.
● Replica en citoplasma (ARN pol viral ADN dependiente).

- Es el virus más
complejo dentro de los
virus ADN.
- Tiene un core
central, una
membrana del core, en
el interior está el ácido
nucléico con enzimas
virales, y luego hay una membrana interna y
otra externa, con glicoproteínas virales.

Ciclo de replicación
1. Fusión de las membranas viral y plasmática y
liberación del virus en el citoplasma. Dispara una
modificación en la morfología viral, parte del
desensamblaje (pasa de forma de 8 a ser más
redondeado u ovoide)
2. Transcripción temprana de transcriptos
primarios en el citoplasma, por la ARN pol viral
(ADN dependiente) (la lleva en el virión como
proteína).
3. Traducción de los transcriptos primarios en
proteínas tempranas, llevada a cabo por la
maquinaria celular.
4. Algunas proteínas tempranas tienen secuencias
similares (son homólogas) a las de los factores de
crecimiento celulares, por lo que pueden inducir la
proliferación de las células vecinas. Otras
contrarrestan el sistema inmune del hospedador.
5. Otras proteínas tempranas inducen la pérdida de
la envoltura nuclear, completando el desensamblaje
y liberando el ADN doble cadena en el citoplasma.

20
6. Otras proteínas tempranas actúan como ADN polimerasas, mediando la replicación.
7. Las nuevas moléculas ADN doble cadena pueden servir de molde para más ciclos de replicación
viral.
8. El ADN viral + proteínas tempranas estimulan la transcripción intermedia de más transcriptos
primarios. Esta transcripción intermedia necesita de proteínas virales de iniciación, producto de los
genes tempranos, y también de una proteína celular llamada Vitf2 proveniente del núcleo de la célula.
9. Los transcriptos primarios son traducidos en proteínas intermedias.
10. Las proteínas intermedias participan en la transcripción tardía.
11. Los transcriptos primarios son traducidos en proteínas tardías/estructurales.
12. La formación de la partícula infectante se da perinuclear.
13. Se forman los viriones inmaduros.
14. Los viriones inmaduros maduran y pasan a tener forma de ladrillo, pudiendo ser liberados por lisis
celular. Estos son estables, y tendrían que ver con la transmisión entre hospedadores.
16. Otra opción es que los viriones inmaduros adquieran una segunda cubierta (aparte de su envoltura)
del compartimiento de Golgi y formen viriones con doble envoltura (“virión intracelular envuelto”).
17. Estos viriones con doble envoltura van a la superficie celular y se fusionan con la membrana
plasmática, pasando a ser viriones célula-asociados. Estos viriones son más lábiles y participarían
principalmente en la dispersión de estas partículas dentro del mismo hospedador hacia diferentes
tejidos.
18. Estos viriones célula-asociados pueden inducir la polimerización de la actina y transferirse a las
células vecinas, o pueden disociarse de la membrana plasmática celular y pasar a ser viriones
extracelulares envueltos (pero sin cubierta, la pierden cuando salen de la célula). Estos viriones
extracelulares se asociarán a otra célula y es en este ciclo de infección que perderán su membrana más
externa y pasarán a ser viriones maduros.

Highlights del ciclo de replicación de Poxvirus

✓ La replicación ocurre en el citoplasma. Necesita llevar su propia maquinaria de transcripción y no
puede usar splicing.
✓ El gen celular Vitf2 es esencial para el virus.
✓ Transcripción temprana, intermedia y tardía (temporalidad).
✓ Puede producir partículas con una o con dos envolturas.

ASFARVIRIDAE
● Virus ADN doble cadena
● Virus de la peste porcina africana → Género Asfivirus
● Virus envuelto → envoltura muy pegada a la cápside.
● T=189
● En el interior hay una membrana interna, un matrix shell en estrecho contacto con el ácido nucleico.
● Codifica para aprox 150 proteínas.
_____

CONSULTAS
3 ETAPAS: TEMPRANA, INTERMEDIA, TARDÍA,
- Manipular la fisiología de la célula para su beneficio (se activan por factores de transcripción que
están en la célula o en el virus (como ej herpes). Pueden inhibir la respuesta inmune, manipular a la
célula para que entre en determinado estado fisiológico que necesita el virus para su replicación.
- Duplicación del genoma.
- Proteínas estructurales de la célula (se activan por factores de transcripción tempranos). Producen
proteínas necesarias para la cápside o envoltura.
1ro transcribe unas y después otras por una cuestión energética. Las de la cápside no las produce
antes porque para que producirlas antes si no tiene genoma viral para envolver.

21
22
Virus traducibles
- Polaridad positiva.
- Se interpretan como mensajeros → No se convierten en nada.

Virus no traducibles
- Doble cadena o simple cadena negativa.
- Convierten su ARN en uno complementario de polaridad positiva.
- Llevan en el virión una ARN polimerasa ARN dependiente (YA HECHA → proteína estructural).

Problemas de los virus ARN

✓ Copiar ARN de ARN.
✓ Exponer estructuras doble cadena ARN (altamente censados por los mecanismos del SI).
✓ Deben producir mensajes monocistrónicos porque no pueden usar splicing (excepto
Orthomyxoviridae y Bornaviridae que replican en el núcleo y usan el splicing).

Estrategias para la síntesis de ARNm

✓ Variabilidad*: a partir de poco genoma.
✓ Temporalidad: se deben producir proteínas, y se debe transactivar genes en su momento adecuado.
✓ Multifuncionalidad: no son virus grandes (excepto coronavirus), tiene pocas proteínas
multifuncionales.

*Variabilidad: la polimerasa de los virus ARN comete errores incorregibles bastante frecuentemente.
Esto hace que la variabilidad trabaje en dos sentidos para el virus: a favor y en contra. En contra porque
demasiadas mutaciones generan una población demasiado incapacitada, y a favor porque ciertas
mutaciones le dan al virus la capacidad de adaptarse (puede que los viriones mutados no repliquen bien

23
ante una determinada presión de selección, pero sí ante otra presión de selección).

El virus genera un equilibrio entre lo que es bueno y lo que es malo. Esto se ve reflejado en el tamaño
de los genomas. Los virus ADN pueden tener un genoma inmenso ya que tienen una polimerasa más
precisa. Pero los virus ARN tienen un límite en cuanto a su tamaño, porque si tuvieran mucho genoma
(+ una polimerasa que comete errores) tendrían más posibilidades de generar errores y genomas
fallados.

Conclusiones
✓ El virus genera una población en equilibrio (con errores y sin errores), lo que le da la posibilidad de
adaptarse.
✓ La presión de selección selecciona a la población. Un individuo que no es bueno para algo puede ser
bueno para otra cosa.

picornaviridae. grupo IV
Morfología
No envuelto, esférico, de unos 30
nm de diámetro.
T = cápside pseudo3 que rodea
el genoma del ARN desnudo.
La cápside consta de una
disposición icosaédrica
densamente empaquetada de 60 protómeros, cada uno de los cuales consta de 4 polipéptidos, VP1, VP2,
VP3 y VP4. VP4 se encuentra en el lado interno de la cápside.

Genoma monopartito, ARN simple cadena (+) lineal poliadenilado, compuesto por un único ORF que
codifica una poliproteína.

Hay dos regiones no traducidas en el ARN genómico viral (UTR): una en 5’ y otra en 3’.

Extremo 3’: la polimerasa viral coloca una cola polyA → la polimerasa es multifuncional.
Extremo 5’: hay una “hoja de trébol” (cloverleaf), que es una estructura secundaria, donde se va a unir
covalentemente la proteína VPg (que tiene un rol en la replicación del ARN; cuando se traduce el ARN
es sacado, pero si se hacen copias genómicas está presente). Hay otras estructuras secundarias
importantes para la replicación del ARN.
El UTR largo en el extremo 5’ contiene un sitio de entrada del ribosoma interno = IRES → son
estructuras de ARN que
permiten el inicio de la
traducción independiente del
CAP y son capaces de
iniciarla en el medio de un
ARNm → La célula la
interpreta como un CAP (el
virus no tiene CAP).
El IRES permite la traducción
directa de la poliproteína. La

24
poliproteína es procesada inicialmente por la(s) proteasa(s) vírica(s) en varias proteínas precursoras y
maduras para producir proteínas estructurales, replicasa, VPg y una serie de proteínas que modifican
la célula hospedadora, lo que finalmente conduce a la lisis celular.
La región P1 codifica proteínas estructurales. Las regiones P2 y P3 codifican las proteínas no
estructurales asociadas con la replicación. La UTR 3' más corta es importante en la síntesis de
cadenas (-).

L es una proteína líder N-terminal adicional presente en algunos géneros que puede ser una cisteína
proteinasa similar a la papaína (géneros aftovirus, erbovirus) o tener otra función (géneros kobuvirus,
cardiovirus, teschovirus, sapelovirus, senecavirus).

El genoma es de polaridad positiva y codifica para una poliproteína que contiene en su interior
varias proteínas individuales. Esta es clivada durante la transcripción por dos proteasas virales (2Apro
y 3Cpro) para producir proteínas estructurales y no estructurales. Estas primero se deben autoclivar.

La parte izquierda del

genoma codifica para
P1, que es clivada
por 3Cpro en VP0,
VP3 y VP1. Luego
VP0 es clivada por
una proteasa
desconocida en VP4
y VP2. Son
estructurales.
La parte derecha del
genoma codifica para
proteasas y para
proteínas no estructurales. Notar que la proteasa 3Cpro está codificada en un precursor del que también
va a surgir la polimerasa (3Dpol).
A diferencia de lo visto antes, la temporalidad está dada por la secuencia que sigue la proteasa al
clivar las proteínas, no por haber un mensajero para cada proteína.
Destina proteínas que van a inducir a la célula a que produzca muchas vesículas membranosas, donde
la polimerasa va a hacer las copias.

Ciclo de replicación citoplasmático

1. El virión se une a un receptor celular y
media la endocitosis.
2. La cápside sufre un cambio conformacional
y libera VP4 que abre un poro en la
membrana endosomal del hospedador y el
ARN genómico viral penetra en el
citoplasma de la célula hospedadora.
3. La proteína VPg (representada como un
pequeño círculo en el extremo 5’) es
removida, y el ARNm se asocia con los
ribosomas.
4. Cuando el ribosoma se une al IRES del
ARNm se inicia la traducción, lo que dará
como resultado un precursor de la
poliproteína.
5. La poliproteína es clivada después y
durante su síntesis para la producción de
proteínas virales individuales (P1, P2 y P3,
que luego se clivarán en las proteínas antes
nombradas). La poliproteína regula su
traducción.
6. El virus destina proteínas que inducen a la
25
 célula a producir vesículas membranosas derivadas del RE. Las proteínas que participarán en la
síntesis de ARN viral (proteínas no estructurales) son transportadas a vesículas membranosas. La
síntesis ocurre en la superficie de las vesículas, que concentran todos los elementos necesarios
para la síntesis de ARN.
7 y 8. La hebra (+) de ARN es transportada a las vesículas de membrana, donde es copiada en un
ARN doble cadena. Las vesículas tendrían como función ocultar a la célula el ARN doble cadena,
entre otras.
9. Las hebras (-) de ARN recién sintetizadas sirven de molde para la síntesis de nuevas hebras (+) de
ARN.
10. Algunas de las hebras (+) de ARN recién sintetizadas son traducidas luego de la remoción de la
proteína VPg para formar más proteínas.
11. El clivaje de P1 da como resultado proteínas estructurales (VP1, VP2, VP3 y VP4).
12. Estas proteínas estructurales se asocian con las hebras (+) de ARN (sintetizadas en el punto 9)
que conservan la proteína VPg para formar los viriones.
13. Los viriones son liberados por lisis celular.

¿Si no tiene cap como hace este ARN para mostrarse como un mensajero y convencer al ribosoma de
que lo traduzca? Con este complejo de estructura secundaria en 5’:

El AUG es el que da origen a la poliproteína, o sea que todo

este complejo está a 5’ del comienzo de traducción.

Está formado por un montón de estructuras secundarias. Una

región se llama “hoja de trébol” (cloverleaf) y la otra “sitio
interno de entrada al ribosoma” (IRES). El cloverleaf actúa en
la transcripción, y el IRES en la traducción.
Este complejo es el encargado de “convencer” al ribosoma de
que se una a este sitio del ARN. Estos virus producen un
cambio dentro de la célula en el cual el mensajero, que es cap dependiente, se verá afectado.

Lo que ocurre en la célula durante una traducción normal

El factor eIF4E reconoce el cap y trae a otros factores del
complejo de traducción. Este complejo se une al 40s del
ribosoma, que empieza a escanear el genoma hasta que
encuentra el codón AUG y se une al componente
ribosomal restante.

Lo que ocurre en la célula durante una infección con Picornaviridae

El factor eIF4G es clivado por la proteasa 2A
(enterovirus/rhinovirus) o por la proteasa líder (aftovirus).
Al ser clivado, este factor pierde la capacidad de
reconocer el factor eIF4E que estaba unido al cap. Todo
lo que sea cap dependiente se verá afectado dentro de la
célula. El complejo de traducción queda incompleto y sólo
puede unirse al IRES. El virus atrae y ensambla los otros
componentes que son atraídos hacia el IRES, y la falta de elF4E no lo perjudica porque no tiene CAP.
Esta estrategia es bastante beneficiosa para el virus ya que no sólo engaña al ribosoma para que lo
traduzca, sino que también elimina su competencia (los mensajeros cap dependientes que ya no
pueden ser traducidos).
El virus tiene otra proteasa que destruye la TATA binding protein (proteína que reconoce el TATA box
para dar inicio a la transcripción). Esto también hace que haya menos competencia para el virus, y así
más disponibilidad del complejo de traducción.

Todos estos mecanismos que terminan perjudicando a la célula (porque no puede producir proteínas)
hacen que el virus tenga que replicar lo más rápido posible para salir de la célula antes de que ésta
muera.

“No todos los picorna hacen esto, los que no lo hacen deben compartir los ribosomas con la célula”
26
¿Cómo se hace el cambio de traducción a síntesis de ARN genómico (-)?
Se detiene un proceso para iniciar otro.

A. Traducción: la iniciación de la traducción está

estimulada por la unión de la proteína celular
PCBP2 al IRES y por la proteína SRp20, que atrae el
ribosoma al ARN.
La síntesis de la copia tiene sentido 5’ - 3’, utilizando
como molde el 3’. 3Dpol no puede extender el ARN,
porque toda la maquinaria de traducción viene en
sentido opuesto. PCBP2 también puede unirse al
cloverleaf.
B. El switch para pasar de traducción a síntesis
genómica viene dada por los altos niveles de 3CD.
Esta, acumulada, tiene actividad proteasa y es capaz
de clivar a PCBP2. Esto inhibe la unión del ribosoma
al IRES, reduciendo los niveles de traducción y de
formación de complejos, y liberando SRp20 de PCBP2. El PCBP puede todavía participar en el
complejo entre cloverleaf y 3CD. Este complejo facilita a su vez la interacción con el 3’ polyA a través
del factor PABP (polyA binding protein). Como resultado la 3Dpol ahora puede avanzar y completar la
copia antigenómica (-). Luego ella misma va a convertir esas copias negativas en positivas.

Conclusión: cuando la proteasa 3CD se acumula y llega a ciertos niveles en la célula, ésta cliva los
factores celulares y es así como se inhibe la traducción para que pueda continuar la síntesis de ARN
genómico (-).

Esto es muy propio de Picornaviridae porque el mensajero es igual al genómico.

RESUMEN: funciones de las proteínas virales de Picornavirus

Cuando piden un ejemplo de una proteína multifuncional se puede hablar, por ejemplo, de aquellas
proteasas que clivan la poliproteína viral y a su vez clivan algún componente celular. Estas proteínas
primero tienen una función en el ciclo de replicación del virus y luego tienen otra función secundaria a
nivel de la célula.

27
No sólo las proteínas son factores de patogenicidad. También son factores de patogenicidad las
estructuras secundarias, como es el IRES, que pueden ser más o menos patógenas en un virus u
otro. Una mutación en el IRES puede generar un IRES más a fin, que hará una traducción más
rápida, o sea que será más patógeno.

flaviviridae. grupo IV
Los Flavivirus son muy parecidos a los Picornavirus (prestar
atención a los extremos 5’ y 3’), pero son envueltos.

La envoltura está muy estrechamente relacionada a la

cápside, y sobre la envoltura está la glicoproteína viral E, que
es muy abundante.
En esta familia algunos virus tienen IRES y otros no, y
algunos tienen cap y otros no.

En 3’ no hay polyA pero sí muchas estructuras secundarias.

Al igual que Picornaviridae, el genoma codifica para una poliproteína que también va a ser clivada.
En este caso es un poco más compleja ya que al ser un virus envuelto, en su ciclo de replicación va a
tener que transitar por el RER y por el Golgi, ya que tiene que producir glicoproteínas para su envoltura.

Hay proteasas de la célula que van a clivar (donde estan las flechas azules y rojas)
- Peptidasa de señal
- Proteasa de golgi
Hay proteasa viral y proteínas NS (no
estructurales).
Todas las proteasas que realizan clivajes,
van a permitir la traducción de la
poliproteína.
En esta imagen vemos la cadena de ARN
sobre la cual se está sintetizando la
poliproteína y los sitios de clivaje.

En esta familia están los virus de:

hepatitis C (HCV), fiebre amarilla (YFV),
diarrea viral bovina (BVDV-1), dengue
(DENV), y zika (ZIKV). Algunos de estos
son transmitidos por un vector, pero no
todos → Los integrantes de la familia
comparten características genómicas pero no siempre biológicas. El virus de la diarrea viral bovina se
utiliza como modelo para estudiar antivirales contra el virus de la hepatitis C.

28
Pestivirus (Virus de la Diarrea Viral Bovina)
La envoltura está muy
pegada sobre la cápside, y
presenta una glicoproteína
que es un dímero entre E1 y
E2, lo que le da su forma
característica.

Genoma monopartito, lineal,

ARNsc (+). El extremo 3' del
genoma no está
poliadenilado sino que forma
una estructura de bucle. El
extremo 5' tiene un CAP de
nucleótidos metilado (para permitir la traducción) o una proteína ligada al genoma (VPg).
El ARN del virión es infeccioso y sirve como ARN mensajero del virus. Todo el genoma se traduce en
una poliproteína.

REPLICACIÓN CITOPLASMÁTICA
1. La unión de la proteína E de la envoltura viral a los receptores del hospedador media la
internalización en la célula hospedadora por endocitosis mediada por clatrina o por mimetismo
apoptótico.
2. Fusión de la membrana del virus con la membrana endosómica del hospedador. El genoma de ARN
se libera en el citoplasma.
3. El ARN simple cadena genómico positivo se traduce en una poliproteína, que se escinde en todas
las proteínas estructurales y no estructurales (para producir las proteínas de replicación).
4. La replicación tiene lugar en la superficie del retículo endoplásmico en las fábricas de virus
citoplasmáticos. Un genoma de ARNdc se sintetiza a partir del ARNsc genómico (+).
5. El genoma de ARNdc se transcribe / replica proporcionando así ARNm virales / nuevos genomas
de ARNsc (+).
6. El ensamblaje del virus ocurre en el retículo endoplásmico y parece ser facilitado por el canal iónico
viral. El virión brota en el retículo endoplásmico y se transporta al aparato de Golgi.
7. Liberación de nuevos viriones por exocitosis.

Genoma del virus de la DVB

🗸 Tiene IRES (y no tiene cap).

🗸 Codifica para una

poliproteína que contiene
proteínas de cápside (C),
proteínas de envoltura (E),
proteínas no estructurales
(NS), y una ARN polimerasa
ARN dependiente (RdRp).
🗸 Presenta regiones que son
clivadas por la proteasa de la
célula, y regiones que son
clivadas por la proteasa viral.

La cepa citopática surgió por la recombinación (en virus ARN ocurre por salto de templado),
seguramente, entre una cepa vacunal y una no citopática. Lo que define si una cepa es citopática o no
citopática son las proteínas NS2 y NS3. En las cepas no citopáticas estas proteínas están fusionadas
(NS2-3), mientras que en las cepas citopáticas hay un sitio de clivaje (que se lo robó de un sitio de
clivaje de un transcripto celular) y son dos proteínas individuales (NS2 y NS3). La ARN polimerasa
cuando hace la copia del genoma hace un salto de templado, en el que salta a un transcripto celular y
después regresa al genoma del virus, y sigue sintetizando la copia. Esto lo hacen varios virus para
robarse secuencias celulares. Estos robos pueden terminar en mutaciones no beneficiosas para el
virus, o pueden terminar en mutaciones beneficiosas, como lo fue robarse este sitio de clivaje.

29
En el ambiente están circulando las dos cepas. La cepa citopática se originó evolutivamente, por una
recombinación entre el genoma y un ARNm celular que tenía esa secuencia, a partir de eso cuando se
traduce es un sitio de clivaje para una proteasa celular.
Si hiciéramos un Western Blot con un Ac policlonal contra la proteína NS2-3 en la cepa citopática
encontraríamos dos proteínas de distinto peso molecular, mientras que en la cepa no citopática
encontraríamos una sola.

Flavivirus
Los Flavivirus pertenecen, junto a otros virus, al
grupo de los Arbovirus (Arthropod Borne
Viruses) = virus que son llevados por
artrópodos.
Se dan tres ciclos: enzoótico selvático,
epidémico urbano, epizoótico rural → En el
ciclo enzoótico selvático el virus es mantenido
en un hospedador vertebrado (mono, pajarito),
y es transmitido por un hospedador
invertebrado (mosquito) → Ambos se pasan
permanentemente el patógeno hasta que,
eventualmente, éste pasa a hacer un ciclo
rural/urbano en el cual infecta una especie
doméstica o al humano. Esto puede
desencadenar un brote urbano epidémico. El
brote epidémico ocurre y luego desaparece, ya
que no hay en el ambiente un elemento que mantenga al virus (en los hospedadores terminales el virus
no alcanza la concentración necesaria en sangre como para infectar a otro mosquito). El ciclo rural es
una conexión entre el selvático y urbano (aunque el humano también puede ir a un ambiente selvático).

Ciclo en los cuales:

- El humano juega un rol: dengue, fiebre amarilla, chikungunya → Hay circulación a nivel urbano, en
individuos que están infectados y el mosquito lo transmite.

- Spillover tipo dead ends: los individuos que se infectan no transmiten la enfermedad y mueren. Por
ejemplo en Fiebre del Nilo del Oeste los hospedadores son mosquitos y aves, y los hospedadores
terminales son los equinos y los humanos.

Transcripción de ARN subgenómico

Los ARN subgenómicos de los virus de hebra positiva tienen los mismos extremos 3’ que el ARN
genómico, pero tienen deleciones en los extremos 5' para acercar el extremo 5’ del ARN al codón de
inicio de los ORF cadena abajo (en el ARN genómico).
Debido a que la replicación es necesaria para la síntesis de ARNsg, la ARN polimerasa dependiente
de ARN viral siempre se traduce primero, directamente del ARN genómico de los virus de ARN de
cadena positiva.
Los ARNsg expresan productos necesarios durante las etapas intermedias y tardías de la infección,
como proteínas estructurales o de movimiento.
Estos ARNsg no forman parte del genoma porque no comprenden señales de encapsidación y, por
tanto, no son transportados por viriones a nuevas células infectadas.
La síntesis de ARN subgenómico se puede explicar en dos modelos, no se establece claramente con
precisión si es solo uno, o si suceden ambos dependiendo del virus.

30
 Modelo de iniciación interna → La polimerasa viral de alguna manera se inicia no en 3' del ARN
genómico, sino más internamente, creando así un ARN subgenómico más pequeño.
Modelo de terminación prematura (modelo PT) → La polimerasa viral se detendría y detendría la
síntesis durante la síntesis de ARN negativo, creando así un ARN negativo subgenómico más corto
que el ARN genómico. Esta terminación prematura sería inducida por una estructura secundaria en la
secuencia del genoma. El ARN negativo más corto sería la plantilla para los ARN positivos
subgenómicos.
Transcripción discontinua: puede ocurrir en los dos modelos anteriores. Es una característica bien
descrita en Nidovirales, por lo que se prefiere el modelo PT. De alguna manera, se agrega un ARN
líder del ARN genómico 5' a todo el ARN subgenómico.
● En el modelo de iniciación interna: los ARN líderes se transcriben y sirven para cebar ARN
subgenómicos.
● En el modelo de terminación prematura la polimerasa "saltaría".

caliciviridae. grupo IV

Pocas proteínas estructurales.

Cápside sin envoltura de
aproximadamente 27-40 nm de diámetro,
con simetría icosaédrica T=3 . La cápside
está compuesta por 180 copias de VP1.
Hay múltiples copias de la Proteína Principal VP1, codificada por ORF1, a partir de la cual se codifican
las proteínas estructurales. T=1 → 60 copias de VP1 T=3 → 180 copias de VP1.

31
 Género Vesivirus: incluye exantema vesicular del cerdo y calicivirus felino.

Exantema vesicular del cerdo

- Vesículas en hocico y mucosa oral.

- Muy agudo
- ! Diferencial de FMDV (aftosa)

Calicivirus felino

Úlceras en lengua, generalmente localizadas

Monopartito ARNsc (+). El extremo

5’ está unido a una proteína VPg
(como en Picornaviridae) y el
extremo 3' tiene una cola poliA,
por lo que al ingresar es
reconocido como mensajero.
La VPg tiene función dual:
participa en la replicación del ácido
nucleico y en la traducción
capturando a la maquinaria
(diferencia con la VPg de
Picornaviridae, que no participa en
la traducción). Debido a su rol en la traducción se puede decir que funciona como un cap.
El ORF1 contiene información para proteínas no estructurales y corresponde a ⅔ del genoma. Codifica
para una poliproteína que dará origen a una serie de proteínas individuales, y comienza con una
proteasa, que es la que se va a clivar primero y después va a clivar a los otros componentes de esta
poliproteína.
La polimerasa luego de ser clivada a partir de la poliproteína, comienza a reconocer secuencias en el 3’
viral y va a hacer una copia antigenómica (o sea, una copia negativa). Mientras lo hace, este tipo de
polimerasas comete errores que no son corregidos.
Luego, sobre la copia negativa que hizo, la polimerasa reconoce a una secuencia que actúa de
“promotor” (un promotor medio trucho, no hay que decir promotor en el parcial/ final porque es un
desaprobado), y sintetiza otro ARN comenzando solamente a partir de ese sector, es decir, hace
subgenómicos.
También hace otras copias de ARN genómicas, positivas, comenzando normalmente desde la punta
pero siempre utilizando como base a la cadena negativa.
La síntesis de proteínas estructurales se hace a partir de ARNm secundario o subgenómico, que lo
único que va a hacer es codificar para ellas.
Estos son ARNm con el mismo extremo 3’ que el ARNm genómico, pero con deleciones cerca de su
extremo 5’, para que este quede más cerca del codón de inicio de los ORF que están corriente abajo (en
nuestro ejemplo de ORF 2). Codifica para las proteínas estructurales que están en la parte derecha
(corriente abajo) del genoma.

32
 En verde oscuro
tenemos al ARNm
genómico (+), que
va de 5’ a 3’.
La ARN
polimerasa se
encarga de
sintetizar una
copia negativa
(ARNm
antigenómico) En verde claro tenemos el ARNm
antigenómico (-), que va de 3’ a 5’. Es producto de la
transcripción discontinua del ARNm genómico. Sobre la
copia negativa, la polimerasa reconoce determinada
secuencia (similar a un “promotor”), y sintetiza ARNm
subgenómico, comenzando solo desde ese sector.

Mediante el mecanismo de terminación y reiniciación, es

el ribosoma quien produce dos proteínas diferentes,
esta es una artimaña viral a nivel de la traducción.

Vemos lo que está codificado en el

genoma.
La poliproteína (ORF 1) va a producir
proteínas no estructurales:
● Polimerasa (POL): reconoce
secuencia 3´
● Proteasa (Pro)
● VPg
● Helicasa (Hel)

El mensajero tiene un codón de stop al finalizar la secuencia de la poliproteína.

Como producto de la traducción y de la escisión de la poliproteína surge la polimerasa (POL). Es ella la
que va a sintetizar una copia negativa (ARNm antigenómico), reconoce un sector de esta (que actúa
como “promotor”, pero no tiene las características de un promotor), y sintetiza el ARNm subgenómico.
Este proceso es secuencial, es decir, primero se produce la síntesis de ARNm antigenómico y luego de
ARNm subgenómico.
La polimerasa hará también ARNm antigenómico continuo (desde el extremo 3’) para hacer nuevas
copias de ARNm genómico completas, que son positivas, y van a ser introducidas dentro de los
viriones.
En este dibujo vemos que a partir de ARNm
genómico la polimerasa hace ARNm
antigenómico completo (arriba, en verde oliva)
para la síntesis de más ARNm genómico; y también
incompleto (abajo, en verde oliva) para la síntesis
de ARNm subgenómico (abajo, en verde loro).

Primero se traduce la poliproteína, luego ésta es procesada y da origen a la ARN polimerasa (entre
otras proteínas no estructurales).

Es la ARN polimerasa la que se encargará de la síntesis de los distintos ARNm subgenómicos (a partir
de ARNm antigenómicos), que por último darán origen a las proteínas estructurales.
El ARNm subgenómico es positivo.

Hay un “delay” en la síntesis de proteínas estructurales porque primero tiene que sintetizar la
polimerasa. NO es temporalidad.

33
Este esquema corresponde a Coronaviridae, que pertenece al Orden Nidovirales, por eso hay
tantos transcriptos distintos. Está puesto a modo de ejemplo. En Caliciviridae hay un solo ARNm
subgenómico.

Ciclo de replicación de Caliciviridae

1. Unión del virus al receptor celular e
ingreso a la célula.
2. Decapsidación (el virus pierde su
cápside y libera su genoma).
3. Traducción del ARNm genómico que
codifica para la poliproteína.
4. Procesamiento y liberación de las
proteínas no estructurales
individuales.
5. Las proteínas no estructurales se unen
formando un “complejo de replicación”.
6. El complejo de replicación sintetiza el
ARNm antigenómico.
7. El ARNm antigenómico es usado
como templado para la síntesis de más
ARNm genómico. El ARNm
genómico recién sintetizado será traducido en más poliproteínas (3) o será empaquetado con las
proteínas estructurales para formar los viriones (10).
8. El ARNm antigenómico también es utilizado como templado para la síntesis de ARNm
subgenómico.
9. El ARNm subgenómico es traducido en proteínas estructurales (VP60 y VP10). En los Lagovirus
(RHDV) VP60 también se origina del precursor de la poliproteína luego de ser procesado por la
proteasa viral.
10. El ARNm genómico es empaquetado con las proteínas estructurales y el virión maduro es
liberado.

coronaviridae. grupo IV
Subfamilia Coronavirinae

Coronavirus entérico felino (CoEF).

Coronavirus felino productor de PIF (CoPIF).
Virus de la epidemia hemorrágica de los cerdos
(PEDV).
Virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV).
Virus de la gastroenteritis transmisible del cerdo
(TGEV).
Virus de la hepatitis murina: presenta HE que no está
siempre
Virus del síndrome respiratorio agudo y grave
(SARSV).
Virus del síndrome respiratorio en Oriente Medio
(MERS-CoV).

Morfología
Envuelto, esférico, helicoidal, de unos 120 nm de diámetro.
Genoma monopartito, ARNsc lineal (+) (tiene el genoma más grande de todos los virus ARN).
34
 Tiene CAP y está poliadenilado. El ARN líder en el extremo 5' del genoma también está presente al
final de cada ARN subgenómico.
El genoma de ARN está asociado con la proteína N para formar la nucleocápside.
Los mismos colores que están en el esquema del virión se mantienen en el esquema del genoma. En
el virión vemos sólo las proteínas estructurales.

➔ S: Glicoproteína de espícula (Spike glycoprotein trimer). Se cree que puede llegar a ser la
responsable de que un Coronavirus entérico felino (CoEF) adquiera la capacidad de atravesar el
intestino y se convierta en un Coronavirus felino productor de PIF.
➔ N: Proteína de nucleocápside. Está adherida al ácido nucleico. Antagonista de IFN.
➔ M: Proteína de membrana. Es un virus envuelto. Antagonista de IFN.
➔ HE: Hemaglutinina estereasa. En el virus de la hepatitis murina.
➔ E: Pequeña proteína de envoltura.
➔ Ácido nucleico: helicoidal.

Frameshift: cambio en el marco de

lectura a cargo del ribosoma. En
algunos casos la síntesis de la
proteína no estructural termina en
donde termina el gris oscuro (ORF
1a), y en otros el ribosoma se saltea
el codón de stop y la síntesis
termina en donde termina el gris
claro (ORF 1b).

Hay muchos ARNm

subgenómicos (a diferencia de
Caliciviridae que tenía uno sólo).
Todos van a dar origen a proteínas
estructurales, proteínas tardías.

¿Cómo hace la polimerasa para hacer tantos ARNm subgenómicos distintos?

Del lado derecho (cerca del extremo 3’) se van a

sintetizar proteínas estructurales, del lado
izquierdo proteínas no estructurales (2/3 del
genoma, cerca del extremo 5’ → ORF1).
Comienza igual que lo antes visto en Caliciviridae:
se traduce la poliproteína a partir de la porción
izquierda del ARNm genómico, ésta es escindida
y da origen a la polimerasa.

La polimerasa reconoce “secuencias regulatorias

de transcripción” (TRS), que están distribuidas en
la parte derecha del genoma del virus y que son
importantes para la síntesis de los distintos ARNm antigenómicos.

La polimerasa siempre comienza a sintetizar el ARNm antigenómico en 3’.

Copia el genoma en sentido 3’ → 5’ hasta que reconoce una TRS. Esto hace que se saltee todo lo que
queda del genoma hasta que reconozca una secuencia líder ubicada en 5’ y termine de copiar el
genoma. Va a reconocer una TRS u otra (pasando por alto las TRS que le aparecieron antes) en forma
azarosa. Todos los transcriptos comparten el mismo 5’ y 3’ y son de polaridad negativa.
Esto es una alternativa al splicing para producir transcriptos que codifican para distintas proteínas
estructurales.

La polimerasa hará los ARNm subgenómicos (+) a partir de los ARNm antigenómicos (-).

35
La polimerasa también tendrá que hacer un ARNm antigenómico completo que servirá de molde para la
síntesis de más copias de ARNm genómico.
Aparte de todo esto, también es la polimerasa la encargada de poner el cap y la cola polyA. Es una
polimerasa muy compleja ya que tiene muchas funciones.

En si voy a tener todo esto:

- ARNm estructurales subgenómicos -
- Antigenoma de longitud completa
- ARN genómico de polaridad positiva
- ARNm de polaridad + provenientes de ARN - (antigenomas de cadena corta)
Todo esto es generado por proteínas virales.

Ciclo de replicación de Coronaviridae

Ingresa por vía endosomal.
Se sintetiza la polimerasa → Copia antigenómica →
sintetiza los ARNm subgenómicos - → ARNm
subgenómicos + → Mensajeros de genes estructurales.
La antigenómica también de copia genómica.

Notar como todos empiezan con la misma región 3’

(verde) y también terminan con la misma región 5’
(rojo). Todo esto se realiza en vesículas virales,
“escondido”. Los ARNm subgenómicos se traducen a
proteínas estructurales.
Las proteínas estructurales junto con los ARNm
genómicos forman los nuevos viriones que finalmente
abandonan la célula.
Las proteínas de envoltura ingresan al RER y golgi,
hasta ser liberadas por exocitosis.

36
● Orden mononegavirales: tienen un solo fragmento y es negativo.
● Al ser ARNm negativos la célula no los reconoce como mensajeros, por lo que primero debe hacerse
una copia positiva, asi que presentan una polimerasa integrada. Su primer evento es la
transcripción.
● Producen ARN subgenómicos mediante el reconocimiento de secuencias intergénicas.
rhabdoviridae. grupo V

Rhabdoviridae

Virus ARNsc negativo, helicoidal, envuelto.

G: glicoproteínas de superficie.
M: proteína de matriz. Se asocia a la ribonucleocapside (RNP) para dar la forma de bala al virión.
N: proteínas de la nucleocápside. Envuelve estrechamente el ácido nucleico para protegerlo y
comprimirlo. Es la proteína más abundante.
Al ARN están unidos los dos componentes que forman la ARN polimerasa:
- P: fosfoproteína; cofactor de L.
- L: polimerasa.
La polimerasa ya está lista para iniciar la transcripción apenas ingresa el virus a la célula. Llevan la
polimerasa ya hecha (común a todos los -) para poder iniciar la transcripción.
La fosfoproteína (P), las proteínas de la nucleocápside (N), y la polimerasa viral (L) envuelven al
genoma viral y constituyen la ribonucleocápside.

Genoma

La transcripción es particular: habrá un ARNm por cada gen codificado en el genoma (uno para cada
proteína), que luego será traducido en una determinada proteína. La polimerasa también realiza una
copia genómica del largo completo.
Hay cap y cola polyA, y la polimerasa es la encargada de aplicarlo.

37
Las líneas punteadas marcan dónde empieza y termina cada gen.

La polimerasa reconoce la secuencia Leader (esta región define el tipo de trabajo que va a hacer la
polimerasa) y empieza a transcribir el ARN (-) a ARNm (+) hasta que llega a una región, igual en todos
los casos, llamada intergénica. Allí pueden ocurrir dos situaciones:
1) Que la polimerasa termine de sintetizar el ARNm porque reconoce una secuencia de terminación,
le ponga la cola polyA, libere al mensajero y se despegue del genoma.
2) Que la polimerasa termine de sintetizar el ARNm porque reconoce una secuencia de terminación,
le ponga la cola polyA, libere al mensajero, pero queda unida y sigue con la síntesis del 2°
transcripto (reiniciación de la transcripción).
Los últimos mensajeros son sintetizados en menor cantidad respecto a los primeros. La primera es la
proteína N, de la cual se requieren muchas copias para recubrir el ácido nucleico.
Que la polimerasa continúe transcribiendo o que se despegue es azaroso.
- Hay un único promotor en 3’ (leader) y la transcripción es secuencial. Los ARNm van a tener todos el
mismo 5’ y 3’.

En este esquema vemos la secuencia intergénica (la

línea punteada del esquema anterior).
Esta secuencia está delimitada por la señal de
poliadenilación de un gen y la señal de iniciación del
siguiente.
La polimerasa viene avanzando en dirección 3’ 🡪 5’ y se
encuentra con una seguidilla de Us (UUUUU) que
interpreta como señal de terminación del mensajero
(señalización resbaladiza) y también es una señal de
poliadenilación, por lo que empieza a agregar A (polyA).
Es en ese punto que puede despegarse y liberar al
mensajero, o seguir unida al templado y continuar con la
transcripción del gen que sigue mientras el ARNm se
libera.
Aquellos genes que estén más a 3’ (gen N) se
encontrarán en mayor cantidad que aquellos genes que
estén más a 5’ (gen L). Esto es estratégico: el virus “pone”
cerca de 3’ aquellos genes que necesita en más cantidad.
Esto es la REINICIACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN,
estrategia a nivel de transcripción.

Hay que hacer ARN + a partir de ARN -.

Ciclo de replicación
1. El virión se une a un receptor celular e ingresa a la célula por endocitosis mediada por clatrina.
2. La envoltura viral se fusiona con la membrana del endosoma y libera la nucleocápside viral
(ARN+N+L+P) en el citoplasma.
3. La polimerasa (L+P) transcribe el ARN (-) en cinco ARNm subgenómicos (+).
4. Los ARNmsg que codifican para las proteínas N, P, M, y L son traducidos por ribosomas
citoplasmáticos (libres). Estas proteínas participarán en la replicación viral del punto 7.

38
 5. El ARNmsg que codifica para la glicoproteína G es
traducido por ribosomas del retículo
endoplasmático.
6. Síntesis de un ARN completo (+). Al igual que el
ARN (-) también está en forma de
ribonucleoproteína, es decir, en conjunto con las
proteínas N, L y P.
7. El ARN completo (+) del punto 6 sirve de templado
para la síntesis de más ARN (-) en la forma de
nucleocápside.
8. Algunos de los ARN (-) sintetizados en el punto
anterior sirven para la transcripción de más ARNm
subgenómicos (+).
9 y 10. La proteína G traducida en el RER ingresa a la
vía secretoria (golgi), en la que es glicosilada, y viaja
hacia la membrana plasmática en endosomas.
11 y 12. El genoma generado en el punto 7 es
transportado junto con la proteína M hacia la
membrana plasmática. Allí se asocian con las
regiones que contienen la glicoproteína G y se inicia el
ensamblaje de los viriones.
13. Los viriones abandonan la célula por gemación.

Switch
El cambio de síntesis de ARNm a síntesis de genómico de longitud completa está determinado por los
niveles de proteína N y por el rol de la primera región intergénica (cerca del leader).

El ARN (-) (rectángulo rojo) es el genómico. A partir de él la polimerasa hace ARNm subgenómicos
(arriba) para la síntesis de proteínas y ARNs de longitud completa (abajo) para la síntesis de más
genómico. La polimerasa utiliza el mismo templado para las dos cosas. Por lo que requiere de un
switch, que será el nivel de proteína N y el rol de la primera región intergénica.
El genómico tiene una región intergénica (cerca del leader) que es reconocida por la proteína N.
Cuando hay suficiente cantidad de proteína N esta se une a la región leader, y como la N está unida al
ácido nucleico la polimerasa empieza la síntesis unas posiciones más arriba (hacia el extremo 3’; en vez
de arrancar del +3, arranca del +1). Este cambio determina que el transcripto se inicie y continúe
sintetizando ARNs de longitud completa. Además, la proteína N en alta cantidad envolverá el ácido
nucléico, y cubrirá todas las regiones intergénicas, por lo que la polimerasa no se despega y transcribe
hasta el final.

39
 paramyxoviridae. grupo V

ARNsc negativo, helicoidal, envuelto.

En la envoltura presenta glicoproteínas de superficie, que son hemaglutinina y neuraminidasa (HN),

salvo en Morbilivirus que sólo tiene hemaglutinina (HA). Esta glicoproteína puede estar sola o fusionada
a la proteína de fusión (F), que participa en la fusión viral con la membrana celular. Además, cuando se
encuentra expresada en la superficie de la célula infectada, media la unión entre membranas celulares,
formando sincicios.
También tiene:
● Proteínas de matriz (M)
● Nucleoproteínas (N): están enrolladas al ácido nucleico-polimerasa (L)
● Fosfoproteínas (P): forma parte de la polimerasa.

Virus de importancia
Virus del Distemper canino (foto)
Rinderpest (peste bovina: se declaró erradicada en 2011)
Peste de los pequeños rumiantes
Parainfluenza 3 Bovino
Hendra: infectó caballos y humanos. Relacionado con murciélagos.
Nipah: relacionado con murciélagos y afecta cerdos.
Newcastle

Programa de
transcripción muy
parecido al de
Rhabdoviridae: hay un
leader (que dirige las
actividades de la
polimerasa), proteínas
NP* responsables del switch entre la
síntesis de mensajero y la síntesis de
genómico, proteína P, ARNm subgenómicos,
secuencias intergénicas, L como
polimerasa, etc. Hay reiniciación de la
transcripción.
Hay dos proteínas que en Rhabdoviridae no
estaban: F y HN.
Hay mucha mayor transcripción de NP que
de L.
*NP es el mismo que N en Rhabdoviridae.

Atención: este virus además utiliza ARN editing parecido a Ebola.

40
En este esquema vemos el ARN (-) a partir del cual se sintetizan los ARNm subgenómicos (+) que
serán traducidos en proteínas.
La polimerasa reconoce (al igual que en rhabdo) secuencias intergénicas circundadas por la
terminación de un gen y por la secuencia de inicio del transcripto que sigue.
Este virus realiza ARN EDITING (como está en el citoplasma no hay splicing). Las proteínas V surgen
de ARN editing, si no ocurre el editing surge la proteína P → no se generan por un evento en el
ribosoma, sino que provienen de dos mensajeros diferentes: un mensajero codifica para P y otro para V.
En el editing, la polimerasa incorpora entre 1 y 6 nucleótidos (guanina), no complementarios a ningún
templado, generando un mensajero diferente (y, por ende, una proteína diferente): genes P/V (W). Esta
incorporación de nucleótidos al ARN cambia totalmente el marco de lectura, y por lo tanto codificará
para una proteína distinta.
El ARN editing es a nivel de transcripción y está dado por la polimerasa. El objetivo es producir dos
proteínas diferentes. Este proceso no es azaroso, la polimerasa tiene una señal para colocar el
nucleótido de más. La señalización está dada por una estructura secundaria. Un Ac monoclonal no
reconocerá la proteína producto del editing porque es totalmente distinto.

La proteína C, que también deriva del

mismo transcrito que P y V se produce
por un mecanismo que tiene que ver
con la traducción: leaky scanning.

Las hebras en dirección 5’ 🡪 3’ son

las hebras positivas.

Las hebras en dirección 3’ 🡪 5’ son

las hebras negativas.

El mensajero positivo tiene una señal de editing.

ARN editing produce ARNm para glicoproteína de

ebolavirus
Virus del ébola, ¿para qué hace editing? Para ahorrar
genoma y para dar variabilidad.

- Izquierda: región del ARNm sin editar, que dará

lugar a una proteína no estructural, secretada, que
captura Ac, eliminando Ac de circulación.
- Derecha: región del ARNm editada (se adicionaron
uno o dos nucleótidos). Este ARNm será traducido
en una proteína diferente a la que iba a ser
traducido originalmente. De hecho, esta va a ser la
glicoproteína de membrana.

41
Ciclo de replicación
(Muy parecido al de Rhabdoviridae).
Hay fusión de la envoltura del virus con la
membrana celular.
El gen F, que codifica para la proteína
de fusión, es un factor de
patogenicidad.
Estas proteínas de fusión deben activarse
en el momento adecuado: cuando el virus
está dentro de la célula o reconociendo al
receptor.
El precursor de la proteína F (junto con la
proteína HN, menos importante) transita
por el RER para luego llegar al Aparato de
Golgi.
Dentro de la proteína F hay un sitio de
clivaje.
Cuando sale de la célula este precursor es clivado y queda “preparado” para poder fusionarse cuando
encuentre otra célula. Será activado en la nueva célula por el reconocimiento del receptor o por el pH
del endosoma.
Esta estrategia es para evitar que la proteína de fusión esté constantemente activada y se fusione con
moléculas o células con las que no debe fusionarse.
El clivaje del precursor de la proteína F es esencial para que el virus pueda infectar una nueva
célula. Este clivaje depende de las enzimas presentes en Golgi, que deben reconocer la secuencia de
clivaje. Si el virus tiene una secuencia de clivaje que puede ser reconocida por las enzimas del Aparato
de Golgi, entonces generará y liberará virus clivados e infectivos. Si el virus, en cambio, tiene una
secuencia de clivaje que no es reconocida, liberará virus no clivados y no infectivos. A la vista los
viriones son iguales.

El ejemplo más conocido es el virus Newcastle

La cepa velogénica/mesogénica tiene, en la proteína F, una secuencia de clivaje distinta a la que tiene la
cepa lentogénica.
- La secuencia de clivaje de la cepa velogénica/mesogénica puede ser reconocida por proteasas del
Aparato de Golgi de muchos tipos celulares. Entonces saldrán virus infectivos de prácticamente
cualquier tipo celular. Replica rápido y en muchos tejidos.
- La secuencia de clivaje de la cepa lentogénica, en cambio, es bastante más rara, por lo que no puede
ser reconocida por enzimas del Aparato de Golgi de muchos tipos celulares, sólo de algunos. Es así
que esta cepa adquiere especificidad de tejidos. Replica más lento y es específica de ciertos tejidos.

Mutaciones en el sitio de clivaje en proteína F hace que pueda ser reconocido por proteasas de más
tejidos → diferencia entre la patogenicidad de distintas cepas.
El clivaje de la proteína F es muy importante para la diferenciación de cepas de alta y de baja
patogenicidad en Paramyxo.

Estos virus tiene bastante variabilidad dada por:

● La polimerasa comete errores.
● El editing.
● Salto de templado para producir recombinantes: en una célula infectada por dos virus diferentes (de
distinta cepa), la polimerasa al copiar el genoma, salta de un genoma a otro, generando una
población formada con pedacitos.

Bornavirus
● Virus mononegaviral, pero que replica en el núcleo.
● Tienen reservorios varios, pero hacen dead end en gatos, equinos, ovejas y hombres: no replica el
virus, pero genera cuadros de encefalitis severa.
● En felinos, el ciclo de infección empieza con aves silvestres → infección de roedores → infección al
gato → distribución viral generalizada en el cerebro y órganos viscerales.

42
Al tener el genoma segmentado, los virus de este grupo no tendrán muchos problemas para formar
ARNm. Producirán un mensajero por cada segmento de su genoma. Diferencia con los
Mononegavirales que tienen genoma monopartito.

orthomyxoviridae
Virus Influenza

Virus ARN simple cadena, negativo,

envuelto, con replicación nuclear.
● Neuraminidasa (N): glicoproteína de
superficie que es una enzima que
cliva la unión del ácido siálico terminal
con la HA glicosilada → facilita la
liberación del virus, evitando que los
virus se agreguen entre ellos.
● Hemaglutinina (HA): glicoproteína de
superficie multifuncional =
- Responsable de la unión al receptor (ácido siálico).
- Responsable de la fusión con la membrana del endosoma.
- Presenta epítopes para la acción de Ac neutralizantes.
- Es sintetizada como un polipéptido único que luego es clivado durante el transporte hacia la
membrana (HA1 y HA2, permanecen unidas por un puente disulfuro formando una proteína
funcional) → HA1 posee una región de unión al receptor, y HA2 posee el péptido fusogénico,
responsable de la unión de las membranas virales y el endosoma.
● Proteína de matriz (M1): íntimamente asociada a la envoltura. Media la interacción con la
nucleocápside. Confiere rigidez a la estructura del virión. Participa en la exportación del ácido
nucleico desde el núcleo y en el vading del virus.
● Proteína de canal iónico (M2): permite el influjo de protones, acidificando el endosoma cuando el
virus ingresa a la célula (para que se produzca la otra función de la HA), lo que provoca la separación
de la RNP de la Proteína M. Además tiene otra función en el egreso ya que permite la salida de los
protones, aumentando el pH dentro del virión, y evitando así la alteración conformacional de HA.
Importante en la replicación del virus.
● Nucleocápside: está formada por los 8 segmentos de ARN conjugados con proteínas NP, formando
así una estructura helicoidal. A cada segmento se une el complejo polimerasa
(transcriptasa/replicasa), que está formado por PB1, PB2 y PA.
● Nucleoproteína (NP): envuelve el ácido nucleico, y ayuda al ácido nucleico a salir desde el núcleo.
● NEP: cumple varios roles durante el ciclo de replicación viral. Participa en la exportación de la
ribonucleoproteína desde el núcleo.

Genoma
segmentado 🡪 un
segmento para cada
ARNm, representado
de 3’-5’ por ser
negativo.
PB2 (en algunos
virus) y el segmento
7 y 8 van a sufrir
splicing (se
producen 2
mensajeros de cada
genoma).

43
Los genes 4, 5 y 6 codifican para las proteínas estructurales HA, NP y NA, respectivamente.
El gen 7 codifica para dos proteínas estructurales: M1 y M2.
El gen 8 codifica para dos proteínas no estructurales: NS1 y NEP/NS2. Surgen como producto del
splicing. Son factores de patogenicidad e inhiben la respuesta antiviral.

Polimerasa
La polimerasa está integrada por tres proteínas codificadas en los genes 1, 2 y 3: PB1, PB2 y PA. Al ser
un virus negativo la tiene que llevar consigo. Ella será la encargada de la transcripción, de la síntesis del
genómico, de agregar el cap, y de la poliadenilación de los mensajeros. La verdadera polimerasa, en
realidad, es la PB1 ya que es la encargada de la elongación y de la síntesis del ARNm. PB2 (reconoce el
CAP) y PA (cliva el CAP) serán las encargadas de robarles el CAP a los mensajeros celulares (roba el
CAP y un oligonucleótido y se lo lleva como primer). Al perder el CAP la célula se queda sin mensajeros y
por lo tanto sin proteínas. Esto le trae consecuencias muy graves y eventualmente termina en muerte
celular. Esta es una de las tantas estrategias que utiliza este virus para monopolizar la maquinaria de
traducción.

PB1-F2 es la encargada de regular el IFN. Esto es lógico ya que en algún momento va a generar un ARN
doble cadena, lo que activará la respuesta inmune. Todo virus que en algún momento genere un ARN
doble cadena va a tener que dedicar algún gen a regular el IFN.

PA-X es una proteína que surge del mismo fragmento que PA. Es inductora de la apoptosis porque
reprime la actividad mediada por ARN polimerasa II, que no afecta al virus, ya que tiene una propia, pero
sí a la célula. Es la responsable de la inflamación, de la apoptosis y de la señalización de linfocitos T.

Algunas proteínas tienen más de una función → Proteínas multifuncionales.

Ciclo de replicación
1. El virión se une a una proteína/lípido (que contiene ácido siálico) de la membrana celular e ingresa a
la célula vía endocitosis mediante reconocimiento de receptores mediado por HA. Diferencia con
Paramyxo. En este punto tiene que ver si la HA fue clivada o no, de no haber sido clivada no se
fusionará con la vesícula endocítica. Relacionado con cepas alta/baja patogenicidad.
2. M2 de envoltura va a acidificar el interior del virión, permitiendo que se separe la proteína M1 de todo
el complejo núcleo-proteína. La membrana viral se fusiona con la membrana del endosoma y libera
las ocho nucleocápsides virales al citoplasma (para simplificar el esquema solamente se muestra una
nucleocápside).
El virus cliva los CAPs de mensajeros celulares (en citoplasma o núcleo) para hacer sus propios
mensajeros y para su ARN genómico → Priming. Lo logra porque la polimerasa es estructural, ya la
lleva hecha.
3. Las nucleocápsides virales (que contienen en su interior los ARNs (-), múltiples copias de la NP, y
proteínas P) son transportadas al núcleo.
4. Los ARNs (-) son transcriptos por la polimerasa viral (que viajó en el virión) en ARNm (+), usando el
extremo 5’ (CAP) de los transcriptos celulares.
5. Los ARNm (+) son transportados al citoplasma.
6. En el caso de los ARNm (+) que codifican para NEP y M2 antes de ser transportados al citoplasma

44
 deberán someterse a splicing.
7. Los ARNm (+) que codifican para proteínas de
membrana (HA, NA y M2) son traducidos por
ribosomas del RER. Estas proteínas de membrana
ingresan a la vía secretoria de la célula
hospedadora, donde HA y NA serán glicosiladas.
8 y 9. Todos los otros ARNm (+) son traducidos por
ribosomas citoplasmáticos libres.
10a. Las proteínas PA, PB1, PB2 y NP son importadas
al núcleo, donde participarán en la síntesis de ARN (+)
completos.
(11) y luego en la síntesis de ARN (-) (12), ambos
sintetizados en forma de nucleocápside. Algunos de
los ARN (-) recién sintetizados son destinados a la
síntesis de más ARNm (+) (13).
10b. Las proteínas M1, NS1 y NEP son transportadas
al núcleo.
14. La unión de la proteína M1 con los ARNs (-)
recién sintetizados detiene la síntesis de ARNm (+) y,
en conjunción con la proteína NEP induce la
exportación de estos ARN (-) al citoplasma (el
complejo entre NP, M1 y ácido nucleico es exportado
desde el núcleo por la proteína NEP).
15 y 16. Las proteínas HA, NA y M2 son transportadas
a la superficie celular, pasando por Golgi. Es en este punto que la HA debe ser clivada para que el
virión pueda infectar otras células. Luego son incorporadas en la membrana plasmática.
17. Las nucleocápsides virales (asociadas a la proteína M1) y la proteína NEP (18) son transportadas
a la superficie celular y se adhieren a regiones de la membrana plasmática que contienen a las
proteínas HA, NA, M1, y M2.
19. Se completa el ensamblaje de los viriones, que abandonan la célula por gemación.

En el caso de Influenza, puede pasar que las HA que no fueron clivadas en el aparato de Golgi sean
clivadas posteriormente por proteasas extracelulares (producidas por las células Clara del aparato
respiratorio superior). O sea, si la célula infectada no generó un virión infeccioso, las células del
aparato respiratorio superior sí lo hacen.

Este virus replica en núcleo porque tiene que hacer splicing.

NEP tiene que entrar al núcleo (10b) y luego volver a salir (17), por lo que deberá tener una señal de
localización nuclear y una señal de exportación nuclear. Al combinarse con M1 (17) esconde la señal de
localización nuclear y expone la de exportación nuclear. Esta estrategia de combinarse con otras
proteínas para esconder una señal y exponer otra es muy utilizada por proteínas que tienen que entrar y
salir del núcleo.

Switch
El cambio de transcripción de mensajero a genómico ocurre por los niveles de M1. Algunos NEP van a
ir hasta el virión en formación en la membrana plasmática, pero cuando llega a cierto nivel, más copias
de NEP van a ingresar al núcleo junto con M1. El ingreso de M1 al núcleo en ciertas cantidades,
produce el switch: marca el fin de la síntesis de ARNm (+) y se empiezan a hacer las copias
genómicas.

NS1 (factor de patogenicidad) no esencial:

● Se une a polyA celular e inhibe su salida. Retiene a los mensajeros celulares para que haya más a
los que robarles el CAP, y también para que haya menos competencia y monopolizar así la
maquinaria de traducción.
● Inhibe splicing celular inhibiendo la salida de ARN.
● Se une a ARN doble cadena, ocultándolo de los disparadores de la respuesta de interferón.
Al no ser esencial podemos deletear NS1 y el virus va a replicar igual. Probablemente más lento, pero
replica.

45
 VIRUS ARN DOBLE CADENA SEGMENTADO QUE SE COMPORTAN COMO VIRUS ARN NEGATIVOS.

Reoviridae

Orbivirus
Lengua azul
Peste equina africana
Encefalosis equina (Sudáfrica)
Enfermedad de Chuzan (Sureste
de Asia y Japón)
Enfermedad epizoótica
hemorrágica de los ciervos.

Rotavirus
Infecciones por Rotavirus (varias
especies)

Tiene triple cápside:

✔ Cápside externa: VP4 y VP7. VP4 es clivada por proteasas extracelulares en VP8 y VP5. La unión
al receptor celular se hace 1° en forma no específica por estas proteínas y después el verdadero
receptor es VP7.
✔ Cápside intermedia: VP6.
✔ Cápside interna: VP2.

El virus NUNCA expone el ARN doble cadena a la célula durante el ciclo de replicación.

El virus tiene 11 segmentos. Algunos

corresponden a las proteínas
estructurales antes nombradas (VP)
y otros a proteínas no estructurales.

Hay leaky scanning (algunas veces

el ribosoma empieza en un ATG y
otras en otro ATG) (en segmentos 9
y 11).
Dentro del virión, en cada vértice
polimérico, se ve una asociación de
la polimerasa (VP1) con la VP3
(enzima encargada del capping).
Tiene cap. No tiene polyA.

Ciclo de replicación de Rotavirus

1) Reconocimiento del receptor por VP5, VP8 y VP7.
2) Ingresa por endocitosis.
3) Acidificación de la vesícula endocítica.
4) Cambio conformacional de proteínas de la cápside externa.
5) Desensamblaje parcial del virión (pérdida de VP7, 8 y 5).
6) El virión sale de la vesícula al citoplasma.
7) Queda la partícula de doble cápside (no se degrada todo el virión para no exponer el ARN doble

46
 cadena).
8) Se dispara la
transcripción temprana:
el ARN está dentro del
virión, la polimerasa se
desacopla y activa, y
produce ARN (+).
9) Se generan mensajeros
capeados (por VP3).
10) Los ARN (+) salen del
virión al citoplasma.
11) Traducción de proteínas
no estructurales,
encargadas de
antagonizar al IFN y
producir un “shut off” de la
maquinaria de traducción
celular.
12) VP1 y VP3 (no
estructurales) se van a
unir a parte de los
mensajeros y lo van a
llevar al viroplasma (fábrica viral citoplasmática, es una zona de la célula), donde se concentran las
proteínas estructurales para ensamblar nuevamente el virión.
13) VP2 (cápside interna), producida por ribosomas libres, comienza a formar el core (nucleoproteína),
es reconocida por el complejo VP1-VP3 y se empiezan a pegar los ARN unidos a la polimerasa →
sigue el ensamblaje y mientras el ARN que ingresó con la enzima se replica (síntesis de la cadena
complementaria = ARN -) → el virus nunca muestra el ARN doble cadena a la célula.
14) Hay una transcripción secundaria donde el virus produce más mensajeros para formar más
proteínas y más genómico.
15) En el viroplasma la nucleocapside es recubierta por la VP6.
16) Algunas proteínas van a ser procesadas dentro del RE → VP4 y VP7 están adosadas a la membrana
del mismo → momentáneamente el virión atraviesa el RE, teniendo brevemente una “envoltura” que
será procesada quedando solo la cápside externa.
17) Salida del virus por lisis o exocitosis.
18) Maduración viral en el exterior → clivaje proteolítico de VP4 → VP5 y VP8 maduras.

retroviridae. grupo VI
Virus envueltos.
El ARN + diploide altamente condensado, está
asociado a proteínas de nucleocápside (NC),
formando el core. Acá se encuentra también la
retrotranscriptasa (copia a ADN), la integrasa
(integra al genoma celular) y la proteasa (participa
en la maduración del virión al salir de la célula).
Todo esto está contenido en una cápside (CA).
La nucleocápside (core + CA) está revestida por
proteínas de matriz (MA), y está contenido en
una envoltura lipoproteica con dos proteínas: una
transmembrana (TM) y otra de superficie (SU).

47
 En su interior el virión tiene dos moléculas (“genoma
diploide”, no es doble cadena) de ARN con esta forma:
Tienen cap y cola polyA.

Salen del virión combinadas con un ARNt (ARN de

transferencia), que obran como primers para que la
retrotranscriptasa, que viaja en el virión, pueda
sintetizar ADN. La polimerasa no utiliza los dos
genómicos, utiliza uno solo. Lo que puede pasar es que
comience a copiar un ARN y haga un salto de templado
y copie el opuesto. Esto es una ventaja evolutiva ya que genera variabilidad.

SIMPLES COMPLEJOS
● Tienen un casette básico de proteínas ● Tienen muchas proteínas accesorias (que se
Alfaretrovirus: obtienen por splicing alternativo)
- Leucosis Aviar Lentivirus:
Betaretrovirus (+ de un splicing): - Maedi/Visna
- Adenocarcinoma pulmonar ovino - Artritis-Encefalitis caprina
- Tumor nasal enzoótico - Anemia infecciosa equina
Gammaretrovirus: - Inmunodeficiencia felina (VIF)
- Leucemia felina (VILEF) - Inmunodeficiencia bovina
- Virus del sarcoma felino
- Reticuloendoteliosis aviar Leucemia bovina (Deltaretrovirus)
Deltaretrovirus (+ de un mensajero con splicing):
- Leucosis/Leucemia bovina HIV - 1

La diferencia principal de los

retrovirus complejos con los
retrovirus simples es que tienen
genes, aparte de los casettes
principales, que los simples no tienen.
La otra diferencia está en el uso de
splicing: los simples tienen
básicamente un solo transcripto
spliciado, mientras que los complejos
tienen muchos.

Los genes que tengan aparte de los

casettes principales van a variar de un
retrovirus complejo a otro.

Genoma
● Se observa como provirus (ADN doble cadena, inserto al ADN celular).
Hay tres casettes principales:
● gag: contiene a las proteínas del core (MA, CA, NC).
● pol: contiene a los componentes de la polimerasa (PR, RT, IN).
● env: contiene a las proteínas de envoltura (SU y TM).

En los retrovirus complejos también están los casettes gag, pol y env. Pero además hay otros genes
como vif, vpr, vpu, rev y tat. Éstos les dan una ventaja por sobre los simples. Además usa splicing

48
 simple y doble → Algunas de las proteínas surgen por splicing, tienen 2 exones en diferentes partes del
genoma (como rev y tat).

Long Terminal Repeat (LTR): extremos que se van a combinar con el ácido nucleico de la célula. Son
producto de la síntesis de la copia de ADN simple (y después doble cadena). O sea, en ambos
extremos del esquema vemos al LTR combinado con el genoma celular. Actúan como promotor y como
enhancer. En el LTR izquierdo está el promotor enhancer, que va a estimular, junto con la ARN
polimerasa de la célula, la transcripción.
Como en esta instancia el retrovirus complejo está inserto en la célula, puede usar splicing. La ADN
polimerasa celular interpretará el genoma del virus como propio y es ella la que hará el splicing. Los
retrovirus simples tienen un solo splicing.
El Virus de la
inmunodeficiencia felina
(VIF) es un retrovirus
complejo. Es el mejor modelo
para estudiar HIV. Como ya
vimos tiene LTR, los tres
casettes principales (gag, pol y env), y vif, rev, orfA. Además tiene una proteína que se ve solo en VIF
que es la dUTPasa. Normalmente la célula trata de tener un bajo nivel de UTP, ya que hay riesgo de
incorporarlo por error al ADN en vez de TTP, y para esto utiliza una enzima que lo destruye, para que
haya más TTP que UTP. La función de la dUTPasa viral es contrarrestar esta enzima (inhibe a la
enzima que reduce el pool de uracilo dentro de la célula), ya que el virus realiza mucha transcripción y
necesita un pool importante de UTP celular para poder generar sus ARNm.

Ciclo de replicación
1. El virus se une a los receptores de la membrana
celular por medio de proteínas que forman parte
de su envoltura.
2. La envoltura viral se fusiona con la celular y el
core (genoma + nucleocápside + RT, PR e IN)
ingresa al citoplasma. Algunos
beta-gammaretrovirus ingresan por vía
endocítica.
➔ En el proceso de desensamblaje se va a producir
la síntesis del ADN (a partir de ARN).
3. La transcriptasa reversa (RT) copia una de las
cadenas de ARN +, pudiendo hacer salto de
templado a la otra, y transcribe ADNdc lineal con
extremos yuxtapuestos. La RT tiene función
endonucleasa, por lo que degrada el ARN que no
usó } ARN + 🡪 ARN-ADN 🡪 ADNdc.
4. El ADNdc y la integrasa (IN) ingresan al núcleo
con ayuda de la maquinaria de tráfico celular.
- HIV tiene una proteína accesoria que lo ayuda
a entrar al núcleo sin depender tanto de la
maquinaria del polo nuclear.
5. La recombinación, mediada por la integrasa (IN),
resulta en la inserción de los extremos del ADNdc
en el genoma del hospedador.
6. La transcripción del provirus (ADNdc integrado a
la célula) por la ARN polimerasa ADN dependiente
celular produce transcriptos primarios

49
 completos que serán usados para múltiples propósitos.
7. Algunos transcriptos primarios serán exportados al citoplasma como ARNm,
8. y serán traducidos en precursores de las proteínas gag y gag-pol.
9. Otros transcriptos primarios se combinarán con las proteínas de la cápside para formar los viriones
que luego dejarán la célula.
10. Otros transcriptos primarios serán spliceados en el núcleo para formar ARNm que serán traducidos
en precursores de la poliproteína env.
11. Los ARNm spliceados son traducidos por ribosomas del RER.
12. Las proteínas env se dirigen al Aparato de Golgi, donde serán glicosiladas y clivadas por enzimas
celulares para formar el complejo maduro SU-TM.
13. Las proteínas de la envoltura (SU-TM), ahora maduras, son trasladadas a la superficie de la célula
infectada.
14. Los componentes virales (ARN+, precursores de gag y pol, SU y TM) se ensamblan en el sitio de
gemación, con la ayuda de la maquinaria de tráfico celular.
15. Los viriones recién formados abandonan la célula por gemación.
16. Luego de la gemación, la proteasa (PR) cliva un sitio específico de los precursores de gag y gag-pol
para producir las proteínas virales maduras. Esto es fundamental para que el virus pueda infectar
una nueva célula. Este proceso causa la condensación del core viral.

Los retrovirus simples traducen dos ARNms: uno de largo completo y uno que sufre splicing. El entero
es el genómico, y además es interpretado como mensajero en el citoplasma y va a producir las dos
poliproteínas. El que sufre splicing va a producir las proteínas de envoltura (SU y TM).
Los spliceados pueden salir del núcleo sin problema. Los ARNm no spliceados y con señales de
splicing (recordar que normalmente los mensajeros deben salir sin intrones, con cap y con cola polyA)
reconocen una señal del poro nuclear que les facilita la salida forzosa hacia el citoplasma cuando la
célula se está dividiendo (los complejos también pueden hacerlo en células que no se están dividiendo
activamente, pero no es un proceso eficiente, utilizando proteínas que circundan el poro nuclear).

50
 En el caso de los Lentivirus hay
ARNm sin splicear, spliceados
una vez (forman vif, vpr, vpu y
env), y spliceados dos veces
(forman tat, rev y nef). Estos
últimos son los únicos que pueden
salir del núcleo sin problemas
(porque se eliminaron todos los
intrones, mientras que en los
spliceados una sola vez todavía
quedan algunos).
Aquellos ARNm que todavía
conservan intrones, para salir del
núcleo, tienen Rev que es un gen
accesorio doblemente spliceado,
por lo que no tendrá problemas
para salir del núcleo. Una vez
traducida, esta proteína vuelve a ingresar al núcleo y se adhiere a una
secuencia presente en el resto de los ARNm (es decir, en los no spliceados y
en los unispliceados). Es rev quien hará contacto con las proteínas del poro
nuclear y permitirá la salida de estos mensajeros/genómicos. A diferencia de
los simples, que dependen de proteínas de la célula, los complejos tienen su
propia proteína (rev). Si no existiera el gen rev la única opción que tendrían
los mensajeros para salir sería que la célula se esté dividiendo, que es lo que hacen los simples. Los
Lentivirus tienen como ventaja por sobre los simples que no dependen del status celular.

Hay otro gen accesorio de

importancia en los
Lentivirus: vpr. Vpr es
una importina, una
proteína característica de
los Lentivirus. Permite al
ácido nucleico viral entrar
al núcleo de células que no
están replicando
activamente.

Viaja en el virión agregada

al ácido nucleico.

Después de que se
produce la
retrotranscripción, vpr
facilita el ingreso del
complejo ADNdc -
integrasa (IN) al núcleo.

Los retrovirus simples no tienen esta proteína, por lo tanto necesitan que la célula esté en división para
poder ingresar el complejo al núcleo (acceden en el momento que se disgrega la membrana nuclear).

Pasa lo mismo que pasaba con rev, esta proteína hace que los Lentivirus puedan independizarse del
status celular (pueden ingresar al núcleo activamente).
Vpr es una proteína multifuncional: también participa en la inducción de la apoptosis, ayuda a la
eficiencia de la retrotranscripción, detiene a la célula en la etapa G2 (facilita la presencia de factores
que son necesarios para actuar sobre el LTR del provirus).

Otro gen accesorio de importancia en los retrovirus complejos es nef (solo está en lentivirus de
primates). Esta proteína disminuye la expresión de CD4+ (por mayor endocitosis) y de MHC-1 (por
mayor degradación endosomal) en la membrana plasmática.

51
 Nef evita que MHC-1 llegue a la
superficie para que LT CD8 no
pueda reconocer partículas virales.

CD4+ es un receptor del virus,

entonces, al hacer que no se exprese
(o que se exprese menos) los virus
que salen de la célula no quedan
adheridos.

SIV y HIV delecionados en nef son

mucho menos patógenos in vivo.
En VIF el homólogo de Nef sería OrfA.

Gen accesorio vif (no confundir con enfermedad VIF): inhibe APOBEC3 = proteína celular que tiene
que ver con la respuesta antiviral no específica de la célula (parte de la respuesta innata).
La APOBEC3 es una enzima deaminasa, que va a producir la desaminación de las citidinas, y las
convierte en uridinas, lo cual lleva a una mutación de G a A.

Si no hay vif (arriba), cuando el

virus replica en una célula, en el
virión son incorporadas copias de
esta enzima, y cuando ingresa a
nueva célula, esta enzima
empieza a perturbar la
multiplicación viral (en el estadio
de la conversión del ARN a ADN
simple cadena, y luego a la
conversión del simple cadena en
doble cadena).
Esta citidinas, por la actividad de
la enzima que vino en el virión,
lleva a la conversión de C a U, y el
U se termina incorporando como
una A en la cadena
complementaria.
Lo que era G originalmente, lleva a
una mutación a A en el genoma, y luego el provirus ingresa al núcleo y la integrasa lo integra en el
genoma.
La mutación tiene un impacto muy grande porque puede llevar a la generación de un codón de stop, o
un aminoácido distinto que lleve a que esa proteína no funcione.

Si hay vif (abajo): en el momento en que el virus está replicando, la proteína vif que se produce
degrada a la enzima, de manera que el virión sale de la célula infectada sin esta enzima. Esto lleva a
que la retrotranscripción y la conversión de simple cadena en doble cadena se haga como debe ser y
siga su curso, y este provirus no tiene ninguna mutación.

52
 INGRESO VIRAL
El ingreso viral está dado por tres eventos:
➔ Adhesión o anclaje
➔ Entrada
➔ Desensamblaje

ADHESIÓN VIRAL
Es la unión entre el ligando viral y el receptor celular.
- Ligando viral: molécula en la superficie viral que reconoce al receptor celular sobre la membrana
citoplasmática de la célula.
- Receptor celular: molécula de la superficie celular a la cual se une el virus.
- Co-receptor: molécula adicional sobre la superficie celular que es requerida para la entrada del virus
a la célula; mejora el anclaje. Pueden determinar un cambio de tropismo.
Lograda la correcta adhesión, la porción intracelular del receptor o co-receptor dispara una cascada de
eventos que derivan en la internalización de la partícula viral (por endocitosis o fusión de membrana).

ver viralzone

Ligando virales → está en la superficie de la partícula viral.

- Virus no envueltos → Unión mediada por relieves de la cápside viral.
● Protuberancias y valles (Canyons and loops) que contactan con el receptor celular → Ej:
Picornavirus, Parvovirus.
● Fibras protruyentes → Ej: Adenovirus.
- Virus envueltos → Unión mediada por glicoproteínas de superficie en la envoltura viral → Ej: HA en
Influenza.

53
Receptor celular → Anclado a la membrana plasmática.
- Origen: proteico, lipídico, azúcares, etc.
- Suelen ser parte del sistema de comunicación célula-célula, pero no actúan como vía de entrada
para el virus.
- Un receptor puede ser compartido por más de una familia viral, y un virus puede unirse a más de un
tipo de receptor.
- Determina el tropismo al definir el hospedador, el tejido y el tipo celular.
- Algunos funcionan como factores de adhesión, concentrando al virus en la célula. Otros funcionan
como verdaderos receptores ya que tienen un dominio transmembrana y disparan la cascada de
internalización de la partícula viral.
- Algunos son específicos de un tipo celular y otros son más ubicuos (se encuentran en más tipos
celulares).

Receptores alternativos y co-receptores

- HIV 1: reconocen al receptor CD4 en los linfocitos, pero hay adhesión/no infección; necesitan como
co-receptor α-quemoquina para ser internalizado.
- Otras cepas de HIV 1 son macrofagotrópicas y usan como correceptor a B-quemoquinas.
- HIV 2: ingresa sin necesidad de co-receptor, usando como receptor una quemoquina → esto podría
llevar al aumento del rango de células hospedadoras.
- VIF: receptor proteína CD134 que se expresa en la superficie de LT y usa como receptor a la

😑
α-quemoquina.
- Sars-Cov2 → El ligando viral es la proteína S que reconoce como receptor a la proteína AC2
(enzima convertidora de Angiotensina II); esta proteína se expresa principalmente en células
epiteliales de pulmón e intestino delgado, pero también en riñón, corazón y otros tejidos. Con un
cambio de 2 aminoácidos en el dominio de reconocimiento del receptor de la proteína S pudo
reconocer el AC2 de origen humano, permitiéndole el salto de especie. La proteína S adquirió un
motivo RGD que no se encuentra en otros coronavirus, ni en su virus parental de murciélago. Este
motivo RGD es un dominio conservado en ligandos virales que usan a las integrinas como receptor,

54
 entonces Sars-Cov 2 estaría usando a las integrinas como receptor alternativo (lo que causaría
aumento del tropismo y aumento de la transmisibilidad).

Potencial fusogénico

- Los virus envueltos poseen una proteína llamada péptido fusión, el cual acerca membranas para
favorecer la fusión.
- El potencial fusogénico debe estar desactivado, sino fusionaría hacia cualquier membrana o hacia
otras partículas virales y no hacia la célula target.
- La activación del potencial se da por un clivaje proteico, disminución del pH o interacción con
co-receptores.
Foto derecha: fusión del HIV, donde la proteína GP120 (ligando viral), reconoce el receptor CD4 de la
célula. Cuando interacciona con el correceptor de la α quemoquina, realiza el cambio de conformación,
y esto expone al péptido de fusión (GP41) y termina acercando las membranas para poder fusionarla.

❖ La presencia del receptor/co-receptor en una célula no asegura que el virus replique en la misma (no
asegura que produzca una infección productiva) → necesita de factores y componentes celulares.
❖ Una infección será productiva si la célula es “susceptible y permisiva”.
❖ Susceptibilidad: presencia del receptor/ y co-receptor requeridos para la entrada del virus.
❖ Permisividad: presencia de componentes intracelulares requeridos para la replicación.

PENETRACIÓN VIRAL
Es el ingreso del virus al interior celular atravesando la membrana celular. Mecanismos de penetración:
1) Penetración directa: en superficie de la membrana citoplasmática. Ej: HIV
- Virus envueltos con proteínas de fusión pH independiente (no necesita pH bajo para su cambio de
conformación).
- Fusión en membrana plasmática. Fusión = penetración.
- Posibilidad de transmisión célula-célula al expresar el péptido de fusión en la superficie de células
infectadas.
- En algunos casos el virus ingresa y libera el material genético (decapsidación), y en otros
decapsidan más adelante.
- Ej: Retrovirus, Herpesvirus, Paramyxovirus, Poxvirus.
2) Penetración diferida: dentro de endosomas (el virus atraviesa la membrana del endosoma)
(generalmente es pH dependiente). Ej: Influenza. Sucede en distintos momentos la adhesión e
internalización contra la penetración viral.
- Penetración = atravesar membrana del endosoma.
- Virus envueltos:
55
 ● Requieren un descenso del pH para expresar el potencial fusogénico. Ingresa vía endocítica y
penetran la célula cuando alcancen el pH endosomal requerido.
● Fusión desde endosomas. pH dependiente. Ej: Influenza.
● Potencial fusogénico expuesto post cambio de conformación luego de unión al correceptor.
- Virus no envueltos: todos ingresan vía endocítica y requieren un descenso del pH para poder
exponer las proteínas que realizan lisis o poros en la membrana endosomal.
● Lisis membrana endosomal: cambio en proteínas virales por descenso de pH o por unión al
receptor. Ej: Adenovirus, Rhinovirus.
● Inducción de poros en membrana endosomal: mediado por proteínas específicas virales que
deben ser primero activadas (pH o receptor). Ej: Picornavirus, Parvovirus, Rotavirus.
● Desde RE mediante ERAD (degradación asociada al RE). Ej: Poliomavirus.

Internalización/endocitosis
● Macropinocitosis: partículas grandes (Poxvirus)
● Endocitosis mediada por:
- Clatrina (Influenza, Adeno)
- Dinamina (Rota)
- Caveolina (Polioma)

Sitios de penetración
● 1- pH 7 (membrana citoplasmática) Ej: Retrovirus, Herpes.
● 2- pH 6.5-6 (endosoma temprano) Ej. Rhabdo.
● 3- pH 6 (endosoma maduro). Ej: Picorna.
● 4- pH 6-5 (endosoma tardío). Ej: Influenza, Papiloma.
● 6- ERAD (penetra por el retículo endoplásmico). Ej: Polioma.

Mecanismos alternativos de entrada (independiente de receptor).

- Fusión célula-célula: hay una célula infectada por un virus envuelto, que posee una proteína de fusión
y la va a expresar en la membrana citoplasmática de la célula infectada. En la vecindad hay una
célula no susceptible (no tiene receptores para el ingreso de ese virus), pero que si es permisiva
(posee factores necesarios para su replicación). El péptido fusión (pH independiente) puede fusionar
las membranas de ambas células, y la célula no susceptible resulta infectada.

- Mediado por Ac. Ej: Dengue, Aftosa, EBV en células epiteliales.

Las partículas virales son reconocidas por

Ac, que son fagocitados por monocitos
que tienen receptores para su región
constante de los Ac. Si los monocitos son
permisivos, el virus puede replicar en su
interior.
Ingreso el virus… ¿Y ahora qué pasa?
Los virus que ingresaron por endocitosis deben librarse de la membrana endocítica, y para eso se valen
de 3 mecanismos, dos de ellos usados por virus no envueltos y uno por virus envueltos.
- Virus envueltos → FUSIÓN (como ya vimos antes)
Las proteínas de fusión virales impulsan una reacción de fusión al experimentar un cambio
conformacional importante desencadenado por el bajo pH del endosoma tardío.

56
 - Virus no envueltos
→ PERMEABILIZACIÓN: permitir la penetración de la cápside del virus en el citoplasma a partir de
la interacción entre la membrana del hospedador y una proteína de penetración de membrana
asociada con la cápside.
La proteína de penetración de la membrana viral primero debe activarse, principalmente a través del
pH ácido endosómico o la unión del receptor para mostrar su actividad de penetración de la
membrana.
→ LISIS: ocurre cuando una cápside viral induce la ruptura de la membrana endosomal. Este
proceso ocurre después del cambio conformacional de la proteína de la cápside desencadenado por
el pH ácido endosómico o por la unión del receptor. El resultado es el escape de partículas virales al
citoplasma (adenovirus 2 y 5) o la liberación del genoma viral al citoplasma (rinovirus humano).

Transporte intracelular
No es por difusión. El tránsito está señalizado y manejado mediante dos vías de transporte: fibras de
actina y microtúbulos. Las partículas virales no escapan a este sistema de transporte, ya que tiene sus
señales de localización para llegar al sitio de replicación, transcripción y traducción.

DESENSAMBLAJE
Evento por el cual el genoma viral se libera de su cápside.
Las cápsides virales son estructuras METAESTABLES
● Fuera de la célula: la estructura protectora del virus debe ser suficientemente robusta para soportar
condiciones ambientales y proteger al genoma viral del medio extracelular.
● Dentro de la célula: la estructura protectora del virus debe ser inestable para liberar el material
genético al ingresar a la célula.

El evento puede ocurrir:

➔ En simultáneo junto con la penetración. Como Paramixo, que ocurre en la membrana citoplasmática
(penetración y desensamblaje), u ortomixo que ingresa por vía endosomal y realiza penetración y
desensamblaje a pH dependiente.
➔ Diferido → Adeno, usa la vía endocítica, penetra a pH 6 a nivel de endosoma tardío, pero
desensambla en el poro nuclear donde termina inyectando su genoma. Herpesvirus penetra la
membrana citoplasmática a pH independiente y decapsida en el poro nuclear.

57
Penetración y desensamblaje: en influenza ocurren al mismo tiempo pero van a depender de
distintos eventos y proteínas.
Reconocimiento de receptor celular (ácido siálico mediante la región globular de la HA), internalización
de partícula viral por endocitosis mediada por clatrina. Eventos:
1) Acidificación del endosoma mediado por vATPasa a medida que van ingresando protones (canal de
protones celular) → Los protones hacen que disminuya el pH en el endosoma y provocan el cambio
de conformación y se expone el péptido de fusión → Fusión entre envoltura viral y membrana
endosomal. Penetración: el virus logra salir del endosoma hacia el interior de la célula.
2) El genoma viral asociado a nucleoproteínas (ribonucleoproteínas) están adheridas a proteínas de
matriz M1 que forman la cápside. Para que estas 2 estructuras se puedan separar y se produzca la
decapsidación es necesario la acidificación del interior de la cápside, y este evento se produce
gracias al ingreso de protones a la cápside a través de la proteína M2, que es un canal de protones
en la membrana viral (M2 es un blanco de antivirales).
M2 es un canal que atraviesa ambas estructuras (cápside y envoltura viral), y es de origen viral, a
diferencia de la vATPasa que es de origen celular.
Se necesita acidificación del endosoma para la penetración, y la acidificación del interior de la cápside
para que se produzca el desensamblaje. Todo este evento ocurre en simultáneo.

Ingreso al núcleo → los

genomas tienen señales de
localización nuclear.
- Virus ARN (ej: Orthomyxo)
→ El complejo
ribonucleoproteico ingresa
por poro nuclear.
- Virus ADN → Ingresan por
el poro pero desnudos.
- Lentivirus (ej: VIF) →
Tiene proteínas accesorias
que los ayudan a ingresar
por el poro al núcleo.
- Virus ADN pequeños (ej:
Parvo o circo) → ingresan
al núcleo con cápside completa y denudan en el interior del núcleo para evitar mostrar su ADN en el
citoplasma (necesitan células en división, no para entrar al núcleo porque ingresan con su cápside
completa, sino porque necesitan proteínas de la maquinaria de replicación).
- ADNdc y de cápside grande (Herpes y Adeno) → decapsidan en el poro nuclear e inyectan su
genoma en el núcleo, quedando la cápside afuera.
- Retrovirus no lenti → Necesitan de la disgregación de la membrana nuclear durante la etapa de
división celular para poder ingresar al mismo (no tienen proteínas accesorias).

58
 EGRESO VIRAL

El egreso comprende:
1. Ensamble/ensamblaje: formación de unidades estructurales de la cápside (capsómeros) y armado de
la cápside.
2. Encapsidación: empaquetamiento del genoma viral dentro de esa cápside junto a otros componentes.
3. Egreso/salida: liberación de la célula hospedadora, momento en el que los virus envueltos adquieren
la envoltura.
4. Maduración: reorganización de componentes del virión. Es un paso necesario para que el virus gane
su infectividad (no ocurre en todos los virus).

ENSAMBLAJE
Ensamblaje de unidades estructurales (capsómeros)
1. Ensamble de proteínas individuales: cada proteína se sintetiza individualmente y la cercanía de las
mismas, al estar en un espacio confinado, favorece su interacción conformándose el capsómero. Ej:
Adenovirus.

59
2. Ensamble a partir de un precursor poliproteico: ej: picornavirus, se sintetiza una sola proteína (VP1,
VP2, VP3, VP4), conforman la estructura 2°, interactúan entre ellas, y recién al final cuando aparece
la proteasa (3CDpro) se clivan las uniones entre ellas conformándose el capsómero.
3. Ensamble asistido por chaperonas: las chaperonas son proteínas, en este caso virales, que colaboran
para la interacción de otras proteínas (las acercan). Una vez que las acercaron se degradan.

Ensamblaje de la cápside
1. Ensamblaje por interacción de
capsómeros individuales: el poco
espacio que tienen disponible favorece
a la interacción.
2. Ensamble asistido por chaperonas:
ejemplo Herpesvirus. Las chaperonas
colaboran para la interacción de otras
proteínas; acercan dos proteínas entre
sí para favorecer su interacción.
Forman un esqueleto/ andamiaje desde
el centro que favorece el armado de la
cápside que no se puede armar sola
porque es muy grande. Suelen ser
provisorias, después de cumplir su
función se degradan y queda el lugar libre. Esta estructura se llama procápside.

Estos eventos ocurren según el sitio

de replicación del virus:
● Intranuclear → cuerpos de
inclusión.
● Citoplasmático → cuerpos de
inclusión, viral factories,
viroplasma, vesículas.

60
 ENCAPSIDACIÓN
Proceso por el cual el ácido nucleico ingresa dentro de la cápside.

Señal de empaquetamiento: son secuencias específicas en el ácido nucleico que dirigen y señalizan el
proceso.
● Virus ADN: (PAC) señales cortas y repetitivas
de nucleótidos, generalmente se encuentran
cerca del ORI. Son reconocidas por proteínas
virales.
Por ejemplo, Herpesvirus: el ADN de herpes se
copia en forma de concatémeros, quedan los
ácidos nucleicos uno atrás del otro, y tienen que
ser ingresados a la cápside ya preformada, que
va a tener un portal (poro), con proteínas que
reconocen las señales PAC y comienzan desde
allí a ingresar el ácido nucleico hasta que se
reconocen entre sí dos señales idénticas, y ahí
es donde se cliva y se cierra el portal.

● Virus ARN
- Mediado por nucleoproteínas.
- Suelen reconocer estructuras secundarias
(Stem-Loop).
- Importa el tamaño del genoma que se está empaquetando en relación a la cápside (importante en
vectores virales, hay un límite de lo que se puede agregar al ácido nucleico).
Por ejemplo HIV: el ARN forma stem loop (horquillas que terminan en bucle), 4 en este caso, en una
zona determinada nombrada como psi (ψ). Esta región está cerca del sitio spliceado del ARN de retro.
De esta forma se asegura que los ARN genómicos completos sean los únicos con posibilidad de ser
encapsidados. Este virus es diploide por lo que debe haber dos cadenas → se forma un complejo de
kissing loop, se enlazan los dos loops idénticos e ingresan a la cápside.

La encapsidación puede ser:

- Secuencial: primero se forma la cápside y después se incorpora el genoma (herpes y adenovirus).
- Coordinada: ambos eventos ocurren juntos. La formación de la cápside y la encapsidación es
dirigido por el mismo ácido nucleico. Las proteínas que conforman la cápside se unen al ácido
nucleico, el cual participa en el plegado y formación de la cápside. Ocurre en rhabdo, influenza y
retrovirus.

Los virus deben encapsidar otros componentes para su ciclo de replicación además del genoma viral,
por ejemplo polimerasas (virus ARN), retrotranscriptasas (en retro), proteasas, integrasa (retro), VP16
(en herpes: proteína transactivadora de los genes inmediatos tempranos).

Algunos ejemplos
Picornaviridae
Ensamblaje de capsómeros por precursor poliproteico que contiene a VP1, 2, 3 y 4, y eso genera un
plegamiento de las proteínas en capsómeros. Los capsómeros quedan circunscriptos al exterior de
vesículas de doble membrana donde replica picornavirus. Esto favorece el encuentro de los capsómeros
y armado de una cápside vacía.
- Encapsidación secuencial.
- En vesículas citoplasmáticas.
- Maduración intracitoplasmática: clivaje de una proteína que se autocliva VP0, que cliva de VP2 a
VP4 generando un virión infectivo a partir de un no infectivo no clivado.
61
Herpesviridae
- Se sintetizan las proteínas independientemente; éstas tienen una señal de señalización nuclear, para
dirigirse al núcleo. Usa proteínas de andamiaje/chaperonas (scaffold), que deben degradarse antes
de permitir la entrada del ácido nucleico con una proteasa viral p24, quedando armada la cápside.
- Encapsidación secuencial en núcleo → Ingresa por el poro.

Adenoviridae
- Las proteínas se sintetizan independientemente y se dirigen hacia el núcleo. Se ensamblan las
unidades y luego la cápside, asistida por chaperonas. Se degradan las chaperonas y la cápside
queda libre para encapsidar el genoma viral.

Rhabdoviridae
- Simetría helicoidal.
- Mecanismo coordinado.
- La proteína N se asocia al genoma para formar la nucleocápside, y el proceso va a estar dirigido por
ella, señalizada por señales de empaquetamiento (estructura secundaria ubicada en el extremo 5’ del
genoma viral). Luego la nucleocápside se va a dirigir a la superficie celular para adquirir su envoltura.

EGRESO / SALIDA
Virus no envueltos
- Lisis celular: más frecuente. Una vez que agotaron los sustratos celulares y formaron muchos
viriones:
➔ Viroporinas (proteínas virales): forman poros en la membrana celular y permiten la liberación
de las partículas virales.
➔ Apoptosis: proteínas virales que generan apoptosis celular, muere la célula y se liberan las
partículas.
- Exocitosis: fusión de vesículas provenientes de organelas con la membrana plasmática. Usa el
mecanismo celular saliendo por vesículas, “exosomas”. Ej: virus polio.

Virus envueltos
Se tiene que llevar una envoltura: membrana celular (plasmática o de organelas) con glicoproteínas
virales.
- Por gemación (budding): salida como brotando de la célula.
- Por exocitosis: ej. Herpes.

Virus segmentados
- Estos virus deben reunir uno de cada uno de sus fragmentos.
Influenza: deben asociar los fragmentos entre sí. Ensamble coordinado, el ácido nucleico tiene señales
que reconocen al fragmento vecino, tomando siempre la misma conformación. De esta forma los 8
fragmentos migran juntos hacia el parche de glicoproteínas virales que se forma en la MP y por allí
realizan el budding.

Los virus que replican y se encapsidan en el núcleo (ej: herpes, adeno, parvo) necesitan salir del núcleo
antes de salir de la célula. Usan distintos mecanismos:
- Poro nuclear.
- Rompen el núcleo, así como rompen la célula. La rotura de la envoltura nuclear es un proceso
activo inducido por proteínas virales tardías específicas.
- Salen por la membrana interna haciendo una vesícula que se fusiona con la membrana externa, y
así llegan al citoplasma donde recogen la envoltura (Herpes recoge una envoltura secundaria; o
podrían recoger su envoltura en el citoplasma).

62
Vía alternativa para virus envueltos con proteína de fusión
- Pasaje de célula a célula.
- Formación de sincitios: los sincitios se forman mediante la fusión de células infectadas con células
vecinas que conducen a la formación de células agrandadas multinucleadas. Este evento es inducido
por la expresión superficial de la proteína de fusión viral que es fusogénica directamente en la
membrana de la célula hospedadora.
Solo puede ocurrir con virus envueltos con péptido de fusión pH independiente, que sean capaces de
fusionarse directamente en la superficie celular sin necesidad de endocitosis.

Herpes
Debe salir con su cápside armada del núcleo → egresa llevándose parte de la membrana nuclear →
deja la membrana en el RER → Ingresa al golgi y se lleva proteínas de tegumento (ej: pbo16), ge, gm, y
glicoproteínas y la membrana de golgi → Sale del golgi por sistema vesicular → la vesícula la deja en la
membrana plasmática. Egreso por exocitosis.

Poxvirus
- Adquiere su envoltura principal del RER.
- Sale un virión inmaduro redondeado → a partir de la maduración por proteasas adquiere la forma de
ladrillo característica = virión maduro.
- Puede salir por lisis celular.

Una gran población de los virus maduros son tragados

por Golgi ganando dos membranas más. Estas
partículas pueden salir por exocitosis dejando una
membrana fusionada con la membrana plasmática →
“virión envuelto”, porque le quedan dos membranas: una
de golgi y otra del RE.
- Los viriones envueltos inducen a la formación de
colas de actina y son expulsados a mayor distancia
de la célula hospedadora, dándole mayor
diseminación del virus.
- La doble membrana también le permite escapar del
sistema inmune, porque presenta en la superficie
distintos Ag. También podría variar su tropismo por
tener mayor cantidad de proteínas en su superficie,
las cuales se unen a diversos ligandos.
- Viriones maduros (MV) salen por lisis → integrado
por macropinocitosis, y luego fusiona su membrana
con la del endosoma.
- Viriones envueltos (EV) salen por exocitosis → ingresa fusionando membranas.

Todos estos eventos están dirigidos por el

tránsito citoplasmático, ya que cápsides,
genomas y proteínas deben utilizar el
transporte celular mediado por
microtúbulos y filamentos de actina.

Influenza
Después de replicar sus fragmentos
genómicos en el núcleo y de haber
sintetizado proteínas debe encapsidar su genoma, para eso M1 (proteína de matriz) y Nucleoproteína
(NP) ingresan al núcleo.

63
Los 8 fragmentos de genoma son exportados del núcleo, ayudados por la NEP, se acoplan, y migran a
la superficie celular, donde se encuentran con un parche de glicoproteínas virales formado por HA, M2,
NA. En el parche egresan por gemación (budding).

Liberación
La HA reconoce al ácido siálico, que se
encuentra en la mayoría de las membranas
plasmáticas. Durante la gemación de la
partícula de influenza, la HA reconoce al ácido
siálico que queda en la célula, y hace que la
partícula se quede retenida dentro de la célula
(CREO que queda atrapada en la superficie).
En estos casos la NA cliva la unión al ácido
siálico y permite la liberación de los viriones.
La NA puede ser blanco de antivirales,
haciendo que las partículas queden atrapadas
en la célula.

MADURACIÓN
Maduración del péptido de fusión (para poder ser infectivos)
Los virus envueltos con proteína fusogénica no pueden sintetizar esta proteína con toda su capacidad
fusogénica, ya que se fusionarían a cualquier receptor que encuentren (a ellos mismos o a células que
no son su blanco, quedando atrapados).
El virus lo resuelve sintetizando una proteína fusogénica inactiva, que debe clivarse para volverse
funcional.

Imagen tridimensional de la HA
Porción globular: reconoce al receptor celular.
α-hélices = dominios de transmembrana.
Péptido de fusión oculto entre la HA. Para poder ser funcional
y exponerse debe ser clivado por la HA.

La HA está formada por tres unidades de un polipéptido que es

HA0. Este presenta 2 subunidades:
- HA1: porción globular, reconoce el ácido siálico.
- HA2: porción transmembrana y contiene al péptido de fusión.
Para que el péptido de fusión pueda sufrir un cambio de conformación y fusionar las membranas, debe
ser liberado. La HA inmadura debe clivarse → le permite sufrir un cambio de conformación y exponer
el péptido de fusión, si no se cliva no queda expuesto y no realiza su función.
El clivaje lo hace una proteasa, en influenza es la “triptasa clara”* → Es producida por las células
CLARA del epitelio alveolar → La maduración es extracelular en el pulmón → define el tropismo
respiratorio del virus.
*En las cepas de baja patogenicidad de influenza, clivan esa unión para poder dejar al péptido de fusión
preparado para hacer su trabajo ante un pH ácido.
Maduración de influenza: para que el péptido pueda cambiar su conformación cuando baje el pH, tiene
que estar libre. Para ello HA0 se cliva en sus 2 subunidades.

Ciclo de influenza
1) Síntesis de HA0 en el RE.
2) La HA migra a la MP donde forma un parche por donde va a gemar el virus.
3) Clivaje HA0: HA1 + HA2 “maduración de influenza” → por la enzima extracelular, triptasa clara.
64
4) HA1 reconoce el ácido siálico en una nueva célula.
5) Exposición del péptido fusión (cambio de conformación),
pudiendo fusionar las membranas. Debe disminuir el pH.
Si HA0 no se cliva (porque el virus va a otros tejido): la porción
globular contacta con el receptor → endocitosis → baja el pH en
el endosoma pero al no estar liberado el péptido, no se genera el
cambio conformacional, no se expone y la membranas no se
fusionan → el virus no penetra en la célula, queda atrapado en el
endosoma → unión de un lisosoma al endosoma, que lo digiere.

El virus de influenza de baja patogenicidad solo es infectivo en

células del aparato respiratorio y digestivo donde hay triptasa
clara.
Puede haber mutación en el ARN de influenza que codifica para
el sitio de clivaje de la hemaglutinina y se cambian los
aminoácidos. Le permite ser clivado por otras proteasas,
multiorgánicas, permitiendo que la cepa de influenza infecte muchos tejidos y sea de “alta
patogenicidad”.
Las mutaciones ocurren también en otros virus, por ejemplo el virus de Newcastle con cepas
lentogénicas pueden volverse meso/velogenicas.

Retrovirus

Sintetiza sus proteínas de cápside mediante el precursor poliproteico GAG; este contiene a MA, cápside
y nucleocápside. En algunos casos sintetiza GAG-POL, que contiene además la polimerasa RT,
integrasa y proteasa.
GAG se une al genoma viral a partir del reconocimiento de estructuras 2° (al ser diploide realiza el
complejo de kissing loop). Los ARN genómicos migran hacia la membrana citoplasmática para
encontrarse con el parche de glicoproteína y allí geman.
Sale el virión inmaduro → todas sus proteínas estructurales están juntas (polipéptido). La proteasa
integrante del complejo gag-pol se autocliva y cliva a los componentes de gag y pol, dejando un virión
maduro.

SARS cov 2.
La glicoproteína S (ligando), posee dos subunidades:
- S1: dominio de reconocimiento al receptor de la ECA, región con alta variabilidad.
- S2: péptido de fusión y altamente conservada.
S1 reconoce al receptor de la ECA a AC2, y esto permite la internalización de la partícula. Cuando el
endosoma llega a un bajo pH (“endosoma maduro”) se promueve el cambio de conformación y
exposición del péptido de fusión, permitiendo que el virus penetre en la célula.
A esto se le suma que el virus incorporó una mutación, que es un domino polibásico entre S1 y S2, y
que este dominio puede ser clivado por purinas → le da la capacidad de liberar el péptido de fusión sin
que baje el pH, pudiendo penetrar por la membrana plasmática. Esto le da gran capacidad infectiva al
virus.
65
 GENÉTICA Y EVOLUCIÓN VIRAL

Estudio de la genética viral

- Para comprender cómo funcionan los virus en el contexto del hospedador.
- Para conocer cómo producen enfermedad.
- Para manipularlos a favor nuestro → Ej: generando estrategias para combatir infecciones virales (ej:
en el diseño de antivirales) o para prevenir infecciones virales (diseño de vacunas).

Estudio de:
- Tipos (secuencias) de genomas.
- Expresión de genes virales a nivel de transcripción, traducción.
- Tipos de mutaciones.
- Intercambio de material genético (entre ellos y el genoma celular).
- Mecanismos de variabilidad genética (base para la evolución de los virus).

➢ A nivel de transcripción:
- Presencia de distintos promotores (protoparvo y dependoparvovirus; papilloma, herpes).
- Transcripción en dos direcciones (polyoma, adeno, herpes).
- Reiniciación de la transcripción (rhabdo, paramyxo, ARN -).
- Editing (paramyxo, ébola).
➢ A nivel de procesamiento:
- Presencia de distintos sitios de poliadenilación (adeno y amdoparvovirus).
- Splicing alternativo (parvo, polyoma, papilloma, adeno, herpes [poco], ortho y retro).
➢ A nivel de la traducción:
- Diferentes mecanismo de traducción*.
➢ A nivel post- traduccionales:
- Clivaje de poliproteínas.

*A nivel de la traducción
- Leaky scanning (dependoparvovirus, polyoma, paramyxo, orthomyxo, rota).
- Reinicio de la traducción (termination- reinitiation) (herpes, orthomyxo).
- Supresión de terminación (retro).
- Ribosomal frameshifting (corona, orthomyxo,retro).
Estos 4 permiten, a partir de un mismo fragmento de ARN, generan distintas proteínas.
- Inicio de traducción independiente de CAP (picorna, flavivirus).
- Ribosome shunting (adeno).

66
 Leaky scanning
Implica el uso de AUGs (codones de iniciación) alternativos.
Ej: polyomavirus
Verde: mensajero
Lila: CAP
La subunidad menor del ribosoma
reconoce el CAP, comienza a
escanear hasta encontrar el
primer codón de iniciación.
Empieza la traducción que finaliza
cuando encuentra el STOP.
Acá hay dos marcos abiertos de
lectura, el ORF1 y ORF2, cada
uno con su codón de iniciación, y
si ocurre el mecanismo de leaky
scanning, el ribosoma va
directamente al segundo codón
de iniciación.
En general debe estar presente la secuencia consenso COSAC para que pueda reclutarse la subunidad
del ribosoma y todos los factores de iniciación de la traducción. En el primer codón de iniciación esta
secuencia COSAC es débil, por lo tanto está favorecida la traducción del 2° marco de lectura (la
secuencia consenso es más fuerte, más importante).
La subunidad menor reconoce el CAP, empieza la traducción del 1° y puede concluir o incluso pasarlo
por alto y comenzar directamente en el 2°. Esto está regulado por proteínas celulares y se da en casos
particulares, por ejemplo con estrés celular. En ejemplo de esto último son las infecciones virales que
activan el mecanismo de shut off de la traducción; esta se inhibe por el bloqueo del factor F2α, pero con
una secuencia COSAC fuerte puede reclutar la subunidad del ribosoma y empezar la traducción del
segundo ORF.
- La proteína codificada por el 1° ORF es la que se
produce con mayor frecuencia.
- Para que se traduzca la proteína codificada en el 2°
ORF, tiene que ocurrir leaky scanning. Si no ocurre, solo
tendremos la proteína codificada por el ORF1.

Por ejemplo: las proteínas VP1, VP2 y VP3 de Polyomavirus.

La VP1 está codificada más cerca del extremo 5’ (se obtiene
mayoritariamente) y hay otros dos marcos de lectura para la
VP2 y VP3.

Influenza A: con la flecha roja están marcadas las

proteínas que se generan por leaky scanning o alternative
initiation. Se ve la PB1-F2 y las versiones de la proteína
PA que se generan por este mecanismo.

67
 Rotavirus: la proteína BP7 y la NSP5 y 6 codificada en el
segmento 9 y 11 respectivamente.

Paramyxovirus: la proteína C
se genera por este
mecanismo. El transcripto P
también tiene incluido el
marco de lectura de la
proteína C. Si ocurre el leaky
scanning se obtiene C, que se cree tiene un efecto en la regulación de la tasa de transcripción de la
proteína P.

Reiniciación de la traducción
Este mecanismo permite la expresión de un 2° ORF que se encuentra en el mismo mensajero. Una vez
finalizada la traducción del 1° ORF, la subunidad 40s permanece unida al mensajero y se reinicia en el
2° ORF.
El reinicio se da por una secuencia denominada TURBS (termination upstream ribosomal binding site)
ubicada corriente arriba del stop del 1° ORF. El factor de traducción celular eIF3 aumenta la eficiencia
de la reiniciación.

También hay 2 marcos de lectura.

En el caso del Cytomegalovirus humano están
separados por una región intercistrónica.
También ocurre en influenza en el segmento 7, donde la
proteína BM2 se genera por este mecanismo.

Influenza B: los dos ORF están superpuestos.

El ribosoma traduce la proteína que está codificada
en el 1° ORF; cuando la subunidad menor llega al
stop no se separa y queda retenida, reiniciando la
traducción en el 2° marco de lectura.
La presencia de un “motivo de reiniciación”, la
secuencia TURBS, favorece la reiniciación sin que
haya escaneo: al traducir el 1° ORF debe reconocer
el CAP, pero cuando termina y queda unido no
necesita un escaneo previo para comenzar a traducir
el 2°.

- Si se produce este mecanismo obtenemos la proteína codificada por el ORF2. En este caso la proteína
BM2 solo va a poder producirse si ocurre este mecanismo, sino se fabrica solamente la proteína
codificada en el ORF1.

68
 Supresión de la terminación

En la traducción convencional, el codón stop es reconocido por el factor de liberación. En la supresión

de la terminación el codón stop es parcialmente reconocido por un ARNt que coloca un aminoácido,
continuando con la traducción. Este evento está favorecido por la formación de una estructura 2ria o por
una determinada secuencia ubicada río abajo del stop.

En Retrovirus el mensajero codifica para

los genes GAG y POL (ambas
poliproteínas). En general la traducción
inicia con la poliproteína GAG, al
finalizar encuentra el stop, termina y se
libera.
Para que se genere la proteína POL, la
traducción debe seguir. A continuación
del codón stop perteneciente a GAG,
hay una estructura 2ria del mensajero,
complementaria a otras bases que se
encuentran más adelante, produciéndose una especie de loop. Esa secuencia hace que se pase por
alto el stop, y se traduzca una proteína entera GAG-POL.

Izquierda: solo hay traducción de GAG. Se

encuentran los aminoácidos, el ARNt, y al llegar al
stop se une al factor de terminación, y se libera la
proteína.
Derecha: supresión de la terminación. Se genera la
estructura 2ria que evita que el factor de terminación
se una al stop; este es pasado por alto, se une otro
aminoácido y continúa la síntesis, obteniéndose así
las poliproteínas GAG y POL.
Siempre hay mayores niveles de GAG porque es la
que se produce siempre.

Ribosomal
frameshifting

Se da en:
- Retrovirus: involucra a la poliproteína GAG
POL.
- Coronavirus: con el ORF 1a y 1b.
- Influenza.

69
Requiere una secuencia resbaladiza
X-XXY-YYZ (virus del sarcoma de Rous
es A-AAU-UUA) y una estructura 2° de
ARN llamada pseudoknot, ubicada 5-8
nucleótidos río abajo.
El ribosoma llega a la secuencia
resbaladiza y queda detenido, se mueve
y retoma la traducción un nucleótido para
atrás, produciendo un corrimiento del
marco de lectura (frameshifting).

Si bien hay un codón de terminación,

cuando retoma lo hace un nucleótido
para atrás, por lo que el stop ya no es
leído, y sigue traduciendo hasta el final.
Retrovirus: está superpuesta la
terminación de GAG con POL. GAG se
produce siempre, y la poliproteína
GAG-POL se va a producir si existe este
mecanismo.

Influenza: PA-X (relacionada con procesos

apoptóticos) se produce por este
mecanismo.

Coronavirus: las proteínas codificadas

por el ORF 1b se van a producir solo
si ocurre este mecanismo. Las del 1a
siempre.

Estos 4 mecanismos permiten que se genere una proteína codificada en un segundo ORF. Si no
ocurren sólo será traducida la proteína codificada por el primer ORF.

70
 Traducción independiente de CAP

Requiere la presencia de una estructura 2ria del ARNm viral

denominada IRES (internal ribosome entry site). Ej:
picornavirus.
El IRES es reconocido por el ribosoma y puede comenzar la
traducción en ausencia de CAP.

En el extremo picorna tiene otra estructura 2ria (cloverleaf) y

la proteína VPg.

Inicio de la traducción CAP-dependiente: los

factores de iniciación se unen al CAP para
reclutar a la subunidad menor del ribosoma.
Picornaviridae: no presenta CAP, por lo tanto,
al iniciar la traducción se cliva el Vpg, y el
IRES permite reclutar la subunidad menor del
ribosoma y los factores de iniciación,
dependiendo de la cantidad de factores que se
requieren (algunos son más o menos
dependientes de los factores de iniciación
celulares). Las proteínas ITAF son factores
celulares que regulan la traducción en
ausencia de CAP. En la célula este mecanismo existe para genes relacionados con la angiogénesis,
regulación de expresión génica y genes de desarrollo.
Izquierda: traducción convencional
en la célula. El CAP es reconocido
por el factor 4e, que está unido al
extremo amino terminal del 4g. Se
recluta, se hace el escaneo,
reconoce al codón de iniciación, se
incorpora la subunidad mayor y se
traduce.
Derecha: cuando no hay CAP la
traducción puede empezar porque
se recluta la subunidad menor del
ribosoma y algunos factores de
iniciación, en este caso no es
necesario el extremo amino terminal
del 4g para poder iniciar una
traducción. Algunos virus
(enterovirus, rinovirus y aftovirus)
poseen proteasas virales para clivar
este factor y así anular la traducción CAP-dependiente, aprovechando la maquinaria de traducción de la
célula a favor del virus. Ante la presencia del IRES pueden iniciar la traducción, ya que solo requiere el
extremo carboxi terminal que participa en la unión de estos factores.

71
Ribosome shunting

Adenovirus: el ARNm recluta la

subunidad 40S, realiza un escaneo
muy limitado y rápidamente se
transloca hasta el codón de iniciación.
Permite la traducción diferencial de los
genes tardíos en etapas tardías de la
infección.
El ORF6 codifica para una proteína
tardía. En el medio del ORF1 y 6 se
encuentra una secuencia líder
tripartita.
El ribosoma es reclutado en el CAP, pero al estar formada esa estructura 2ria salta al codón de iniciación
del ORF6.
En la etapa tardía de la infección, los Adenovirus traducen selectivamente los ARNm tardíos y en forma
simultánea suprimen la traducción de los ARNm celulares. Los ARNm tardíos tienen CAP y se traducen,
a pesar de estar bloqueada la traducción celular, ya que poseen la secuencia líder tripartita en el
extremo 5´ que les confiere la habilidad de iniciar la traducción por el mecanismo de “ribosome
shunting”. En el mismo, el ARNm recluta la subunidad 40S, se realiza un escaneo muy limitado y
rápidamente se transloca hasta el codón de iniciación. Este mecanismo está favorecido por la proteína
tardía 100k de los adenovirus. Esta se ubica en una región que impide la traducción de la célula; se
genera un shut off de los mecanismos de traducción celulares, aprovechandolos. 100k se une al factor
de iniciación 4g y a la proteína PABP que se une a la cola polyA; esto promueve el inicio de la
traducción reclutando a la subunidad 40s.
Esta proteína tardía 100k:
✓ Participa en el bloqueo de la traducción de la célula.
✓ Favorece selectivamente la traducción de estos genes tardíos en adenovirus.

Dos estrategias para bloquear

la traducción celular
- Picornavirus: clivaje del factor de
iniciación de la traducción por
proteasas virales.
- Adenovirus: la proteína 100k se
une al factor 4g ocupando el lugar
que utiliza la enzima que fosforila
al 4e (que debe estar fosforilado
para que pueda ocurrir la
formación del complejo de
iniciación); queda desfosforilado
bloqueando la traducción celular.
También se une a la región
tripartita y a la región de unión de
la polyA permitiendo que se inicie
la traducción en esa región
selectivamente.

72
A nivel post-traduccional

Clivaje de poliproteína

Picorna: se genera una poliproteína que es clivada en distintas etapas → etapa 1 (flecha roja) que
separa la P1 del resto. En azul están los clivajes que permiten la generación de otras proteínas. Las
proteínas en picorna van apareciendo en forma secuencial porque el clivaje se realiza de forma
secuencial.
Retro: GAG y POL son poliproteínas que requieren de proteasas para que se generen el resto de las
proteínas individuales.

RESUMEN DE LOS MECANISMOS DE TRADUCCIÓN Y POST-TRADUCCIÓN

73
MECANISMOS QUE GENERAN VARIABILIDAD

1) Mutaciones.
2) Recombinación ADN y ARN.
3) Reasociación o Reassortment (sólo en virus ARN segmentados).

Mutación
Las mutaciones se producen por errores que comete la polimerasa al sintetizar la copia genómica,
colocando nucleótidos que no corresponden.
Hay distintos tipos de polimerasas dependiendo del virus (ADN o ARN).
- Tasa de mutación del genoma celular. FM = 10-9 - 10-10.
- La polimerasa comete errores, pero puede corregirlos.
- Los virus que usan la ADN pol tienen tasa de mutación similar a la celular (Polyoma, Papilomavirus).
- Los que tienen pol viral tienen una tasa de mutación mayor (pox, adeno y herpes).

En virus ADN lo esperable sería:

➔ Virus que utilizan ADN polimerasa celular sean poco variables (Virus ADNsc).
➔ Virus que utilizan ADN polimerasa viral sean más variables (Virus ADNdc). FM = 10 -7 - 10 -8
Pero los virus ADNsc que usan ADN pol celular tienen una frecuencia de mutación alta, de 10-6. Ej:
parvo y circovirus.

Virus ARN: FM = 10-3 - 10-5 (tasa de mutación más alta).

- Excepción: Coronavirus Nsp14 10-5 - 10-7 → tasa de mutación menor.
ARN polimerasa ARN dependiente comete muchos errores y carece de mecanismo de corrección
(proofreading) dando origen a una población de ARNs con diferentes secuencias (todas las copias no
son idénticas, sino que en la célula hay una población heterogénea de secuencias).
Cuantas más mutaciones más secuencias → cuasiespecie: “población de secuencias de ARN
diferentes, similares pero no idénticas” (población heterogénea que se encuentra dentro del individuo o
célula infectada).

74
Tasa de mutación
Tamaño del genoma en función de la tasa de
mutación.
Tasa de mutación de los virus:
ADNdc < ADNsc < Corona < ARN.

Las mutaciones:
➔ Afectan las proteínas.
➔ Pueden caer en las secuencias regulatorias:
promotores, UTR, IRES.
➔ Provocan cepas más patógenas o menos
patógenas: depende de la mutación y de cómo afecte su funcionalidad.

Interacciones entre virus (cuando hay una coinfección).

● Complementación.
● Recombinación en virus ADN.
● Recombinación en virus ARN.
● Reasociación o reassortment.

Complementación
Virus 1 (arriba): mutación en la secuencia que codifica para la
proteína A, gen esencial (sin esta no replica).
Virus 2 (abajo): mutación en la secuencia para la proteína B, que
es esencial.
Co-infección con distintos mutantes: dos virus
defectivos pueden “ayudarse” mutuamente,
obteniéndose progenie de ambos. Uno
proporciona el producto génico (proteína) que es
defectuoso en el otro y viceversa, pero cada uno
sigue con su mutación. No hay intercambio de
material genético, sólo interacción a nivel
funcional.
Se obtiene progenie viral. Cada virus aporta su
proteína, y cuando se genera la progenie esta
tiene las dos proteínas y puede ser funcional.
Por ejemplo virus helper (requieren de otros virus, a veces no emparentados, para su replicación):
Parvovirus → solo replican en coinfección de adeno o herpes que le dan las proteínas necesarias para
que el dependovirus pueda replicar; en su ausencia el virus tiene una replicación abortiva.
En los virus ARN, hay muchos que pueden ser defectivos, pero si se encuentran todos juntos se
favorece la complementación y puede haber replicación.

recombinación

➔ Virus ADN
◆ Homologa
◆ No homóloga.
Virus ADN: hay una coinfección de 2
cepas virales diferentes que pueden
recombinar porque hay sitios que son

75
reconocidos por la maquinaria de recombinación celular, y permiten que ocurra.
También puede haber recombinación de virus con el genoma celular.

Virus ARN (co-infección).

La polimerasa empieza usando de molde la cadena
gris oscura y produce la gris clara.
En un punto la POL salta a otra cadena cercana y
continúa usando como molde la verde.
La cadena gris es complementaria a la oscura, y
hace unión fosfodiéster con la cadena
complementaria a la verde. La parte inicial es
complementaria a la gris oscura, y luego a la verde.
“La POL viral salta de templado cuando está haciendo
la copia genómica”.

Reasociación- reassortment
Solo en virus ARN segmentados (Rota e influenza).
Influenza: cepa 1 y cepa 2. Cuando hay coinfección y se produce el
ensamblaje, pueden ensamblarse segmentos uno del otro. Esta
reasociación puede ocurrir entre cualquier segmento.
Si están involucrados los segmentos que codifican para las proteínas HA
o NA (en influenza: proteínas de superficie) puede generar un escape al
reconocimiento antigénico del hospedador: shift antigénico = se adquiere
un fragmento que antes no estaba, como si fuera una mutación gigante.

Ejemplo de shift antigénico:

generación de la cepa de
influenza H3N2 en humanos →
coinfección en cerdos de influenza humana (H2N2) e influenza
aviar (H3N8), se produjo reasociación y adquirió la H3 aviar y
N2 de humanos. ESTO es el shift antigénico → mediante el
mecanismo de reasociación se produjo una combinación nueva
de HA y NA y se genera el H3N2.
Que ocurra un shift antigénico no necesariamente implica que
haya un salto de rango de especie.
Coinfección de ambos influenza → Reasociación → Shift Antigénico → Salto de especie (a veces).

Drift antigénico
Es la consecuencia de la selección y establecimiento de mutantes, que escapan al reconocimiento
antigénico en las poblaciones virales. Pueden o no generar un salto de especie.
Las mutaciones que ocurren en los genes que codifican para las proteínas de superficie (reconocidas
por Ac neutralizantes) le confieren un escape al reconocimiento por parte del SI del hospedador,
confiriendo una ventaja adaptativa al virus.
Las mutaciones que no vemos son las que no fueron exitosas.
El drift antigénico es consecuencia de la no corrección de los errores que comete la polimerasa.

76
 No confundir los mecanismos con el salto de especie: el drift es por errores en la polimerasa, la
reasociación es porque se mezclan los segmentos. No todo error que comete la polimerasa
genera un drift, y no todo drift antigénico genera salto de especie.
- No toda reasociación genera shift antigénico y no todo shift genera salto de especie.
Depende de la proteína involucrada y del reconocimiento con el receptor celular.

Evolución de los virus

- Diferentes presiones de selección conducen a constantes cambios en las poblaciones virales.
- Los virus tienen una alta capacidad adaptativa: ciclo reproductivo rápido, altísimo número de
partículas, capacidad de eludir respuestas del hospedador, capacidad de sobrevivir fuera del
hospedador.
- Fuentes de variabilidad genómica: mutación, recombinación, reasociación (virus ARN segmentados).

Ejemplos de adaptación
- Cuasiespecies en virus ARN constituyen un reservorio genético para la adaptación y evolución
(población heterogénea que le permite adaptarse a distintas circunstancias).
- Virus ADN con infección latente (Herpesvirus) tienen una tasa de variabilidad semejante a su
hospedador. Co-evolución con sus hospedadores. Poca capacidad de adaptación si hay alguna
presión de selección muy fuerte.
- Virus emergentes: necesitan un periodo de adaptación para instalarse. Matar al hospedador no es
conveniente. Ej. influenza aviar en humanos.

Ejemplo de evolución
El parvovirus canino se originó a partir del virus de la
panleucopenia felina.
Se originó inicialmente el parvovirus canino tipo 2
alrededor de 1980. La diferencia radica en la proteína
de la cápside VP2 (que se une al receptor celular de
transferrina). Mutaciones en esta proteína hicieron
que pudiera reconocer al receptor de caninos e
infectarlos.
Mutaciones en la proteína VP2 generaron las cepas
2a y 2b, que reemplazaron a la cepa tipo 2.
En el año 2000 surge la cepa tipo 2c, que difiere de
los otros 2 en un solo aminoácido.
Son mutaciones puntuales por errores que comete la
polimerasa, por lo tanto la consecuencia es el drift
antigénico.

Representación de la proteína de la cápside VP2: a pesar de

sufrir mutaciones sigue siendo funcional. Esto se llama
plasticidad estructural: determinados virus tienen proteínas
con mayor capacidad estructural, que resisten una cantidad de
mutaciones que no anulan su función.
Las mutaciones que se generan en las regiones de unión al
receptor son las que cambian la afinidad de una cepa a la otra.

77
 Evolución por drift antigénico en influenza: el origen
de influenza canina desde influenza equina también
surgen de mutaciones producidas por la polimerasa.
El cambio de un solo aminoácido ubicado en la
posición 222 fue suficiente para que se originara un
drift antigénico, y a la vez un cambio de especie.
Antes vimos la reasociación y salto de especie.
Ahora es drift antigénico y salto de especie.

Evolución de coronavirus (SARS Cov2)

Hipótesis de los cambios para el salto entre
especies: murciélago al humano con el
pangolín de intermediario.
- Región de reconocimiento del receptor
celular AC2 → reconoce proteína S
(proteína spike). Se secuenció el genoma y
se comparó la región de unión al receptor
celular. Cuando se compara se ve que hay
5 aminoácidos que están compartidos entre
humanos y el pangolín, y tienen un
ancestro en común con los murciélagos.
- Mutación entre los dominios de la proteína
S. Región bisagra: importante para que se
exponga el péptido de fusión.
El del humano adquiere un sitio polibásico
de clivaje dado por la adición de 4
aminoácidos. Este sitio es reconocido por
furinas de la célula, lo clivan y expone el
péptido de fusión y antes de salir de la
célula. En el golgi.
Le da un loop más expuesto que le permite un mejor clivaje por parte de las furinas celulares.

78
 ANTIVIRALES
Detienen el desarrollo y propagación de virus específicos sin causar un daño relevante en la célula
hospedadora.

Importancia y dificultades
● Gran relevancia en patógenos de humanos: el 75% de las enfermedades humanas son zoonóticas.
● Los antivirales deben estar en el medio donde replican los virus y deben ser específicos para no
afectar a la célula hospedadora.
● Resultados in vivo o in vitro: por ejemplo, HCV y HBV no replican fácilmente en cultivo por lo que no
se pueden estudiar; otros ocasionan enfermedades graves y se transmiten muy fácilmente, de modo
que se requieren niveles de biocontención elevados, que aumenta la dificultad su estudio.
● Cada virus tiene sus propias enzimas: a veces es un beneficio (cada virus tiene en su genoma
proteínas que son específicas de ese grupo) y otras puede generar una dificultad (al desarrollar una
una molécula que sea efectiva contra determinado grupo de virus, probablemente no lo sea contra
otros). No se puede tener un antiviral de amplio espectro.
● Infecciones virales que pueden establecer latencia: en este caso cualquier molécula que desarrolle
para interrumpir el ciclo de replicación viral no tendría efecto, por lo que una reaparición del virus en
el hospedador va a ocasionar problemas y se puede proteger con la droga.
● Muchos agentes patógenos tienen una gran plasticidad en su genoma, principalmente cuando se
habla de ARN. Ejemplo VIH: hay una producción de 1012 viriones por día, entonces si se tieneuna
terapia antirretroviral deberá ser bastante efectiva, porque se estará enfrentando a una población
extremadamente alta y una variabilidad muy alta de viriones.

Condiciones previas a cumplir

- Altamente específica y segura: para que no afecte a las células del hospedador.
- Baja toxicidad, acción mutagénica, teratogénica, cancerígena.
- Buena disponibilidad y solubilidad.
- Costo y dosis conveniente: si la población de pacientes infectados es alta, el tratamiento deberá ser
alcanzable a la mayoría de la población.

Cuando pensamos en virus como VIH de alta

replicación, la droga va a ejercer presión sobre
la población viral, disminuyendola, pero nunca
llega a 0, ya que hay variantes que escapan al
antiviral.
A medida que transcurre el tiempo de
tratamiento, si tengo un único antiviral, la
presión de selección va a llegar a un cuello,
pero siempre alguna variante escapa, haciendo
que sean importantes en la 2° subida de carga
viral → el tratamiento deja de ser efectivo.
Esto puede ocurrir por distintos fenómenos, por la variabilidad que tienen las poblaciones virales en un
hospedador infectado. No va a estar solo haciendo presión de selección el antiviral, sino que también el
sistema inmune está actuando detrás del tratamiento.

Según sitio de interacción: se puede frenar el ciclo de replicación en distintos puntos:

- Interacción virus- célula: cuando el virus - Modificación post- traduccionales.
ingresa a la célula hospedadora. - Síntesis de ADN/ARN.
- Desensamblaje. - Ensamblado, egreso, liberación.
- Síntesis proteica.

79
Según modo de acción
- Terminadores de cadena (análogos y no - Péptidos miméticos.
análogos de nucleósidos). - Moléculas solubles.
- Inhibidores de maduración. - SiARN.

Antivirales que inhiben la síntesis de ácido nucleicos

- Acyclovir - Abacavir
- Valaciclovir: es más soluble y tiene mayor - Lamivudina
disponibilidad - Emtricitabina
- Ganciclovir - Foscarnet (no nucleosido!)
- Ribavirin - Favipiravir: muy utilizado en virus ARN.
- Azidotimidina/ zidovudina
Los AN tienen purinas y pirimidinas unidos a una pentosa. Esta última se puede fosforilar.
Nucleósido (base + ... → Nucleótido: mono, di y trifosfato).

Acyclovir
● Análogo de la guanosina.
● Tiene su base nitrogenada igual a una
guanosina, pero la base pentosa está
incompleta.
● Se puede trifosforilar perfectamente,
pero al tener la región de la molécula
incompleta impide la formación del
enlace fosfodiéster entre las bases, con
lo cual al integrarse al ADN viral en
síntesis, impide que la polimerasa viral
siga agregando nucleótidos y con ello la replicación. Interrumpe la síntesis de la cadena del AN viral.
● La afinidad por la polimerasa viral es mucho mayor que la afinidad por la ADN polimerasa celular. Si
hay una célula infectada la molécula se va a incorporar a la doble hebra de ADN viral en síntesis y no
al genoma celular.
● Tiene alta especificidad, y necesita baja concentración a nivel celular para que sea efectiva.
● 3 fosforilaciones: la timidina quinasa es una enzima viral que realiza la primera fosforilación del
aciclovir, volviéndolo activo cuando ingresa. Las otras dos fosforilaciones las hace la célula. En una
célula sin infección, la primera enzima no está, por lo tanto el aciclovir no tiene efecto.

Ribavirina
● Análogo de nucleósido guanosina.
● Usado para virus ARN muy
diferentes: virus de la hepatitis C,
respiratorio sincicial (RSV), rabia,
ébola, lassa fever virus (LFV).
● Mecanismos propuestos de su
acción en infección por HCV: la
ribavirina ingresa a la célula e
inmediatamente es mono, di y tri
fosforilada.
● En forma de nucleósido trifosforilado
es procesado por la polimerasa e
incorporado a la hebra de ARN en
síntesis de novo dentro de la célula infectada.
80
● Es mutagénico: al interactuar con la polimerasa celular entorpece su actividad → aumenta la tasa de
error hasta niveles catastróficos → acumula tantos errores que el genoma es defectivo → se eliminan
partículas defectivas y así se interrumpe el ciclo viral, ya que esa partícula cuando ingresa a una
célula que no está infectada no va a poder replicar.
● No va a haber una síntesis de novo de esos genomas debido a que se está interrumpiendo la
síntesis de AN.
● Estimula el sistema inmune, pero no es específico de su actividad antiviral.
● Puede tener cierto efecto en la inhibición de la síntesis de algunos nucleósidos, lo que disminuye el
pool disponible de nucleótidos dentro de la célula y colabora con la interrupción del ciclo de
replicación.
● Específico-no tóxico (pro droga).
● Derivados: valacyclovir, famiciclovir.

Sofosbuvir
● Eficacia para hepatitis C.
● Análogo de nucleósido que es
trifosforilado → se integra al
genoma viral → interrumpe la
síntesis de AN viral.

Distintos blancos terapéuticos para frenar el ciclo de

replicación de hepatitis C (flavivirus):
- Sofosbuvir y Ribavirina: actúa a nivel de la
replicación del ARN.
- Inhibidores a nivel del ARN y proteólisis .

Azidotimidina (AZT)
● Análogo de nucleósido.
● Muy usado en retrovirus.
● Prodroga que debe ser trifosforilada por 3 quinasas celulares (a diferencia del aciclovir).
● El análogo trifosforilado es incorporado por la Transcriptasa reversa viral a la hebra de ARN que está
retro transcribiendo a ADN. Es una droga muy específica de la enzima.
● Como la droga no tiene la pentosa para formar el enlace fosfodiéster, se frena la retrotranscripción.

Adefovir
● Lo mismo que AZT, ya viene mono fosforilada, y es trifosforilada por la célula.
● Interrumpe una hebra de ADN que está siendo sintetizada por la retrotranscriptasa viral.

81
Antivirales que intervienen en el ingreso o egreso viral

Amantadina
● Asociado a influenza.
● Inhibidor de M2 → M2 es un canal iónico viral, que permite el ingreso de protones a través de la
membrana del virión. Este canal se activa por el descenso del pH. A la izquierda está el canal que
responde al descenso del pH, se abre y permite pasar hidrogeniones. Si se obstruye no habrá
ingreso de protones ni cambio de pH en el interior. A la derecha se ve la estructura del canal y donde
interactúa con la
amantadina.
● Es irreversible → una
vez que interactúa
con el canal no sale
más, porque tiene
una carga particular y
residuos que
interactúan con
residuos específicos
● Virión dentro del
endosoma: en el interior del virión (flecha roja) se ve el
ARN viral rodeado por nucleoproteínas que están
interactuando con M1, que a su vez interactúa con HA y NA.
M2 está obstruido por la amantadina, por lo que los
protones no pasan.
Ciclo normal: M2 permite el pasaje de H+ endosomal.
A medida que el endosoma progresa tratando de eliminar la
partícula viral, disminuye su pH y el virus aprovecha por M2 a
ingresar H+ a su interior. El ingreso hace que el balance de
cargas que había en la interacción de M1 con la nucleocápside
sea modificada de tal modo que la interacción se hace laxa, y
cuando la membrana se fusione con el endosoma, las hebras del genoma estarán interactuando más
lábilmente con M1 y van a ser liberadas al citoplasma.
Al obstruir el canal de protones, lo dicho arriba no ocurre. Las hebras de ARN genómico van a
permanecer interactuando con las proteínas y no van a ser liberadas al citoplasma. Por último la célula
degrada la partícula y el ciclo de replicación se interrumpe.
● No hay cambio de M1, no se libera la ribonucleoproteína (ARN + proteína).
● Influenza tipo B tiene una proteína diferente: NB
● No tóxico, sirve dentro de las 48 hs desde el comienzo de los síntomas → Mutantes.
● Rimantadina - solo influenza.

Zanamivir - Oseltamivir
● Influenzavirus tipo A y B
● Bloquean la función de la actividad de la
NA.
● No remueven el ácido siálico, los virus
geman de la célula pero siguen
adheridos.
● Formación de acúmulos de virus, baja
infectividad.

82
● No tóxico - inhalación (zanamivir), oral (oseltamivir).
● NA = sialidasa, el residuo que digiere es el ácido neuramínico, componente del ácido siálico.

La amantadina (izquierda) inhibe la liberación del virión al citoplasma celular; por más que ocurra la
fusión de membranas y el virión pueda o intente liberar su genoma al citoplasma; la liberación está
interrumpida.
Oseltamivir (derecha): evita la salida del virión de la célula infectada. La HA (“manitos”) va a
permanecer unida a la superficie celular (porque se llevan membrana celular con ácido siálico), y la NA
(“tijeras”) no va a poder cortar los residuos, porque está actuando el antiviral. Se inhibe la actividad de la
NA impidiendo la liberación. Aquellos que puedan salir tendrán asociado a su superficie residuos de
ácido siálico, si hay alguna HA libre habrá interacción entre ambos generando una acumulacion de
viriones y, entonces, una disminución de la tasa de replicación (este agregado de virus tiene una
infectividad 3 veces menor). Así puedo darle tiempo a un SI competente para controlar la infección.

Resumiendo
Podemos usar distintos antivirales para
reducir la tasa de replicación de
influenza (solo de influenza?) en tres
niveles:
- En su ingreso
- En su replicación
- En su liberación.

Antivirales inhibidores de proteasas virales

Las proteasas virales son cruciales para muchos virus, tales como retrovirus, picornavirus y flavivirus,
entre otros.
Ciclo normal de retrovirus: el virus ingresa, retrotranscribe, se integra al genoma, transcribe y traduce
sus proteínas. La progenie viral brota de la célula infectada, pero las poliproteínas (GAG y GAG-POL)
deben ser clivadas por proteasas virales específicas para que el virión madure.
La proteasa de VIH cliva GAG y GAG-POL, generando proteínas estructurales (p17, p24, p9 y p7) y
proteínas funcionales (proteasa, RT e integrasa).
Por ende, si tengo un antiviral que evita la actividad de la proteasa, podría lograr que el virión no
madure nunca.
Si el virión inmaduro ingresa a una célula no ocurre el resto de la replicación viral e infección. A nivel
estructural no hay separación de las subunidades de GAG, y las actividad enzimáticas codificadas en
POL no van a ser procesadas.
No hay más proteasa disponible, no hay retrotranscriptasa ni integrasa.

83
Inhibidores de retrotranscriptasa no-nucleósidos

Nevirapina
Interactúa con la retrotranscriptasa generando un cambio
conformacional cerca de su sitio activo por lo cual no reconoce el
AN y, consecuentemente, no puede sintetizar la hebra de ADN.
Rojo: sitio activo. Amarillo: unión del antiviral. Ambos sitios están
cerca y el cambio conformacional es tal que interrumpe la
actividad de retroTr. Las retroTr se simbolizan como la mano, y
en ese canal formado por el pulgar y los otros dedos es por
donde se reconoce la hebra molde y se sintetiza la hebra de
ADN nueva.
Inhiben a la enzima por medio de la unión directa a la estructura de la misma, en este caso, la
Nevirapina interactúa de manera irreversible en el “bolsillo” hidrofóbico, localizándose a unos 10Å de
distancia del sitio catalítico.
A diferencia de los análogos de nucleósidos, estos compuestos NNRTis no precisan ser activados por
ninguna actividad enzimática viral o del metabolismo celular.
En general los NNTRis se diseñan específicamente para un único virus, por ejemplo los específicos
para HIV, no lo son para otros retrovirus.

DROGA VIRUS TIPO QUÍMICO ACTIVIDAD INVOLUCRADA

Vidarabina Herpesvirus Análogo de Interrumpe síntesis de cadena

nucleósido de AN viral

Aciclovir Herpes simplex Análogo de Interrumpe síntesis de cadena

(HSV) nucleósido de AN viral

Ganciclovir y valganciclovir Citomegalovirus Análogo de Interrumpe síntesis de cadena

nucleósido de AN viral

Análogos de nucleósidos Retrovirus (VIH) Análogo de Interrumpe síntesis de cadena

inhibidores de la transcriptasa nucleósido de AN viral
reversa: AZT, didanosina (ddi),
Zalcitabina (ddC), Estavudina
(d4T), Lamivudina (3TC)

No nucleósidos inhibidores de Retrovirus (VIH) Análogo de Transcriptasa reversa

la transcriptasa reversa: nucleósido
Nevirapina, Delavirdina

Inhibidores de la proteasa: VIH Análogo de Proteasa de VIH

saquinavir, ritonavir, nelfinavir péptido

Ribavirina Amplio espectro: Triazol Interrumpe síntesis de cadena

HSV, HCV, rubeola, carboxamida de AN viral, inhibidor de
sarampión polimerasa, mutágeno de ARN

Amantadina, Rimantadina Virus de influenza B Amina tricíclica Proteína de matriz M2

Relenza, Tamiflu Virus de influenza A Mimético de Inhibidor de NA

yB ácido neurámico

Pleconaril Picornavirus Compuesto Viriones (bloquea la unión y

cíclico pequeño denudamiento)

Interferones Virus de hepatitis B y Proteína Activa proteínas de defensa

C

84
Inhibidores de Coronavirus felino
- Coronavirus felino (FeCV) causa una enteritis inaparente o suave en gatos, pero por mutaciones en
el genoma viral provoca un cuadro altamente fatal denominado Peritonitis Infecciosa Felina (PIF).
- Macrofagotrópico: PIF infecta principalmente macrófagos. Hay gran evidencia de un ingreso mediado
por Ac.
Si un gato tiene una infección crónica tendrá Ac por la importante respuesta inmune humoral. Si el felino
se inmunosuprime se harán relevantes las variantes que provocan PIF. Estas ingresan mediante Ac a
los macrófagos donde replican muy bien y se diseminan por todo el cuerpo. Entonces, al hacerse
macrofagotropicos se hacen invisibles al SI.
Los macrófagos infectados con una carga viral alta ingresan en un proceso apoptótico.
- Linfopenia: la apoptosis de células linfoides (más LT que B) es una característica común, pero no
ocurre en gran medida en macrófagos ni en tejidos linfoides.
- No hay tratamiento específico.

Inhibición de la proteasa 3CLpro (viral) para FeCV: GC376

La proteasa es específica del virus, y muy importante en el procesamiento de proteínas virales.
Remdesivir:
- Frena el ciclo en cierto punto de maduración de las proteínas virales.
- Revierten el cuadro agudo en felinos. Es altamente específica y de gran eficacia.

- Efectiva a baja concentración.

- Cuando se aplica una dosis de 10 mg/kg SC, se ve una caída de la concentración.
- Administrando 2 dosis (mañana y tarde) se está por arriba de dosis efectiva de 10 mg/kg/día. Esto
mantiene la dosis elevada y disponible para las células infectadas sabiendo que no va a afectar la salud
del animal.

Temperatura (cada una de las líneas es un paciente):

cuando hay una infección llega un punto donde los
gatos suben la T°. Pero la caída de la T° es muy Carga viral: la mejora del cuadro clínico se condice
marcada a las 12 hs de aplicado el antiviral. con la disminución de replicación del virus (excepto con
algunos individuos donde el tratamiento no fue
efectivo). La caída es muy abrupta en pocos días.

85
 Post tratamiento: después de tratarlos, esa población
Linfopenia: se aplica el antiviral, y los animales linfocitaria que se recuperó se mantiene en el tiempo, a
recuperan el número de linfocitos por unidad de menos que haya una reaparición de la infección. Un
volumen. gran n° de gatos pudieron mejorar su calidad de vida.

Análogo de nucleósido inhibidor de FeCV: GS-441524

(2018) La concentración efectiva para evitar la infección de una monocapa celular es por debajo de 1
micromol. A una concentración muy baja este virus es muy efectivo in vitro.
¿Qué pasa a nivel intracelular? La concentración se mantiene muy bien a nivel celular, por encima de 1
micromol (a lo que era efectivo). Eso habla de que es efectivo porque
está donde tiene que estar (es específico).
A una concentración por encima de 1, esa tasa de replicación está
anulada.
- Cuando se evalúa en un gato como persiste la droga a nivel
plasmático, durante varias horas el nivel plasmático se mantiene por
encima de 1. Es importante porque si lo aplico SC o EV, se
mantiene en una cc que sigue estando por encima de la
concentración donde favorezco lo que veo en vitro.
- Se evalúa a nivel intracelular (in vitro): con células que extraigo del
animal (cultivo 1rio de células del SI para ver si el antiviral llega
dentro de las células). Se mantiene la concentración por encima de
la DE50.
- Cuando se prueba en un modelo animal: cuando infecto a los
animales la T° sube, y cuando aplico el tratamiento la T° vuelve a
un nivel normal.
- Linfopenia: en la mayoría de los gatos hay una recaída muy grande,
que luego se recupera cuando comienza el tratamiento.

86
 (2019) Linea negra: 2 mg/kg/día SC; Línea interrumpida: gatos en los que el tratamiento no fue
suficiente o tuvieron una recaída y aumentó la carga viral, y se aplica una dosis mayor.

Temperatura: horas después del tratamiento la Linfocitos T: estaban muy bajos y empiezan a subir.
mayoría de los gatos tiene una mejoría de la T°.

Linfocitos B: la mayoría tenía una respuesta humoral Hematocrito: aumenta y llega a niveles casi normales.
aumentada (porque recién estaban comenzando el
cuadro infeccioso agudo). En vez de ir a niveles muy
bajos de linfocitos, eso que estaba elevado se
normaliza (no llega a 0 como ocurriría en un cuadro
avanzado agudo, sino que lo lleva a niveles normales).

Sars-CoV-2
- Se están evaluando
antivirales.
- Actúan a los mismos niveles
que los antivirales contra
coronavirus en animales:
inhibición de la proteasa, y que
se incorporan al ARN viral
para interrumpir la síntesis.
- Se usan en individuos que
están atravesando un cuadro
agudo.
- Se trasladan los conocimientos
adquiridos a través de
antivirales que fueron
desarrollados para resolver un
problema veterinario a una
enfermedad de humanos.

87
GS-5734 contra el virus Ébola
- Análogo de nucleósido
adenosina que genera
protección en un 100%
de los monos rhesus
infectados con el virus
Ébola.
- Se demuestra protección
post-exposición.
- A cierta concentración
muy baja del análogo de
nucleósido trifosforilado
se inhibe grandemente la
actividad de la
polimerasa viral.
- A una concentración
mucho mayor las
polimerasas celulares no
son afectadas.
- Mayor relevancia en un
modelo animal que en un modelo in vitro → rol del veterinario MUY importante.

GS-5734 contra Coronavirus

- Dosis efectiva a concentración muy baja para controlar la infección de MERS in vitro.
- Poca citotoxicidad.
- El nivel de aumento de todos los nucleótidos, incluyendo el análogo de nucleósido es muy alto,
probablemente en gran medida por el análogo de nucleósido. Se mantiene en una concentración
bastante superior a la que presenta este compuesto (no entendí).
- Disminución de la carga viral (baja de 7 log a 3 log) → está altamente disponible, a una
concentración superior a la que estoy inhibiendo, el escenario es ideal.
- Disminución del ARN viral.

88
 MANIPULACIÓN DE VIRUS EN EL LABORATORIO
¿Para qué manipulamos virus en el laboratorio?
● Estudiar cómo producen enfermedad y aprender a prevenirla y/o curarla.
● Usarlos en nuestro beneficio en la generación de vacunas o como vectores virales.

¿Cómo manipulamos virus en el laboratorio?

Para replicar los virus necesitan una célula viva (animal o aislada).

Manipulación de virus mediante inoculación en animales (ej: virus de la rabia en conejos).

➔ Uso de un hospedador natural, hospedadores alternativos, animales de laboratorio (pueden no ser
susceptibles a la enfermedad y luego pasa a serlo), huevo embrionado.
➔ Inoculación del virus para:
- Observar sus efectos (ej: Virus de la fiebre aftosa produciendo lesiones erosivas, Herpesvirus
equino I que produce abortos, Rotavirus bovino produce diarreas).
- Observar las interacciones entre el virus y el SI adaptativo (probar vacunas).
- Hacer ensayos de transmisibilidad del virus (que tan contagioso es).
- Estudiar la patogenia (como produce la enfermedad).
- Probar tratamientos (ej: con un antiviral), probando la eficacia en un animal (in vivo).

Manipulación de virus en cultivos celulares (células cultivadas fuera de un animal).

Cultivos primarios: se toma un órgano donde hay muchos tipos celulares.
Líneas celulares: todas las células son genéticamente y fenotípicamente idénticas. No son idénticas a
las que están en el animal, porque a pesar de su origen animal, están genéticamente modificadas para
que sean inmortales, y el continuo cultivo hace que sean distintas a la célula que les dio origen.
Como las líneas celulares están compuestas por células genéticamente idénticas entre sí, es esperable
que el comportamiento de un virus en una determinada línea sea siempre parecido. En cambio, los
cultivos primarios provienen de distintos animales y pueden tener diferentes proporciones de los
diferentes tipos celulares que los componen → El resultado obtenido en un cultivo primario no
necesariamente será igual entre un laboratorio y otro.
➔ Se infecta el cultivo con un virus y se ven los cambios. Ej:
- Línea celular MDCK (riñón canino): la
infección con parvo canino produce lisis
celular diseminada.
- Línea MDBK (de hámster): la infección
con un herpesvirus bovino tipo 5
provoca placa de lisis (delimitada).
- Línea VERO (humano): la infección con
virus de distemper canino produce la
fusión de células entre sí (sincitios
celulares).
- Cultivo primario de embrión de pollo infectado con el virus del sarcoma de Rous: produce tumores
(grumo de células).
- Hay virus que no son citopáticos, por lo que no se van a ver cambios en la misma.
✔ Ventajas: simplifican el manejo de los virus ya que las células están en una superficie reducida.
Permiten trabajar en ausencia de importantes efectores del SI que influyan en la replicación del virus.
➔ Usos:
- Estudio de interacciones virus-célula sin tener un animal en pie: se puede ver apoptosis,
disminución/aumento de proteínas dentro de la célula, los pasos de replicación viral.

89
 - Probar antivirales: se trata el cultivo con el antiviral y se ve como responde la infección. Puede ser
un paso previo a probarlo en animales.

Manipulación genética de los virus: mutaciones genéticamente dirigidas para alterar, remover o
agregar funciones a los virus. Las funciones están dadas por las proteínas (su cadena de aminoácidos y
conformación), codificadas en el genoma de las células y de los virus. Al modificar el genoma, se
modifican las proteínas y las funciones. Se hace reemplazando una porción del genoma por otra.

Aclaraciones
➢ Cuando se cambia un segmento por otro se llama reasociación y NO es lo mismo (segmento ≠
porción) → Restringido a virus con genoma segmentado.
➢ No se usan enzimas de restricción porque tienen ciertas restricciones
○ Cortan en un sitio específico y deja extremos que solo son empalmables con otros cortes
producto de la misma enzima.
○ Muchas veces en una misma molécula hay más de un sitio de restricción para la misma enzima,
y otras veces no hay ninguno.
○ Para cortar una determina región del genoma viral se necesitaría que haya justo por delante y
justo por detrás una enzima de restricción que corte ese fragmento para que después se puedan
volver a empalmar; y no debería haber otra región similar que pueda ser cortada.
➢ Se trabaja con un grupo de células y moléculas (no con una sola célula o molécula).
➢ Tener el genoma del virus en pureza es difícil; sacar el virus de una célula infectada, nos llevamos
parte de ella, y al aplicar una enzima de restricción también va a actuar sobre el genoma celular.

Estrategias
La más difundida es la recombinación (ocurre fisiológicamente
en la célula y en los virus) y la más frecuente es la homóloga:
secuencias de nucleótidos se intercambian entre 2 moléculas
similares de ADN. Durante la síntesis del ADN celular ocurren
rupturas del mismo que son reparadas luego para que la
molécula tenga una funcionalidad.
En la separación de las hebras de ADN para la síntesis de la
copia puede haber cerca otra molécula parecida → cuando las
hebras vuelvan a unirse, una de las hebras puede unirse con la
vecina que tiene una homología en la secuencia → se dice que
las secuencias que recombinan tienen que guardar homología
(recombina A x a o B x b). Hay cambios en las porciones de
moléculas de ADN, pero siempre ocurren en relación a la
misma porción de un gen.

Recombinación homóloga para generar un virus

recombinante: ADN viral, que quiero que recombine
con otra molécula no viral. Coloco en el núcleo de una
célula el virus y la molécula → algunas van a
recombinar con las moléculas del virus → resulta en un
genoma viral con una porción de la otra molécula. Esto
sucede en los 2 sentidos, por lo que está también va a
incorporar la porción del virus.
El virus se puede llamar deleteado (δ), ya que todo lo
que codificaba para la porción que perdió no lo tiene
más. En este caso también puede ser recombinante.

90
Identificación del virus recombinante: cuando el virus surja de la multiplicación no se puede ver su
genoma, pero sí las proteínas que produce. Si esto no se hace en forma rápida, tampoco lo será la
identificación del recombinante y se perderá en la población de virus que no recombinaron (la mayoría).
En estos casos se usan “genes reporteros”, incluidos en la molécula que quiero que se incorpore al
virus.

Gen reportero: gen que codifica para proteínas fácilmente detectables al microscopio de fluorescencia
u otro elemento de laboratorio, permitiendo confirmar que ocurrió la recombinación. La mayoría son
enzimas o proteínas que emiten algún color.
➔ B- galactosidasa: cuando se le da un sustrato a esta enzima genera un color azul.
➔ Proteínas fluorescentes: no tiene color, pero cuando se la estimula con luz de determinada longitud
de onda, emite luz en otra longitud.
➔ Luciferasas: enzima que cuando se le da un sustrato produce luz.
La recombinación es homóloga, entonces hay que buscar la forma de incorporar una enzima (que
normalmente no está) al genoma viral.

Ejemplo de BHV-5: se busca quitar el promotor del gen LAT (latencia) →

se realiza una molécula de ADN donante (gen reportero: promotor + GFP
[proteína fluorescente verde]) que queremos que reemplace la porción
del gen LAT → el donante se pone en una molécula exógena (como un
plásmido) → el promotor + GFP no tiene nada de homología con el
genoma del virus → por delante y por detrás de la molécula a incorporar
se ponen fragmentos o regiones de homología a las regiones por delante y por detrás de lo que se
quiere eliminar (= reemplazar) del genoma viral.
➔ Se infecta una placa de cultivo celular con el virus wild type y por transfección (introducción de una
molécula de ADN desnudo a la célula) la molécula → se espera que en el núcleo ocurra la
recombinación homóloga → al multiplicar, la mayoría de los virus que salen son no recombinantes,
aunque alguno sí puede serlo.
➔ Cuando el recombinante ingrese a la célula va a producir sus proteínas; al infectar el
cultivo celular muchas de las placas de lisis o de replicación van a ser normales y
otras expresan la Proteína Fluorescente Verde.

Selección del virus recombinante: se puede colocar el virus en un medio semisólido con
tal que el virus no viaje por el cultivo infectando toda la monocapa de células, sino que solo
infecte las vecinas. Al cosechar solo el virus con fluorescencia y no las demás placas de
lisis, se va a obtener un clon del virus (producto de la multiplicación de la placa de lisis
fluorescente).
➢ Después de la purificación, se va a obtener una población de virus recombinantes
(virus deleteados).
➢ No cualquier región del genoma viral se puede recombinar:
- Genes virales esenciales: su expresión es necesaria para generar progenie en cualquier contexto.
La ausencia o falla total en su expresión genera una infección abortiva. Si elimino uno de estos
genes probablemente nunca pueda ver la recombinación, ya que el virus va a morir en el intento
de replicación (no va a dar progenie).
- Genes no esenciales: son necesarios para asegurar la progenie viral sólo en determinados
contextos. La ausencia o falta total de su expresión puede tener diversas consecuencias
dependiendo del contexto en el que el virus esté replicando.

Uso de virus recombinantes como herramientas biotecnológicas: los vectores virales son generados
por este tipo de virus recombinante. El más difundido son las vacunas recombinantes/de vectores
virales.
91
Vacuna de un virus en el cual se reemplaza un gen no esencial por
otro no relacionado: HVB tipo I
➔ Se buscó eliminar la glicoproteína E (proteína no esencial de
envoltura) → es requerida para infectar células vecinas sin salir al
espacio extracelular → el virus replica más eficientemente, hace
más eficiente la propagación.
➔ El virus sin la glicoproteína E puede infectar viajando por el
medio extracelular hasta encontrar otra célula más lejana →
propagación ineficiente → virus atenuado.
➔ Se buscó reemplazar la glicoproteína E por el gen reportero de
B-galactosidasa para identificar al virus recombinante → se
colocó un plásmido de transferencia que tenía promotor, gen
reportero y regiones flanqueantes por delante y por detrás del
mismo.
➔ Infección de una monocapa celular, que se cubre con medio
semisólido, con el virus y por transfixión se agrega el plásmido → en el núcleo conviven ADN viral y
plasmídico → algunos virus (la minoría) van a
recombinar → alguna placa debería tener color azul por
la expresión de β-galactosidasa. Si se toma ese virus y
se sigue propagando se obtiene un virus recombinante,
deleteado.
➔ Se generó una vacuna contra BHV-1.
➔ El virus recombinante puede crecer bien en el
laboratorio, pero es atenuado in vivo, pudiendo usarse
como vacuna. Puede usarse viva o inactivada, y la
ausencia de la glicoproteína E la convierte en una
vacuna marcadora (diferencia infectados de vacunados
→ vacuna DIVA). Tiene baja probabilidad de reversión.

Para poder usar como vacuna un virus en el cual se reemplaza un gen no esencial, este debe estar
atenuado. Se podrá usar como vacuna siempre y cuando sea tan poco virulento como para no
producir enfermedad → vacuna atenuada y deleteada (perdió parte de su genoma - factor de
patogenicidad).

Reemplazo del gen reportero por otro no relacionado

● Se genera un genoma viral que porta un gen de otra
especie; este puede tener cualquier origen: otros virus,
microorganismos, animales.
● Se produce un vector viral → virus que porta en su genoma
un gen que codifica para una proteína de interés para el
investigador.
● Son virus transgénicos (contienen un gen de otra especie) y
recombinantes (por este medio se obtienen)
● El virus actúa como “caballo de troya” → está diseñado para
ingresar a la célula susceptible y llevar genes directo al
núcleo o citoplasma para la transcripción y traducción de las
proteínas codificadas en ellos → al lograr meter en el virus
un gen, logramos que se exprese ya que de otra forma no
hubiera llegado a la célula, se formará la proteína y cumplirá
la función buscada.

92
Vector: agente que transporta algo de un lugar a otro. Los virus recombinantes funcionan como
vectores recombinantes, llevando el genoma al citoplasma o núcleo. Para que un virus sea utilizado
como vector:
1) Debe infectar a la especie a la que va a ser inoculada (reconoce la célula e ingresa).
2) No es necesario que replique (que complete el ciclo replicativo).
3) No debe producir enfermedad.
4) Debe tener capacidad de incorporar genes (virus grandes).
5) Los más utilizados son Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae.

Vector replicativo: infectan productivamente la especie de destino. Poca cantidad de virus es suficiente
para que multiplique y alcance nuevas células susceptibles.
X Desventaja: puede haber eliminación del virus en la naturaleza, pudiendo infectar animales donde
el virus vacunal sí produce enfermedad (ej: poxvirus de ratón como vector para aves, y hay ratones
en el galpón).
✓ Ventaja: el vector inoculado puede transmitirse a otras células llevando el transgen. Por ejemplo en
un galpón de pollos donde se administra la vacuna en el agua de bebida, algunos animales van a
recibir más dosis que otros y eliminan carga viral al ambiente; por lo tanto, aquellos que respiren el
virus también van a vacunarse. Generalmente una dosis es suficiente para generar protección.
● Ej: vacuna contra la rabia en animales salvajes (Raboral) en EEUU. Se administra por vía oral.
Son cebos de alimento que se distribuyen por helicópteros a las zonas donde viven esos
animales. Es un virus Vaccinia (poxvirus) que porta como transgen la glicoproteína G del virus
rábico. Esto le permite atravesar la barrera inmunológica del intestino.
● Ej 2: la cepa vacunal es un herpesvirus de pavo (HVT) que expresa el Ag protector (VP2) del
virus de la bursitis infecciosa aviar (IBDV). Además, el vector viral por sí solo ya es una vacuna
para la enfermedad de Marek, ya que no causa enfermedad ni en pavos ni en gallinas. Este virus
per se es inmunógeno contra Marek, y recombinante contra IBDV → vacuna dual.
● Ej 3: utiliza virus atenuados como vectores. Virus de la viruela aviar (pox) sirve de vector para
una proteína de laringotraqueitis.

Vector no replicativo: infección abortiva en la especie de destino. Debe expresar el transgén de interés
en la célula infectada y para ello tiene que infectar productivamente algún tipo celular para generarlo
(por ejemplo en el laboratorio que produce la vacuna).
● Ej: vacuna vectorizada en Canarypox, con agregado de proteínas de influenza equina / rabia /
VILEF / distemper en hurones → el virus replica eficientemente en células de aves, pero en
mamíferos sólo infecta.

Aplicación biotecnológica

VACUNAS RECOMBINANTES
El virus vector infecta una célula, produce sus proteínas (todas o solo algunas) y una proteína
inmunogénica (codificada en el transgen) de otro patógeno → respuesta inmune celular y/o humoral que
genera memoria, y permite proteger ante la infección con el patógeno.
● No sirve cualquier proteína porque la inmunidad generada no siempre es protectiva. Hay que
seleccionar algunas proteínas del virus, y la inmunidad contra estas debe ser suficiente para inhibir la
replicación del virus completo.
● Se llaman recombinantes porque se producen reemplazando un gen no esencial por un gen
reportero, y luego este se elimina y se cambia por un gen de interés inmunológico.
Se parte de un virus que tiene un gen reportero (GFP o β-galactosidasa), mediante el agregado de
regiones de homología por delante y por detrás de lo que queremos incorporar se pierde el gen
marcador y se coloca el gen que codifica para la proteína de interés. Proceso de deleción inverso: antes
de la recombinación produce placas fluorescentes, y después pierden la capacidad de fluorescer.

93
- Se produce un virus vector,
incorporando el gen que codifica
para una proteína de otro virus
hacia el cual se quiere generar
inmunidad → el vector tiene sus
proteínas de cápside diseñadas
para reconocer receptores celulares
→ ingreso a las células en el sitio
de inoculación → en el interior, el
virus expresa sus proteínas y las
transgénicas → son procesadas por
el proteosoma y presentadas por el
CMH-1 para estimular LT CD8 → la
célula puede morir por lisis o
apoptosis → las proteínas son
captadas por las CPA del espacio
extracelular → las CPA migran al
LN drenante y presentan los Ag a LB y LT helper.
Este proceso es primordial para que ocurra la memoria inmunológica, si no ocurre no habrá switch
isotípico (IgM pasa a IgG).

El éxito de estas vacunas es que los virus tienen muy pocas proteínas en su superficie, con lo cual el
riesgo de que produzcan la enfermedad es nulo, son vacunas muy seguras.

Características de las vacunas recombinantes / deleteadas / basadas en vectores

➔ Vacunas DIVA: permiten diferenciar animales infectados de vacunados.
➢ Ej: vacuna recombinante de influenza equina con
Canarypox → al haber un brote se podría saber que
animales están vacunados y cuales infectados → los
que tienen Ac contra la HA podrían estar infectados o
vacunados porque el virus wild type y vacunal la
poseen; si se detectan Ac para otra proteína, como la
NP, los animales están infectados, ya que la vacuna no
presenta esta proteína. Si se usa una vacuna a virus
vivo inactivado el virus tiene la NP porque es la cápside
del virus.
➔ Menor riesgo de reversión que las vacunas basadas en
virus atenuadas por pasaje (mutaciones puntuales vs
deleciones de porciones del genoma).
➢ La probabilidad de que el virus recupere la porción deleteada es mínima. Casi nunca sucede, pero
si un animal presenta el virus deleteado y wild type se pueden recombinar, recuperando la porción
deleteada → el resultado final va a ser el virus salvaje, siendo imposible diferenciar si fue vacunal o
no.
➢ Ej: la cepa Pasteur de la rabia se adaptó al conejo y perdió afinidad por el perro; a medida que
Pasteur pasó el virus fue acumulando mutaciones puntuales al azar hasta que se adaptó. Por esto,
si se hicieran pasajes sucesivos en perros, probablemente recuperaría su virulencia en esta
especie, ocurriendo la reversión. Por esto no se pueden usar en animales de rodeo en Argentina
(riesgo de reversión).
➢ Ej 2: vacuna de polio cuando el virus atenuado tiene solo unas mutaciones en la región del IRES. El
virus replica en el intestino y se elimina; se puede producir el contagio a otra persona y el virus
puede adaptarse nuevamente al humano, apareciendo brotes por el virus vacunal.
94
➔ Mejor inmunidad: cuando son competentes para replicar productivamente. Se pueden dar vía oral, y
con muy poco virus se puede generar inmunidad. Cuando el virus es menos replicativo y menos
competente va a ser más seguro pero menos inmunogénico.
➔ Propiedades adyuvantes intrínsecas: los virus vectores infectan células y estimulan al SI innato.
➢ Esto también ocurre con vacunas atenuadas; pero los virus inactivados quedan en el espacio
extracelular, y tienen que ser captados por una célula dendrítica para generar inmunidad, para lo
que necesitan adyuvantes más potentes.
➢ El vector y el atenuado ingresan a la célula y producen un montón de respuestas inmunes, que
culminan por ejemplo con la secreción de IFN, para llamar a las CPA, que acuden directamente al
sitio donde se está realizando la replicación.
➢ Ej: vacuna de VILEF virus Canarypox, vector de los genes env y gag de VILEF, no necesita
adyuvantes. El canarypox ingresa a la célula → estimula sensores de replicación viral → llaman a
las células inmunes al lugar de infección.
➔ Evita la interferencia de los Ac calostrales en la vacunación: si la madre transfiere pasivamente
Ac contra el patógeno.
➢ El uso de vacunas basadas en el mismo patógeno podría verse interferida con los Ac maternos. Ej:
la vacuna de parvovirus a virus vivo no puede darse a los 15 días de vida, porque los Ac de la
madre interferirían.
➢ Luego de la vacunación se genera inmunidad contra los Ag propios del vector. Esto puede (o no)
influir en las futuras vacunaciones ya que si se logra neutralizar al vector este nunca llegará a
infectar y expresar el transgén.
➢ En las producciones sectorizadas se puede aplicar un tipo de vacuna en una categoría y otro tipo a
los animales que tendrían interferencia con los Ac maternos. Ej: en producción de pollos parrilleros
se utiliza una vacuna a virus completo inactivado a las madres, que transmiten inmunidad a la yema
que pasa al pollito; y se vacuna a los pollitos/huevo con una vacuna vectorizada para evitar la
interferencia.
➔ Activa la respuesta humoral y celular: ya que se sintetizan proteínas de novo en la célula. Generan
protección mediada por infección, lo que estimula la producción de determinadas citoquinas que
atraen al SI al sitio de replicación/infección. Todas las células que sean susceptibles al virus en el
sitio de entrada van a presentar epítopes del virus a LT CD8.
➢ En las vacunas inactivadas las proteínas que queden sueltas en el espacio extracelular tienen que
ser encontradas por CPA y fagocitadas, y solo estas van a presentar los epítopes, no todas las
células en el sitio de inoculación, siendo menos eficiente.

Manipulación viral en el laboratorio

Cualquiera sea el objetivo de manipular los virus en el laboratorio es necesario saber cuántos virus
manipulamos:
● Virulencia: para compararla hay que inocular la misma cantidad de virus.
● Patogenicidad: si se inocula mucho virus puede matar al animal, para ver los signos hay que
calcular cuánto inocular.
● Transmisibilidad
● Protección de vacunas: si la vacuna es buena y se pone una tonelada de virus en el animal, no va a
servir. Si la vacuna es mala y se pone muy poco virus los resultados no van a ser correctos.
● Efectos antivirales: puede ser mejor o peor dependiendo de la cantidad de virus que se le presente
al animal.
Se requiere básicamente para todo excepto en un aislamiento viral, donde se toma el virus de una
muestra clínica y se coloca en cultivo solo para ver si crece algo y caracterizarlo.

95
Saber cuánto virus hay en una suspensión viral depende del método de cuantificación que se utilice, y
cada metodología mide cosas diferentes, por lo tanto cada una dará distinto para una misma
suspensión.

1) Métodos físicos
- Detecta los componentes del virus (ácido nucleico y proteínas).
- No tiene en cuenta la infectividad del virus (no importa si está activo o inactivo, o si es infectivo o
no).

➔ Microscopía electrónica de transmisión

Dilución del virus → se cuentan partículas por campo → corrección por el volumen
de suspensión en el campo → X partículas / ml.
El problema es que no se sabe si las partículas son inefectivas. Se ven físicamente
las cápsides, pero no si contiene una mutación letal, si está vacía (sin AN adentro),
o si el virus estuvo expuesto al sol o radiaciones UV que no le permitan replicar.
➔ Hemoaglutinación
Algunos virus tienen la capacidad de hemaglutinar:
reconoce en los GR moléculas de superficie y genera un
entramado entre partícula viral y GR.
- Detecta la presencia de HA en la cápside o envoltura →
estas no deben estar rotas para que se forme el entramado,
sin importar si el virus está o no activo.
- Se hacen diluciones seriadas del virus hasta que se deja
de ver el efecto → cuando los GR no precipitan en el fondo, hay HA → X unidades
hemaglutinantes/ml.
El título es la inversa de la mayor dilución con formación del entramado.
➔ PCR en tiempo real (qPCR)
Permite estimar la cantidad de moléculas ADN/ARN viral específica.
Es un PCR común más una sonda fluorescente (molécula fluorescente + “apagador”). Cuando ocurre la
polimerización se libera el fluoróforo y se separa del “apagador”, emitiendo luz. El aparato de real time
tiene un sistema óptico que
detecta la intensidad de
fluorescencia. La emisión de luz
es proporcional a la cantidad de
ADN/ARN.
Es necesario tener una curva
patrón: cantidades conocidas de
la molécula a la que se somete a
la técnica, y se estima la cantidad
de fluorescencia suficiente.
- Ej (con el gráfico): en todo
momento que en el tubo la fluorescencia aumenta por encima de 2,5, se considera que tiene ADN/ARN
viral. Cuanto más virus haya en la muestra, la fluorescencia va a alcanzar el umbral en un ciclo anterior;
si hay menos cantidad de virus va a tardar más en alcanzar el umbral.
Se usa como técnica cualitativa o cuantitativa: el animal tiene o no el virus y en qué cantidad → X N° de
copias de ADN o ARN / ml

2) Métodos biológicos
- Tiene en cuenta la infectividad del virus.
- Las unidades de medición dependen del sistema que utilice y el objetivo final del uso del virus.

96
➔ Ensayo de placas
- Cuantifica el número de unidades formadoras de placas en un volumen dado (UFP/ml).
- Se utiliza una monocapa de células que se cubre con un medio semisólido (agar) → el virus ingresa a
la célula e infecta sólo a las adyacentes.
- Se cuentan las placas de lisis luego de la incubación (si el virus es
lítico).
- Sirve para virus citopáticos en cultivo; si no es lítico se podrían
usar Ac marcados con color o fluorescencia y contar eso (es muy
difícil hacerlo).
En una placa de cultivo de 6 pocillos se inocula el virus diluido → se
espera que el virus realice su efecto citopático → fijación (acetona,
paraformaldehído) → tinción del citoplasma celular con colorante:
➔ No hay infección: toda la superficie está teñida (A, es de control= células sin infectar)
➔ Virus poco diluido: mucha placa de lisis (B y C).
➔ Virus diluido: se pueden contar las placas de lisis (D → 9 placas en una dilución 1/1000 → hay
9000 placas de lisis).
Se hacen diluciones y se correlaciona.

➔ Dilución límite
Calcula cuánto de la suspensión viral es necesaria para producir un efecto en el 50% de las unidades
experimentales.
Por ejemplo, si el efecto es muerte y las unidades son ratones, la
cuantificación es la cantidad de virus que mata el 50% de ratones.
El efecto traza una curva sigmoidea, por lo cual se usa el 50% ya
que es el punto en que existe una diferencia considerable en las
concentraciones virales.
En este caso no importa cuánto virus hay en cada unidad
experimental, sino si ocurre o no el efecto, en cuantas unidades, en
una determinada concentración.
Para algunas variables, puede pensarse un punto de corte (por
ejemplo, si estudiamos disminución de peso, vamos a considerar positivo si disminuye más de un
10% del PV).
Para medirlo, se van realizando diluciones del virus y se grafica el % Efecto/Log de la dilución.
Depende de la unidad experimental utilizada como se va a expresar el título viral:
- TCID50/ml (dosis infectiva en cultivo celular 50 → cantidad de virus por ml, necesario para
producir el efecto buscado en el 50% de los cultivos celulares).
- LD50/ml (dosis letal 50) → dosis necesaria para que se produzca la muerte del 50% de los
animales inoculados).
- ID50/ml (dosis infectiva 50) → lo que importa es si un animal se infecta o no.
- IDE50/ml (dosis infectiva de embriones 50).

https://drive.google.com/file/d/147EPFjba4GLm5-PujQ1t08DGKI_fnLXb/view VACUNAS COVID

97
 INTERACCIÓN VIRUS CÉLULA
● Patogenia / Virulencia ● Apoptosis
● Oncogénesis ● Modulación del SI.

PATOGENIA / VIRULENCIA
Contacto virus-hospedador (para que se pueda generar la infección viral)
Iceberg o pirámide de la infección viral:
- Base: contacto entre virus y hospedador que no genera
infección, o generen infecciones subclínicas. Estas últimas
son las más complejas ya que no se pueden detectar,
aunque puede haber Ac una vez finalizada.
- Hay infección y aparece una enfermedad leve o moderada.
Dependiendo del patrón de infección se puede detectar o
no (si son agudas tal vez no puedan verse).
- Si la enfermedad es moderada o grave (que puede
desencadenar la muerte) es más fácil detectarla, ya que
llegan a consulta y hay signos evidentes de la infección y
se pueden tomar recaudos, tratar al animal y ver cómo frenar la infección.

Pasos necesarios para que el contacto virus-hospedador monte una infección viral
1) Entrada a las células del hospedador y replicación
primaria: el virus evade las defensas naturales y los
mecanismos de defensa de las puertas de entrada
(secreciones, mucosidades, aparato mucociliar, pH,
etc).
2) Diseminación local a nivel de las células y del
tejido (dependiendo del tropismo) y replicación
secundaria: el virus tiene que evadir las defensas
del animal y las barreras naturales de los tejidos.
3) Evadir las defensas (inflamatorias e
inmunológicas): fagocitosis, defensas, evasión del
SI. Esto tiene que ocurrir durante un tiempo
suficiente como para que se complete su ciclo
replicativo.
4) Eliminación por parte del hospedador para poder
salir e infectar a otros animales: tiene que haber
una concentración de viriones suficiente en la puerta
de salida y contacto entre los distintos hospedadores
para que pueda transmitirse.
Todo esto puede generar daño en el hospedador (o no), que va a
determinar la capacidad patogénica de los virus.

Hay que tener en cuenta que durante el proceso patogénico que puede
producir una infección viral pueden haber muchos mecanismos por los
cuales el virus produce injuria a una célula, y así mostrar una
sintomatología propia de la enfermedad.
En el ingreso habrá replicación del genoma viral y producción de
proteínas virales.

98
➔ Estas proteínas reducen la síntesis de proteínas propias del hospedador generando una
imposibilidad metabólica en la célula.
➔ Injuria por cuerpos de inclusión que desplazan las organelas en el citoplasma generando un mal
funcionamiento de la célula y del tejido.
➔ Daños metabólicos a nivel de las mitocondrias que puede desencadenar apoptosis.
➔ Lisis celular.
➔ Fusión (proteínas virales que tengan capacidad fusogénica).
➔ Algunas proteínas virales producen la transformación neoplásica de las células.
➔ Las proteínas virales van a ser Ag virales, que al ser expresados en la superficie de la célula van a
desencadenar una injuria citotóxica mediada por LT CD8.
El ensamblaje del virus y el egreso generan un daño en la célula (si es que lo hacen por lisis).

3 condiciones básicas para que ocurra la injuria (patogenia)

● Cantidad suficiente de virus: cuántas partículas virales son suficientes para iniciar una infección
depende de:
➔ Ambiente
- Dilución (agua, viento): un ambiente con un efecto de dilución (ej: animal a campo), no va a
infectarse con la misma carga viral que un animal estabulado. Cuanto más diluido esté el
ambiente alrededor del animal se va a necesitar mayor cantidad de virus.
- Daño ambiental (desecación, radiación UV): algunos virus sufren el daño ambiental, en estos
casos la cantidad de virus que se necesita para realizar una infección será mayor.
➔ Puerta de entrada
- Contacto con células equivocadas o detritos, o células que están entrando en apoptosis: en
estos casos se va a requerir mayor cantidad de virus.
- SI inespecífico (aparato mucociliar, saliva, pH, IFN, NK): importante en el impedimento de la
infección. La cantidad de virus va a ser mayor si hay acciones del SI inespecífico.
➔ Célula infectada
- Fallas en alguno de los pasos del ciclo replicativo: la célula debe ser susceptible y permisiva.
- Partículas defectivas (no replicantes): la cantidad de virus que se necesita es mayor si las
partículas no replican.
● Células susceptibles en la puerta de entrada
➔ Tropismo: predilección de un virus por replicar en determinado tejido o tipo celular. Depende de:
- Susceptibilidad: presencia de receptores en la superficie.
- Permisividad: el virus tiene que poder replicar dentro de la célula (tiene que tener los factores
necesarios para permitir esta replicación).
Se puede infectar una célula susceptible por presentar los receptores que permitan el ingreso del virus,
pero el ciclo no se completará por falta de algún factor celular que no la haga permisiva. De esta manera
la infección se verá interrumpida siendo ABORTIVA.
➔ Ej: enterovirus (enterotrópico y neurotrópico), HVB tipo 1 (neurotrópico), Distemper canino
(pantótropo), Coronavirus Felino* (enterotrópico y macrofagotrópico). Un mismo virus puede tener
trofismo por distintos tejidos.
● Modulación del SI.

Coronavirus felino
● Disminuyen las defensas maternas → infección con corona felino entérico → replica en enterocitos
→ signos leves (o nulos) donde hay bajos niveles de Ac y un equilibrio entre el gato y el virus.
● Esta infección genera la eliminación de virus durante toda la vida del animal.
● En el caso que el gato se estrese o inmunosuprima → aumento de la replicación del corona
entérico y empiezan a aparecer variantes (cuasiespecies).

99
 ● Dentro de estas variantes aparecen los macrofagotropicos (cambio de tropismo), responsable de
PIF → las variantes ahora van a reconocer el receptor de los macrofagos y replicarán dentro.
● Esto genera una liberación de citoquinas → atracción de macrófagos → aumento de virus en
sangre → viremia → colecta → peritonitis.
● Este tipo de cambio de tropismo se da por la “Teoría de la mutación interna”. Es la misma cepa que
cambió su patotipo (su comportamiento, su tropismo).

El cambio de tropismo y patotipo viral

está dado por mutaciones en 2 proteínas:
- Proteína S (la que se une al receptor):
un cambio permite que el virus se una
al receptor de los macrófagos.
- Proteína C3 (proteasa que cliva la
poliproteína replicasa [ORF 1a, 1b]):
un cambio permite que además de
infectar al macrofago, tenga la
capacidad de replicar en él.
Los cambios en la capacidad de un virus para infectar una célula distinta también pueden generar un

🌝
salto de especie si el virus adopta la capacidad de replicar en el mismo tejido pero de otra especie (ej:
SARS-CoV 2 ).

Patogenia: capacidad del virus de producir daño / enfermedad / efecto evidenciable.

- Suficiente virus.
- Accesibilidad, susceptibilidad y permisibilidad.
- Baja en el sistema inmunitario antiviral.
Virulencia: concepto relativo de patogenia que se utiliza para la comparación del comportamiento
viral en un sistema. No es la capacidad de hacer daño, sino el grado en el cual el daño se puede
observar.

Los estudios de virulencia sirven para:

- Detectar los genes involucrados en el daño.
- Comprender los procesos de patogenia viral.
Así se puede saber si un virus tiene una capacidad grande de producir daño (si es virulento), o si es
atenuado o avirulento. Este comportamiento se puede modificar, es decir que puede pasar de ser
virulento a avirulento/atenuado y viceversa.

100
La virulencia se modifica por acúmulo de mutaciones, que se puede dar por:
- Pasajes en animales o cultivos celulares: dependerá de la tasa de mutación, de las polimerasas
implicadas en la replicación viral (ARN pol vs ADN pol).
- Atenuación programada: por manipulación en el laboratorio (sabiendo los genes determinantes de la
virulencia, se puede modificarlos y atenuar la virulencia).

¿Dónde se generan las mutaciones que generan el cambio de virulencia?

● Son al azar y pueden ocurrir en cualquier región, pero es importante si ocurre en genes involucrados
en el desarrollo de la patogenia.
● Los cambios pueden ser pequeños en lugares que influyen en el comportamiento replicativo del
virus, o en muchos puntos variados, en regiones más amplias.
● Estos cambios pueden revertirse, y es más probable que suceda cuando ocurre en pequeñas
regiones.
Ej: laringotraqueítis (GaHV-1). Luego de vacunar a los animales con 2 vacunas atenuadas (Serva y
SA2), los virus recombinaron y generaron una cepa de campo virulenta → brote de laringotraqueitis.
El genoma del virus aislado del brote tenía en los extremos una parte de similitud con la cepa Serva,
y la parte central similar a la cepa SA2. Las dos vacunas atenuadas en distintas regiones
recombinaron en los animales vacunados y se generó un genoma que recuperó su virulencia.

Estudio de la virulencia por estudios de comparación. Estos miden:

- Cantidad de virus que produce la muerte.
- Tiempo promedio de aparición de signos (Poxvirus: lesiones cutáneas; Retrovirus: latencia clínica
hasta la aparición de tumores).
- Medición de la temperatura corporal o pérdida de peso.
- Medición de daño histológico (CPE).

Los estudios de comparación de la virulencia dependen de:

- Dosis (UFP/ml): la cantidad de virus que se va a aplicar tiene que poder medirse.
- Cepa viral: tienen que ser comparables = la misma cepa con distintas dosis, o la misma dosis de
distintas cepas.
- Vía de inoculación / puerta de entrada: puede modificar la capacidad replicativa del virus.
- Especie en la que se hace la prueba de virulencia.
- Edad del hospedador, género, susceptibilidad.
Todos los estudios tienen grupos controles para asegurarse que el manejo de los animales no es el que
está generando el daño, y es el virus el que lo está produciendo.

Los parámetros que se usan para comparar la virulencia entre virus tienen que ser homogéneos.
La virulencia es una propiedad relativa. No puede utilizarse para comparar distintos sistemas.

Comparación relativa (lesiones por pox ovino):

A la izquierda se ven lesiones por el virus salvaje, y a la
derecha por el virus atenuado por deleción (se le quitó un
gen no esencial).
Ambos virus tienen capacidad patogénica (ambos
producen lesiones).
Fotos de abajo: se hizo una inoculación intradérmica del
virus, y se ve que en ambos casos se produce una lesión
(vesícula en piel), pero éstas no son iguales, ya que el
virus deleteado modificó su comportamiento (puede
replicar pero de forma atenuada), generando una lesión
más leve.

101
Formas de actuar de los genes que participan en la virulencia
1) Afectando la capacidad de replicación del virus.
2) Modificando los mecanismos de defensa del hospedador.
3) Facilitando la diseminación en o entre hospedadores.
4) Por toxicidad.

1) Modificación de la capacidad de replicación

Ej 1: herpesvirus neurotrópico → Virus ADN que necesita que las células estén en fase S para poder
replicar.
➔ Algunos virus ADN (como los herpesvirus neurotrópicos) infectan neuronas (que no entran en fase S)
porque codifican para genes que son factores de neurovirulencia:
- Gen de la timidina kinasa: kinasa que fosforila a la timidina para poder utilizar el nucleótido que no
está presente en células en G0 (como no hay replicación de ADN no se utiliza la timina).
- Ribonucleótido reductasa: los nucleótidos de ARN tienen que reducirse a desoxirribonucleótidos,
que son necesarios para la síntesis del genoma viral.
- Los genes de la Timidina Kinasa y la Ribonucleótido reductasa le confieren al virus la capacidad
de replicar en las neuronas por participar en la síntesis de nucleótidos de ADN. Las neuronas no
sintetizan este tipo de enzimas por haber perdido la capacidad de ingresar en la fase S del ciclo
celular.
➔ Atenuación de un herpesvirus simplex tipo 1:
- Deleción de la región ICP34.5 y donde se encuentra la timidina kinasa codificada.
- Eliminación de la ribonucleótido reductasa.
➔ Esto va a generar que el virus no pueda replicar en neuronas, y sólo lo hará en células que entran en
mitosis (pasan por la fase S y el virus aprovecha para replicar su genoma), que luego pueden morir.
➔ Este tipo de atenuación puede ser utilizada para el tratamiento de gliomas (células malignas en el
SNC).

Ej 2: genes “accesorios” de Lentivirus → Gen VPR: codifica para una proteína que =
➔ Tiene función de importina: participa en el ingreso del genoma al núcleo en células quiescentes [que
no disuelven su membrana nuclear] (luego de la retrotranscripción del genoma en el citoplasma, para
poder integrarse al genoma tiene que entrar al núcleo).
➔ Frena a la célula en G2 en el momento del egreso (por degradación de proteínas que actúan con las
ciclinas B y CDK1), llevando a la célula a apoptosis.

Cambios en la virulencia por mutaciones en regiones no codificantes

➔ Ej: Picornaviridae: la traducción de la poliproteína (que es clivada y da lugar a todos los componentes
proteicos estructurales y no estructurales) depende del IRES, que se encuentra en la región 5’ no
codificante.
- A esta región se la considera un factor de patogenicidad ya que se observó que las cepas
atenuadas de algunas vacunas (ej: Sabin del Poliovirus humano) tienen cambios en el extremo 5’
(donde está el IRES). Estas mutaciones modifican su estructura 2ria, que impide que el virus
replique en el cerebro, disminuyendo la traducción del mensajero y la producción de la
poliproteína, que completaría la replicación del virus. Entonces si se modifican algunas regiones
necesarias para la replicación, esta se va a ver comprometida (cepa vacunal atenuada). La Sabin
se generó por pasajes seriados que causaron la mutación de nucleótidos.
- Un individuo vacunado con la cepa P3 León mostró signos de poliomielitis con distintos niveles de
parálisis. Se aisló el virus que había revertido (dejó de ser atenuado) y se vió que había
recuperado una de las mutaciones que tenía la cepa wild type. Esa sola reversión restituyó el
IRES del virus, y así pudo replicar y generar la signología.
➔ 2 cepas del virus de la fiebre aftosa → A Argentina 00 y 01 → Tienen diferencia en su virulencia y
patogenicidad por tener cambios en la región 5’ no traducible → el IRES es potencialmente un factor
de patogenicidad, ya que cambios en el pueden modificar el comportamiento replicativo del virus.
102
2) Genes que producen modificaciones en las defensas del hospedador
Ej: proteínas miméticas del virus de Ébola.
➔ Por problemas en el editing genera una variante de una proteína que es secretoria (SSGP) a partir
de una glicoproteína de envoltura.
➔ Esta proteína al ser secretada se va a unir a los Ac neutralizantes y los bloquea, permitiendo que
una vez finalizado el ciclo replicativo del virus, pueda tener la vía libre para poder infectar otras
células ya que los Ac fueron bloqueados.

Viroquinas: algunos virus codifican proteínas homólogas a IL, las cuales juegan un rol en la evasión
inmune y favorecen la replicación viral.
➔ El herpesvirus Equino tipo 2 codifica una proteína homóloga de la IL-10, que es capaz de inhibir la
respuesta por LTh1.
➔ El herpesvirus humano tipo 8 sintetiza la proteína K2 con alta homología con la IL-6, la cual es
capaz de inducir una señal antiapoptótica en linfocitos, favoreciendo la aparición del sarcoma
asociado a este virus.

Inhibición de la cascada de complemento: Orthopoxvirus, Herpes simplex 1 → bloquean el componente

C3b → no se generan las perforinas → las células infectadas no son atacadas por este mecanismo de
defensa.

Viroreceptores: proteínas virales homólogas a receptores celulares → Algunas proteínas virales actúan
como receptores para Fc de IgG, uniéndose a los Ac e inhibiendo la respuesta dependiente de Fc.
➔ El Citomegalovirus del ratón codifica para un receptor Fc (FcR) que parece estar relacionado con la
inactivación de células dendríticas.
➔ Herpes simplex 1 expresa un receptor para Fc llamado gE-gI. Se ubica en la superficie del virión y
de la célula infectada, uniéndose a la IgG e interfiriendo con su función.

3) Genes que favorecen la diseminación

Ej: clivaje de la HA de Influenza
➔ Región globular (ligando del receptor de ácido siálico de la célula
hospedadora); zona de bisagra y zona de tallo.
➔ La HA madura en la luz bronquial por la serin proteasa.
➔ Cambios que se producen en la HA pueden generar modificación en la
virulencia, por lo que van a haber cepas de alta virulencia y de baja
virulencia.
➔ Las de alta virulencia tienen mutaciones en
el sitio de clivaje, que permite que sea
reconocido por otras proteasas ubicuas (como furinas, plasminas) →
Esto le da al virus la capacidad de diseminarse a otros órganos y
madurar en ellos, o diseminarse ya maduros (hay cepas de alta
patogenicidad que ya egresan maduros, porque el clivaje se produce en
Golgi). Se producen cambios de patogenicidad.
➔ Factor de patogenicidad: péptido de fusión de la HA → favorece la
diseminación del virus dentro del animal.

La diferencia entre las cepas de alta y baja patogenicidad se da por la capacidad de clivaje de la HA por
parte de proteasas ubicuas producto de las mutaciones de dicho sitio. Esto permite que proteasas
puedan reconocerlo y así madurar al virión en distintos tejidos.

Ej: clivaje de la proteína F del virus de Newcastle (Paramixo).

➔ Factor de patogenicidad: proteína F de fusión.
➔ Hay un cambio en el sitio de clivaje → es reconocido por una furina.
103
➔ Estos cambios de aa permiten que el virus madure de distinta manera en distintos tejidos, dando
sintomatología nerviosa, digestiva (velogénica y mesogénica = mortalidad de hasta 90%), y signos
respiratorios leves (lentogénica).

4) Proteínas tóxicas
● Son proteínas que producen injuria en los tejidos solo por existir (no por el proceso replicativo).
● Se ha descubierto por purificación y agregado de estas proteínas a los cultivos.
● Algunas producen injuria en cultivos celulares, y alteraciones en sus genes reducen la virulencia.

Ej: proteína no estructural VP4 de Rotavirus.

➔ La proteína nsP4 se secreta en las células que están infectadas por Rotavirus y generan un cambio
en la función de los canales de Ca+ y Cl- → pérdida de líquido → aumento de extravasación de
líquido a la luz intestinal → diarrea.
➔ Esta proteína que se secreta de las células infectadas puede afectar a células vecinas que no están
infectadas.

Ej: Influenza A. PB1F-2 (frame 2 de la PB1) → produce injuria a distintos niveles.

➔ Se une la PB1F-2 a la membrana mitocondrial y le genera poros → se produce la liberación de
citocromo C → desencadena injuria por apoptosis en las células infectadas.

Importancia en el estudio en el cambio de la virulencia

● Conocer los factores de virulencia.
● Conocer los mecanismos de injuria celular (ya que están asociados con la signología).
● Atenuar la virulencia → Producción de vacunas:
- Tienen que generar una respuesta inmune estable.
- Suficiente atenuación para que no revierta.
El comportamiento replicativo del virus y su interacción con la célula determina el patrón de infección.

Infecciones agudas vs infecciones persistentes

Infección aguda: rápida producción de virus y rápida resolución de la infección (por clearance
inmunológico o muerte del animal) → El ciclo replicativo no dura más de 1 semana.
- Puede generar enfermedad o no, y algunas infecciones pueden ser asintomáticas (infección
inaparente).
- En caso de producir enfermedad, esta puede ser grave o no (dependiendo de los órganos afectados
y de la respuesta del SI).
- Estos virus están bien adaptados a sus hospedadores, y permiten
cambios en sus proteínas (mutan) sin dejar de ser infectivos →
Plasticidad estructural (Ej: influenza y Rhinovirus).
- Ej: HA de influenza (de la pandemia de 1968 a 1995). A la derecha se
ve la original (1968), y a la izquierda la de 1995. Amarillo: regiones
conservadas (ligando del receptor celular). Verde: distintos sitios de
sustitución → La HA mutó sin perder su capacidad infectiva. Este
concepto está muy relacionado con el de Drift
antigénico: de un año a otro la HA muta
generándose un escape antigénico, y por eso los
animales se vuelven a enfermar con distintas
variantes del virus de influenza.
Curso típico de una infección aguda: una vez que el
virus ingresa al organismo hay un momento de eclipse,
en el que no se pueden detectar partículas virales → el
virus empieza a replicar → viremia, que tiene un pico
104
en donde se produce una respuesta adaptativa → empieza a bajar el título viral en el animal en forma
rápida → se produce el clearance.

Infección persistente / crónica / larga: la infección no se resuelve rápidamente (sí puede aparecer
rápidamente). Algunas se resuelven eventualmente, mientras que otras no resuelven nunca (infecciones
de por vida). Para persistir en el animal los virus deben:
- Evadir la respuesta inmune del organismo.
- Asegurar la supervivencia de la célula infectada (bajo efecto citopático).
- Existen productos virales que modulan a la célula.
Algunos virus pueden evadir el SI: esto se puede dar por la infección de tejidos o células restringidas
para el SI.
● No todas las células del organismo están sujetas a una vigilancia inmunológica activa.
➔ Infección de los epitelios: si bien el virus tiene que sortear a la inmunidad pasiva (alta tasa de
recambio celular, mucus, lisozimas, pH ácido, etc), una vez que la infección se establece puede
permanecer “oculta” al resto del SI.
- Ej: Papilomavirus → en el estrato basal y espinoso hay replicación del genoma del virus y
expresión de genes tempranos. Hay una desregulación de la célula por parte de proteínas virales
que permiten estimular la fase S para que se pueda replicar el genoma. A partir del estrato
granuloso el SI no genera una vigilancia de estas células, entonces cuando se empiezan a
sintetizar las proteínas estructurales de la cápside viral, el SI no puede detectarlas y no se va a
montar una respuesta adaptativa → el virus genera un infección persistente ya que el SI nunca
va a montar una respuesta contra él.
- Ej: Citomegalovirus (gland. salivales).
➔ Infectar células del SNC: está restringido al SI, ya que si se produce una infección generando
pequeñas alteraciones de volumen, concentración de electrolitos y la respuesta citotóxica pueden
generar daños irreversibles en este tejido. Los linfocitos son capaces de atravesar la BHE pero
están de paso, a menos que encuentren un Ag correctamente presentado (en el MHC). Las
neuronas no poseen MHC I, por lo tanto quedan excluidas de la vigilancia activa por parte de los
LT CD8.
➔ Infectando directamente a las células efectoras del SI (linfocitos y macrófagos): permite al
virus diseminarse por todo el organismo (estas células entran y salen de muchos tejidos no
relacionados entre sí).
- Ej: VIF, ViLeF, AIE, OvHV-2, BHV-4 (herpes ovino y bovino).
➔ Induciendo tolerancia inmunológica: virus no citopáticos capaces de infectar a los animales in
útero. Las células infectadas nunca son atacadas por los componentes inmunológicos del animal
→ se produce una exclusión clonal de los linfocitos que reconozcan a los Ag virales ya que se
van a considerar como propios en el momento de la maduración del SI.
Ej: VDVB, Virus de la Coriomeningitis Linfocitaria (LCMV).
● Existen también mecanismos de modulación del SI generando una disminución en la expresión
del CMH, inhibición de IFN, muerte de LT citotóxicos.

Tipos de infecciones persistentes

Infecciones latentes: durante la latencia no hay producción de viriones.
➔ La latencia no interfiere con la replicación normal del ADN celular → infectan células que no replican
(como las neuronas) o su genoma del virus es copiado al mismo tiempo que el celular.
➔ El SI es incapaz de detectar la célula que lleva el virus en forma latente.
➔ Los genes involucrados en el ciclo productivo del virus permanecen apagados.
➔ El genoma viral permanece intacto y puede iniciar un ciclo productivo en algún momento para
asegurar su progenie e infectar un nuevo animal.
➔ Ej: BHV 1 que infecta neuronas ganglionares.
- Replicación en la unión muco-cutánea → migración axonal. El virus ingresa al soma neuronal
dentro del ganglio y ahí es donde hace latencia (donde tiene que tener la capacidad de reactivarse),
105
 esperando las condiciones para reiniciar el ciclo lítico y migrar hacia la unión muco cutánea y
producir progenie viral.
- Durante la fase de latencia, la transcripción está bloqueada, salvo por los transcriptos asociados a
la latencia (LAT) → mantienen a la célula en un estado antiapoptótico esperando las condiciones
para que el virus se reactive.

Infecciones transformantes: la persistencia de estos virus se basa en la inmortalización de la célula

infectada (virus oncogénicos), produciendo tumores.
Ej: ARN (Retroviridae), ADN (Adenoviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Herpesviridae).

Infecciones lentas: el período entre que la célula es infectada y se produce el daño en la misma es muy
largo (años), y el daño es acumulativo.
- Esto dificulta mucho el estudio y la capacidad de identificar los agentes etiológicos.
- Se les ha asignado a varios virus la probabilidad de ser agentes causales de enfermedades
degenerativas crónicas.
- Ej: Encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) provocadas por priones (no es un virus) → la
acumulación de estas proteínas infectivas van a generar a lo largo de los años un efecto
acumulativo con la signología propia.

Resumen de patrones de infección

Infección aguda: rápida aparición de
viriones, respuesta inmune adaptativa, y un
clearance y una rápida resolución (días y
semanas).

Infección persistente: aparición rápida o no,

infección que está a lo largo de la vida del
animal, eliminando viriones en forma
persistente.

Infección latente: la primera infección tiene

un patrón agudo, latencia (sin producción de
viriones) y reactivación sistematizada hasta el momento de la muerte del animal.

Infección lenta: primera infección, y luego distintos niveles de producción de virus, con reactivación y
muerte. Tienen efecto por acumulación y suelen durar años.

106
 MODULACIÓN DE LA APOPTOSIS

Cuando una célula está infectada trata de responder inmunológicamente, y el virus busca contrarrestar
la respuesta celular. Realizará una modulación tratando de escapar de la estrategia de la célula
(deshaciéndose de la célula, o contrarrestando la infección viral).

APOPTOSIS: proceso genéticamente programado mediante el cual las células de organismos

pluricelulares llevan a cabo su autodestrucción en respuesta a una amplia variedad de estímulos
(intracelulares o extracelulares). Este proceso está finamente regulado a distintos niveles.

Eventos morfológicos de la
apoptosis
En una célula apoptótica: las
mitocondrias no se
destruyen, se empieza a
compactar el citoplasma y el
núcleo, y se forman los
cuerpos apoptóticos que
contienen en su interior a las organelas intactas. Los cuerpos apoptóticos son fagocitados por
macrófagos, o células capacitadas para tal función.

Características de las células apoptóticas: sirven para diferenciar de células necróticas.

● Reducción del volumen celular: por compactación del citoplasma.
● Condensación de la cromatina.
● Degradación internucleosomal de ADN: genera fragmentos de ADN de 200 pares de bases, o
múltiplos de 200 pb, ya que es la distancia en que se encuentran los nucleosomas entre sí, y
pertenece a la parte de ADN desnudo donde pueden actuar las enzimas.
● Translocación de fosfatidilserina desde la cara interna hacia la externa de la membrana plasmática
(las membranas son asimétricas en cuanto a la composición de fosfolípidos y proteínas → la
fosfatidilserina es un fosfolípido de la cara interna, y cuando se inicia la apoptosis por flip-flop trasloca
a la externa. Es un evento que ocurre bastante temprano en la apoptosis, a diferencia de, por
ejemplo, la degradación del ADN).
● Fragmentación de la célula en cuerpos apoptóticos.

Todos estos eventos pueden ser detectados con alguna técnica de laboratorio: microscopio, geles para
corrimiento de ADN, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia. Mediante esto se puede
determinar si está en una etapa temprana, o una etapa más tardía.

Cuerpos apoptóticos saliendo Las células en cultivo se

de la célula. achican y retraen,
levantándose del sustrato.

Activación de la apoptosis
● Estímulos extracelulares: se activa la vía extrínseca/ vía de receptores de muerte.
● Estímulos intracelulares: se activa la vía intrínseca/ mitocondrial.

107
Ambas vías confluyen con la activación de las caspasas (cystein dependent aspartate specific protease)
ejecutoras, que son las que ejecutan la apoptosis al degradar proteínas del citoesqueleto, proteínas del
núcleo, etc; y esto lleva a la autodestrucción de la célula.

Vía extrínseca o de receptores de muerte

1) Cuando el ligando se une al receptor se produce la trimerización del receptor.
- Hay distintas posibilidades de ligando, que se corresponden con un receptor en particular:
➔ Fas ligando con Fas.
➔ TNF α con receptor de TNF 1.
➔ TRAIL con DR5.
2) Estos receptores reclutan a
proteínas adaptadoras.
- Hay distintas: FADD
(para Fas-FasL) o
TRADD.
3) Estas proteínas reclutan a la
procaspasa 8 → a partir de
este paso es idéntico para
cualquier ligando.
4) La procaspasa 8, cuando
está formando parte de esta
estructura, se activa por
autoclivaje y se convierte en
caspasa 8 activa.
5) La caspasa 8 activa activa a las caspasas ejecutoras, de las cuales la caspasa 3 es la más conocida,
pero también están la 6, 7 y otras.
6) Las caspasas ejecutoras terminan con la apoptosis.

Vía intrínseca o mitocondrial

1) Ante la presencia de un estímulo
se activa la síntesis de proteínas
proapoptóticas, pertenecientes a
la familia de la Bcl-2.
2) Forman homodímeros que van
desde el citoplasma hacia la
membrana mitocondrial, formando
poros que permiten la salida del
citocromo c de la mitocondria al
citoplasma.
- El citocromo c se encuentra
habitualmente dentro de la
mitocondria, y su salida podría ser
indicador de la ocurrencia de una
vía apoptótica intrínseca.
3) El citocromo c en el citoplasma
forma el apoptosoma junto con
otras proteínas como la Apaf-1.
4) En ese estado recluta a la procaspasa 9, que al formar parte del apoptosoma se transforma en
caspasa 9 activa por clivaje.
5) La caspasa 9 activa es capaz de activar a las caspasas ejecutoras (3,6,7).

108
Hay otras proteínas de la familia de Bcl-2 que son antiapoptóticas, y la presencia de unas o de otras
determina que ocurra o no ocurra la apoptosis.
Las proteínas proapoptóticas además de formar homodímeros y poros en la membrana de la
mitocondria, pueden formar heterodímeros con proteínas antiapoptóticas. En este caso las proteínas
antiapoptóticas actúan como secuestradoras. Si se forma el heterodímero, las proapoptóticas no puedan
traslocar a la mitocondria, y por lo tanto no se forma el poro en la membrana mitocondrial → no sale el
citocromo c → no se forma el apoptosoma → no se activa la procaspasa 9 → inhibición del proceso.

Principales vías de apoptosis en mamíferos

Mecanismo de regulación celular: la proteína
C-FLIP compite con la procaspasa 8 para
unirse a proteínas adaptadoras → no se
puede unir la procaspasa 8 → no se activa,
inhibiendo todo lo que ocurre a continuación.
Dependiendo de los estímulos habrá
mayores niveles de unas o de otras,
ocurriendo la activación de la apoptosis o la
limitación de la apoptosis ya iniciada (porque
ya hubo un ligando que se unió al receptor,
proteínas adaptadoras que se unieron, y
estamos en la etapa de reclutamiento de la
procaspasa 8).

Vía intrínseca representada por la

mitocondria: es iniciada por un estímulo,
como el daño en la molécula de ADN, que
activa la p53, y esta activa a la proteína
proapoptótica, como la Bax. Esta transloca
del citoplasma a la mitocondria para formar los poros, liberar el citocromo C, y formar el apoptosoma.
La presencia de Bcl-2 forma un heterodímero con Bax e inhibe su salida a la membrana mitocondrial.
Otra proteína antiapoptótica representada es la Bcl-xl, que tiene el mismo efecto.
Hay otras proteínas que pueden inhibir la apoptosis por vía intrínseca ya iniciada, como por ejemplo las
proteínas IAPs, que son inhibidoras directas de las caspasas (inhibe la apoptosis avanzada). Hay
proteínas capaces de inhibir a las IAPs, denominadas smac diablo, inhibiendo la inhibición de la
apoptosis, por lo que va a ocurrir.

Si se inhibe Bcl-2, se estaría induciendo la apoptosis y además participa en la vía intrínseca.

Se puede inhibir la apoptosis ya iniciada por la célula a través de proteínas IAPS-v (inhibidores de
caspasas → frenan la apoptosis iniciada por ambas vías) o expresando v-FLIP, que compiten con las
proteínas adaptadoras para reclutar a la procaspasa 8.

Existe una conexión entre las vías extrínseca e intrínseca, que se da cuando la vía extrínseca no es
suficiente. En ese caso la caspasa 8 cliva a la proteína proapoptótica Bid, y esta, en estado clivado, es
capaz de inducir la formación de poros en la membrana, y contribuir a la salida del citocromo c. Las
proteínas proapoptóticas también pueden inhibir a Bid clivado formando heterodímeros. Esta es una
activación indirecta de la vía intrínseca.
Algunos virus destinan proteínas virales para interferir con el proceso apoptótico, inhibiéndolo o
induciéndolo.
- v-FLIP compite con la procaspasa 8.
- IAPs virales inhiben a caspasas ejecutoras en una apoptosis avanzada.
- Homólogos de receptores.

109
- Inhibición o bloqueo de p53 (se bloquea bastante al principio la vía intrínseca).

Que la célula termine en apoptosis o no

depende del balance entre las
proteínas proapoptóticas y
antiapoptóticas, por la capacidad que
tienen de formar heterodímeros. Si hay
altos niveles de proteínas
antiapoptóticas va a estar inclinado
hacia la supervivencia de la célula;
mientras que si los niveles de las
proteínas proapoptóticas son mayores
va a estar inclinado hacia la apoptosis.
La sola presencia de estas proteínas no
indica que está en apoptosis, es
necesario cuantificar.
Estrategias
VIRUS CÉLULA
Inhibir apoptosis: ● Células NK, macrófagos
● Bloqueo p53 ● Respuesta inmune CD8+
● Proteínas anti-apoptóticas ● Interferón, genes inducidos por interferón,
● Inhibidores caspasas factores reguladores de interferón (IRFs)
● Homólogos de receptores de muerte ● Activar apoptosis vía p53
● Homólogos de ligandos ● Activar vía intrínseca y/o extrínseca de
Inducir apoptosis: apoptosis.
● Activación p53
● Expresión Fas L
● Expresión Bax y Bcl-2

Inhibición de la apoptosis
● Virus que codifican proteínas homólogas a Bcl-2 (capaces de formar heterodímeros con
proapoptóticas) → Se inhibe vía apoptótica mitocondrial.
- Adenovirus (etapas tempranas) → E1B 19K
- Virus fiebre porcina africana → A179L
- Epstein Barr virus → BHRF1

● Virus que codifican v-flip (compite con la procaspasa 8 y se une a la proteína adaptadora) → Inhiben
la vía extrínseca.
- BHV 4 → BORGE 2
- EHV 2 → E8

● Virus que codifican v-IAPs → Inhiben caspasas.

- Virus fiebre porcina africana → A224L.

● Virus que inhiben caspasa 8 (se inhibe la apoptosis inducida por la vía de receptores de muerte).
- Pox bovino → Crm A
- Vaccinia (poxvirus) → homóloga Crm A

● Virus que codifican para proteínas homólogas a receptores

- Myxoma (poxvirus de conejos) → T2 es homóloga a TNFR: T2 compite con TNFR (receptor de
TNF) para unirse al ligando, por lo que si el ligando se une a T2, se inhibe la activación de la
apoptosis por vía extrínseca.

110
● Virus que inhiben p53: los virus destinan proteínas para unirse a p53, y actúan secuestrándolo,
imposibilitando que p53 active la apoptosis (además tienen proteínas para promover que la célula
pase de G1 a S porque necesita el entorno replicativo para duplicar su ADN).
- Adenovirus (etapas tempranas) → E1B
- Polyomavirus → LT
- Papillomavirus → E6.
● Herpesvirus: el ARNm LAT asociado a la latencia tendría una función en la inhibición de ambas vías
apoptóticas.

Inducción apoptosis
● Adenovirus (etapas tardías) → E1A y E4.
● Virus de la anemia del pollo (Circoviridae) → VP3 (viaja dentro de cuerpos apoptóticos, y al ser
fagocitados por células vecinas el virus queda dentro de los cuerpos apoptóticos y entra a las células
sin ser identificado por el sistema inmune).
● HIV (retro) → Tat
- ↑ FasL, ↑ Bax: induce proteína proapoptóticas de ambas vías.
- ↓ Bcl-2: reduce proteínas antiapoptóticas.
- ↑ FasL: al liberar FasL pueden entrar en apoptosis células no infectadas, porque se va a unir a
receptores de células no infectadas.
● Diarrea viral bovina → NS3 (en cepas citopáticas).

Proteínas virales que modulan la apoptosis

Verde: vías de
modulación de
inducción de la
apoptosis.
HIV: estimulación de
FasL.
DVB: NS3.
Adenovirus: a nivel
nuclear induce la
apoptosis en etapas
tardías.
Virus de la anemia del
pollo: VP3 a nivel
mitocondrial.
Adenovirus: a nivel
mitocondrial induce la
apoptosis en etapas
tardías.
Rojo: inhibición de la
apoptosis.
Homólogo del
receptor de TNF: pox
de conejo
Pox bovino: CRM que pueden bloquear la apoptosis por vía extrínseca.
Homólogos de flip en herpes
Homólogas a IAPS celulares
Homólogos a bcl2
Inhibidores de apoptosis a nivel de p53.

111
Proteínas virales que modulan la vía mitocondrial

112
 ONCOGENESIS VIRAL
¿Cómo pueden los virus inducir oncogénesis?
A - Modificando la señal de transducción → activando la cascada mitogénica de la que forman parte.
B- Bloqueando los reguladores negativos del ciclo celular → genes supresores de tumores que se
encargan de frenar la división celular cuando esta no es correcta.

Transducción de señales para que la célula se divida

Cuando una célula recibe el estímulo para dividirse, la transducción
de señales se puede dar a distintos niveles:
1) Aumento de factores de crecimiento celular extracelulares: le
indican a la célula que las condiciones están dadas para la
división.
2) Aumento del número receptores: los factores estimulados por los
de crecimiento generan una cascada de fosforilación de segundos
mensajeros (transducción de señales dentro del citoplasma) →
puede verse modificada en el estímulo mitogénico.
3) Aumento de la señal de transducción.
4) Aumento de la activación de la trascripción de genes que están
involucrados en la división celular.

Algunos factores de la cascada mitogénica que participan en la

señalización para que la célula se divida: factores de crecimiento,
factores citoplasmáticos, receptores, factores de señalización nuclear →
son genes normales para la célula que la lleva a la mitosis.
Cuando la célula tiene un estímulo que la lleva a la mitosis estos genes
se van a transcribir y traducir, habiendo un estímulo mitogénico.

Regulación del ciclo celular

Estos factores celulares o genes supresores de tumores actúan en el ciclo de
división celular
- Protooncogenes → estimulan la mitosis.
- Genes supresores de tumores → frenan la mitosis si hay alguna alteración
en la célula, y luego va a la apoptosis.
Los virus actúan en estos 2 puntos, estimulando a la división celular como si
fuesen protooncogenes e inhibiendo a los supresores de la división celular, por lo
que estimula la división y se inhibe su freno.

Mecanismos virales
A - Modificando la señal de transducción
Inducen oncogénesis modulando la cascada de señalización a través de distintos
mecanismos:
1) Retrovirus transductores: portan un v-oncogen → genes homólogos a los c-oncogenes o
protooncogenes que participan en la cascada mitogénica, simulando el estímulo de los factores
mitogénicos propios de la célula.

113
2) Retrovirus no transductores: integración próxima a un c-oncogén → modifican su expresión → el
LTR viral se apropia del control del protooncogen, reemplazando al promotor del oncogen generando
un aumento en la transcripción.
3) Retrovirus transactivadores: transactivación de genes que regulan el ciclo celular → Inducen
oncogénesis modulando la cascada de señalización a través de distintos mecanismos.

Retrovirus oncogénicos promotor/enhancer fuerte

Se fusionan las membranas a nivel de la membrana citoplasmática,
decapsidación, retrotranscripción, e integración al ADN celular.
La integración es esencial para los retrovirus, ya que sino lo hace no
puede transcribir ARNm y genoma.

LTR en 3’ y 5’ → promotores virales fuertes para gag, pol y env

además de formar parte de la integración dentro del ciclo replicativo.

Retrovirus oncogénicos (pueden generar malignización de la célula)

1) Retrovirus transductores
● Portan y expresan un v-oncogen que desregula el ciclo celular.
● Perdieron algún componente de su genoma (pol o env), habiendo ruptura del marco de lectura
→ Muchos son defectivos en su replicación. Los viriones de los retrovirus transductores no
generan replicación completa → ciclo replicativo abortivo → al ganar un oncogen en su genoma,
por una cuestión de espacio, pierden genes importantes para sobrevivir.
● Son altamente carcinogénicos en animales.
● Transformación aguda (rápida).
Retrovirus transductores (son retrovirus simples con gag, pol y env).
- Virus sarcoma de Rous → V-src (proteína de señalización intracitoplasmática). Tiene gag, pol y env
intactos, y el src (oncogen) está corriente abajo de env y antes de LTR 5´.
- Virus Sarcoma Felino → V-fms (homólogo del receptor FMS de la cascada de activación mitogénica)
- Virus sarcoma Aviar → V-ras (proteína de señalización citoplasmática).

Son genes que codifican para v-oncoproteinas homólogas de las c-oncoproteínas que forman parte de
la cascada mitogénica.
El v-oncogén está mutado (los virus introducen muchas mutaciones en su proceso replicativo) de
manera tal que no va a poder apagarse este tipo de estímulo porque el feedback - de la célula no
funciona con las v-oncoproteínas (las c-oncoproteínas son normales y tienen un mecanismo de
feedback negativo para que la célula deje de dividirse) → son homólogas pero no idénticas → escapa a
la regulación celular → aumento exacerbado de la vía de transducción celular que conlleva a la mitosis.

Ejemplo de diferencias entre un c-oncogen y un v-oncogen

Src: codifica para una tirosina kinasa (enzima que adhiere grupos fosfato a los residuos de tirosina de
las proteínas).
C-src V-src
● Tiene un dominio al final, en el extremo ● Tiene una deleción en la posición 527, por lo
carboxiterminal, con una tirosina en la posición que solo tienen 526 aa.
527 (sin fosforilar). Cuando es fosforilada, se ● No puede adquirir su conformación INACTIVA
inhibe su actividad. porque carece de la tirosina 527, y permanece
siempre ACTIVA → estímulo mitogénico
constante.

114
 ● 2 conformaciones posibles y el pasaje de una
a otra está regulada por fosforilaciones de las
kinasas celulares.
- Fosforilación de la tirosina 416 → ACTIVA.
- Fosforilación de la tirosina 527 → INACTIVA

2) Retrovirus no transductores
● Son retrovirus que no portan un oncogen. Tienen su genoma normal.
● Se produce una oncogénesis por inserción: generan una desregulación de la célula, el LTR del virus
estimula la transcripción de un oncogen celular debido a que se inserta dentro o próximo al mismo.
● Alteran la expresión o la actividad de proteínas celulares normales relacionadas con la transducción
de la señal.
● Transformación lenta.
● Ejemplos:
○ Virus leucosis aviar
○ Virus leucosis del ratón
○ Virus tumor mamario del ratón
Activación por inserción
● El PROMOTOR viral (LTR) toma control de la
transcripción del c-onc. Como es un promotor
fuerte, la expresión del oncogen celular está
exacerbada. Se integra dentro del gen y el
promotor del virus pasa a ser promotor del
oncogen.
○ Arriba: el virus se integra dentro del gen (entre el
promotor del oncogen y el marco de lectura):
integración del LTR dentro de la región
codificante de un proto-oncogen → El promotor
viral estimula su síntesis.
● El ENHANCER viral (LTR) modula al promotor del
c-onc. Esto conlleva a una transcripción
exacerbada del c-onc.
○ Abajo: la integración no altera el protooncogen
pero la proximidad del enhancer viral estimula la
transcripción (puede integrarse corriente arriba,
no entre el promotor del gen y los primeros
exones, sino cercano al promotor, y estimularlo como si fuese un enhancer).
Desregulan c-onc
● Virus Leucemia felina → desregula c-fms
● Virus sarcoma Aviar → desregula gen ras
● Virus Leucosis aviar → desregula c-myc

Virus de leucosis aviar- Alpharetrovirus

Tiene sus genes gag pol env.

Virus simple, que se integra dentro
del c-myc generando una
desregulación (porque el LTR
actúa como promotor).

115
 Las flechas indican en qué sitios se encuentran las
inserciones dentro del gen myc: corriente arriba del
exón 1, en el exón 1, y en el intrón 1. El virus se
integra en cualquier dirección y en todos produce la
desregulación del gen myc porque tiene su LTR en
ambos extremos (si se integra en una dirección un
LTR toma el control, mientras que si se integra en la otra dirección el otro LTR toma el control).
Genera un aumento en la tasa de expresión del c-myc que codifica una proteína normal de la célula. La
proteína myc se apaga por feedback negativo → esta inactivación se da hasta que aumente mucho la
tasa de transcripción y supere el umbral de inactivación de la célula.

Un aumento en la tasa de expresión del gen myc produce un

aumento en la capacidad de división celular ya que la proteína Myc
tiene como función el estímulo de distintos genes, por ejemplo el gen
de la ciclina D, el gen de la subunidad SCF y el gen E2F. Todos
estos genes activos van a estimular la formación de complejos
ciclina Cdk y estimulan el pasaje de la célula de G1 a S.

3) Retrovirus Transactivadores: Virus de Leucosis bovina.

Es un mecanismo por el cual algunos virus sintetizan proteínas
parecidas a las proteínas accesorias → el virus de leucosis bovina
codifica para la proteína Tax, que:
● Transactiva proto-oncogenes: estimula a los promotores de protooncogenes.
● Inhibe procesos de reparación del ADN → la célula no frena su ciclo.

B - Bloqueando los reguladores negativos del ciclo celular (genes supresores de tumores)
Genes que codifican para proteínas:
- Proteína Retinoblastoma (pRb)
- p53
Los virus que generan este tipo de bloqueo son principalmente: adenovirus, polyomavirus y
papillomavirus.

Regulación celular de pRb: si las condiciones

son adecuadas pRb permite el pasaje de G1
a S dentro del ciclo celular.
pRb al estar activa está unida a E2F (que no
es activa), y cuando pRb se fosforila se libera
E2F. E2F es un factor de transcripción de
genes involucrados en la fase S (genes que
codifican para proteínas y enzimas
necesarias para la síntesis de ADN).

Control celular de integridad de ADN por p53

p53 verifica la integridad del ADN de la célula en el momento en que se está dividiendo.
- Cuando hay un daño leve en el ADN se frena el ciclo celular, permitiendo a la célula reparar el ADN.
- Cuando el daño es muy grave y es irreversible la activación de p53 va a estimular la apoptosis por la
vía intrínseca.
● pRb estimula a la célula a dividirse, y p53 va a frenar o no la división sin daño del ADN.

116
Regulación viral de pRb y p53
Si un virus regula a estos bloqueantes del ciclo, provoca la estimulación de la división celular en forma
exacerbada pudiendo desencadenar oncogenesis.
Estos virus sintetizan proteínas que bloquean:
- pRb (no la fosforila) → E2F queda libre → pasa a la fase S.
- p53 → no frena la replicación del genoma si hay algún tipo de daño en el ADN → al persistir en
S se va a completar el ciclo celular aunque haya daño.
Esta división celular estimulada con el acúmulo de daños en el ADN de la célula puede dar como
consecuencia un proceso de malignización (si p53 está bloqueada, la célula persiste, no entra en
apoptosis en virus ADN, lo que lleva a ONCOGÉNESIS).

Proteínas virales que regulan Rb y p53

Polyomaviridae: SV40 → el Ag Large T es la
oncoproteína viral encargada de bloquear pRb y
p53, que es una proteína multifuncional, que tiene
dos dominios de unión: uno a Rb y otro a p53. Es
una proteína temprana, que se expresa al comienzo
del ciclo replicativo con el fin de desregular a la
célula.
Adenovirus presenta la proteína E1A que liga Rb, y
la E1B que liga p53.
Papillomavirus cuenta con dos proteínas tempranas
encargadas de desregular la célula: E7 se une a Rb, y E6 se une a p53.
Estas uniones pueden generar la degradación de la proteína, el bloqueo, pueden enviar la proteína de
proteosoma y degradarla. Al bloquearse estas dos proteínas celulares se permite que la célula entre en
S y complete su división celular y replicación del genoma.
● Se unen a p53 y bloquean su actividad: ● Se unen a pRb e impiden que éste se una a
○ E1B de adenovirus E2F:
○ LT de polyomavirus ○ E1A de adenovirus
○ E6 de papillomavirus ○ LT de polyomavirus
○ E7 de papillomavirus.

Poder transformante de papilloma de alto riesgo

• Interacción de E7 con pRb
• E6 con mayor afinidad por p53 → el estímulo más fuerte, y la célula está muy desregulada.
• E6 transregula a c-Myc, y juntas inducen la activación de la telomerasa a nivel transcripcional → hay
inmortalización de la célula con mayor desdiferenciación → da un tumor más maligno.

En carcinomas producidos por papillomas de alto riesgo hay un evento de integración del genoma del
virus dentro de las células transformadas. No es una condición necesaria para la replicación viral la
integración, si no que ocurre por los arreglos cromosómicos que se dan en la célula tumoral. La
integración de papilomas de alto riesgo (visto en el 80% de los carcinomas) se da en forma aleatoria, y
puede interrumpir el ciclo viral, y el genoma del virus se ve interrumpido. Cuando el genoma se integra
la célula transformada va a expresar E6 y E7 continuamente, estimulando a la célula a mantener la
división celular, y fomentar la transformación del tejido. Esta capacidad transformante de papilloma está
acompañada por una integración que se da por microhomología y rearreglos cromosómicos que
sostienen la expresión de E6 y E7.

117
 Enfermedad de Marek
Se caracteriza por neurolinfomatosis. Es producida por
Gallid herpesvirus tipo 2 (Alphaherpesvirus).
Este herpes tiene proteínas involucradas en la
desregulación del ciclo de las células. Tiene 2 proteínas
importantes:
➔ VP22 (va en el tegumento): colabora con la latencia (de
semanas a meses) y daño ADN → permite que habiendo
daño del ADN se mantenga la latencia de las células
infectadas.
➔ Oncoproteína Meq: tiene varias funciones =
◆ Transactiva uniéndose a c-oncogenes (Jun, Fos,
Myc), activando la telomerasa e integridad de telómeros de
células infectadas.
◆ Se une a Jun y transactiva genes de las
interleuquinas.
◆ Bloquea pRb y p53 (genes supresores).

Conclusiones
La oncogénesis surge como una consecuencia de la desregulación, no es un fin en sí mismo → se
desregula, acumula mutaciones, lo que lleva a una malignización de la célula.
Retrovirus
● Transductores: v-onc “simula” el estímulo de los factores mitogénicos.
● No-transductores: LTR viral se apropia del control del protooncogen.
● Transactivador: trans-activa genes implicados en la cascada mitogénica.
Virus ADN
● Sintetizan oncoproteínas que suprimen los controles de la división (p53 y pRb).
● Transactivación (Meq).

118
 MECANISMOS DE EVASIÓN / MODULACIÓN DEL SISTEMA INMUNE
➔ Mecanismos de defensa intrínsecos.
➔ Respuesta inmunidad innata y adquirida frente a la infección viral.
➔ Mecanismos de evasión viral.

Mecanismo de evasión ≠ modulación del SI

- La evasión del SI por parte de un virus no es que está tratando de combatirlo ni que está
produciendo algo que vaya en contra de una reacción inmune del hospedador. Ej de mecanismo de
evasión: latencia de los Herpes. El virus no replica por lo tanto no produce ninguna proteína que vaya
en contra de alguna otra proteína o enzima del SI.
- La modulación implica que el virus va a producir algún tipo de respuesta contra la respuesta inmune
que reacciona frente al encuentro con un Ag foráneo.

Todos los virus intervienen en la regulación de al menos una de las vías del estímulo o respuesta del
sistema intrínseco o innato → Todos van a tener por lo menos una vía de regulación que va a
contrarrestar las respuestas de la célula hospedadora y del organismo (la célula hospedadora da como
respuesta antiviral el uso del SI intrínseco y va a dar respuesta frente a la respuesta del organismo tras
la activación del SI innato).

Los virus están en el medio exterior. Si alguna

barrera inmune (anatómica o químicas del
organismo: piel, moco, células ciliadas, lágrimas, pH)
se rompe o la carga viral es muy grande, las
partículas atraviesan e ingresan al hospedador.
Los virus ingresan a las células susceptibles con un
receptor acorde para que pueda ingresar a la misma
→ infección → presencia de distintas estrategias de
la célula (respuesta intrínseca celular que ya está
activada, y no depende del Ag) contra el virus:
- Silenciamiento epigenético
- Autofagia
- Apoptosis
- MicroARN o ARN de cadena corta
- Sistema CRISPs, etc…
Estas estrategias le complican al virus la
replicación intracelular.
Si el virus sobrepasa esta respuesta
intrínseca → producción de proteínas
virales que desencadenan la activación
del SI innato → producción de
citoquinas, y activación de distintas
células (CPA, neutrófilos, NK) del SI
innato (que se activa ante la presencia
de un Ag foráneo). Como producto final
genera el estado antiviral celular con
gran producción de IFN y citoquinas, y la
activación de la respuesta inmune adquirida que es dirigida hacia un Ag en particular.

● La respuesta intrínseca siempre está en la célula (incluso en la no infectada).

● La respuesta innata está inducida por la infección.

119
● La respuesta adaptativa está inducida por el patógeno. → Comienza con el clearance viral.
Produce memoria que ante el segundo ingreso del Ag (no del virus) se producen Ac que hacen que
pueda sortear la etapa de infección (rectángulo celeste del gráfico).

RESPUESTA INTRÍNSECA
- Apoptosis - Silenciamiento epigenético
- ARNmicro (de interferencia). - Sistema CRISPs.
- Sistema APOBEC

1) miARN
Están descritos en plantas e invertebrados, y se cree que
también están en las células de mamíferos, pero no está del
todo comprobado (tienen otros mecanismos de respuesta
entonces no sería necesario su presencia).
Cuando ingresan ARN foráneos (ej. doble cadena) serán
detectados por la enzima DICER (endonucleasa), que corta el
ARNdc en pequeños ARN de 20-40 nucleótidos. Estos serán
reconocidos por el complejo de enzimas RISC (complejo de
silenciamiento inducido por ARN) que abre las mini doble
cadena y las toma como base para guardarlas como templado.
Este mecanismo genera que el ARNm viral sea cortado y las
proteínas virales nunca se expresen.
Tanto en virus ARN o ADN que retrotranscriben.

2) Sistema APOBEC3 y HIV

La enzima APOBEC3 es una deaminasa del ARN (saca grupos
amino) y deamina una citosina (C), que se convierte en uracilo
(U). Es decir que, al hacer la retrotranscripción a cADN se
generará una mutación de una A en el lugar que debería haber
una C, la C se deamina a U cuando se transforma en ARN y
luego cuando ese ARN se copie a la progenie viral, ese U (que
debería transcribirse a una G) va a pasar a A. Esto genera
hipermutaciones en el ADN proviral, lo que se reduce a la
incapacidad de expresar las proteínas virales correctamente.
HIV tiene su contrapartida en respuesta a esta enzima. Hay una
proteína (cuadradito blanco) que se llama VIF (viral infection
factor) que reconoce a APOBEC y genera la ubiquitinación de
esta misma, llevándola a la proteólisis, y así el genoma viral
ingresa y se copia como corresponde.

3) Silenciamiento epigenético
El genoma no tiene
todos los genes
expuestos;
normalmente la
cromatina está
compactada en
histonas y está
deacetilado (lo que
permite que el ADN
esté compactado).
120
Cuando el ADN se “quiere” expresar las acetiltransferasas de histonas lo acetilan, exponiendo los genes
de interés.
Algunos virus, como el citomegalovirus humano, ébola-virus o HIV degradan factores que activan las
deacetilasas con el objetivo de mantener el genoma de la célula acetilado y expuesto (ej: HIV lo hace
para insertarse).

4) CRISPR/CAS
CRISPR = “repeticiones cortas palindrómicas espaciadas por clusters
regulares”. Son repeticiones de ADN especiadas por secuencias
palindrómicas.
CRISPR son secuencias palindrómicas, pero lo importante no es eso
sino el espacio que hay entre esas secuencias: hay ADN que no es
idéntico, cada segmento es único, y coinciden con secuencias de ADN
viral (bacteriófago), y hay genes CAS (genes asociados a CRISPR).
Se descubrió como un sistema de las bacterias E. coli para defenderse
de los bacteriófagos. Los bacterias tienen los genes CAS que codifican
para la proteína CAS con acción helicasa, que abre cadenas de
genoma, y nucleasa, las corta.
Cuando un bacteriófago ingresa su ADN a la célula, el sistema CRISP
reconoce genomas foráneos (inyectados por el bacteriófago), produce
ARN para esa secuencia, produce proteína CAS, que cliva el ARN e impide que comience la infección.
Expresa la proteína codificada en ese pedacito y la guarda como “base de censado”; y cuando ingresa
una proteína igual, la cliva.
En el caso de que ingrese un virus para el cual no haya una secuencia de ADN en el sistema CRISPR ,
el sistema CAS produce una proteína CAS1, que toman genomas nuevos que se incorporan por
infecciones, los copian y los guardan en regiones espaciadoras del genoma de la bacteria (en esas
regiones espaciadoras están todas las infecciones anteriores que tuvo la bacteria), para que ante su
eventual ingreso la bacteria lo pueda clivar (se encarga de clivar el ADN viral y meterlo en el sistema
CRISPR para una memoria futura).
Se usa en biología molecular para clonar y hacer construcciones de interés, y para diagnóstico viral (con
genoma conocido): se hacen cortes palindrómicos (homólogos a una secuencia determinada), en
secuencias conocidas. Al usarlo para diagnóstico el sistema reconoce el genoma viral y lo corta; si se
analiza y está cortado se sabe que en la muestra estaba el virus de interés.
https://www.youtube.com/watch?v=MnYppmstxIs

RESPUESTA INMUNE INNATA

El reconocimiento de Ag está dado por la discriminación
de las células sobre lo que es propio o extraño.
Los Ag tienen patrones moleculares que son
reconocidos como algo externo o no propio = PAMPs
(patrones moleculares asociados a patógenos) → dentro
de la célula son reconocidos por los PRRs (receptores
de reconocimiento de PAMPs), entre ellos los receptores
tipo Toll (TLRs), que son considerados la base del
desencadenamiento de la respuesta inmune innata.
● Si los PRR no reconocen ningún patrón no se
desencadena una respuesta.
● Si los PRR lo reconocen → activación del “estado
antiviral” de la célula, acompañado de la producción
de citoquinas e IFN que conllevan a la activación de
las CPA (dendríticas), y la cascada de complemento.

121
 → Culmina en la activación de la RI innata que incluye: activación del complemento, la producción y
amplificación en cascada de citoquinas e IFN, y la activación de CPA y NK. Todo esto favorece la
activación de la RI adaptativa: reconoce estructuras particulares de los patógenos, produciendo una
expansión clonal de LB y LT con una respuesta final de memoria.

Cascada de señalización
Los PRR mas conocidos son:
- TLR (3, 7, 8 y 9): anclados a
superficie de membrana celular o
internamente en la membrana
endosomal.
- RIG-1: censado de PAMPs de
influenza. Están en citoplasma.
- mda5
- PKR: están en citoplasma.
Qué puede ser un PAMP dependerá del
virus, pero serán proteínas,
glicoproteínas de envoltura o ácidos nucleicos, principalmente el ARNdc (que en la célula normal no
existe).
Cuando los PRRs tengan un reconocimiento, se activan por fosforilación, y van haciendo una cascada
de activación, la cual termina activando a unas kinasas que fosforilan factores de transcripción (IRF3,
IRF5, IRF7, C-JUN, ATF2, NF-Kappa beta). Estos, normalmente se encuentran desfoforilados e
inactivos en el citoplasma, al fosforilarse, se activan, migran al núcleo y hacen de transactivadores de la
expresión de genes que están en el ADN celular, y estos genes que se expresan producen citoquinas
proinflamatorias como IL-6, IL-12, TNF α e IFN. Estos productos egresan de la célula y van a aumentar
la cascada de producción, generan el estado celular antiviral y van a activar células del SI innato.
- Algunas enzimas virales van a inhibir determinada fosforilación de la cascada.

PAMPs virales
● Las glicoproteínas son censadas por los TLR 2 y 4 en la membrana celular.
● PAMPs relacionados con el ARN: las fosforilaciones en 5’ que tienen algunos virus (como
influenza) son reconocidos en el citoplasma por receptores RIG-1.
● Estructuras de ARN de alta complejidad (IRES) son censadas por mda5 en citoplasma.
● Los ARNdc y las regiones ricas en uracilo de ARNsc son reconocidas en los endosomas → del
lado interno de la membrana están los TLR3, TL7, TLR8. Estos pueden activar RLRs (o se pueden
activar directamente por ARN en el núcleo).
● En los ADN (ej: Herpesvirus), no ARN, las islas CpG, que son secuencias seguidas repetitivas de C
y G, son reconocidas en los endosomas y membranas de los endosomas del lado interno por TLR9.
● ADNsc no se sabe si es reconocido o no, o por quién
● ADNdc: AIM2, DAI.
● Virus ADNdc tienen muchas secuencias A-T que son reconocidas por receptores Pol III.

➢ TLR 3 reconoce ADNdc de los

citomegalovirus.
➢ TLR 7 y 8 reconocen ADNsc de HIV y Virus
de la estomatitis vesicular.
➢ TLR 9 reconocen islas CpG de HSV.
➢ RIG 1 detecta Newcastle en aves.
➢ NF-KB interviene en la respuesta de muchos
virus (envueltos y desnudos, como Adeno,
Influenza, Ébola-virus, Retro,

122
 Citomegalovirus, HIV), produciendo IFN y citoquinas proinflamatorias.
Otros receptores: NLR y sensores de ADN, que son los AIM2 y DAI y Pol III que están en el citoplasma
(no se conocen mucho).

Lugares de intervención viral.

Donde dice stop van a interferir en la
producción de IFN, en la transcripción
de genes relacionados con la RI
innata.
Los que tienen el signo ↑↓ lo modulan,
no lo inhiben: pueden sobreexpresarlo
o inhibirlo según le convenga al virus.

TIPOS DE INTERFERÓN
● Tipo 1: IFN α → el más abundante.
● Tipo 2 : IFN γ → el que producen las CPA.
● Tipo 3: IFN 𝝀.
El IFN no actúa por sí solo en las células, lo hace a través de receptores celulares, de la misma célula
en la que se produce o en células vecinas asociadas con proteínas JAK-STAT que se activan por
fosforilación y terminan activando un factor transactivador, que emigra al núcleo y activa factores de
transcripción como ISRE, EAS, más IFN y más citoquinas (lo que dice más arriba).

IFN tipo 1: α y β
La activación del receptor para interferón de tipo I activa la transcripción de varios genes asociados a la
resistencia a la infección viral (en forma parácrina):
- PKR: afecta diferentes procesos en la célula afectando replicación viral (elF-2a inhibe elF-2 que
inhibe la traducción) HBV (fosforila HIV tat)
- 2’-5’ oligoadenilatosintetasa (OAS): ribonucleasa L, que cliva ARN viral.
- Aumenta la expresión de moléculas de MHC clase I.
- Incrementa la citotoxicidad de las células NK y los linfocitos CD8+.
- Promueve la diferenciación de linfocitos T CD4+ naive en Th1.
- Induce el secuestro de los linfocitos en los linfonódulos, maximizando la posibilidad de ser activados
por CPA.

IFN tipo 2: γ
● Producido principalmente por células NK
● Activa monocitos e intermediarios reactivos del O2.
● Activa a la NOS (óxido nítrico sintetasa)
● Estimula la expresión de MHC clase II.

123
TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12
● Favorecen la migración de CD que están en los tejidos censando, y cuando reconocen algo migran a
los linfonódulos para transactivar los linfocitos.
● Interviene en muerte celular (apoptosis).
● Activa monocitos.
● Reclutamiento de leucocitos al sitio de infección: favorece la expresión de moléculas de adhesión
(cuando los neutrófilos pasan a través del endotelio).
● Activación de neutrófilos.
● Síntesis de proteínas de fase aguda.
● Fiebre.
● Aumento de la permeabilidad de los vasos: edema.
● Aumento de adhesividad de células endoteliales.
● Inducen la secreción de más citoquinas por parte de los leucocitos.

Evasión: mimetismo viral → virorreceptores y virokinas

Los virus como contrapartida al SI tienen virorreceptores/viroceptores y virokinas.
Los virorreceptores emulan a receptores celulares: producen proteínas virales solubles que quedan en
el medio extracelular, y actúan como receptores, consumiendo esas IL, ya que quedan reconocidas por
ese virorreceptor (binding protein), y no están disponibles para poder actuar con el receptor celular.

Las virokinas emulan a las citoquinas: interaccionan con el receptor pero tienen algo que no deja que
se active el receptor. Son como citoquinas defectuosas. Bloquean a los receptores, no desencadenan
las respuesta y cuando la citoquina real quiera interactuar con el receptor no va a poder porque va a
estar bloqueado.

Células dendríticas
● Estimulan células T presentando CMH-1 (presente en todas las células) y CMH-2 (solo en CPA).
● Producen IL-12.cu
● Las CD plasmocitoides producen IFN tipo I.
● Las CD inmaduras están en los tejidos y por factores de crecimiento (por las IL e IFN) maduran,
migran a los LN, y tienen una activación por los LT por la producción de IL.

Células NK
● No tienen receptores que reconocen Ag, sino que sensan
los CMH-1 en las células (tienen un receptor que al
interactuar con CMH 1 inhibe el receptor activador).
● Secretan IFN γ y TNF α.

Los virus pueden:

1. Disminuir el CMH 1 (pero no les conviene que disminuya el
CMH porque no serían reconocidos por células NK,
quedando el receptor activador activado en vez de inhibido).
2. Producir un antagonista del receptor activante de la célula
NK (para que quede apagado).
3. Producir inhibición de la expresión del ligando que produce
la célula infectada.
4. Producir viroceptores (citoquina o quemoquina binding
protein) (bloquea la función de la citoquina).
Producir virokinas (citoquina que bloquea el receptor de
citoquina celular).
5. Bloquear el receptor inhibidor de las NK
6. Infectar a las NK.

124
Ejemplo de sensado y detección: VIF tiene las glicoproteínas 120 (interacciona con el receptor y
correceptor y puede ser detectada por PRR de tipo CLR en la membrana) y 41.
- Los retro entran por fusión de membranas, y hay liberación del ARN y transcripción reversa → hay
una exposición de un híbrido ARN-ADN en el citoplasma, que va a ser sensado por PRRs
citoplasmáticos (como mda-5 y RIB-1).
- El ADNdc puede ser sensado por PRRs citoplasmáticos (como ADNr).
- Al ingresar al núcleo hay receptores ADNr que podrían sensar el ADN antes de integrarse.
- Una vez integrado sale ARNm viral del núcleo, que difiere del ARNm celular → puede ser sensado.

¿Cómo pueden interferir los virus en relación a la producción de citoquinas proinflamatorias?

● En la producción:
- Interferencia con la síntesis de las citoquinas o quemoquinas.
- Inhibición de la generación de citoquinas funcionales.
● En la interferencia con la acción
- Homólogos de citoquinas (virokinas).
- Viroceptores de citoquinas solubles.
● En la interferencia con la función efectora: alterando el camino de la activación de las citoquinas.

La inflamación estimula respuestas inmunes potentes! Los virus citopáticos, que causan lisis celular,
promueven el daño celular y de tejidos activando una respuesta innata. Por lo tanto, los virus citopáticos
tenderán a producir proteínas que modulan la respuesta inmune. Ej. Herpes, Pox, Adeno.

Otros virus, por lo general no citopáticos, promueven infecciones más de tipo crónicas, con latencia →
esto no promueve una inflamación potente! La respuesta innata suele ser escasa. No siempre activan
efectivamente la respuesta inmune adaptativa. Ej. HIV, Herpes en latencia, etc.
En las vacunas que no replican se agregan adyuvantes para favorecer la presentación de Ag foráneos y
que se promueva la inflamación-edema celular.

¿Evasión viral de la detección / respuesta intrínseca?

- Establecer ciclos replicativos que minimicen la
exposición de PAMPs.
- Alterar la cascada de señalización que se activa por los
PRRs.
- Interferir con las acciones biológicas de los efectores
directos de las PRRs: IFN 1 y citoquinas
proinflamatorias.

● Cuando entra el virus la proteína N de la nucleocápside

(por ejemplo en rabia) bloquea la trifosforilación en 5’
del ARN para que el RIG-1 no lo reconozca.
● Influenza: la proteína NS1 inhibe la fosforilación de
RIG-1.
● Paramyxo: bloquea la fosforilación del factor MDA-5.
● Rota: la proteína NCP-1 inhibe a nivel de la
fosforilación de los factores transactivadores.

125
PUENTE ENTRE SI INNATO Y ADAPTATIVO
- Está dado por las CD
- Las citoquinas promueven la respuesta TCD4.
- Los virus que producen un perfil más fuerte de IFN tipo 1 y pocas
citoquinas estimulan más una respuesta de tipo TCD8.
- Todos los IFN inducen la expresión de CMH-1 en todas las células, e
IFN ɣ estimula más CMH-2 por parte de las CPA.

Los LTh1 (respuesta humoral) producen citoquinas e interaccionan con

las células plasmocitoides que generan LB activados, que generan las
células plasmocitoides, y estas finalmente producen Ac.

El patógeno es detectado por las 2 CPA

más importantes: macrófagos y CD. Los
macrófagos toman al patógeno y lo eliminan
(ojo con el virus de la fiebre aftosa que
infectan los macrófagos). Las CD producen
citoquinas inflamatorias, IFN y van a
presentarlo al LT naive, y según el perfil de
citoquinas que se produzca van a perfilar
hacia un tipo más citotóxico o humoral.
Las TH17 y las Treg regulan la respuesta.

Vía de presentación de los

CMH:
- Tipo 2 para Ag
extracelulares.
- Tipo 1 para Ag
intracelulares.

126
RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA
Evasión viral a la respuesta TDC8
CMH-1
- Inhibición de la TAP (transportina =
proteína que permite el ingreso de los
péptidos que van a ser cargados en el
CMH), bloqueando el cargado del péptido
en la MHC (ej: adeno, citomegalovirus,
herpes, ébola).
- Mandar el CMH al lisosoma, mediante
proteína NEF → la NEF disminuye la
expresión de CMH-1, porque lo manda al
lisosoma y nunca se llega a expresar en
la superficie celular.
- Proteína TAT de HIV marcan al CMH1 y lo
mandan a proteolisarse.
- Proteínas de ébola-virus inhiben que la
proteína viral citoplasmática se proteolise
y transforme en péptidos para luego
cargarlos.
CMH-2
- Inhibición de la carga de la cadena
invariable del CMH-2 (ej:
citomegalovirus).
- NEF actúa igual que en CMH-1.

Anticuerpos
● Zona de binding (reconocimiento).
● Dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas, conectadas por
puentes disulfuro.
● Región Fc se puede clivar (por la papaína).
● Los extremos de la cadena pesada y liviana que reconocen a los
Ag tienen regiones hipervariables (que reconocen epítopes de
Ag) intercaladas con regiones constantes.

Cuando el organismo ve por 1° vez un Ag hay una respuesta

primaria y luego, una vez que se clarifica el virus, queda una
respuesta de memoria. Ante una nueva incursión de ese Ag, va
a ser más rápida la respuesta y con un mayor título de Ac →
activación de la respuesta inmune adaptativa de memoria.

Frente a una respuesta inmune adaptativa hay una primera

respuesta más rápida de IgM, que son inespecíficos pero con
más avidez para captar más Ag.
La baja en IgM y alta en IgG permite diferenciar una infección
nueva de una vieja.
Los IgG son Ac de alta afinidad.

127
Ac neutralizantes
Los Ac neutralizantes logran neutralizar al virus y previenen la infección y favorecen la recuperación de
la infección. Proveen protección.
Ac antivirales ≠ Ac neutralizantes → Si un animal tiene gran título de Ac no significa que esté protegido.
Si se pudieran ver solo los neutralizantes se puede esperar que el animal esté protegido, pero aunque
se tenga un título alto de Ac neutralizantes, individualmente no está queriendo decir que el animal esté
protegido.

Unión de Ac neutralizantes
1. Neutralizando por agregación de cantidad de Ac en el medio
extracelular.
2. Bloquean la adsorción al receptor celular: Ac neutralizantes
dirigidos al epitope del ligando viral → no hay ligando libre para
interactuar con el receptor.
3. Bloqueando la endocitosis del virus: llega a unirse el ligando al
receptor pero hay tantos Ac recubriendo el virus que la endocitosis no
puede ocurrir.
4. Bloqueando el denudamiento dentro del endosoma, incluso
aunque baje el pH en el endosoma. No se puede liberar el ácido
nucleico → por estabilización de la cápside por parte de los Ac y
porque hay interferencia en la fusión.

Otra forma en la que actúan los Ac neutralizantes en virus envueltos o en células infectadas
● Favorecen la lisis y fagocitosis
mediada por complemento (los Ac lo
marcan y va a actuar el complemento).
● Si el virus llega a infectar, hay Ac que
pueden reconocer proteínas virales
que se expresan en la superficie de la
membrana celular, que en virus
envueltos van a formar la envoltura.
● Las regiones Fc de los Ac hacen que
sean reconocidas y las células son
lisadas o clarificadas mediante
sistemas efectores mediados por Fc
(ej: macrófagos), y por obstrucción,
inhibiendo la liberación del virus,
inhibición de transmisión de virus
célula-célula, sin egresar al medio
extracelular.

Evasión de virus a respuestas de Ac

Drift antigénico
- En mutantes o serotipos virales diferentes, la
mutación puntual y la deriva génica se da en sitios
antigénicos = en proteínas virales que se expresan y
están expuestas frente a la respuesta del SI.
- Si se da en sitios antigénicos reconocidos por Ac
neutralizantes hay un escape a la respuesta inmune.

128
EJEMPLO INFLUENZA: evasión del virus de influenza al SI innato y adaptativo.
- El virus ingresa a la célula y es reconocido por los TLR 2 y 4.
- Entra en forma diferida mediante endocitosis.
- La envoltura viral se fusiona con la envoltura endocítica.
- Se expone su ARN, que es reconocido por receptores como
RIB-1 que están en el citoplasma de la célula, y evitan que el
ARN sea liberado para ir al núcleo.
- A nivel de la activación de PRRs o transactivación de factores
que expresan el IFN está en NS1?, que inhibe el
reconocimiento del ARNsc con fosforilación en 5´ por RIB-1.
- Proteínas como PB1, PB2 o NS1 inhiben a nivel de la
activación de RIB-1.
- NS1 inhibe que se unan factores de activación del factor NFkb.
- NS1 inhibe los ingresos al núcleo de los transactivadores.
- NS1, PB1, PB2 y PA actúan dentro del núcleo de la célula
inhibiendo la expresión del IFN.
- PB1, PB2 y PA secuestran CAPs del ARN celular.

- Influenza A induce la expresión de un un factor llamado SOCS (supresor del señalamiento de

citoquinas), que inhibe la activación por fosforilación del complejo JAK/STAT del receptor de IFN
(interviene luego de que se produjo el IFN).
- La nucleoproteína de influenza se adhiere al complejo p58hsp40. Este complejo se libera y la
nucleoproteína puede inhibir algunos factores pro respuesta inmune (como PKR).
- La proteína M2 (canal de protones del virus) inhibe la liberación del factor p58, porque si el p58 se
libera, favorece la síntesis proteica por parte de la célula. Al inhibirse la síntesis proteica se empieza
a desestabilizar un montón de circuitos y procesos celulares que termina llevando a la apoptosis
celular.

- Influenza puede infectar directamente a las CD.

- La NS1 altera la maduración de las CD, y además limita la respuesta TC8 (citotóxica).
- Influenza puede infectar a las células NK, y regula negativamente la expresión de una cadena de uno
de los receptores de sensado de las MHC1 de las NK.
- La mutación gradual de la HA lleva a la pérdida de reconocimiento por parte de las NK.

EJEMPLO HSV-1: evasión de la respuesta inmune por herpesvirus simplex de humanos.

- Evade por latencia sin modulación.
- También puede modular la respuesta innata.
- Tiene una proteína llamada VHS (virion host shut off) que produce una inhibición de la traducción
para inhibir la producción de IFN.

VACUNAS Y RESPUESTA INMUNE

● Clave de la vacunación: inmunidad poblacional.
● La vacuna busca movilizar el SI del individuo. Esto no quiere decir que si el individuo vacunado se
enfrentara al virus siempre va a estar protegido, ya que depende de la movilización y de cómo y
cuánto hay de esa movilización.
● Lo importante es el nivel crítico de inmunidad → la vacunación rompe la cadena de transmisión (el
nicho de replicación del virus). Es importante el concepto de rodeo/ inmunidad a nivel poblacional.
Se aplica a todos los ámbitos de salud pública.
● Siempre va a haber un % de individuos de la población que no van a estar protegidos (no van a
tener Ac protectores frente al Ag), y si el virus ingresa en la población inicialmente con Ac

129
 protectores, van a estar protegidos en forma indirecta, porque las posibilidades de que el virus
replique son menores.
● La replicación se puede asociar a la mutación del virus. Algún mutante puede sobrepasar la
inmunidad del rodeo y volver a generar un brote. Se debe frenar el lugar de nicho que se le da al
virus para que replique.
● No hay vacunas 100% eficaces.
● Ej: en una población con 95% de individuos vacunados, pueden haber infecciones de individuos,
pero esos están rodeados por otros individuos protegidos, y esos son los que hacen de barrera del
virus y protegen indirectamente a los otros individuos que por alguna razón no están vacunados o no
tienen inmunidad. Si el % de vacunación baja al 90% hay mayor cantidad de individuos contagiados.
Si se baja al 75% hay más contagios todavía.
● Cada vacuna tiene un nivel de inmunidad poblacional mínimo para que no ocurran muchos
contagios.

Tipo de inmunidad
Inmunidad pasiva → cuando se suministra a un organismo algo que me promueva una protección pero
de forma indirecta, como un antisuero.

Ac a partir de plantas
- Infección a partir de plantas ya crecidas.
- Infectar la planta antes de que crezca con los genes que codifiquen para determinado Ac.

Inmunidad activa
- Se busca una respuesta apropiada
- Se busca inducir respuesta: Th1? Th2? citotóxica?
- La presencia de Ac con un título alto no es igual a tener un alto título de Ac neutralizantes (los que
evitan que el virus exponga su ácido nucleico y replique).
- Inmunidad poblacional → hay respuesta frente a la vacuna, pero no se sabe si están protegidos a
pesar de que tengan Ac. Para saberlo tengo que analizar si hay Ac neutralizantes, y para establecer
un valor determinado deberá tener una correlación frente a la prueba de oro de protección
poblacional (prueba in vivo de desafío).
- Vacunas inocuas (que no produzcan la enfermedad contra la que quiero prevenir), duración de la
protección, esterilidad, estabilidad, costo.

Tipos de vacunas
● Vacunas atenuadas: vienen del virus natural, pueden replicar en el animal pero no producen
sintomatología. En individuos inmunodeprimidos se puede complicar. Es importante el concepto de
seguridad.
● Vacunas inactivadas: son muy seguras, requieren de uso de adyuvantes fuertes y suelen requerir
varias dosis.
● Vacunas de subunidades fraccionadas: se produce el virus, se amplifica el virus y se purifican
proteínas del virus. NO confundir con vacunas a subunidades de nueva generación (están clonadas).
● Vacunas clonadas: con un vector vacunal (virus que hace de contenedor de un gen de otros virus =
canarypox → contiene genes que expresan proteínas del virus del moquillo). Es a virus
recombinante.
● Vacunas a ADN: hacer llegar ácido nucleico inyectado, que lo tomen las CPA y que se exprese algo.
● Clonar genes que quiero que se expresen en un sistema de expresión (puede ser bacteriano,
levaduras, células de mamífero), y lo que hacen es expresar proteínas que luego se pueden
ensamblar formando vacunas que contengan partículas similar a un virus (VLPs) o puedo hacer una
vacuna a subunidades.

130
 DIAGNÓSTICO VIRAL
¿Que tiene que tener una técnica diagnóstica? Lo ideal es que sea rápida, sencilla y barata, pero sin
perder dos características:
- Especificidad: que detecte el agente en cuestión.
- Sensibilidad: que detecte incluso poca cantidad del virus que quiero medir.

Muestra: conocer cuál es la muestra ideal, cuándo es el principal momento para tomarla, de dónde
tomarla y cómo remitir la muestra.

¿Cuál es el mejor momento para tomar la muestra?

Cuando el virus entra, hay un periodo que no se
puede detectar, luego empieza a multiplicarse. Ese
momento es el mejor para encontrarlo. Luego la
cantidad de virus cae por la respuesta inmune.
Hay un umbral antes del cual no se va a montar una
respuesta adaptativa si no hay una dosis infectiva
suficiente.

El momento para tomar la muestra dependerá del

tipo de infección que el virus lleve a cabo.

Variantes de ciclos infectivos

1) Una sola infección: hay un periodo
en el cual el virus multiplica, hay
signología asociada o no. El agente
después desaparece. Ej: Rhinovirus,
Rotavirus, Aftosa, Influenza.
2) Infecciones latentes: puede infectar
en forma latente el SN, y a lo largo de
toda la vida hay eventos de
reactivación, en los cuales puede
haber o no signología. Ej:
Herpesvirus.
3) Persistencia: los virus persisten en el tiempo asintomáticamente (o con pocos signos), pero hay
producción de partículas virales. Ej: virus de la linfocoriomeningitis, Virus JC, coronavirus felinos (no
PIF).
4) Persistentes patogénicas: a la larga genera la muerte del hospedador por el deterioro. Nunca se
combate todo el virus. Ej: VIF, VILEF, HIV (humano). Sistema inmune o nervioso deteriorado.

Es Importante saber del virus, del momento en que se puede muestrear y el tipo de muestra. Por
ejemplo, si el virus está en muy bajas cantidades y hay Ac circulantes puede convenir más buscar Ac
que Ag.

Técnicas diagnósticas: detectan=

1) Partícula viral
- Microscopía tradicional: apariencia histológica, cuerpos de inclusión.
- Microscopía electrónica: morfología del virus.
- Propiedades especiales de la partícula: hemoaglutinación, hemoadsorción.
2) Proteína → detección de Ag (directo): inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ELISA, etc.
3) Genoma viral → métodos moleculares: hibridización con probes, reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
131
Aislamiento e identificación
El aislamiento es clave, ya que se puede tener muy pocas partículas virales en la muestra, entonces al
aislarlo se aumenta la cantidad del agente y es más fácil detectarlo.
También la muestra puede tener inhibidores u organismos contaminantes.

La muestra se trata de manera particular y después se pone en una línea celular. Si no se sabe que
agente es se puede usar una monocapa. Diariamente se observa hasta ver efectos citopáticos.
A veces después de cierto tiempo hay que hacer muchos pasajes ciegos (se toma el sobrenadante de
las células y se coloca en una nueva monocapa) hasta que vemos algún efecto citopático en el cultivo.
Los ECP no son diagnósticos de una determinada enfermedad, sólo sirven para saber que hay algo.
Después se puede hacer IF, ELISA, y otras pruebas.

1) Partícula viral
a) Microscopía común y electrónica
- Buscamos inclusiones IC o IN.
- Es sugestivo de una determinada
enfermedad, pero se debe combinar el
diagnóstico clínico con la microscopía.
- Partimos de suponer que está el virus.
- La microscopía electrónica no
identifica qué virus en específico es,
solo la familia.
Foto arriba: se ven CI intracitoplasmáticos eosinófilos en células de
purkinje → Corpúsculos de negri → Rabia.

Influenza: se ven las glicoproteínas de superficie.

Coronavirus: tiene una estructura globular más importante.
Paramyxovirus: se ve que el ácido nucleico helicoidal se eliminó de
la partícula viral.

b) Propiedades especiales de alguna partículas virales

❖ Hemoaglutinación (HA) de GR
- Si hay aglutinación: se ve todo difuminado (halo).
- Si no hay aglutinación: punto rojo al fondo.
➔ Técnicas no específicas, da una idea de que
agente puede ser → NO ES UN DIAGNÓSTICO
CONFIRMATORIO.
➔ No es exclusivo de virus envueltos.
➔ Hay muchas vacunas tituladas con esta técnica.

❖ Inhibición de la HA (IHA): sirven para

que la prueba presente especificidad →
se usa un suero específico para el agente
que se trata de identificar → el Ac se va a
unir a la partícula viral y va a inhibirse la
HA. También se puede testear el suero
del animal (ya se tiene el Ag en el
laboratorio).

132
 ❖ Adsorción: en la monocapa de células que se infectó con el agente viral, si las células expresan
proteínas aglutinantes en la superficie celular, se podría poner en contacto GR con la monocapa
de células infectadas. Esto sí es característico de virus que tienen proteínas hemaglutinantes en la
envoltura y membrana plasmática de la célula.

2) Proteína: detección de Ag utilizando Ac.

a) Inmunofluorescencia (IF)
b) IHQ: es mejor que la IF, puede determinar la predilección del agente viral.
Los Ac poli/monoclonales se compran, viene estandarizado para qué agente qué Ac usar.
Los Ac monoclonales se producen en ratones, se obtienen de líquido ascítico. En un futuro
supuestamente se producirán en células.
En la Argentina no se vende nada de eso, capaz uno secundario (segundas marcas).
c) ELISA: fase líquida - fase sólida. Caseros o comerciales
Se basan en una reacción enzimática, que a partir de la modificacion del sustrato hay un cambio de
color.
- Detección de Ac: fijo en la placa el Ag → se agrega la muestra con los presuntos Ac →
segundo Ac marcado con una enzima + el sustrato → si hubo union Ag- Ac se ve el cambio de
color.
- Detección de Ag: fijo en la placa un Ac + muestra con los presuntos Ag y luego coloco un Ac
marcado contra ese agente para poder visualizar el virus capturado.

ELISA fase líquida: detección de individuos

portadores de DVB para evitar tener animales
persistentemente infectados, donde cualquier
tejido de ese animal libera virus.
Cuando se caravanea se saca un pequeño anillo
de la oreja al aplicar la caravana → el anillo se
mete en un tubo de pvs → se morterean para
liberar más agente viral → se centrifuga → el
pedazo de tejido queda en el fondo → se toma un
volumen de sobrenadante → se pone en contacto
con el Ac de la microplaca → se agrega el resto
de los reactivos y se ve el desarrollo de color →
lector de elisa: desde cierta intensidad de color se
considera la muestra positiva.

3) Genoma viral: métodos moleculares.

Diagnóstico basado en la detección de ácidos nucleicos (ADN / ARN viral). Tipos:
- Con amplificación: la PCR es la más usada por excelencia, permite amplificar una región del
genoma del virus y así detectar mejor.
- Sin amplificación: detección directa de la secuencia de ácido nucleico con una sonda radioactiva o
no radioactiva (métodos basados en hibridización). Southern, northern, dot/slot blot, ISH
(hibridización in situ).
La especificidad de la reacción depende de las condiciones utilizadas: T°, concentración salina, etc.

❖ Hibridización: se fundamenta en la
complementariedad entre una secuencia de
ácido nucleico simple cadena con su cadena
complementaria. Se sabe que a una A se le une
una T, y a una C se le une una G, y así se puede
determinar una secuencia específica de un
133
 determinado agente. Si en una muestra se tiene una secuencia viral, se puede poner en contacto con
una sonda, que puede ser radioactiva o no radioactiva, complementaria a lo que quiero identificar.
Después se saca la sonda y hay que tener una manera de visualizarlo para poder corroborar que esa
secuencia fue identificada.

Varios tejidos de un macaco que fue infectado con un virus

porcino (encefalomiocarditis).
- Se usó una sonda radioactiva.
- Se ven varias células donde el puntillado está probando la
presencia del agente viral.
- Se está detectando genoma viral.
- Orienta hacia el tipo celular que el virus está infectando.
- Se puede hacer una PCR y poner en evidencia que el
tejido estaba infectado por el virus (foto de abajo) →
Como se macera el tejido nunca se va a poder saber de
qué célula vino.

Sonda no radioactiva
Izquierda: está basada en un
sustrato que lleva plata (que se
deposita). Originariamente el ácido
nucleico está marcado con
determinada molécula, que es
reconocido por Ac que están
unidos a una enzima, que con el
sustrato va a producir color.

Derecha: la sonda es sintetizada

con digoxigenina, luego se le
agrega un Ac que lleva adherido
una enzima, que con el sustrato va
a producir color.
Es muy parecido a la IHQ, pero no
se detecta Ag sino el genoma viral.

Posibilidad 2/ Dot / Slot Blots

- ADN o ARN se une
directamente a una membrana
de nitrocelulosa.
- Ideal para muestras múltiples y
cuantificaciones.
- Importante establecer
especificidades.
- Se deposita la muestra a
estudiar en cada wel?, se ensambla, y se le aplica vacío, concentrando la muestra. Luego se toma la
membrana, se trata, y luego se la confronta con la sonda específica para el agente.

❖ PCR (reacción en cadena de la polimerasa): amplificación in vitro de un segmento de ADN

utilizando a la ADN polimerasa.
- Se debe conocer la secuencia a amplificar.

134
 - El templado puede ser ADN o cADN (o sea puedo comenzar con ARN, pero debo convertirlo a
ADN). En retro hay un estadío de doble cadena cuando está como provirus en el genoma de la
célula, entonces se puede aprovechar esa posibilidad. Es más difícil trabajar con ARN ya que se
degrada fácilmente.
- Parámetros a estandarizar: primers, temperatura de annealing y concentración de Mg.
- Existen otras versiones: nested (muy proclive a contaminaciones) degenerada, etc.

Consiste en una reacción de polimerización aprovechando las

características de una enzima que polimeriza, es decir que
completa las secuencias de ácidos nucleicos que están
incompletas. Lo interpreta como algo incompleto ya que en la
reacción se utilizan cebadores o primers (secuencias de ácido
nucleico complementarias a la región que se quiere amplificar).
Hay que determinar un primer izquierdo y uno derecho para
que la reacción ocurra.
Cuando los primers se unen al ácido nucleico viral, la enzima
interpreta que hay un 3’ y que hay que copiar la cadena
complementaria.
La polimerasa completa la secuencia en una dirección y en la
otra. En un primer momento están las moléculas del templado
original, pero luego hay un montón del templado amplificado.
Esa secuencia se va a volver a separar, se va a unir el primer y se va a volver a amplificar esa cadena.
La separación de las 2 cadenas de ADN es dependiente de T°, necesita de una T° de desnaturalización.
La unión del primer al ácido nucleico también requiere de otra T° mucho más baja de 95°C. También se
necesita de una T° donde la enzima se sienta cómoda para hacer la polimerización.

Componentes
● Polimerasa: debe ser termoestable (ya que pasa por 3 temperaturas diferentes).
● Primers.
● dNTP’s: pool de nucleótidos que la polimerasa utiliza para hacer las copias complementarias.
● Cloruro de magnesio.
● Agua.
● Buffer: tiene que tener la presencia de un componente que permita el cambio conformacional de la
enzima durante su trabajo de síntesis. Tiene que haber cloruro de magnesio, sino la enzima no
puede realizar su trabajo (tiene que ver con los cambios conformacionales y la actividad de la
enzima).

2 factores importantes en la reacción

- Especificidad: ¿los primers pueden seleccionar y diferenciar este virus de otros?
- Sensibilidad: ¿cuál es la cantidad mínima de partículas que detecta?

¿Cómo se hace para diseñar un primer que amplifique a todos los

potenciales representantes de ese agente viral? Busco comparar
secuencias / literatura.

¿Será un virus local reconocido por primers diseñados en base a

variantes de otros lugares?
Para saber si los primers que diseñaron algunos autores para un
virus en otro lugar van a funcionar con el potencial virus local se
alinean secuencias, y esto da indicios de cuan conservadas son
estas regiones. Hay que identificar una región que sea común a
todos.

135
Las regiones que no son iguales se colorean de otro color (amarillo y azul). Cuando está totalmente
conservado se ve todo verde.
Si tuviera una secuencia de 20 nucleótidos seguidos me serviría para hacer un primer.
Si en todo el mundo esta secuencia es conservada, lo más probable es que esta secuencia en
Argentina también sea conservada.

Si las regiones no están conservadas → primer degenerado (siguiendo un código)

Puede ocurrir que se quiera amplificar una región que es altamente variable, y no
va a quedar otra que diseñar un primer que involucre regiones en donde hay
cambios.
Cuando la empresa sintetice el primer degenerado, cuando llegue a la posición, en
vez de ponerle una A o una G (ya que no todos tienen esos nucleótidos), se debe
hacer un primer donde algunas versiones tengan A en esa determinada posición y
otros que tengan G. Eso tiene un código (una letra) que le indica a la compañía
que es así.
En este ejemplo la A o G es una R, por lo que le coloca una R se sigue con la
síntesis.
El 50% del primer va a tener una A y el otro 50% una G.

Otros factores para optimizar

- Aumentar la temperatura de annealing (T° con la cual se pegan los primers en la reacción). Con el
aumento de la T° las uniones laxas se van a terminar separando.
- Ajustar la concentración de Mg. Normalmente se usa 1,3 milimolar.

Cabina: para trabajar de manera aislada, para limpiar el ambiente.

Se debe usar solo para el set up: se ponen la polimerasa, buffers, agua, primers
dNTP. Esto se hace por los problemas de contaminación que pueden surgir.
El ADN se agrega en otro lugar del laboratorio.
En el “sector sucio” se corre la prueba.

Etapas de la PCR
1) Desnaturalización: 5 minutos a 94°C (T° de melting). Ayuda a abrir la molécula de ADNdc (viral y
celular) para que los primers se unan.
2) Desnaturalización: 30 segundos-1 minuto a 94°C.
Alineamiento: 30 seg-1 min a 55-65°C → Se baja la T° para permitir que los primers se unan.
3) Polimerización: 30 seg-1 min a 72°C. T° para que la enzima trabaje adecuadamente completando la
cadena de ADN.
4) Elongación: 10 minutos a 72°C. Para terminar cualquier fragmento de ADN que no se haya terminado
de completar.

La segunda desnaturalización ya forma parte del proceso de amplificación.

El 2do y 3er paso se repite entre 30-35 ciclos (tiempo que demora para que se agoten los componentes
de la reacción).

Todo el ciclo de cambios de T° se realiza en un

termociclador (izq arriba). A las 2,5 - 3 hs está
todo listo, y se usa un equipo de electroforesis
para visualizar.
El equipo de electroforesis es una caja donde se
pone un buffer, donde se transmite una corriente
eléctrica desde un polo - a uno +. Se hace a
través de un sustrato (gel de agarosa), donde se
siembra el ácido nucleico.

136
Corren las partículas y se ve con un colorante UV que se ve cuando se mete en el transiluminador. Hay
una excitación por UV de un colorante que se agrega durante la corrida, que se intercala entre los
nucleótidos, permitiendo visualizarlos.
La manera de visualizarlo es a través de bromuro de etidio (es cancerígeno).

Tinción con Bromuro de etidio

El operador tiene que tener protección contra la luz UV (máscara de
acrílico, guantes).

Para saber si anda bien o mal la PCR se puede hacer:

➔ Titulación. El punto de referencia es importante, se puede usar cultivo de tejido o unidad formadora
de placa.

Para aumentar la sensibilidad de la técnica

Arriba se ve la PCR clásica, con un primer
sense/ izquierdo y uno reverse/ antisense/
derecho.
PCR Nested (anidada): cuando termina la PCR,
del mismo tubito se toma unos microlitros y se
pone en otro tubo. Tiene los mismo
componentes que la PCR, excepto el set de
primers, que están dirigidos a una región
interna del fragmento mayor, de la parte
izquierda y derecha. Al hacerlo correr se va a obtener un fragmento más pequeño derivado del anterior.
Hay que correr dos veces la PCR, pero es muy sensible.

Real time PCR

Funciona como una PCR
común. Se agrega un tercer
nivel para garantizar
especificidad, se agrega una
sonda (es un fragmento de
ADN marcado con dos
moléculas en sus extremos,
una que actúa como reporter y
otra como quencher).
Cuando la reacción de
amplificación procede, la polimerasa completa el extremo 3’ que estaba libre del primer y va a producir
el desplazamiento de la sonda que estaba unida al ácido nucleico. Como la enzima tiene una actividad
de 5-3 nucleasa, va a clivar el fragmento a medida que va avanzando. Producto de ese proceso se
libera el reporter y, como deja de estar inhibido por el quencher, el reporter emite fluorescencia.
Se ve a través de un gráfico, no es necesario un gel. En la computadora se ve una relación entre la
fluorescencia emitida con la cantidad de partículas virales.
Ventajas: es mucho más sensible que la PCR común, y como no hay que abrir los tubos se reduce la
posibilidad de que haya contaminación.
Es una técnica costosa, no lo tenemos.

¿Cómo sé que lo que amplifiqué es lo que busco?

1) Hibridación: con sonda radioactiva o colorimétrica para ver si hay complementariedad entre la
sonda y la secuencia que se amplificó. Poco usada.

137
2) Secuenciación: es el mejor
método. Se diluye la banda y
se la manda a secuenciar. A la
empresa se le manda el primer
utilizado. Se hace una reacción
de PCR que va a tener 4
divisiones. En los 4 tubos se
hace la reacción de PCR con el
primer pero se va a agregar en
cada uno un didioxinucleótido
(ddT, ddA, ddG, ddC).
La polimerización sigue pero en
algunas moléculas se mete una
base modificada con lo cual la
síntesis de ADN se frena y
quedan fragmentos cortados a
nivel de cada base de toda la secuencia. Dando una población donde los fragmentos tienen distintos
pesos moleculares y difieren en 1 nucleótido.
Cuando estas reacciones se corren en un gel, van a diferenciarse entre ellas según su peso
molecular por una sola base. Se usa gel de poliacrilamida que tienen un gran poder de definición.
Cada uno de los didioxi tienen un color diferente, entonces en un mismo gel se pueden sembrar los 4
tubos al mismo tiempo, ya que si tienen diferente peso molecular y se separan unos de otro, también
se pueden leer por los diferentes colores. Se obtiene un cromatograf.
Después se compara lo que dio con el banco de todas las secuencias virales conocidas.

3) PCR RFLP para diferenciar subtipos: para saber la cepa, se usan enzimas de restricción que
cortan en una secuencia determinada. Entonces si se cliva o no va a depender de qué cepa sea.
Primero se secuencia para saber si es por ejemplo parvovirus, después se hace este para tipificar.

EJEMPLOS DE DIAGNÓSTICOS
CASO 1
¿Cómo se diagnostica una enfermedad persistente? ¿Se detectan Ac o virus?
Diagnóstico de VIF y VILEF

Virus de la Inmunodeficiencia Felina (VIF)

- Baltimore: grupo VI (ARN monocatenario) diploide
- Familia: Retroviridae
- Género: Lentivirus
- Diferentes subtipos: A-E/F → basados en regiones de la envoltura y gag.

En el interior del virión hay proteasas,

transcriptasa reversa, integrasa y UTPasa. Cada
una tiene su nombre de acuerdo a la
identificación que se hizo originalmente con
respecto a cómo migran en los geles de
poliacrilamida (tiene que ver con el peso
molecular).

Los retrovirus entran como ARN diploide, y

pasan a ser ADN doble cadena por transcriptasa reversa. Ingresan al núcleo, y se integran al genoma
de la célula por la enzima integrasa. Se producen mensajeros de longitud completa, que dan lugar a gag
y pol, y glicoproteínas que van a entrar al circuito vesicular.
138
Curva de Ac
Virus: hay un pico en la producción del
virus, que luego bajan progresivamente
hasta tener ciertos niveles, que van
aumentando progresivamente a lo largo
de la vida del animal hasta llegar a los
últimos estadios en donde se exacerba.
Ac contra gp36 (gp40): es un Ac
bastante confiable que se eleva, y
persiste por todo el tiempo de la
infección crónica, aunque en los últimos
estadíos cae.
Ac contra p24: una vez que pasa la infección viral hay un pequeño pico en la producción, pero
inevitablemente por el desgaste (porque se infectan las células del SI), el SI se va deteriorando, por lo
que a medida que pasa el tiempo va a haber mayor cantidad de virus y menor cantidad de Ac.
Hay que tener en consideración en qué estadío de la infección se encuentra el animal. Es probable que
un solo test no sea suficiente para llegar a un diagnóstico.

Situaciones en las que pueden haber falsos negativos si se hacen técnicas basadas en serología
1) Período agudo, en donde todavía no hubo seroconversión (Ac 2-4 semanas PI).
2) Fase asintomática con bajos niveles de Ac.
3) Fase terminal con depleción de Ac: por deterioro del SI.
● Kit con problema en la detección de Ac → no detecta un amplio rango de Ac contra diferentes
proteínas virales.

Kits diagnóstico
Pueden tener las proteínas p15, p24 y gp40.
- En Australia, NZ, y América del norte
había kits que solo tenían p15 y p24.
- En Europa se comercializaba otra que
combinaba p15, p24 y gp40 → es el ideal
porque tiene las 3 proteínas.
Había animales que iban a dar negativo con el
kit de las 2 proteínas y que resultaban positivo
con el kit de Europa, ya que era mucho más completo.
Cuando se adquiere un kit es muy importante saber qué proteínas tiene, ya que pueden haber falsos
negativos por la proteína que está pegada. .
- Si se usa el witness (que tiene gp40 pegada), le falta la p15 y p24.

¿Cuándo encuentro al agente?

En el periodo de latencia clínica
puede haber cierta disparidad de
resultados: puede haber
resultado positivo por serología y
negativo por PCR, o viceversa →
resultados incongruentes.
Momentos ideales para detección
de genoma: fase aguda y fase
final. Es difícil detectar la fase
aguda, excepto que sepamos que
estuvo en contacto con otro
animal positivo, y hacia el final es
139
muy fácil hacer el diagnóstico por otras vías, pero sirve hacer una confirmación por PCR.

PCR
Se obtiene la fase de mononucleares en
sangre a través de un colchón de Ficoll.
Después de obtenidos los blancos se les hace
una extracción de ácido nucleico. No se
busca el ARN viral, sino el provirus. Se usa
PCR anidada dirigida contra la p24. Esto
aumenta la sensibilidad de la técnica.
Si se quisiera buscar el virus en vez del
provirus se va a tener que extraer ARN y
luego convertirlo en ADN. Buscar el provirus
simplifica mucho más el proceso, y a la hora de dar el diagnóstico es igual.
Con esta PCR se pueden identificar todos los tipos de VIF. Para saberlo debo hacer una secuenciación.
Subtipos: A, B, C, D, E. F no es tan común. Se vio que el que más circula en Buenos Aires es el B, y
también hay evidencias del A.
Esto se hace de la región del gen gag, pero también se puede tipificar con el gen env. Los subtipos son
importantes ya que se suele hablar de subtipos que son un poco más o menos patogénicos que otros, o
subtipos que se asocian más a cuadros neurológicos.

Si da negativo también hay que chequearlo con un

test diagnóstico diferente. También puede ser
negativo porque la infección está comenzando.

Si se empieza haciendo PCR y da negativo también

puede ser falso negativo, ya que no se encontró el
virus o puede que tenga muy bajo nivel de carga
viral y no sea detectable, por lo que si da negativo
se recomienda que se haga el test serológico.

ViLeF
Hay versiones endógenas efectivas, y hay
versiones exógenas del virus. Es un virus
inmunosupresor.
Puede ser que el animal elimine totalmente al
virus y deja una prueba serológica.
En algunos casos hay una viremia transitoria
(largo tiempo) que puede convertirse en una
infección que dura toda la vida del animal. Ahí
se va a encontrar virus circulando, pero puede
ocurrir que de esta viremia el animal termine
en una infección latente, donde si va a estar el
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ácido nucleico, hay Ac, pero en realidad va a costar encontrar los Ag en circulación, y por eso este
estadío de infección latente es más difícil de diagnosticar.
Una opción para la situación de infección latente es utilizar la PCR.

Kit comercial
Detección de Ag p27 (diferencia con VIF que
detecta Ac). Es un problema si se quiere detectar
a los animales latentemente infectados (ya que
no hay Ag en circulación). Se detecta provirus.

La inmunocromatografía correlaciona bastante

bien con PCR (en VIF).
PCR es más sensible para ViLeF que la IC.

CASO 2
¿Cómo diagnostico en mis muestras un virus recientemente descripto? ¿Y si es exotico?
Identificación de Circovirus Canino: brote de gastroenteritis en perros en Argentina. Su veterinario decía
que no creía que era parvo, sin embargo había parvo en todos los tejidos (observación que ya había
sido descripta para ese virus).
Problemática que se presenta con un virus nuevo: se hace la PCR, pero ¿cómo se hace si no se tiene el
control positivo? Se puede contactar un colega que pueda mandar material.
Se procesó la muestra y se hizo la PCR y dió positivo, que se convirtió en el control positivo de todos los
otros testeos que se hicieron.
Circovirus siempre parece estar asociado a otro patógeno (es un agente que empeora el estado de
enfermedad del animal).

CASO 3
¿Cómo diagnostico un virus del que se poco?
1) Me oriento con microscopia: Gammaherpes del perrito de las praderas.
2) Me oriento con la patología/signos: Virus de la enfermedad de Pacheco
(PsHV-1: Pacheco’s disease (PDV), Parvovirus canino en coatí (¿será
igual al canino?)

Diagnóstico del virus de Pacheco por PCR degenerada de herpesvirus → un

sitio de restricción único para este virus: +RFLP → se hace una PCR en
donde se ve el fragmento sin digerir, y el fragmento se digiere con una
enzima de restricción (XHO).
- Se mandó a secuenciar y se corroboró efectivamente que el primer
diagnóstico era correcto.

Coatí infectado con parvo: dio positivo, pero cuando se hizo la secuenciación
se encontró una pequeña diferencia con el resto, que después se caracterizó
con con técnicas en el laboratorio (como la HA). Se pudo concretar que era
un parvovirus de tipo 2c.

CASO 4
¿Cómo diagnostico un virus del que no tengo idea? Se busca qué virus están presentes. Next
generation sequencing (NGS) → es necesario hacer secuenciación de todo el material que se tiene,
para ver si hay algo diferente entre esos animales y otros.

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Virus de Schmallenberg (2012): enfermedad transmitida por un vector.
- Deformidades en ovinos, bovinos, caprinos (articulaciones curvadas, cuello duro sin movimiento,
columna curva…). Estas lesiones las vieron en un número importante de animales.
- Se hizo secuenciación completa del material de estos animales, y se encontró una secuencia que
pertenecía a un virus dentro de la flia bunyaviridae? Suelen ser transmitidos por insectos. Cuando se
encuentra una secuencia única en esos animales, el tema es probar que esa secuencia única está
asociada a un agente que es causante del problema.
- Cuando se hizo en otros animales que tenían el mismo problema, se identificó esa misma secuencia
viral (secuenciando TODO el material), con lo cual se concluyó que ese patógeno estaba asociado
con esta enfermedad.
- No hay contagio entre animal y animal, es vectorizado (los insectos viajan).

El hecho de encontrar una secuencia nueva (haciendo secuenciación de segunda generación, o sea
secuenciación completa de todo el material del individuo), no necesariamente lo hace responsable de
esa enfermedad. Una manera de probarlo es por la presencia del agente en múltiples incidentes que
producen la misma enfermedad, o hacer una infección experimental con el agente (lo que se hizo con
Schallenberg).

Protoparvovirus de gansos - NGS

Se secuencia todo el material. El problema es interpretar los resultados.

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