TRABAJO FIN DE MÁSTER

en
Biología y Tecnología Aplicada a la
Reproducción Humana Asistida

Revisión bibliográfica sobre Diagnóstico

Genético Preimplantacional No Invasivo
frente al Diagnóstico Genético
Preimplantacional convencional

Autor: Rosario Eugenia Lázaro Sánchez

Tutor: Jesús Aguilar Prieto

Villaviciosa de Odón, 2020/2021

ÍNDICE
1. Introducción ............................................................................................................. 1-6
1.1. Historia del DGP .......................................................................................... 2
1.2. Técnicas de Biopsia ................................................................................... 2-5
1.3. Problemática DGP .................................................................................... 5-6
1.4. niDGP-A ....................................................................................................... 6
2. Objetivos…. ................................................................................................................. 7
3. Métodos ........................................................................................................................ 7
4. Resultados .............................................................................................................. 7-18
5. Discusión .............................................................................................................. 19-21
6. Conclusión ................................................................................................................. 21
7. Bibliografía .......................................................................................................... 21-24
RESUMEN

El Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) es una técnica que permite el estudio

genético de los embriones, mediante la obtención de ADN del embrión. Para ello, se
llevan a cabo técnicas invasivas, entre ellas, la más utilizada, es la biopsia de
trofoectodermo entre los días 3 y 5 de desarrollo. Esta es una técnica cara y compleja que
puede afectar a la viabilidad del embrión si no se realiza correctamente. Además, uno de
los problemas principales es la presencia de mosaicismo embrionario, lo que podría llevar
al descarte de embriones sanos o la selección de embriones alterados.

Por ello, en los últimos años están surgiendo nuevas técnicas menos invasivas para la
detección de anomalías embrionarias, basadas en el análisis del “ADN libre” o cfDNA
(ADN libre circulante, por sus siglas en inglés) que se encuentra en los medios de cultivos
como son la blastocentesis y el ni-DGP (Diagnóstico Genético Preimplantacional No
Invasivo). Concretamente, esta última es una técnica totalmente no invasiva en la que se
está haciendo mucho hincapié para demostrar su fiabilidad frente a las técnicas de DGP
convencional.

En este trabajo se ha hecho una revisión bibliográfica con el fin de describir la fiabilidad
de las nuevas técnicas de DGP, en especial el ni-DGP frente a las técnicas convencionales
de DGP. Para ello, se han comparado varios estudios que demuestran los niveles de
concordancia entre los resultados de ambas técnicas.
1. INTRODUCCIÓN

Conseguir un recién nacido vivo sano (RNV) es el objetivo principal de los

profesionales de la medicina reproductiva. En las últimas décadas diversos métodos de
estudio se han desarrollado para lograr este fin. Entre ellas el Diagnóstico Genético
Preimplantacional (DGP) es la técnica más usada en la actualidad para seleccionar
embriones libres de anomalías y mutaciones genéticas antes de su transferencia al útero,
mediante el cual, se biopsian células del embrión y posteriormente, estas células
biopsiadas se someten a una prueba de diagnóstico genético.

Dentro del DGP encontramos distintas variantes dependiendo del tipo de estudio
que se quiera realizar: el DGP-A para detectar aneuploidías, anomalías cromosómicas
numéricas, tanto duplicaciones como deleciones, el DGP-M para detectar enfermedades
monogénicas hereditarias y el DGP-SR para detectar alteraciones estructurales de uno o
varios genes. Además, existe el DGP combinado en el que podemos estudiar varias
enfermedades monogénicas, aneuploidías o alteraciones cromosómicas estructurales,
incluso podemos seleccionar qué embriones son histocompatibles con un hermano
enfermo. Otro tipo es el eDGP, para el estudio de enfermedades genéticas no mendelianas
en el que se involucran varios factores genéticos y epigenéticos, se evalúan trastornos de
penetrancia total o parcial. En los últimos años han surgido nuevas alternativas menos
invasivas basadas en el estudio del “ADN libre” o cfDNA. Estas técnicas son conocidas
como DGP no invasivo (niDGP), del cual existen dos estrategias: la blastocentesis, esta
es medianamente invasiva, o el análisis de los medios de cultivos utilizados durante el
cultivo del blastocisto (5) (Figura 1).

Figura 1. Figura que representa los tipos de DGP.

1
1.1. Historia del DGP
A lo largo de los años el DGP ha ido evolucionando, el tipo de biopsia y el
momento de la biopsia han ido cambiando. Los primeros estudios fueron llevados a cabo
por Gardner y Edwards en 1968. Realizaron un estudio cuyo objetivo era determinar el
sexo de embriones de mamíferos, mediante el cual usando una pipeta holding aspiraron
células del trofoectodermo de embriones de ratón (3). Pero no fue hasta dos décadas
más tarde cuando, gracias a la aparición de la fecundación in vitro (FIV) se realizaron
los primeros avances en DGP y las primeras biopsias de blastocistos en humanos. Los
avances en la mejora del método de biopsia en modelos animales permitieron que a finales
de la década de 1980 se realizaran las primeras biopsias de embriones. Concretamente, se
realizaron biopsias de blastómeras en etapa de escisión, en día 3 de desarrollo, en la cual
se perfora la ZP utilizando ácido Tyrode y posteriormente se obtenían las blastómeras
mediante aspiración. Las primeras biopsias de embriones humanos con resultados
positivos de embarazos y los primeros recién nacidos vivos se realizaron en 1990 por el
grupo de Handyside, en el cual se realizó DGP para pacientes portadores de trastornos
hereditarios ligados al cromosoma X (3).

A pesar de los buenos resultados obtenidos con la biopsia de blastómeras, varios

grupos de científicos se plantearon el estudio de la biopsia de varias células del
trofoectodermo (TE) en día 5 de desarrollo, a partir del cual se podría obtener una muestra
que proporciona más material para el análisis de tejido extraembrionario sin afectar a la
masa celular interna (IMC) que es la que da origen al feto, basándose en los estudios de
Gardner y Edward y en estudios anteriores en blastocistos de ratón y tití (9,16).

Los primeros procedimientos de biopsia de TE eran muy agresivos ya que se

biopsiaban muchas células y era un proceso muy lento por lo que se podría ver
comprometida la viabilidad del embrión, no se llevaron a la práctica clínica hasta años
después cuando se perfeccionó la técnica.

1.2. Técnicas de Biopsia

Basándose en el protocolo de apertura de la zona pelúcida con láser (17) se
perfeccionó la técnica y es la que se utiliza hoy día, para la cual existen dos tipos de
protocolos (1,8).

2
 En el primero, en día 3 de desarrollo se realiza el hatching o eclosión asistida, el
cual consiste en realizar un pequeño orificio en la zona pelúcida (ZP) que puede realizarse
mediante ácido Tyrode o mediante disparos de láser y se deja el embrión en cultivo
secuencial hasta día 5 de desarrollo. En día 5 de desarrollo podemos observar cómo parte
del trofoectodermo (TE) ha salido por la zona donde se realizó el hatching, esas células
que han salido serán biopsiadas mediante un método de tracción de las células o de
movimiento rápido, ayudado de pulsos de láser en ambos casos. Mientras que el segundo
método consiste en dejar hasta día 5 de desarrollo el embrión en cultivo. En día 5 de
desarrollo se perforará la zona pelúcida y se realizará la biopsia de trofoectodermo por el
lado opuesto a donde se encuentre la masa celular interna (MCI) para evitar dañarla (1,8).
Posteriormente, el embrión se vitrificará hasta obtener los resultados del estudio
genético. Este método fue corroborado por el grupo de investigación de Parriego en
2007 (3).

Para el análisis genético de la muestra se han desarrollado una variedad de

métodos. La primera técnica que se utilizó para el diagnóstico genético del DGP fue la
hibridación fluorescente in situ (FISH) mediante sondas marcadas con una secuencia
específica (3). Esta prueba presenta limitaciones ya que el número de cromosomas que
se pueden evaluar es muy limitado debido a la limitación de fluoróforos. Para sortear
esta limitación en 1996 Wells y Delhanty desarrollaron un método citogenético que
permite la enumeración simultánea de todos los cromosomas. Este método se basa en el
microarray de hibridación genómica comparada (CGH) (3). Se considera una técnica
FISH con principios competitivos ya que el ADN de la muestra problema competirá con
el ADN control para hibridar con cromosomas metafásicos. Los cromosomas son
marcados con fluoróforos distintos y posteriormente, mediante un escáner, se puede
identificar dónde se ha producido la hibridación y si se han producido ganancias o
pérdidas de material genético. Las técnicas de arrays de CGH con la aparición de las
tecnologías de secuenciación masiva (NGS) están dejando de usarse. Desde 2013 el uso
de la NGS es cada vez más amplio a nivel global ya que es una técnica que permite
secuenciar un número de bases mayor por experimento. Además, es capaz de detectar
todos los tipos de variaciones genómicas en un único experimento (3). Actualmente, las
tecnologías Illumina y Thermo Fisher son las técnicas de secuenciación más utilizadas
debido a su alta efectividad.

3
 Una vez obtenidos los resultados se hará la transferencia del embrión no afectado/
euploide que pasará por un proceso de desvitrificación. En 2014 el grupo de investigación
de Capalbo propone el protocolo de apertura secuencial de la ZP y posterior biopsia de
TE en día 5-7 sin previa eclosión asistida en día 3 (2).

Por otro lado, a principios de la década de 1990 se realizaron los primeros

estudios sobre biopsia de los corpúsculos polares como alternativa a la biopsia de
embriones. Para ello se produce una rotura de la zona pelúcida y se biopsian los
corpúsculos polares, pero esta técnica presenta limitaciones ya que solo ofrece
información sobre el material genético materno y tampoco se pueden detectar errores
sobre la no disyunción mitótica.

Figura 2. Figura resumen de los procedimiento para un DGP.

Entre 2012 y 2013 se realizaron estudios para demostrar la superioridad de la

biopsia de TE frente a la biopsia en día 3 de blastómeras y se demostró que el potencial
de implantación fue menor en el caso de los embriones biopsiados en día 3 frente a los
embriones que se les realizó una biopsia de TE en día 5 (13). Aunque no se han podido
evaluar los riesgos en embriones humano, se han obtenido resultados en estudios
animales que muestran un mayor riesgo neurodegenerativo, mayor peso corporal y
modificaciones epigenéticas producidas después de la biopsia de blastómeras en día 3
(3). A pesar de estos resultados la biopsia en día 3 de desarrollo se

4
sigue realizando en muchos laboratorios. Sin embargo, la técnica llevada a cabo
actualmente en la mayoría de los laboratorios para la detección de anomalías genéticas es
la biopsia de TE en día 5 de desarrollo.

1.3. Problemática
Pese a ser la biopsia la técnica más usada hoy día para la detección de anomalías
genéticas, en los últimos años se está cuestionando su uso. Uno de los temas de debate
sobre el DGP es la seguridad de la biopsia del embrión, ya que existen riesgos al ser una
prueba de micromanipulación que conlleva una biopsia invasiva.

Otro de los problemas a los que se enfrenta el DGP es la presencia del mosaicismo
embrionario, que se caracteriza por la presencia de dos o más linajes celulares en el
embrión. Ante la presencia de mosaicismo, se pueden formar células euploides y
aneuploides en el trofoblasto. Además, la frecuencia de aneuploidías en el trofoblasto es
mucho mayor que en la MCI, por lo que puede no ser informativo. En estadio de
blastocisto podemos encontrar distintos tipos de embriones mosaicos dependiendo del
linaje celular afectado. (Figura 3)

Figura3. Figura que representa la clasificación de los distintos tipos de mosaicismo. (18)

5
 Por otro lado, es una prueba de alto coste ya que el material y el equipo empleado
es costoso. Además, el personal que realiza la técnica de biopsia debe tener una formación
especial y ser embriólogos experimentados y con una gran precisión para realizarla.

Dadas todas estas barreras a las que se enfrenta la biopsia invasiva del embrión se
han buscado alternativas más económicas y menos invasivas. Los estudios actuales se
centran en la blastocentesis y en la detección de ADN en el medio de cultivo utilizado.

1.4. ni-DGP-A
La blastocentesis es un proceso mínimamente invasivo que consiste en la
obtención de ADN libre que las células han podido liberar hacia el blastocele. Este
proceso se realiza mediante la aspiración del líquido del blastocisto con una aguja de ICSI
por el lado opuesto a donde se encuentra la MCI, dejando al embrión completamente
colapsado (10). Aunque es una técnica prometedora, se necesitan más estudios debido a
que no se ha comprobado suficiente capacidad de reproducibilidad y precisión ya que el
ADN obtenido, en su mayoría, proviene de células necróticas y apoptóticas.

La otra alternativa es el estudio del ADN libre en los medios de cultivo de

embriones (cfDNA), este es un método completamente no invasivo. Se ha comprobado
la existencia de ADN mitocondrial y celular en medios de cultivos de blastocistos.
Actualmente, se desconoce el mecanismo de liberación de ADN embrionario. Un estudio
llevado a cabo por el grupo de Legge en 1995 comprobó que macromoléculas
relativamente grandes son expulsadas al medio a través de la zona pelúcida. Esto es
posible ya que la ZP contiene un alto grado de permeabilidad que permite el paso de
ciertas moléculas, lo que podría explicar la expulsión de ADN al medio.

Los enfoques actuales se centran en el estudio del cfDNA como alternativa al DGP
debido a que no se usan técnicas invasivas y su coste es mucho menor.

6
2. OBJETIVOS
El objetivo principal de este trabajo es demostrar si es posible que mediante el
análisis por NGS del ADN liberado por el embrión al medio de cultivo (cfADN) se pueda
reemplazar a las técnicas de biopsia embrionaria para el Diagnóstico Genético
Preimplantacional.

3. MÉTODOS
Para realizar el presente trabajo, se realizó una búsqueda bibliográfica de artículos
científicos publicados entre 1988 y 2020 tanto de trabajos publicados en español como en
inglés.

Las bases de datos consultadas fueron National Library of Medicine (a través de

PubMed y Medline) y Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America para la consulta de una gran variedad de artículos en revistas científicas
como “Fertility and Steriliy”, “Human Reproduction Update”.

Las palabras claves utilizadas fueron: preimplantation genetic testing, noninvasive

PGT, free embryonic DNA, trophectoderm biopsy, ICSI, culture medium, human
blastocyst DNA.

4. RESULTADOS

En la última década diversos estudios se han centrado en demostrar la presencia

de ADN embrionario en los medios de cultivos con el fin de demostrar que el análisis del
cfADN es un método alternativo de detección de anomalías embrionarias. Fue en 2013
cuando el grupo de estudio de Stigliani se plantearon la hipótesis de que la fragmentación
de blastómeras conlleva la liberación de ADN celular al medio de cultivo. Ellos
demostraron por primera vez la presencia de ADN genómico (ADNg) y ADN
mitocondrial (ADNmt) en el medio de cultivo. El protocolo consistía en recoger, por un
lado, tras la transferencia embrionaria, el medio de cultivo usado y, por otro lado, el medio
de cultivo de embriones vitrificados en día 2 y 3. Posteriormente, mediante cuantificación

7
por PCR cuantitativa, demostraron la presencia, en el secretoma, de ADNmt y ADNg
procedente del embrión en ambos medios de cultivo (15).

Una vez demostrada la presencia de ADN en los medios de cultivos se llevaron a

cabo diversos estudios. Los primeros estudios publicados sobre el análisis de ADN libre
de células en medios de cultivo de embriones vienen de la mano del grupo de
investigación de Shamonki y colaboradores en 2016. El estudio consistió en comparar los
resultados obtenidos tras analizar medios de cultivo usados frente a los resultados
obtenidos mediante biopsia de TE en día 5. Para ello, en día 3 de desarrollo, los embriones
se cambiaron de medio hacia una segunda placa de cultivo y se les realizó la eclosión
asistida con el objetivo de facilitar la biopsia en día 5 y la salida de ADN embrionario
libre. En día 5 o 6 los embriones fueron sometidos a biopsia de trofoectodermo, se
vitrificaron y el TE se mandó a analizar mediante aCGH. Por otro lado, el medio usado
se recogió y se procesó para su posterior análisis mediante aCGH (Figura 4). En este
estudio se utilizaron un total de 57 embriones de los cuales 55 obtuvieron resultados
positivos para la presencia de ADN en el medio, aunque los resultados de amplificación
fueron relativamente bajos. Obtuvieron niveles de concordancia entre los resultados de la
biopsia de trofoectodermo (BT) y del cfDNA muy bajos de apenas un 3,5% (14).

Figura 4. Procedimiento para la obtención de ADN libre en medios usados para FIV. (14)

El grupo de Xu y colaboradores en 2016 realizaron un estudio en el cual utilizaron

42 embriones que vitrificaron en día 3. Posteriormente los desvitrificaron y colocaron en
medios de cultivo hasta llegar a blastocisto. En día 5, se recogió el medio de cultivo y se

8
analizó mediante WGA y secuenciación mediante múltiples ciclos de amplificación
basados en hibridación y bucle (MALBAC) –NGS (Figura 5). Compararon los resultados
del medio de cultivo con el blastocisto y obtuvieron unos niveles de concordancia del
85,7%. Del total de resultados, se observaron 2 falsos negativos. Esto puede deberse a la
contaminación de células maternas del cúmulus en el medio. También se obtuvieron 4
falsos positivos que se asociaron al mosaicismo embrionario, ya que estudios anteriores
demostraron que los embriones tienden a extruir hacia el exterior las células que presentan
errores mitóticos. Este ensayo se aplicó a un paciente con una translocación equilibrada,
del que se obtuvieron 3 blastocistos. Mediante el análisis del medio de cultivo se
detectaron anomalías cromosómicas en 2 de ellos. Posteriormente, se lisó el blastocisto
completo y se analizó; obtuvieron los mismos resultados que mediante el análisis del
medio. De todos ellos, sólo uno de los embriones obtuvo un cariotipo normal. Este se
seleccionó para transferencia y el 5 de marzo de 2016 resultó en nacimiento de un recién
nacido vivo cromosómicamente normal (20).

Figura 5. Diagrama del proceso del ensayo de obtención de ADN de medio de cultivo y de blastocisto. (20)

Posteriormente otro grupo de estudio evaluaron la ploidía embrionaria utilizando

los medios de cultivos usados hasta blastocisto y los compararon con los resultados de
análisis del corpúsculo polar (4). Para ello utilizaron el medio de cultivo de 22
embriones a los que se les hizo biopsia de ambos corpúsculos en día 1 post- ICSI. Tras la
biopsia, los embriones se cultivaron en nuevas gotas de cultivo hasta día 5, momento en
el que se recogió la muestra de medio de cultivo para su análisis. Tanto la muestra de
los medios de cultivo como la de los corpúsculos polares, se analizaron mediante
aCGH. De las 22 muestras de medio de cultivo se pudieron finalmente

9
amplificar 18. De las 18 muestras, en 13 de ellas, se obtuvieron resultados concordantes
de ploidía entre los análisis del medio de cultivo con la biopsia del corpúsculo, lo que
equivale en una concordancia del 72,2%.

En 2018 el grupo de investigación de Ho y colaboradores realizaron un estudio en

el cual querían comprobar si el momento de recolección del medio de cultivo o la eclosión
asistida interfieren en los datos obtenidos al analizar el ADN en los medios de cultivos.
Para ello, utilizaron 61 embriones de los cuales, 41 embriones se cultivaron hasta día 5,
momento en el que se recogió el medio y se les hizo PGT-A al embrión completo. Por
otro lado, de los 20 restantes, a 10 se les realizó eclosión asistida en día 3 y se recogió
muestra de medio de cultivo después de realizar la eclosión asistida (AH) en día 3 y D5
y los otros 10 se cultivaron hasta día 5, se recogió muestra de medio de cultivo en D3 y
D5 y posteriormente se les realizó la eclosión asistida. Posteriormente, a esos 20
embriones se les realizó PGT-A. Se comparó la precisión en la detección de aneuploidías
con el uso del análisis del medio del cultivo en comparación con biopsias de TE y de
embriones completos mediante la tecnología NGS. Comprobaron que en D3 la
concentración de DNA en el medio de cultivo era mayor que en D5, sin embargo, la
calidad del ADN era mayor en D5 versus D3, reflejando una mayor concordancia de
ploidía en D5 (56,3% y 65% respectivamente). Esto sugiere que, en etapa de escisión, la
expulsión de ADN es mayor, pero es mayoritariamente de células anormales. Sin
embargo, conforme avanzan en su desarrollo, los embriones expulsan al medio ADN que
sí reflejan la ploidía real del embrión. Por otro lado, obtuvieron tasas ligeramente
superiores de cfDNA en los medios de cultivos recogidos antes de la realización del AH,
sin embargo, los resultados no son significativos debido al pequeño tamaño de la muestra
(6).

Una vez descrita la presencia de cfDNA en los medios de cultivos, el grupo de

investigación de Vera-Rodríguez y Rubio en 2018 realizaron un estudio para determinar
el origen del ADN libre en los medios de cultivos de embriones. Este estudio combina
análisis cromosómico de ADN de los medios de cultivo, secuenciación de SNP para
identificar la contaminación y análisis mediante FISH, de blastocisto completo, para
determinar mosaicismo. El estudio incluía embriones humanos fertilizados mediante
ICSI, con AH en día 3 y en día 5 se les realizó biopsia de trofoectodermo para análisis de
DGP-A y posteriormente se recogió el medio usado. Se utilizaron 141 muestras de medios

10
de cultivo de los cuales 28 gotas eran de grupo control, medios sin contacto con
embriones, que dividieron en dos grupos: secuenciación de ADN no amplificado (53
muestras de medio usados y 17 medios de muestra control) y secuenciación de ADN
amplificado (60 muestras de medio gastado y 11 muestras de medio control) (19).

Analizaron las muestras de los dos grupos para determinar la cantidad de ADN en
los medios de cultivo y observaron que la cantidad de ADN era mayor en los medios que
habían estado en contacto con embriones que los medios que no habían estado en contacto
(6,7pg frente a 1,4pg). Por otro lado, analizaron si dependiendo del grado de aneuploidía
o el sexo de los embriones las cantidades de ADN variaban y no encontraron diferencias
significativas. (Figura 6)

Para analizar la
concordancia de ADN de los
medios de cultivos usados y del
ADN de biopsia de
trofoectodermo se utilizaron
muestras de 56 embriones
sometidos a PGT-A y se
recolectaron sus medios usados.
Los resultados mostraron un
30,4% de embriones concordantes
(ambas muestras aneuploides), un
60,8% de embriones con presencia
de contaminación materna o
externa y un 5,8% de muestras no
informativas. Debido al alto
porcentaje de muestras con
Figura 6. Diagrama de cajas para la cuantificación de ADN. (19)
presencia de contaminación se
realizó secuenciación por SNP
(solo de autosomas) para determinar el origen del DN libre. Para ello, se analizó ADN
del trofoectodermo, del líquido folicular y del medio gastado. Los resultados obtenidos al
comparar el ADN embrionario frente al materno fueron superiores al 80% en la mayoría

11
de las muestras. Por otro lado, los resultados de ADN embrionario en el medio fueron
muy variantes, ya que se encontraron resultados desde el 0% al 100% siendo la media de
un 8%, lo que podría indicar que el ADN embrionario no está representado de manera
uniforme en el medio de cultivo.

El mosaicismo embrionario también tiene un gran impacto al comparar el ADN

de las muestras de BT y de los medios de cultivo. Para su estudio volvieron a analizar 12
embriones aneuploides completos que previamente se analizaron mediante FISH, 11 de
ellos mostraron un patrón de mosaicismo tanto en BT como para el cfADN y de los 24
cromosomas analizados el 75% concordaban con el análisis de BT y de cfADN. Además,
como estos embriones también se incluyeron en el análisis de SNP se estudió si había
algún patrón que correlacionara la cantidad de ADN embrionario en el medio con el
resultado del FISH. Obteniéndose que, hay mayor porcentaje de ADN embrionario en el
medio, cuanto mayor sea la concordancia entre los medios de cultivos y el diagnóstico
del trofoectodermo.

Uno de los estudios que demostraron una gran fiabilidad del niDGP-A para el
análisis de aneuploidías fue el realizado por el grupo de Huang y colaboradores en 2019.
En él establecieron un umbral de mosaicismo. Utilizaron un total de 52 embriones
desvitrificados que previamente habían sido sometidos a DGP-A y sus correspondientes
52 muestras de medio de cultivo, de los cuales sólo 48 muestras obtuvieron perfiles de
número de copias interpretables (CN) (7). Los resultados demostraron que el niDGP-A es
capaz de identificar tanto embriones euploides (Figura 7) como embriones aneuploides
(Figura 8).

Figura 7. Perfiles embrión A24. Se observan dos perfiles correspondientes al embrión A24, en el eje vertical
observamos el número de copias (CN) y en el eje horizontal los 22 cromosomas autosómicos y los 2 cromosomas

12
sexuales. El perfil de arriba es el usado como referencia (método invasivo) y el de abajo el obtenido tras el análisis del
cfDNA del medio de cultivo (niPGT-A). En este caso ambos perfiles son euploides y varones (46, XY) (7).

Figura 8. Perfiles embrión A14. Se observan dos perfiles correspondientes al embrión A14, en el eje vertical se ve el
número de copias (CN) y en el eje horizontal los 22 cromosomas autosómicos y los 2 cromosomas sexuales. En este
caso, tanto en el perfil de arriba como en el niPGT-A podemos observar varias alteraciones numéricas. 46, XY, -1, +7.
En el cromosoma 1 solo hay una copia por lo que sufre una monosomía del cromosoma 1. En el cromosoma 7 ocurre
algo distinto, hay una copia de más, habiendo un total de 3 copias, este suceso se denomina trisomía del cromosoma 7
(7).

Por otro lado, otro de los grandes problemas cuando se analiza genéticamente un
embrión es el mosaicismo. Los embriones mosaicos son aquellos que presentan células
con diferentes CN para al menos un cromosoma. En la figura 9 se muestra el ejemplo de
un embrión mosaico con un CN no completo para el cromosoma 16, tanto en el perfil
obtenido por análisis de DGP como el obtenido por niDGP.

Figura 9. Se observan dos perfiles correspondientes al embrión A46, en el eje vertical observamos el número de copias (CN) y en el
eje horizontal los 22 cromosomas autosómicos y los 2 cromosomas sexuales. En este caso representa un embrión mosaico, con
diferentes poblaciones celulares. En el perfil superior, en el cromosoma 16 hay un CN no completo de 1.5 lo que significa que la mitad
de las células son diploides y la otra mitad haploides (45, XY, -16q (50%)). Además, en el cromosoma 18 hay una monosomía. Por

13
otro lado, en el perfil inferior aparece un resultado similar detectando correctamente la monosomía del cromosoma 18, y con un
mosaicismo de 1.4 lo que significa que el 40% es diploide y el 60% haploide (45, XY, -16(60%)). Sin embargo, en este perfil aparece
un mosaicismo del cromosoma Y que no aparece en el de referencia (+Y (40%)) (7).

Debido al problema del mosaicismo establecieron un límite para poder identificar

las aneuploidías pese al mosaicismo, fue lo que denominaron el umbral de mosaicismo
(M). Este fue creado para minimizar los FP y los FN. Dependiendo del límite puesto,
habrá más o menos FP y FN. En estudios anteriores Huang y colaboradores demostraron
que estableciendo el límite en 30% no cabía la posibilidad de FN. Sin embargo, en este
estudio demostraron que conforme aumentaba el porcentaje de limitación la posibilidad
de darse un FP era menor. El punto en el cual la tasa de FP era mínima siendo la tasa de
falsos positivos cero ocurría al poner el límite en un 60%, tal y como se refleja en la
figura 10.

Figura 10. Representación de los distintos niveles de limitación establecidos para minimizar los diagnósticos erróneos.
En la figura se observa una gráfica en la que el eje vertical representa el porcentaje de falsos positivos (azul) y falsos
negativos (verde) para los distintos límites de porcentaje de mosaicismo. En el primer límite de 30% no hay falsos
negativos pese a que el porcentaje de falsos positivos sea el más alto. La mejor opción es el límite de 60%, debido a
que el porcentaje de falsos positivos es mínimo y el de falsos negativos sigue siendo 0 (7).

Utilizando el umbral “M” del 60% determinaron la ploidía en las muestras de

medios de cultivos obteniéndose una concordancia del 93,8% al comparar los resultados
del análisis de los medios con el análisis del embrión completo, la concordancia fue de
un 82% al comparar los resultados obtenidos en el análisis de la BT y del embrión

14
completo. Estos resultados demuestran que el niDGP-A supera al DGP convencional con
BT.

En 2019 el grupo de estudio de Rubio junto al grupo Rienzi continuaron sus

estudios y se plantearon un cambio en las condiciones de cultivo para sortear los
problemas de contaminación. Modificaron el protocolo de cultivo de embriones y análisis
de NGS, tanto en la manipulación embrionaria como el momento ideal de recolección del
medio. Además, observaron los resultados clínicos de embarazos donde tenían
información tanto de biopsia de trofoectodermo como del análisis del ADN del medio de
cultivo (11). En cuanto al cultivo embrionario, en D4 realizaron un cambio de medio y
pasaron los embriones a gotas de cultivo de solo 10 µl, cantidad menor a la usada en
estudios anteriores. De esta forma, minimizan la cantidad de medio y disminuyen la
cantidad de ADN degradado en el medio que podría interferir en los resultados. Hasta el
momento de la biopsia no se realiza la eclosión asistida a los embriones, esta se realiza
entre los días 5-7. Inmediatamente después de transferir los embriones a las placas de
biopsia, recogen el medio de cultivo. Con este protocolo pretenden realizar un enfoque
totalmente no invasivo. Un total de 115 embriones se utilizaron para este estudio, de los
cuales se obtuvieron resultados informativos para BT y cfDNA de 108 muestras.
Realizaron el protocolo estándar de NGS para el análisis de aneuploidías para las
muestras BT, sin embargo, para las muestras de medios de cultivo los volúmenes fueron
preamplificados y amplificados mediante ciclos térmicos expandidos para aumentar el
rendimiento de ADN después de WGA (amplificación del genoma humano completo).

Obtuvieron resultados para la concordancia general de ploidía de un 78,7% siendo

significativamente mayor en las muestras de D6/7 respecto a las muestras en D5,
alcanzando valores del 63% en D5 y del 84% en D6/7, lo que aumenta la fiabilidad
respecto a estudios anteriores. Los resultados de falsos positivos (BT euploide - cfDNA
aneuploide) fueron mayores en D5 respecto a D6/7, de 29% y 8,6% respectivamente. El
mayor porcentaje en D5 puede ser por el ADN degradado en el medio. Respecto a los
falsos negativos (BT aneuploide y cfDNA euploide) no se obtuvieron diferencias
significativas siendo del 3,7% para las muestras en D5 y del 2,5% en D6/7. La
sensibilidad de este estudio, proporción de embriones aneuploides identificados
correctamente al comparar la BT y el cfDNA, es de 94,5% y la especificidad, proporción

15
de embriones euploides identificados correctamente al comparar los resultados de la BT
y del cfDNA, es de un 71,7%, alcanzando valores del 82,1% los D6/7. Estos resultados
confirman que cuanto mayor sea el tiempo de cultivo en las condiciones específicas
mayor será su especificidad.

Con respecto a los resultados clínicos, se realizó un estudio doble ciego, las
transferencias de embriones se realizaron en base a los resultados de las biopsias y fueron
transferencias únicas. Se dividieron en dos grupos de estudios: en el primero tanto la BT
como el análisis de los medios el resultado era normal, embriones euploides y se obtuvo
una tasa de implantación del 52,9% y curiosamente no hubo ningún aborto clínico. En el
segundo grupo los resultados de la BT eran normales, euploides, pero los resultados del
análisis del cfDNA informaban de aneuploidía. En este grupo la tasa de implantación fue
menor, de un 16,7% y si ocurrieron abortos clínicos. Estos datos son muy importantes ya
que prueba la importancia del estudio genético de los medios de cultivos, podría usarse
como prueba complementaria a la BT para la detección de aneuploidías, aunque el tamaño
muestral es pequeño, por lo que los resultados no son estadísticamente significativos.

En 2020 el grupo de estudio de Rubio y colaboradores junto a 8 centros de

reproducción asistida de alrededor del mundo realizaron un estudio multicéntrico para
determinar la utilidad clínica del niDGP-A en el cual, evaluaron la concordancia y
reproducibilidad. En total se evaluaron 1301 embriones de 371 pacientes y 467 ciclos de
DGP-A, solo obtuvieron resultados informativos al comparar el cfDNA y la BT de 1108
muestras (12). Las condiciones del laboratorio y de cultivo fueron distintas para cada
centro, aunque todos utilizaron el mismo protocolo específico de recolección de medio
en D6/7 que se aplicó en el estudio anterior, en el cual no había previa manipulación del
blastocisto ni biopsia. La tasa de concordancia de ploidía al comparar los resultados de
BT y de cfDNA para las muestras informativas (866) fue de 78,2%, un poco menos a la
obtenida en el estudio anterior, aunque los resultados entre centros fueron variables entre
un 72,5% y 86,2%. Además, analizaron la tasa de concordancia según la edad materna y
obteniéndose una línea de tendencia significativa conforme avanzaba la edad materna
(Figura 7).

16
Figura 11. Representación sobre la tasa de concordancia entre ambos métodos (Biopsia TE vs niPGT-A) en relación con la edad
materna. (12)

Sin embargo, analizaron la concordancia respecto a la calidad embrionaria, el tipo

de medio empleado y el tipo de incubador y no se observaron diferencias significativas.
(Figura 8)

Figura 8. Representación sobre la tasa de concordancia entre ambos métodos (Biopsia TE vs niPGT-A) en relación con el medio de
cultivo y el tipo de incubador usado. (12)

En cuanto a la sensibilidad global por centro osciló entre un 76,5% y un 91,3% y

la especificidad entre un 64,7% y un 93,3%. Pero se observó, que el centro con mayor
tasa de concordancia obtuvo resultados de sensibilidad y especificidad mayores, un
86,7% y 87,5% respectivamente, lo que podría indicar que si se cumplen los pasos para
eliminar la contaminación se pueden lograr buenos resultados.

17
 Por último, entre los blastocistos considerados como aneuploides por BT (81)
realizaron un estudio comparativo en el que analizaron el ADN de los medios de cultivo
frente a la BT y a la ICM. Obtuvieron resultados informativos de concordancia del 97,5%
para las BT (79/81), 90,1% para las muestras de cfADN (73/81) y del 90,1% para las
biopsias de MCI (73/81). En total, 64 muestras mostraron resultados informativos para
los 3 tipos de muestras. Consideraron los resultados del ICM como el valor más predictivo
de la información genética del embrión, se obtuvieron tasas de concordancia de ploidía
para el cfDNA y para BT de 87,5% y 84,4% respectivamente. Obtuvieron resultados
discordantes para 10 muestras, de las cuales 4 correspondían a un diagnóstico aneuploide
en el análisis del cfDNA mientras que en la biopsia de MCI era euploide y 6 correspondían
a un resultado del análisis del cfDNA euploide mientras que para la MCI fue aneuploide,
esto puede deberse a la contaminación materna en el medio y al mosaicismo embrionario.

Estos resultados que reflejan altas tasas de concordancia multicéntricas evidencian

que siguiendo un protocolo específico el análisis del cfDNA este podría usarse para el
estudio de aneuploidías embrionarias.

Manipulación Tecnología Tamaño % Problemas

previa muestral Concordancias
(n)
(Shamonki et Sí aCGH 57 3,5% N pequeña y
al., 2016) baja
amplificación
del genoma
(Xu et al., Sí NGS 42 85,7% Contaminación
2016) del medio
(Feichtinger Sí aCGH, 22 27% N pequeña y
et al., 2017) MALBAC- contaminación
NGS del medio
(Ho et al., Sí NGS 61 65% N pequeña y
2018) contaminación
de medios
(Rubio et al., Sí NGS, SNP, 141 30,4% N pequeña
2018) FISH
(Rubio et al., No WGA, NGS 115 78,7% Contaminación
2019) del medio
(Huang et al., Sí WGA, NGS 52 93,8% N pequeña
2019)
(Rubio et al., No NGS 1301 78,2%
2020)

18
5. DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos para la presencia de ADN embrionario (15) en el medio
han hecho posible que diversos grupos de investigación hayan centrado sus
investigaciones en demostrar que es posible el estudio del cfADN como alternativa aluso
del DGP convencional.

Las investigaciones se han llevado a cabo, en su mayoría, comparando los

resultados de las biopsias de trofoectodermo (BT) con los resultados obtenidos del
análisis de los medios de cultivo (cfDNA), aunque cada grupo de investigación ha seguido
un protocolo de cultivo y recolección de medios distinto. Se han obtenido datos de
concordancia muy dispares, pero que han ido aumentando conforme se estandarizaban
los protocolos de estudios. Las concordancias han ido desde un 3,5% (14), 85,7% (20),
72,2% (4), 65% (6), 30% (19), 93,8% (7), 84% (11), hasta un 78,2% (12).

Aunque las tasas de concordancia entre el grupo de Xu y colaboradores y del

grupo de Rubio y colaboradores son similares, concretamente, este último estudio aborda
un enfoque totalmente no invasivo ya que en el primero se realizan pasos previos de
vitrificación y desvitrificación de embriones que podrían mejorar la salida de cfDNA. Sin
embargo, este último deja intacto al embrión hasta el momento de la eclosión asistida
previa al DGP.

Uno de los problemas a los que se han enfrentado en general casi todos los grupos
de investigación, ha sido la baja concentración de ADN en el medio para su cuantificación
y la contaminación en el medio. Por lo que fue muy importante conocer el momento
adecuado de recolección del medio de cultivo. El grupo de Ho y colaboradores
demostraron que a medida que los embriones avanzaban en su desarrollo las
concentraciones de cfDNA eran mayores, encontrando concentraciones más altas a partir
del día 3. Sin embargo, la contaminación en el medio era tan elevada que alteraban los
resultados. Por ello el grupo de estudio de Rubio y colaboradores modificaron el
protocolo de recolección y demostraron que cambiando a los embriones de gota de cultivo
en día 4 eliminaban la contaminación materna y externa que interfiere en los resultados.
Por otro lado, modificaron el método de análisis de los medios de cultivos. Hasta ahora,

19
la mayoría de los grupos de investigación usaban para el análisis genético del ADN las
técnicas aCGH o NGS, sin embargo, en este estudio modificaron el protocolo del análisis
de NGS para los medios de cultivo, todas las muestras de medios fueron preamplificadas
y amplificadas por medio de ciclos térmicos extendidos para aumentar el rendimiento del
ADN después del WGA y obtuvieron mejores resultados de amplificación del ADN.
Además, pudieron comprobar que si dejaban los embriones en cultivo hasta el día 6 las
concentraciones de cfDNA eran superiores que sí se recogía el medio en día 5.

Gracias a los avances y la mejora de los protocolos se han obtenido resultados con
altas tasas de concordancia entre los análisis de cfDNA embrionario y las biopsias de
trofoectodermo alcanzando valores del 78,2% (12), por otro lado, la falta de diferencias
significativas entre los 8 centros que colaboraron en este estudio indica su
reproducibilidad en diversas condiciones de laboratorio. Además, las altas tasas de
concordancia del cfDNA con el TE y el ICM pueden sugerir que el cfDNA podría
originarse en ambos compartimentos, lo que abre la puerta a conocer el origen del cfDNA
embrionario que hoy día sigue sin conocerse con seguridad.

Estos avances han llevado a la creación de un test no invasivo de la mano del

grupo Igenomix y el grupo de Rubio, denominado EMBRACE (Embryo Analysis of the
Culture Environment). Este ofrece la posibilidad mediante un método no invasivo,
analizando el medio de cultivo, ver qué embriones tienen más probabilidad de ser
normales, es un método que prioriza la selección de embriones en base a la probabilidad
de ser genéticamente normal, es decir hace un ranking de los embriones.

Entre sus ventajas encontramos que, si seleccionamos primero aquellos embriones

con mayor probabilidad de ser normales, se necesitaran menos transferencias para
conseguir un embarazo evolutivo y por tanto se reducen los riesgos de abortos. Además,
reduce los costes de un ciclo al disminuir el número de transferencias embrionarias.

Para desarrollar este método se han tomado las biopsias de TE como punto de
referencia, ya que es la técnica más establecida en la actualidad. Se han tomado tres
puntos claves para la elaboración de este test. Primero, definir límites de ploidía, aquel
punto donde la concordancia entre BT y el cfDNA es mayor para cada uno de los
cromosomas. Segundo, establecer la tasa de euploidía por embrión en base a la tasa de

20
concordancia con el trofoectodermo. Tercero, establecer una prioridad embrionaria,
aquellos embriones con una tasa elevada de euploidia tendrán prioridad a la hora de la
transferencia.

6. CONCLUSIONES
Los avances recientes en investigación han demostrado la viabilidad y fiabilidad
del niDGP-A. Con la mejora de las técnicas de NGS se ha demostrado la presencia de
ADN embrionario en el medio y que los resultados de su amplificación reflejan la
dotación cromosómica representativa del embrión, obteniéndose altas tasas de
concordancia entre el cfDNA, las biopsias de trofoectodermo y la MCI.

El ni-DGP podría presentar grandes ventajas, no como reemplazo de las técnicas

actuales de DGP, sino como una técnica complementaria que permite un sistema de
priorización de acuerdo al riesgo de aneuploidías embrionarias, lo que conlleva a un
ahorro de tiempo y de costes en los ciclos. Pese a los buenos resultados obtenidos, es
necesario realizar más estudios para comprobar si los resultados pueden mejorar y si el
sistema de priorización puede ser una alternativa aceptable a corto plazo. Para ello el
grupo de Igenomix está desarrollando un estudio prospectivo randomizado junto a 15
clínicas de reproducción repartidas por todos los continentes, en el cual comparan los
resultados de pacientes que se han sometido a transferencia de acuerdo con la morfología
embrionaria frente a pacientes que se han sometido a transferencia en base a los resultados
obtenidos del análisis de los medios de cultivos.

Finalmente, todavía quedan muchas preguntas por responder, entre ellas, conocer
el origen del cfDNA. Aunque se piensa que este puede provenir de los dos
compartimentos del embrión, se necesitan más estudios que lo corroboren. Otras de las
incógnitas que quedan por resolver es conocer por qué el embrión elimina ese ADN al
medio.

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