Tema 3a: El microscopio óptico

1. Introducción

La capacidad del ojo humano es limitada a la hora de estudiar lo pequeño. Hay una inmensa
cantidad de células y microorganismos que influyen significativamente en la vida del hombre y
que, por ello, exigen ser estudiadas en favor de un mayor conocimiento y mejora en la calidad
de la vida. Gracias a los avances y el progreso en el campo de la microscopía, el hombre ha sido
capaz de ver organismos y estructuras que a simple vista serían invisibles y, con ello, efectuar
descubrimientos decisivos en el campo de la microbiología relacionado con las causas de las
enfermedades, el estudio de diferentes patologías mediante el estudio de las células de los
diferentes tejidos…

2. Descripción del microscopio óptico

En un microscopio óptico podemos distinguir entre el sistema óptico y el sistema mecánico.

● El sistema óptico incluye el conjunto de lentes y elementos de manipulación de la

luz necesarios para generar una imagen aumentada.
● El sistema mecánico proporciona el soporte estructural a los anteriores elementos.

Dentro del sistema óptico se incluye un foco (también denominado fuente de luz) que
emite rayos de luz dirigidos hacia la muestra. Antes de llegar a la muestra los rayos atraviesan
un condensador, la función del cual es concentrar los rayos de luz sobre la preparación a
observar. Habitualmente el condensador está acoplado con un diafragma para regular la
cantidad de luz incidente. El siguiente elemento óptico es el objetivo. Esta parte del
microscopio consiste básicamente en un conjunto de lentes que reciben la luz proveniente de

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la muestra y permiten aumentar la imagen observada. Por último, el ocular amplía la imagen
proveniente del objetivo y es a través de él que se puede observar finalmente la muestra.

En cuanto al sistema mecánico hay en primer lugar una base o pie que permite mantener el
microscopio en posición estable. El brazo es la estructura principal del microscopio y conecta la
base con el sistema óptico. El sistema mecánico incluye también la platina, es decir, la pieza
horizontal donde se coloca la muestra. La platina no está conectada de forma fija con el brazo
sino que su posición se puede regular mediante los tornillos macrométrico y micrométrico.
El revólver es la parte del microscopio donde están montados los objetivos, normalmente 3 o
4, y que puede girar para seleccionar el objetivo deseado. Finalmente, el tubo conecta los
objetivos con el ocular.

2.1.Tipos de objetivos

Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones hay dos categorías de

objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En cada
categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersión:

• Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrección
de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son
ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromático cuando
no posee ninguna denominación.

• Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para

el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para dos colores,
el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor diseñados para la
microfotografía en colores.

• Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por

ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro, azul,
rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para
microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos objetivos poseen
mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto puede ser un
inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un poco curvo.

Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta como
curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos, plan-fluoritas
o plan-apocromáticos.

Objetivos secos y objetivos de inmersión:

Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el
cubre-objeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el
medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del
vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de
inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido
cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua destilada

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(n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción (n=1,515) casi idéntico
al del vidrio.

La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la

refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de
la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El empleo de
la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a
la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados y solo puede utilizarse con
objetivos de mayor aumento.

Nomenclatura del objetivo

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 3. Funcionamiento del microscopio

En esencia el microscopio consiste en dos lentes convergentes. La lente más próxima al

objeto se denomina objetivo. La lente más próxima al ojo se denomina ocular.

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 Cuando deseas examinar un objeto debes colocarlo cerca del objetivo, a una distancia
ligeramente superior a su distancia focal. Gracias a la lente del objetivo se forma una imagen
real, invertida, y de mayor tamaño que el objeto. Se trata de una primera amplificación del
tamaño del objeto original. La distancia entre las lentes, L, debe ser tal que la imagen se forme
dentro de la distancia focal del ocular. El ocular, entonces, actúa como una lupa, produciendo
una nueva amplificación de la imagen previamente formada en el objetivo. La imagen final es
invertida, virtual y de mayor tamaño que el objeto original.

Los microscopios ópticos tienen un límite máximo de resolución de 0,2 µm. El poder de
resolución es la distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este límite viene
determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz visible.

Contiene normalmente dos sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El objetivo recoge la

luz que atraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular es el que proyecta la imagen sobre
la retina. El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la
magnificación que produce el objetivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si estamos
usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el
resultado final será de 400x, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando
microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x
junto con oculares de 10x o 15x).

4. Propiedades ópticas de un microscopio

Aumento total:

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 Es la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño real del objeto observado. Dicha
relación viene determinada por el objetivo y el ocular existentes en el microscopio óptico. El
aumento total se calcula multiplicando el número de aumentos del objetivo por el número de
aumentos del ocular.

Poder de resolución:

Se define como la capacidad de una lente para revelar detalles. Y viene determinada por la
distancia mínima a la que pueden estar dos puntos que se siguen viendo separados. Cuanto
menor sea esa distancia, mayor será el poder de resolución.

A esa distancia se le denomina límite de resolución, y depende de la longitud de onda de la

luz utilizada (λ) y de la apertura numérica (AN) del objetivo. Aumentado la apertura numérica
del objetivo disminuye la distancia (d) o límite de resolución. Y cuánto menor sea el límite de
resolución, mayor será el poder de resolución del microscopio.

R=(0,61λ)/AN

Donde:

- 0,61=constante de contraste mínimo.

- λ = Longitud de onda.
- AN= Apertura numérica.

Apertura numérica:

La apertura numérica de un sistema óptico es un número adimensional que caracteriza el

rango de ángulos para los cuales el sistema acepta luz. Se calcula multiplicando el índice de
refracción, del medio existente entre la muestra y la lente, por el seno del ángulo que forman
el eje óptico del objetivo y el rayo de luz más oblicuo que entra por el mismo.

AN= n senα

Para objetivos secos, el índice de refracción es el del aire que los separa de la muestra, y su
valor es 1. En objetivos de inmersión, el medio es el aceite de inmersión cuyo índice de
refracción es aproximadamente 1,5. Si recordamos la relación existente entre apertura
numérica y poder de resolución, veremos que si el índice de refracción aumenta, aumentará la
apertura numérica, y con ello disminuirá el límite de resolución, aumentando finalmente el
poder de resolución.

Profundidad de foco:

Es el espesor máximo de muestra que puede aparecer enfocado. Depende de la apertura

numérica, siendo inversamente proporcional a ella. A mayor apertura numérica, menor
profundidad de foco.

Contraste: Es la propiedad que permite distinguir los elementos presentes en el campo.

Viene determinado por la distinta capacidad de absorción de luz de cada uno de los elementos.
Puede aumentarse mediante tinciones o con diafragmas especiales.

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 Para contrastar preparaciones en fresco debemos cerrar parcialmente el diafragma, tener
relativa poca iluminación, y el condensador debe estar abajo en caso de ser móvil.

Campo: Es el área de la muestra que el observador ve a través de los oculares. Depende de

los aumentos del objetivo utilizado, ya que a menor aumento, mayor campo observado.

Distancia de trabajo: Es el espacio comprendido entre la lente frontal del objetivo y la

superficie de la preparación cuando la muestra está enfocada.

Parafocalidad: Es una propiedad que nos permite pasar de un objetivo a otro sin perder el
enfoque. Es decir, si tenemos la muestra enfocada con el objetivo de 4X, al pasar al objetivo de
10X seguiremos con la muestra enfocada, sin necesidad de tocar lo más mínimo el tornillo
micrométrico.

Paracentricidad: Es una propiedad que nos permite pasar de un objetivo a otro sin perder el
centro del campo observado. Es decir, si tenemos la muestra enfocada con el objetivo de 10X,
al pasar al objetivo de 4X seguiremos visualizando el centro del campo anterior visualizando un
área mayor. Viceversa también funciona, pero hay que tener en cuenta que si pasamos de un
objetivo de 4X a otro de 10X seguiremos visualizando el centro del campo anterior, teniendo
éste un área menor.

5. Tipos de microscopios ópticos

Existen varios tipos de microscopio ópticos que representan modificaciones a algunas de las
características del microscopio compuesto de campo luminoso, que es el que se ha descrito
hasta ahora. Estos son:

- Estereomicroscopios

También se llama microscopio de disección, lupa binocular o simplemente lupa. Se utiliza

normalmente para manipular muestras pequeñas o para observar características que no
requieren grandes aumentos, entre 7 y 40 X de aumentos, aunque pueden llegar hasta 100x.
Pueden observarse las muestras con diferente aumento, lo que se consigue mediante un
sistema de zum o intercambiando objetivos. Al ser binoculares se observan los objetos en tres
dimensiones y tienen una gran distancia focal, es decir, las muestras se sitúan lejos de los
objetivos, con lo que la manipulación es más fácil. La iluminación de la muestra puede venir de
diferentes fuentes, que pueden ser externas.

- De fluorescencia

El microscopio de fluorescencia se usa para observar sustancias fluorescentes

denominadas fluoróforos. Una molécula fluorescente es aquella que es capaz de captar
radiación electromagnética con una longitud de onda determinada y emitir otra radiación
electromagnética con otra longitud de onda diferente, normalmente dentro del espectro de la
luz visible. Los fluoróforos se utilizan como marcadores para la detección de otras moléculas
tisulares, normalmente mediante la técnica de inmunofluorescencia. Los usados en
microscopía absorben en el rango de la luz ultravioleta, normalmente producida por una
lámpara de mercurio, y emiten en el rango de la luz visible. Para seleccionar el rango de
longitud de onda con que serán iluminados se utilizan filtros específicos localizados entre la

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fuente y la muestra que sólo dejan pasar un determinado rango de frecuencias. Con un tambor
de filtros se consigue iluminar la muestra con diferentes rangos de ondas electromagnéticas y
por tanto activar selectivamente a diferentes fluoróforos.

La microscopía de fluorescencia nos permite usar más de un fluoróforo para detectar varias
moléculas tisulares de forma simultánea siempre que los espectros de absorción y emisión de
estos fluoróforos no se solapen (Figura 4), puesto que entonces sería imposible discriminarlos.

Una aplicación más avanzada de la fluorescencia se da en los microscopios confocales, los

cuales permiten eliminar la luz difusa procedente de fluoróforos que están en el tejido fuera
del plano de enfoque. Esta luz difusa, que aparece en los microscopios de fluorescencia
convencionales, provoca una difuminación y pérdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el
microscopio confocal se consiguen imágenes mucho más nítidas y mediante la digitalización y
solapamiento de planos de foco sucesivos se pueden conseguir imágenes tridimensionales.

- De contraste de fases

Esta modificación del microscopio de campo claro necesita de objetivos especiales y se basa
en el ligero retraso que sufre la luz cuando pasa por las estructuras tisulares en función de
su densidad. De esta manera se consiguen diferentes luminosidades para distintas estructuras
tisulares. Se emplea para ver muestras sin teñir o acuosas, así como células vivas, por ejemplo
en cultivos celulares.

- De campo oscuro

La observación en campo oscuro es un buen sustituto del contraste de fase para observar
especímenes sin teñir o medios acuosos. Consiste en la incorporación de un objeto opaco bajo
el condensador, entre la fuente luminosa y la sección de tejido. Este objeto sólo deja pasar
la luz más lateral que incidirá sobre la muestra de forma oblicua y sólo aquella luz que sea
reflejada por la muestra llegará a los objetivos. Allí donde no haya tejido aparecerá obscuro y
distintas densidades o propiedades del tejido reflejarán diferente cantidad de luz.

- De contraste de interferencia y Nomarski:

Este tipo de microscopía aparece sólo en los microscopios más avanzados y supone
tener objetivos especiales. Estos métodos dan a los tejidos un aspecto tridimensional, es decir,
aumentan la profundidad de campo (espesor de tejido que está simultáneamente enfocado, es
decir, que se ve nítidamente). Se basa en el uso de filtros que polarizan la luz, lo cual consiste
en dejar pasar sólo a las ondas electromagnéticas que vibran en un determinado plano.
Posteriormente pasan por un prisma que reagrupa esta luz en elementos separados por una
distancia que es similar al poder de resolución del objetivo que se está usando. Existe un
prisma para cada objetivo. Entonces la luz pasa por el muestra y las diferencias de densidad del
tejido, como los bordes de las células o densidades del interior celular o matriz extracelular,
provocarán alteraciones en la luz que se dirige hacia los objetivos, los cuales transformarán
esas diferencias en cambios en la luminosidad. Todavía existe una lente adicional entre el
objetivo y los oculares que permiten modular la luminosidad aún más.

6. Preparación del objeto de estudio para microscopía óptica.

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 6.1.Estudio “in vivo”

El estudio “in vivo” se utiliza sobre todo con los microscopios de contraste de fase y de
interferencia. Un estudio “in vivo” es aquel que no precisa un tratamiento en el que se maten
las células, como es la fijación o la inclusión.

a) Examen en fresco.
- Preparaciones húmedas: se pone una gota del líquido que contiene las células que
queremos estudiar sobre un portaobjetos y se pone el cubreobjetos con cuidado para
que no aparezcan burbujas de aire.
- Gota pendiente: se utilizan portaobjetos excavados sobre los que se pone el
cubreobjetos, que lleva adherido la gota del líquido que ha de ser observado. Así
podemos observar el movimiento de las células en el medio líquido sin que estén
sometidos a la presión entre portaobjetos y cubreobjetos.
- Examen en fresco con nigrosina: consiste en añadir nigrosina, al objeto de estudio. De
esta forma podemos distinguir bacterias incoloras sobre fondo negro. Se utiliza con el
objetivo de inmersión.
b) Coloración vital.

Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar al organismo. En general no tiñen,
sino que se acumulan en determinadas zonas de la célula. Como colorantes vitales se utilizan el
azul de metileno, el rojo neutro, el rojo congo, el verde Jannus.

La coloración en vivo se puede hacer de dos maneras:

- Por difusión: en el espacio entre portaobjetos y cubreobjetos de una preparación en

fresco, se pone una gota de colorante que penetra en la muestra por capilaridad.
- Mezclando una gota de colorante con el material que ha de ser examinado en el
portaobjeto y colocando luego el cubreobjeto.

6.2.Estudio “in vitro”

Consiste en la observación de células y tejidos muertos. Para ello se realizan una serie de
pasos, como son la fijación, la inclusión, el corte, la tinción y el montaje.

Fijación:

Mecanismo que consiste en matar a la célula lo más rápidamente posible, para permitir que
se mantengan las propiedades fisiológicas y morfológicas del organismo vivo. Hay diferentes
tipos de fijador:

- Físicos: calor (húmedo o seco), frío (congelación rápida).

- Químicos: alcohol metílico, dicromato potásico, formol 10% tamponado…

Inclusión

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener

secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más tenemos que endurecer

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nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias líquidas que
posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán consistentes (ceras). También se puede
conseguir el mismo efecto mediante congelación rápida.

Corte

Tras la inclusión o la congelación se procede a cortar los tejidos, es decir, obtener secciones.
Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de
nanómetros), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesas (mayores a 10
µm). para ello se usan los vibratomos, micrótomos o ultramicrotomos.

Tinción

Para teñir los cortes éstos no deben tener parafina porque si no, no penetraría el colorante.
La parafina se elimina sumergiendo los cortes 15 minutos en xilol. También se elimina el xilol
haciéndolos pasar por alcohol absoluto, alcohol 90º, alcohol 70º y agua destilada. Una vez
teñidos los cortes, se deshidratan.

Montaje:

Añadir medio de montaje y colocar el cubreobjeto. Gracias al medio de montaje, la

preparación se conservará durante mucho tiempo.

7. Uso del microscopio óptico:

Las reglas generales para el uso de microscopio óptico son:

1. Colocarnos en una postura adecuada.

2. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
3. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
4. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición).
5. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya
que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar
alguno de ellos o ambos.
6. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
7. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar
de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el
objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 4.

https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/6-optico.php

Como usar el objetivo de inmersión:

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1. Repetir todos los pasos anteriores hasta que consigamos enfocar la muestra con el
objetivo de 40x.
2. Movemos el revólver de forma que quede a medio camino entre el objetivo de 40x y el
objetivo de inmersión.
3. Subir el condensado de forma que se visualice de forma clara y nítida el círculo que se
ilumina en la muestra. En este círculo será donde pondremos una gota del aceite de
inmersión.

https://www.youtube.com/watch?v=_DZXqPZ7aTc Como usar el objetivo de inmersión.

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