Biología Dr.

Angel Pablo Gutiérrez

Microscopio Optico

A. G.
Biología Dr. Angel Pablo Gutiérrez
Microscopio Optico
Partes del Microscopio Optico
a) Parte Mecánica o Estativo:
 Pie: para sostener y dar estabilidad al instrumento, debe ser lo suficientemente sólido y pesado. La forma es variable dependiendo del modelo.
 Columna o potencia: sostiene el tubo y la platina, contiene normalmente los tornillos macrométrico (de enfoque grueso) y micrométrico (de enfoque fino).
 Tubo: sostiene las lentes ocular y objetivo. Por lo general un microscopio óptico cuenta con 3 o 4 lentes objetivas, las que se organizan en un sistema
giratorio llamado revólver, que permite intercambiarlas. Los aumentos de dichos objetivos suelen ser de 4x - 10x - 40x, y un objetivo de 100x de
“inmersión en aceite” (flecha). El intercambiar los objetivos permite explorar la preparación con distintos aumentos.
 Platina: de forma variable, es una plataforma sobre la cual se coloca el preparado, está perforada en el centro permitiendo que los rayos
luminosos provenientes del condensador incidan sobre el preparado. Sobre la platina existen pinzas que sostienen el preparado, y que se asocian a un
mecanismo que permite movilizar el mismo y así realizar su exploración sistemática.
 Subplatina: consta de soportes para el condensador y en algunos casos allí se ubican dos tornillos conectados con las pinzas que sostienen el
preparado, y que, al girar, lo movilizan en sentido lateral y anteroposterior.

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Distintos modelos de oculares
b) Parte Optica:
 Ocular: es por lo general un sistema de lentes que tiene dos lentes convergentes, una llamada “Ocular”, la superior, por donde se mira, y la otra “Colectora o de Campo”, que recibe los
rayos provenientes del objetivo. Forma una imagen Virtual, Aumentada y Derecha. Existen de diferentes aumentos, x5, x10, etc.
 Objetivo: es también un sistema de lentes convergentes, que forma una imagen Real, Aumentada e Invertida. Ubicado sobre el preparado (la lente mas próxima al mismo se llama
Frontal).
 Aparato de iluminación: consta de los siguientes componentes:
Espejo: recibe los rayos luminosos desde su fuente y los refleja sobre el condensador, por lo general tiene una cara cóncava, que se usa si la luz no es muy fuerte y otra cara plana.
Condensador: concentra y proyecta los rayos luminosos sobre el preparado.
Diafragma iris: está debajo del condensador y regula la cantidad de rayos que entran al preparado.
Aberraciones
“Son defectos en la imagen que se forman como consecuencia de la forma en que los rayos luminosos se
refractan al atravesar las lentes”
 Cromática: Ocurre como consecuencia de que los rayos luminosos que componen la luz blanca
(la misma está formada, en realidad, por la suma de varios colores), se propagan con distintas longitudes de onda
y por ello se refractan al pasar la lente con distintos ángulos de desviación, y en consecuencia los rayos que forman
la imagen no coinciden en un mismo plano. Se forma una imagen borrosa y coloreada que se corrige con el uso de lentes compensadoras:
-Apocromáticas: son de fluorita y corrigen la desviación para tres colores (rojo, violeta y verde)
-Acromáticas: corrigen dos colores (rojo y verde), utilizan vidrios como el crown glass o el flint glass.
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 De Esfericidad: Ocurre por que los rayos que inciden en la periferia de la lente se desvían mas que los centrales, lo cual trae como consecuencia que los distintos rayos no convergen en un
punto del otro lado de la lente. En otras palabras, un punto del objeto no está representado en la imagen por otro punto, sino por un disco, la lente no puede juntar todos los rayos que
atraviesan un mismo punto del objeto en otro punto de la imagen, no puede crear un foco puntual. Se forman imágenes borrosas que se corrigen con lentes correctoras Aplanáticas o
Periplanáticas.
Límite de Resolución – Poder de Resolución – Enfoque
 Poder de resolución:
Es la capacidad de distinguir o percibir los mas finos detalles de una muestra observada, es decir, de distinguir estructuras que se encuentran muy cerca. No puede determinarse
en forma directa y por eso se usa un valor proporcional y que sí puede medirse: el límite de resolución.
 Límite de Resolución:
Es proporcional al poder de resolución, y por lo tanto es una forma indirecta de medirlo. Se define como la menor distancia existente entre dos puntos para que estos puedan ser vistos
como distintos. Cuanto más pequeña sea, mas puntos se podrán ver en la imagen y esta será mas nítida, por lo tanto a menor límite de resolución, mayor poder de resolución.
En el MO es de aproximadamente 0,2 
K= es una constante 0,61

Se obtiene con la siguiente fórmula: LR = k.   = longitud de onda de la luz usada

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AN
AN= Apertura numérica
 Apertura Numérica:
Es un valor que corresponde al objetivo. Es constante para cada lente, y se obtiene por la fórmula:
AN=  . Sen de a
 es el índice de refracción del medio interpuesto entre el objetivo y el preparado, el cual normalmente es el aire, pero puede usarse un medio líquido como el aceite de cedro, que se utiliza
en los objetivos de inmersión.
Cuanto un rayo luminoso pasa de un medio a otro se desvía menos cuanto mas parecidos sean los índices de refracción de dichos medios. Cuando el medio interpuesto es el aire existe una
apreciable diferencia con el vidrio del preparado, pero al usar aceite de cedro (objetivos de inmersión) dicha diferencia se reduce y por lo tanto los rayos se desvían menos y la calidad de la
imagen mejora, ya que entran mas rayos al objetivo.
Sen de a, es el seno del ángulo de abertura, es decir el que se forma entre el rayo luminoso que entra por el centro de la lente y el más periférico, de modo que cuanto mas grande sea,
mas rayos entrarán a la lente y mayor calidad tendrá la imagen.
 AN  LR y por lo tanto mejor imagen y  PR
 Poder de Magnificación: LR usando luz blanca: =0,527  - AN máxima 1,5
Se obtiene multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular, y es una medida
indicativa cuantas veces la imagen se ha magnificado, es decir cuántas veces el microscopio LR usando luz violeta: =0,400  - AN máxima 1,5
aumentó la imagen.
Por ejemplo, si el ocular es de 5x y el objetivo usado es de 40x el poder de magnificación será de 200.
Debe tenerse en cuenta que esta medida depende del aumento proporcionado por las lentes, en cambio el poder de resolución es un valor relacionado a la calidad de la imagen, y depende
de la apertura numérica y de la long de onda de la luz usada. De modo que dos microscopios con igual poder de magnificación pueden tener distinto límite de resolución y generar imágenes
de igual tamaño, pero con distinta calidad.
 Enfoque:
Para que la imagen formada sea nítida es necesario enfocar el preparado. Para cada objetivo existe una distancia fija, que se mide entre la lente frontal del mismo y el preparado, si
dicha distancia no se consigue con exactitud la imagen formada será borrosa. Como primera medida debe tomarse la precaución de colocar el cubreobjetos del preparado hacia arriba,
y luego, con el tornillo macrométrico se aproxima el objetivo al preparado hasta obtener la mejor imagen posible (esto se realiza observando por el ocular), finalmente, con el
micrométrico, se realiza un ajuste de la distancia hasta que la imagen sea perfecta. Es de destacar que el macrométrico realiza un movimiento rápido, en cambio el micrométrico realiza
un movimiento muy lento, casi imperceptible, por lo que con él se consigue ajustar perfectamente la distancia.
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Otros tipos de Microscopios

- Microscopio de Campo Oscuro

Se le llama también ultramicroscopio y es un microscopio óptico ordinario cuyo condensador ha sido modificado para
dirigir la luz a la preparación desde los lados, de tal modo que sólo la luz desviada por los elementos del preparado pasa al
objetivo y se hace visible.
A causa de esta disposición, la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro. La microscopía de campo oscuro hace
posible la observación en estado vivo de partículas y células
Es usada en el estudio de pequeñas bacterias móviles, como el Treponema pallidum, la espiroqueta causante de la sífilis.

El efecto Tyndall se constituye en el fundamento del microscopio de campo oscuro

o ultramicroscopio, y se basa en la reflexión de rayos luminosos que inciden
oblicuamente sobre partículas que de ese modo se vuelven visibles. A. G.
Es el mismo principio por el cual, cuando en una habitación en sombras se filtra
un rayo de luz, pueden verse en el las partículas de polvo como puntos brillantes.

Microscopio de Contraste de Fases

El microscopio de contraste de fase permite observar células sin colorear y resulta especialmente
útil para células vivas.
Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y
en distintas partes de una muestra de tejido.
Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio óptico de campo claro con
algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales. El condensador presenta un disco
que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos, se agregan unos
“anillos de fase”, que son discos transparentes con un diseño en relieve.
La luz, al atravesar objetos con distintos índices de refracción, experimente retrasos (o desfasajes),
sin embargo, estos no son tan notorios como para poder observarlos; el microscopio de contraste de fase,
mediante las dos adaptaciones antes mencionadas, acentúa dichos retrasos, haciendo que zonas con
distintos índices de refracción se traduzcan en una variación de contraste lo cual puede ser observado
de forma que las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen y las
partes claras a porciones menos densas.
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- Microscopio de Interferencia:
Presenta un dispositivo de desdoblamiento de haces luminoso, (un espejo semirreflector), uno de los hacer resultantes atraviesa el objeto, y el otro lo evita (haz de referencia). Cuando se juntan los
dos haces en condiciones adecuadas, se originan interferencias y se obtienen en la imagen variaciones de intensidad o color. Proporciona datos cuantitativos, por ejemplo, permite calcular la masa
por unidad de superficie.

- Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC):

Utiliza dos rayos de luz polarizada, que se combinan en un proceso de interferencia para formar las imágenes. Estas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue
diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales.
DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases.

- Microscopio de Fluorescencia:
Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten
luz de otra longitud más larga. La inten-sidad y el color de la luz emitida es una propiedad
característica de la molécula fluorescente utilizada (fluorocromo).
Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente
que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de
onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la
muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la luz emitida
por el fluorocromo, y solo deja pasar esa longitud (los elementos fluorescentes aparecen
brillantes sobre un fondo oscuro o poco iluminado).
En el microscopio de epifluorescencia la luz procedente de la fuente
(lámpara de mercurio o xenón), atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda
capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. Esta luz se refleja en un
espejo co (o dicroico e incide sobre la muestra, excitando al fluorocromo, el que emite
fotones de una longitud de onda mayor que la incidente. La luz emitida por la muestra no se
refleja sino que atraviesa el espejo dicroico y llega a un segundo filtro que selecciona la
longitud de onda de emisión del fluorocromo. Finalmente, la luz ingresa a un fotomultiplicador
que la convierte en una señal eléctrica.

Pueden acoplarse colorantes fluorescentes a determinados anticuerpos específicos

para algunos componentes celulares y así identificarlos selectivamente
(inmunofluorescencia), o bien pueden marcarse algunas proteínas con colorantes
fluorescentes y microinyectarlas en células vivas, lo que permite seguir su destino en
dichas células, por ejemplo puede marcarse tubulina y luego inyectarla en células
que se están dividiendo para ver cómo evolucionan los microtúbulos

- Microscopio de Luz Ultravioleta:

El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para mejorar el
detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda de la luz UV, los elementos ópticos de estos
microscopios están hechos con cuarzo. Además, la radiación UV es invisible, y puede dañar la retina, por ello la imagen se muestra en una fotografía. El método sirve para detectar ácidos
nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos, etc.
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- Microscopio de Barrido Confocal:
El sistema óptico del microscopio, generalmente fluorescente, no ilumina toda la preparación a la vez, sino que en cada momento solo ilumina un pequeño punto a una cierta profundidad de la
muestra. Para ello se necesitan fuentes luminosas de gran potencia, habitual-mente haces láser, cuya luz pasa a través de un diafragma. La luz fluorescente emitida por la preparación se recoge y
produce una imagen a la entrada de un fotodetector adecuado. Se coloca un diafragma en el detector, en el lugar que es confocal con el punto luminoso, que es precisamente donde los rayos
luminosos emitidos por el punto iluminado de la muestra quedan enfocados. La luz que procede de ese punto penetra en el detector, mientras que la que procede de otras regiones de la muestra
queda fuera de foco en el diafragma y no es detectada. La muestra es barrida por el punto luminoso y en base a la información obtenida se genera una imagen tridimensional del espécimen.
Microscopio de Barrido Confocal

Microscopio de
Luz polarizada

A. G.

- Microscopio de Luz Polarizada:

El microscopio de luz polarizada usa dos filtros polarizadores (Prisma de Nicol). El primero de ellos, el polarizador, genera un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano y que se hace
incidir sobre la muestra. El segundo, denominado analizador, se encuentra entre la muestra y el ocular. Cuando ambos polarizadores se encuentran cruzados, la luz generada por el primer
polarizador queda
bloqueada. Cuando la luz polarizada atraviesa una estructura cuyo índice de refracción es el mismo en cualquier dirección, la velocidad de la luz es la misma en cualquier dirección, y el rayo no se
desvía, se dice que esa estructura es isótropica o monorre- fringente. Pero cuando al atravesar un cuerpo, la velocidad de propagación de la luz no es la misma en todas las direcciones, la luz
incidente se divide en dos rayos diferentes, uno que mantiene la dirección original y otro que vibra ortogonalmente con respecto al primero, estas estructuras son birrefringentes o anisotrópicas.
En el primer caso toda la luz emergente es detenida en el analizador, pero en el segundo caso el rayo desviado puede pasar y las estructuras birrefringentes se observan iluminadas.
Este tipo de microscopio se usa para poder identificar elementos fibrosos (citoesqueleto), colágeno, queratina, etc.
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Microscopio Electrónico
 ME de Transmisión:
La fuente de energía es un haz de electrones, y las lentes son reemplazadas por bobinas electromagnéticas. El poder de estas bobinas puede modificarse alterando la corriente eléctrica que
las atraviesa. El microscopio consta de una columna cilíndrica hueca, en cuya parte superior se sitúa un filamento de tungsteno, que al calentarse actúa como un generador de electrones,
dicho filamento, además, se comporta como un cátodo. Los electrones son acelerados mediante un ánodo, al que atraviesan, y forman un haz que es enfocado por una serie de bobinas
electromagnéticas colocadas en la columna del ME. Dichas bobinas electromagnéticas son potentes electroimanes capaces de enfocar el haz de electrones como las lentes enfocan la luz.
Es de destacar que cuando los electrones viajan en el vacío tienen una trayectoria ondulatoria, cuya longitud de onda depende de su aceleración, la cual se logra aplicando voltaje al
microscopio, dicho voltaje varía entre 10.000 a 100.000 V, y por ejemplo a 60.000 V la  del electrón es de 0,05 Å. La primera de dichas bobinas se llama “Condensadora”, y enfoca el haz sobre
el preparado, se forma una imagen como consecuencia de que algunos electrones son retenidos o desviados por los distintos componentes de la muestra y otros logran atravesarla, dicha
imagen es tomada por la segunda bobina “Objetiva”, que la amplia, y por una tercera “Ocular o Proyectora” que también la aumenta y luego la proyecta sobre una pantalla fluorescente.
De modo que la formación de la imagen es consecuencia de la llamada dispersión diferencial de electrones que se genera cuando el haz de electrones atraviesa la muestra, en tal situación
algunos electrones son desviados por componentes celulares y no son captados por la bobina objetiva (dispersión), en cambio los electrones que logran atravesar la muestra impactan sobre una
pantalla fluorescente y generan la imagen. Las preparaciones de ME se tiñen con soluciones de metales pesados, lo que logra que algunas estructuras celulares sean mas densas y por lo tanto
provoquen una mayor dispersión, mejorando la imagen.
Las bobinas aumentan la imagen como lo hacen las lentes y variando el voltaje suministrado a la mismas, puede modificarse su amplificación. Como los electrones solo se desplazan en el
vació, dicho microscopio funciona sellado al vació. Se requieren cortes muy delgados para que puedan pasar los electrones. Y su límite de resolución se ubica entre 3 a 5 Å

 ME de Barrido (Scanning Electrón Microscope – SEM –):

Este microscopio tiene una tremenda profundidad de foco y consigue imágenes tridimensionales
de la superficie de la muestra.
La muestra se fija, se deshidrata por una técnica especial (secado hasta el punto crítico), que impide
que se generen daños en la misma, y luego se recubre con una capa de carbón y metales pesados.
Ahora la muestra es barrida por un haz focalizado de electrones, que cuando golpea el material
genera otro haz secundario, formado por algunos electrones reflejados y otros liberados por el tejido
cuando es golpeado por el haz primario.
Dicho haz secundario es recibido por un detector, que permite la formación de la imagen.
Dicha imagen se observa como un modelo tridimensional de la superficie de la muestra.
De manera que en este caso los electrones no atraviesan el tejido, y la imagen es una consecuencia
de la forma en que el haz secundario se refleja a partir de las irregularidades de la superficie de la
muestra. Si bien tiene un límite de resolución de solo 10 nm, tiene una gran profundidad de foco,
lo que permite que las imágenes sean característicamente tridimensionales (de superficie).

A. G.
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Cuadro comparativo entre Microscopía óptica y electrónica

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