Exmenes en fresco

Los exmenes en fresco permiten visualizar los microorganismos sin necesidad de fijarlos ni teirlos, y por tanto vivos. Los microorganismos en general no presentan demasiado contraste respecto al medio que les rodea. A pesar de ello es posible verlos sin necesidad de teirlos gracias a la refringencia que despiden y sobre todo a su capacidad de movimiento en medios lquidos.

La visualizacin de bacterias en fresco puede realizarse mediante la tcnica de la gota pendiente. Consiste en colocar una gota de la solucin con la bacteria en suspensin en un cubreobjetos que se coloca invertido sobre un portaobjetos excavado. Con el objetivo de 40 aumentos pueden detectarse las bacterias en movimiento por la refringencia que desprenden. Es una tcnica que apenas se utiliza en el diagnstico microbiolgico, porque ofrece muy poca informacin en cuanto a la estructura y composicin de las bacterias. Solamente puede tener utilidad en la comprobacin de la motilidad de los microorganismos. Los exmenes en fresco si constituyen un arma potente de diagnstico en las infecciones producidas por parsitos intestinales. Pueden detectarse huevos, quistes y trofozoitos que por sus caractersticas morfolgicas pueden generar por si solas un diagnstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse antes de realizar la preparacin en fresco con el fin de aclarar y concentrar los parsitos. Las infecciones producidas por Tricomonas vaginalis, un protozoo flagelado responsable de infecciones urogenitales, tambin se diagnostican mediante la visualizacin en examen en fresco directo del exudado uretral.

Tinciones

En muchas ocasiones la visualizacin en fresco es completamente insuficiente para distinguir a los microorganismos. Se hace necesario aumentar su contraste respecto al medio donde se encuentran. Para ello se utilizan las tinciones, que posibilitan la observacin de la cantidad, tamao, morfologa y disposicin relativa de los microorganismos.

Las tinciones suponen la muerte de los microorganismos. No puede detectarse la capacidad de movimiento en las preparaciones teidas. Todas las tinciones tienen un paso previo de fijacin al portaobjetos que se realiza con calor o con lavado en alcoholes (metanol). A continuacin se aplican sustancias coloreadas que tien la superficie de los microorganismos. Las tinciones se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien diferenciales cuando usan ms de uno y tien de forma especfica distintas estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las ms utilizadas ya que ofrecen ms informacin diagnstica. Todas las tinciones tienen el mismo esquema de realizacin. Pueden variar los colorantes, los tiempos de exposicin o las tcnicas de fijacin: Extensin. Consiste en obtener una pelcula fina de la muestra sobre el portaobjetos. Si se parte de medio lquido simplemente se extiende una pequea gota. Si se trata de una colonia nos ayudaremos de suero fisiolgico estril. Fijacin. Tras secar el porta las bacterias deben adherirse al cristal. Debe intentar conservarse lo ms posible las estructuras nativas del microorganismo. Puede utilizarse calor (flameado), o bien alcoholes.

Coloracin. Aplicacin de los colorantes. Su eleccin depende del tipo de tincin. Es necesario controlar la concentracin y el tiempo de exposicin para que los microorganismos suficientemente claro queden suficientemente teidos y el fondo

Lavado del exceso de colorante con agua. Tras el secado est listo para ver en el microscopio.

Tincin de gram
A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tincin de gram es la ms utilizada en el diagnstico microbiolgico. De hecho la informacin que ofrece relativa a la composicin de la pared bacteriana es la base de todas las taxonomas en este reino. Se trata de una tincin diferencial que distingue entre bacterias con pared gruesa (gram positivas) y bacterias con pared fina y membrana externa (gram negativas). La mayora de las bacterias presentan una de estas dos morfologas generales.

La tincin de gram utiliza violeta de genciana como colorante primario. Tras su aplicacin todos los microorganismos se tien de violeta. Despus el lugol acta como mordiente, acentuando la penetracin del colorante primario. El tercer paso consiste en la aplicacin del decolorante, una mezcla de alcohol y acetona que elimina el violeta excepto en las bacterias con pared gruesa. Por ltimo el colorante secundario o de contraste, la safranina, tie de rojo las bacterias decoloradas, es decir las de pared fina. En resumen las bacterias gram positivas quedan teidas de violeta y las gram negativas de rojo.

Tincin de Ziehl-Neelsen

Tambin

es una

tincin

diferencial. Se denomina

tincin

cido-alcohol

resistente y es especfica para una serie de bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no est basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en cidos miclicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloracin con cido y alcohol que no se produce en casi ningn otro tipo bacteriano.

La tincin de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tie toda la preparacin de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparacin con el colorante. La solucin decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos cido alcohol resistentes. (BAAR). Por ltimo el azul de metileno tie de azul el resto de la preparacin. Esta tincin es til en la deteccin de bacterias del gnero Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnstico casi definitivo de tuberculosis.

Tincin de esporas
Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecacin, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas. Slo algunas bacterias son capaces de formar esporas y esta caracterstica puede en algunos casos orientar el diagnstico.

Estn descritos varios mtodos para teir esporas. Quizs el ms utilizado sea el de Wirtz-Conklin o tincin con verde malaquita. Este colorante se une fuertemente a las esporas gracias a la utilizacin de calor como mordiente. La fase de decoloracin en este caso se realiza con agua abundante. Las formas vegetativas pierden el color verde y se tien con el colorante de contraste (fucsina o safranina). La deteccin de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes para la clula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca la esporulacin de las bacterias. La presencia de esporas en el mbito clnico no dirige hacia los gneros Clostridium y Bacillus. Algunas esporas se desarrollan sin deformar a la clula vegetativa. Otras si lo hacen y generan segn la disposicin formas centrales o terminales (palillo de tambor). La posicin relativa y la morfologa de la espora constituyen caracteres taxonmicos en las especies de ambos gneros.

Tincin negativa de cpsulas

La deteccin de cpsulas en las bacterias tambin puede orientarnos en el diagnstico de laboratorio, y es especialmente importante en el diagnstico de meningitis producida por Cryptococcus neoformans.. Se trata de una levadura que provoca graves cuadros de meningitis en personas inmunocomprometidas, y su deteccin en LCR lo ms precozmente posible es vital para la supervivencia del paciente.

La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencillsima, consiste en colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cpsula sin color. Existen otras tcnicas de tincin que ponen de manifiesto ms estructuras bacterianas. Es el caso por ejemplo de las tinciones de flagelos. No obstante no tienen demasiado inters desde el punto de vista del diagnstico, y suelen realizarse ms a menudo en investigacin bsica.

Las partes de un microscopio Los dos sistemas de lentes de un microscopio ptico compuesto se denominan lente objetivo, la que est mas cercana al espcimen, y lente ocular, que est en la pieza del ocular del microscopio. Los microscopios modernos llevan la fuente de luz incorporada. En la Figura 3.6se puede observar el recorrido de la luz desde la f'uente luminosa, en la base del microscopio, hasta el ojo del obsenador. La luz pasa frecuentemente a travs de un filtro azul (para eliminar Iongitudes de onda largas) y a travs de otra serie de lentes que constituven el condensador. El condensador tiene

como funcin dirigir la luz sobre el espcimen, donde parte de la misma es absorbida y parte difractada. La luz transmitida entra en la lente objetivo, que forma una imagen en el tubo del microscopio. Posteriormente la lente ocular aumenta la imagen y la proyecta en la ltima lente de la serie la de nuestro propio ojo. El ojo forma una imagen en la retina y el cerebro la percibe. Un microscopio compuesto ordinario proporciona una iluminacin de campo claro. Esto es debido a que el condensador dirige la luz a travs del espcimen, y el fondo queda iluminado de forma brillante. Los microscopios compuestos pueden ser modificados para ver un espcimen mediante (1) contraste de fases, (2) campo oscuro, (3) fluorescencia, o (4) por contraste diferencial de interferencia (Nomarsky); todos estos mtodos se describirn ms tarde.

Poder total de aumento Casi todos los microscopios compuestos poseen varias lentes objetivos, cada una con un poder de aumento diferente. Normalmente, existe una lente de bajo poder (objetivo dbil seco) que aumenta un objeto 10 veces (l0x), una de alto poder (objetivo fuerte seco), que aumenta 40 veces (40x) y el objetivo de inmersin, 100 veces (l00x). Casi todas las lentes del ocular proporcionan un aumento adicional de 10 veces (l0x). Se puede calcular el poder total de aumento de un microscopio multiplicando cl aumento que proporcionan las dos lentes, objetivo y ocular, en uso. (Vase la Tabla 3.1, en la cual se incluyen tres ejemplos.) Si se desea observar la apariencia general de un espcimen es recomendable usar un objetivo de bajo poder, porque su campo de visin es grande. El objetivo de inmersin tiene un campo de visin pequeo, pero proporciona mas detalles de la imagen (Figura 3.7). Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en un microscopio ptico, una preparacin especial; esto es debido a que poseen poco contraste natural. La preparacin y la tincin (tratamiento con colorantes) de un espcimen son fundamentales si se desea obtener buenas imgenes. Muchas dcadas de esfuerzos y errores han conducido a mtodos generales de preparacin que resultan idneos. A continuacin describiremos la observacin en fresco de microorganismos vivos y varios tipos de tinciones.
Tabla 3.1. Aumento Total Microscopio Microscopios pticos Debil seco Fuerte seco Aceite de inmersin Lente objetivo 10x 40x 100x x x x Lente ocular 10x 10x 10x = = = Ampliacin total l00x 400x 1000x

Microscopios electrnicos Transmisin (MET) Barrido (MEB)

~200000x ~10000x

Figura 3.6 El camino de la luz en el microscopio compuesto. La luente de luz est en la base. El condensador enfoca el haz de luz sobre el espcimen, donde parte se absorbe, parte se refracta, y parte se transmite. La luz transmitida penetra en la lente objetivo, que aumenta la imagen. El prisma hace que la imagen se forme en el tubo del microscopio, haciendo la visin ms cmoda. La lente ocular vuelve a aumentar la imagen y la enfoca en el ojo. 3.1.4 Preparaciones en fresco La forma ms simple de preparar un espcimen para su examen microscpico es hacer una preparacin en fresco. Existen dos tcnicas, una preparacin en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuacin

cubrirla con un cubreobjetos. Una preparacin en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubrindolo con un portaobjetos (invertido) con una excavacin central (portaobjetos excavado) (Figura 3.8). Hay que sellar la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin. La ventaja de esta ltima tcnica, es que la preparacin no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la bsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamacin de la vagina y la uretra. Si en la preparacin se observan clulas en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratar de T. vaginalis, pudindose efectuar el diagnstico. Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin. Por tanto, su uso, con un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios pticos que hemos mencionado anteriormente.

Figura 3.7 El microscopio compuesto tiene tres lentes objetivos (tres sistemas de lentes). Se muestra el mismo campo de Bacillus subtilis visto con el objetivo dbil seco (100x), fuerte seco (400x), y con el de inmersin (l000x). Los aumentos mayores revelan progresivamente ms detalle de una porcin de campo menor.

Figura 3.8 Preparacin en gota pendiente. Esta preparacin se realiza colocando una gota de la suspensin bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un crculo con vaselina o parafina (a). La vaselina acta como sellador. (b) Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavacin central que queda adherido gracias a la vaselina (c). Se invierte la preparacin y se observa colocndola en la platina del microscopio (d). Las preparaciones en gota pendiente se utilizan para observar microorganismos vivos.

3.1.5 Tinciones El microscopio de campo claro es ms til para la observacin de especmenes teidos. Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto, colorean clulas vivas. No obstante, la mayora de los colorantes son solamente efectivos despus de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa la preparacin de Forma rpida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las protenas coaguladas unen las clulas

al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijacin qumica, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se aade una gota del fijador, por ejemplo, cido smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre la muestra lquida con los microorganismos. La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la identificacin; adems, no permite la observacin del movmiento de los microorganismos. Despus de la fijacin, se aade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espcimen, para que pueda ser absorbido. A continuacin, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua. Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion cargado positivamente, mientras que en los cidos, el colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes ms utilizados son los de tipo bsico, va que la mayor parte de las clulas microbianas Poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se encuentran la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas positivamente. Se utilizan para teir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.
TABLA 3.2 Tcnicas de tincin para bacterias Tincin Tinciones simples Uso Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo Tcnicas Se tine con un colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la rnayora de los tejidos no se tien.

Tnciones diferenciales Tincin de Gram Dos o ms colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas Se cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal violeta y despus con una solucin de iodo (mordiente). Todas las clulas quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%. Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las

negativas pierden el colorante. Se tie con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve ms oscuro y las Gram negativas se tien de rosa. Tincin de cido-alcohol resistencia (ZiehlNeelsen) Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (cido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teidas de rojo; todas las dems se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes continan tenidas de rojo, las otras se tien de azul.

Tinciones especificas Tincin de Tie selectivamente las esporas de endosporas Wirtz-Cortitlin Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a emisin de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la clula toma el color rosa. A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de cido tnico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine. Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparacin en fresco del espcimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cpsula, que se observa como una regin clara alrededor de la clula.

Tincin de flagelos de Leifson

Permite observar los flagelos

Tincin negativa

Revela la presencia de cpsulas