LABORATORIO N°4

MORFOLOGÍA Y CLASIFICACIÓN BACTERIANA

OBJETIVO

 Poder conocer la clasificación bacteriana, de acuerdo a su morfología.

 Valorar la importancia del microscopio en el estudio y la investigación.
 Conocer las partes principales de un microscopio compuesto
 Aprender el uso correcto del microscopio compuesto.

El objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo que

respecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de
esterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc)
y siembra en condiciones anaeróbicas.
El cumplimiento de las tareas en microbiología clínica exige la realización de tres
actividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se inicia
con el cultivo de las muestras de distinto origen, en medios específicos y en condiciones
definidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas al microorganismo
aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad a
antibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra
la identificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie
con el fin de hacer el control de la infección o análisis de población.
Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un
cultivo puro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es
necesario e indispensable emplear material completamente estéril
Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro
procedimiento importante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo. Esta
consiste en colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se
desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los
medios de cultivo corrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en
forma aséptica.
Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el
desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o
contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.
Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en
estado de pureza, condición indispensable para poder estudiar sus características
morfológicas y bioquímicas y lograr así su identificación correcta.
Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento
de UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos En el caso de los
medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un
aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido para obtener
colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2).
Si fuese necesario, las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener
cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma
morfología y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.
Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana
mediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación

MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO

Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es
la observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan
no es posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar
poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario
proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones
inorgánicos y factores de crecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada
colonia corresponde en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado
en un medio de cultivo sólido, hasta formar una población que se represente como una
colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formada por millones de bacterias.
El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de
colonias. El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras
característica Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis
macroscópico) permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos
que poseen características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma,
elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre).
Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace
imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se
hace necesario además una observación microscópica de las células que conforman
estas colonias. Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas
bioquímicas para la identificación definitiva de las colonias.
En la siguiente figura se observan algunas características macroscópicas de
colonias bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o
microorganismo.
Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia
bacteriana.

IDENTIFICACIÓN DE ALGUNAS BACTERIAS DE AISLAMIENTO FRECUENTE EN MUESTRAS

CLINICAS HUMANAS
Género Staphylococcus
Las especies St. aureus, St. epidermidis y St. saprophyticus son los más considerados por su
implicancia en infecciones humanas.
Son anaerobias facultativas, de fácil desarrollo en medios de cultivos corrientes y mejorados
como agar sangre.

 Tinción de Gram
Se observan de formas cocaceas, Gram positivas, agrupadas en racimos conformados por
un gran número de células, especialmente cuando provienen de cultivos en medios sólidos.

 Colonias
Tamaño relativamente grande (2-3 mm). Son de borde y superficie lisa y brillante

 Pigmentación
Son productoras de endopigmentos, que confieren color a las colonias, que puede ser
blanco, generalmente o amarillo pálido o color crema en el caso de St. aureus.

 Hemólisis
En placas de agar sangre pueden o no presentar hemólisis, la que siempre se manifiesta
como un halo claro, translúcido alrededor de la colonia.
Género Streptococcus
 Tinción de Gram
Se observan de formas cocaceas, Gram Positivas, agrupadas en cadenas de diferente
longitud, en especial cuando provienen de cultivos en medios líquidos.

 Colonias
Tamaño bastante pequeñas, algunas incluso puntiformes

 Pigmentación
No son productoras de pigmentos, lo que constituye un carácter diferencial con el género
Staphylococcus.

 Hemólisis
Las especies de este género se clasifican en tres grupos según sea la actividad hemolítica o
no de sus cultivos en placa de agar sangre.
1. Strep. alfa hemolíticos (o viridans) las colonias están rodeadas de un halo verdoso, por
la hemólisis parcial de los glóbulos rojos
2. Strep. beta hemolítico (o hemolítico) las colonias se evidencian con un halo translúcido
de hemólisis completa.
3. Strep. gama hemolíticos (o inertes) se caracterizan por carecer de actividad hemolítica
en placas de agar sangre.

Familia Enterobacteriaceae
Son bacilos Gram Negativos que en general adoptan agrupaciones características.
La mayoría son móviles, son anaerobios facultativos de fácil crecimiento en medios
corrientemente utilizados en el laboratorio, originan colonias de aspecto similar,
generalmente grandes y no pigmentadas, de aspecto mucoso, húmedas y de borde y
superficie lisa. En agar sangre, por lo general no producen hemólisis.
Ej. E. coli, Shigella sp., Salmonella sp., Proteus sp.,

Género Pseudomonas
Son bacilos Gram Negativos, móviles y aeróbicos. Cultivada en agar sangre, origina
colonias grandes con intensa actividad hemolítica. Los cultivos tienen un agradable olor a
frutas.
Ej. Ps. aeruginosa de gran importancia en patología humana, especialmente en IIH.
MATERIALES
1. Placas con muestras bacterianas similares a la de los portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1. Anotar características morfológicas, de color, textura, etc. (observación
macroscópica)
DESARROLLO
Los alumnos tendrán a su disposición placas sembradas con muestras biológicas, para que
puedan realizar una observación de las características macroscópicas de una bacteria en
particular.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE LOS CULTIVOS

Observación al fresco
Este método permite observar bacterias vivas. Su aplicación principal es el estudio de
movilidad bacteriana que corresponde a movimientos de traslación de las células
bacteriana de un punto a otro, en forma rápida y zigzagueante, muchas veces cruzándose
entre sí. Es traslado pasivo de todas las células en un solo sentido no corresponde a
movilidad bacteriana, como tampoco la vibración constante de las células en un punto fija
(movimiento browniano).

A partir de un cultivo bacteriano en medio sólido:

 Colocar una gota de agua estéril o suero fisiológico en el centro del portaobjetos.
 Esterilizar un asa metálica a la llama y dejar enfriar
 Emulsionar una muestra de la colonia bacteriana en la gota y extenderla suavemente
 Esterilizar el asa a la llama del mechero
 Colocar un cubreobjeto sobre la preparación y observar al microscopio a 40X

A partir de un cultivo bacteriano en medio líquido:

 Colocar una gota del cultivo en el portaobjetos y extenderla
 Colocar un cubreobjeto sobre la preparación y observar al microscopio a 40X

OBSERVACIÓN MEDIANTE TINCIÓN

Tinciones simples
Se basan en el empleo de un solo colorante. Este tipo de tinción sirve para observar la
forma y agrupación de las bacterias.

Preparación de un frotis
A partir de un cultivo bacteriano en medio sólido:
 Colocar una gota de agua estéril o suero fisiológico en el centro del portaobjetos.
 Esterilizar un asa metálica a la llama y dejar enfriar
 Emulsionar una muestra de la colonia bacteriana en la gota y extenderla suavemente
 Esterilizar el asa a la llama del mechero
 Secar el frotis suavemente al calor
  Fijar la preparación para adherir las bacterias al vidrio, pasando rápidamente el
portaobjetos dos o tres veces por la llama del mechero, sin sobrecalentar. El frotis
queda listo para ser teñido.
 Enfriar y colocar el frotis sobre las varillas de vidrio dispuestas sobre la bandeja de
tinción.

A partir de un cultivo bacteriano en medio líquido:

 Colocar una gota del cultivo en el portaobjetos y extenderla
 Secar el frotis suavemente al calor
 Fijar la preparación para adherir las bacterias al vidrio, pasando rápidamente el
portaobjetos dos o tres veces por la llama del mechero Bunsen, sin sobrecalentar,
por el revés. El frotis queda listo para ser teñido.
 Enfriar y colocar el frotis sobre las varillas de vidrio dispuestas sobre la bandeja de
tinción.

Tinciones diferenciales
Se basan en el empleo de más de un colorante y permiten la clasificación de las bacterias
de acuerdo a la diferente afinidad por cada uno de ellos. Las más importantes son la
Tinción de Gram y Ziehl-Neelsen.

Tinciones especiales
Tienen por objeto destacar algunas de las partes constitutivas de la célula bacteriana. Como
ejemplo se pueden citar las tinciones de cápsula, núcleo, flagelos, espora. En general no
son de uso rutinario y encuentran su aplicación en trabajos de investigación bacteriológica.

TINCION DE GRAM

1. Cubrir el extendido con solución de cristal violeta o violeta de genciana durante 60

segundos
2. Eliminar el exceso de colorante y lavar con agua corriente.
3. Cubrir el extendido con solución lugol, durante 60 segundos
4. Lavar con agua corriente.
5. Cubrir el extendido con Alcohol 95°, durante 30 segundos (o 5 segundos según
fabricante) para decolorar.
6. Lavar con agua corriente.
7. Cubrir el extendido con solución de safranina durante 60 segundos como tinción
de contraste.
8. Lavar con agua corriente.
9. Secar con papel absorbente y completar secado a temperatura ambiente hasta su
observación al microscopio.
 10. La observación al microscopio se debe realizar con objetivo de inmersión,
colocando una gota de aceite de cedro sobre la preparación.

La fase de decoloración con alcohol constituye la etapa más importante de la Tinción de

Gram y en ella reside su carácter diferencial. Las bacterias Gram Positivas se observan de
color azul-violeta oscuro y las Gram Negativas de color rosado.

MATERIALES
 Muestra
 Portaobjetos
 Reactivos: Cristal Violeta, Solución Yodada, Alcohol Acetona, Safranina.
 Bandeja para tinción
 Varillas de vidrio
DESARROLLO
Preparar frotis de colonias bacterianas diferentes y efectuar tinción de Gram. Observar al
microscopio.

ANEXO 2 CARACTERISTICAS Y FUNCION DEL MICROSCOPIO

INTRODUCCIÓN
EL microscopio ha cumplido un papel muy importante en el avance de la ciencia a partir del
conocimiento profundo de todo aquello que el ojo humano no puede mirar.
No se sabe con exactitud cuando el ser humano descubrió por primera vez que un espejo
curvo y las esferas con agua aumentaban las imágenes, pero es a partir de esto que se van
inventando los lentes de aumento. En las primeras décadas del siglo XVII se
inician.experiencias con lentes e instrumentos para aumentar la visión y su uso se hace
progresivo.
Los primeros microscopios fueron sencillos estaban formados por un lente montado,
posteriormente se fueron complicando por que combinaron lentes, el primero de estos fue
inventado por Zacharias Jansen en 1590 en Holanda (figura 1.1).
El microscopio se fue perfeccionando con gran lentitud, más sin embargo el avance
realizado hasta nuestros días ha sido enorme, el microscopio cuántico de efecto túnel es
uno de ellos. (figura 1.2)
Figura1.1 Microscopio compuesto de Zacharias Janssen. 1590, Midelburg, HOLANDA.

Figura 1.2 Microscopio efecto Tunel, inventado en 1982 por Binning y Rohrer.

En esta practica vamos ha usar microscopios compuestos binoculares, llamados así porque
poseen dos lentes oculares, esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la
imagen, más cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.

MICROSCOPIO ÓPTICO:
Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del
objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecánico
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular
o binocular.
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar
los objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
micrométrico que consigue el enfoque correcto.
LAS PARTES DE UN MICROSCOPIO COMPUESTO SON:

a) Sistema mecánico:
BASE: Soporta todo el peso del aparato, asegurando la estabilidad del mismo.
BRAZO: Este elemento relaciona el cabezal del microscopio con el pie y sostiene la platina
y el condensador. De esta parte se sostiene el microscopio cuando se lo traslada de un
lugar a otro.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.
REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación se halla sujeta al brazo y posee además
una abertura para el paso de luz.
Las platinas tienen dos pinzas sujetadoras, dos tornillos que permiten desplazar las placas
y unas “reglillas” llamadas Escalas de Vernier, que sirven para tomar las coordenadas
sobre la localización de células o estructuras de interés.
TORNILLOS DE ENFOQUE: son dos, macrométrico que permite acercar la muestra hacia
el lente objetivo y micrométrico, de mayor precisión que es el que define la imagen.

b) Sistema óptico:
OCULAR: Lente que se encuentra
próximo al ojo, amplifica la imagen
producida por el objetivo y su
aumento es de 10X. 8
OBJETIVO: Lente situada cerca de
la preparación su función es
ampliar la imagen. En un
microscopio están insertados en
una pieza llamada revolver en un
número de 4 generalmente. Los
lentes objetivos más comunes son
los de 4X o 5X, 10X, 40X y 100X. El
lente de 100X se usa únicamente
con aceite de inmersión por lo que
es llamado lente de inmersión y los demás se llaman lentes en seco.
La amplificación total o magnificación total resulta de la acción combinada del ocular y
objetivo, se calcula multiplicando estos dos valores. Ej.: ocular 10X, objetivo 10X,
amplificación total 100X.
A medida que el poder de amplificación o la magnificación del microscopio aumentan, el
espacio observado bajo el campo óptico disminuye. Lo más importante de un microscopio
no es el aumento en sí mismo, sino el poder separador también llamado a veces poder de
resolución. El poder de resolución es una cualidad del microscopio, y se define como la
capacidad de distinguir como imágenes distintas dos cercanas. El ojo normal no puede ver
separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro.
c) Sistema de iluminación:
CONDENSADOR: contiene varias lentes que concentran la luz en el objeto a estudiarse.
DIAFRAGMA: Esta junto al condensador y regula la cantidad de luz que entra en el
condensador.
FOCO o FUENTE DE LUZ: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador, usualmente
posee también un regulador de intensidad.
La unidad básica de longitud que se utiliza con el microscopio de luz es el micrómetro o
micra.

USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO CON ACEITE DE INMERSIÓN

1. Colocar la preparación sobre la platina de microscopio

2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de
inmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo la
zona de interés.
4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión 100x
(línea negra)

EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE

INMERSIÓN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberá
estar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeño
espacio
7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico
8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE EL
OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES (PAPEL SUAVE)
IMPREGNADO EN XILOL.
9.- Una vez terminado el trabajo práctico su microscopio debe quedar limpio y apagado,
con la platina abajo y el revólver puesto con el objetivo menor (4x)

Profesora Fanny Alarcón Touris