Seminario Tema: PCR (Reacción en Cadena de La Polimerasa)

Bioquímica, Biología Molecular y Celular Curso Moléculas a Células
Seminario
Tema: PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).

Recuerden que para contestar este cuestionario pueden hacer uso del material de las
clases teóricas, la bibliografía recomendada o la virtualidad (Google, YouTube, etc.).
Este trabajo deberá presentarse en la plataforma Moodle, en la sección “tareas”

del tema degradación de proteínas, hasta el día viernes 11/9 hasta las 20hs.
1- ¿Cuáles son las posiciones en un anillo de purina que poseen el potencial

para formar enlaces de hidrógeno, pero que no se encuentran formándolos
en los pares de bases de Watson y Crick?
Las bases nitrogenadas (hidrofóbicas) se encuentran apiladas en el interior
de la doble hélice, en planos perpendiculares a su eje, La parte exterior es
hidrofílica (grupos fosfato y azúcares). Las bases de una de las cadenas o
hebras están unidas mediante puentes de hidrógeno con las bases de la otra
cadena o hebra uniendo ambas cadenas. De esta manera una purina de una
de las cadenas se encuentra enfrentada y unida a una pirimidina en la otra
cadena. Por ello en número de purinas es igual al de pirimidinas. A se une
con T (con dos puentes de hidrógeno); G se une con C (con tres puentes de
hidrógeno, enlace más estable).
Los puentes de hidrógeno existentes en el emparejamiento entre las bases
nitrogenadas son a veces distintos de los descritos para el modelo de
Watson y Crick en posiciones de N 1 y 6, utilizando el átomo N7 de la purina
en lugar del N1 (modelo de Hoogsteen). Estos nitrógenos que no forman
parte del enlace puente hidrógeno en determinadas condiciones pueden
unirse a otras moléculas.
2- En dos muestras de DNA aisladas a partir de dos especies no identificadas

de bacterias, los porcentajes de adenina sobre el total de bases son 32 y
17% respectivamente. ¿Cuáles son las proporciones relativas de adenina,
guanina, timina y citosina que esperaría encontrar en las dos muestras de
DNA?
Muestra 1 Muestra2
A=T A= 32% T=32% A=T A=17% T=17%
G=C G=18% C=18% G=C G=33% T=33%
3- hebra que se extendiera desde la tierra a la luna (aprox. 320.000 km). La
doble hélice de DNA pesa aproximadamente 1x10-8 g por cada 1000 pares
de nucleótidos; cada par de bases se extiende 0,34 nm. Calcular el peso,
expresado en gramos, de una molécula de DNA de doble.
Si 1 pb------------------------- 0,34 nm
1000 pb-------------------------x=340nm
320000 km=3,2.1017 nm
340 nm -----------------------1x10-8gr
3,2.1017 nm ------------------------x= 9,4.109gr
El peso de una molécula de ADN de doble hélice es de 9,411764,706 gr.
4- Dada la siguiente secuencia de RNA, escribir la secuencia molde (-) y la no

molde (+).
No Molde (+) codificante: 5' AATGCCGGTATACGCGTA 3'
ARNm: 5' AAUGCCGGUAUACGCGUA 3'
Molde (-) No codificante: 3' TTACGGCCATATGCGCAT 5'
5- Suponga que necesita amplificar por PCR un fragmento de 108 bp de un gen

determinado, para lo cual utiliza el siguiente protocolo:
3min 94°C Hot Start

40seg 94°C Desnaturalización
1 min 53°C Hibridación 30 ciclos
1 min 72°C Elongación
3 min 72°C Final de laExtensión
a) Explique qué reacción sucede en cada uno de los pasos dentro de un
ciclo.
Hot Start: ocurre al inicio de la reacción, llamada también calentamiento
de inicio, en esta etapa se lleva la muestra de ADN a 94°C por 5 a 10
minutos permitiendo que todo el ADN se desnaturalice.
Desnaturalización: en esta etapa ocurre la separación de las hebras de
ADN, elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. por alrededor de 1
minuto.
Hibridación: en esta etapa se debe bajar la temperatura para permitir la
unión de los primer a una secuencia complementaria del ADN molde.
Las temperaturas en esta fase son entre 45 y 65ºC, y su duración puede
ser de 1 minuto.
Elongación: en esta etapa se vuelve a elevar la temperatura para
permitir la que la taq polimerasa tenga una temperatura óptima, que es
de 72 °C. Así se inicia la síntesis semiconservativa de una nueva cadena
por adición de nucleótidos debido a la acción del ADN taq polimerasa.
Final extensión: En esta etapa se deja actuar por más tiempo al ADN
taq polimerasa para que termine la elongación de todo el ADN, alrededor
de 3 minutos.
b) ¿Qué parámetro modificaría en el caso de la aparición de bandas
inespecíficas?
Modificaría la concentración de ion Mg++, ya que las concentraciones
muy altas de Mg++ favorecen amplificaciones inespecíficas, afectando la
especificidad de la reacción.
6- Explique cómo modifica cada uno de los siguientes reactivos el rendimiento

de una reacción de PCR: Taq polimerasa, desoxinucleótidos trifosfato,
cloruro de magnesio.
ADN taq polimerasa: es la enzima que permite la elongación pegando
nucleótidos a la nueva hebra. Se caracteriza por no desnaturalizarse a altas
temperaturas, lo cual permite ahorrar tiempo y reactivos, ya que no es
necesario estar adicionando polimerasa en cada uno de los ciclos. La
temperatura a la cual alcanza su mayor rendimiento es a 72 °C, no tiene
actividad correctora y comete 1 error cada 10000 nucleótidos. Se necesitan
de 1 a 2 unidades de enzima cada 100 microlitro de reacción.
DNTPs (DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO): proveen de nucleótidos a
la reacción para la síntesis de ADN. Deben estar en cantidad suficiente para
que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos. No deben estar en
exceso para que los iones Mg++ no formen complejos con los DNTPs.
Cloruro de Magnesio: este ion es un cofactor del ADN polimerasa.
Determinar su concentración óptima es uno de los pasos más importantes en
la puesta a punto de la PCR.
La concentración de Mg++ muy baja produce que la polimerasa no funcione
correctamente, afectando el rendimiento de la reacción.
La concentración de Mg++ muy alta favorece amplificaciones inespecíficas,
afectando la especificidad de la reacción.
7- Si no tiene marcador de peso molecular para analizar el resultado de una
PCR. ¿Podría solucionar este inconveniente? ¿Cómo?
Se puede solucionar utilizando marcadores, como los siguientes:
-ISSRs: marcador molecular conocido como secuencias repetidas
intersimples. Esta técnica es utilizada por los dos métodos como el gel de
agarosa visualizado con bromuro de etidio, y geles de acrilamida teñidos con
nitrato de plata.
-RFLPs: el análisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de
restricción (RFLPs) fué el primer marcador utilizado por biólogos
poblacionales. Este método expresa diferencias específicas del AND que
fueron reconocidas por enzimas de restricción particulares (endonucleasas
de origen bacteriano), reconoce y corta solamente la secuencia específica
de bases nitrogenadas del AND, siempre y cuando éstas no estén metiladas.
8- En el caso de no disponer de Taq polimerasa, ¿podría realizar una reacción
de PCR: Con polimerasa de E. colli (temperatura óptima 37°C)?
Si no se dispone de ADN taq polimerasa se podría realizar una reacción con
polimerasa de E. colli, pero habría que estar adicionando la enzima en cada
ciclo, ya que se desnaturalizaría con el aumento de la temperatura.

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2- En dos muestras de DNA aisladas a partir de dos especies no identificadas

El peso de una molécula de ADN de doble hélice es de 9,411764,706 gr.

4- Dada la siguiente secuencia de RNA, escribir la secuencia molde (-) y la no

5- Suponga que necesita amplificar por PCR un fragmento de 108 bp de un gen

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6- Explique cómo modifica cada uno de los siguientes reactivos el rendimiento

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