Manglar Manglar 18(1): 21-26, 2021

Caracterización de cepas de Vibrio spp. biorremediadoras

de petróleo aisladas de agua marina
Characterization of oil bioremediating strains of Vibrio spp.
isolated from seawater
Robert Peralta Otero1,*; Tessy Peralta Ortiz2; Alberto Ordinola-Zapata2,3

1 Escuela de Posgrado de la Universidad Nacional de Tumbes, Avenida Universitaria S/N, Tumbes. Perú.
2 Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar de la Universidad Nacional de Tumbes, Calle Los Ceibos S/N, Puerto
Pizarro, Tumbes. Perú.
3 Grupo de Investigación en Biodiversidad en Ecosistemas Acuáticos Tropicales (BioTrop) de la Universidad Nacional de
Tumbes, Calle Los Ceibos S/N, Puerto Pizarro, Tumbes. Perú.

*Autor corresponsal: [email protected] (R. Peralta Otero).

ID ORCID de los autores

T. Peralta Ortiz: https://orcid.org/0000-0001-5907-7713
A. Ordinola-Zapata: https://orcid.org/0000-0002-9644-0531

RESUMEN

El objetivo de la investigación fue aislar y caracterizar cepas de Vibrio obtenidas de agua marina en la línea de
playa y la zona adyacente a la plataforma de extracción petrolera CX-11 del Lote Z1 ubicado a 17 km de la ciudad
de La Cruz (Tumbes, Perú). Las cepas fueron aisladas en caldo mineral Bushnell Haas suplementado con petróleo
crudo, luego fueron subcultivadas en caldo de tripticasa soya (TSB) hasta obtener colonias puras, las cuales
fueron caracterizadas mediante tinción de Gram y las pruebas de oxidasa y catalasa; además fueron identificadas
mediante secuenciamiento de un fragmento de sus genes 16S ARNr. Se verificó que las cepas portaran genes de
benceno di oxigenasas. Se pudo aislar seis cepas correspondientes a Vibrio fluvialis y Vibrio spp., que portaban
los genes indicados. La investigación demostró que en aguas de la línea de playa y zonas adyacentes a la
plataforma de extracción CX-11 del Lote Z1, existen cepas de Vibrio fluvialis y Vibrio spp. con capacidad para
degradar hidrocarburos.

Palabras clave: biorremediación; degradación; petróleo; hidrocarburos; benceno; oxigenasa.

ABSTRACT

The aim of research was to isolate and characterize Vibrio strains obtained from seawater in the beach line and
the area adjacent to the oil extraction platform CX-11 of Z1 block located 17 km from the city of La Cruz (Tumbes,
Peru). The strains were isolated in Bushnell Haas mineral broth supplemented with crude oil, then they were
subcultured in trypticase soy broth (TSB) until obtaining pure colonies, which were characterized by Gram
staining and oxidase and catalase tests; they were also identified by sequencing a fragment of their 16S rRNA
gene. It was verified that the strains carried benzene di oxygenase genes. It was possible to isolate six strains
corresponding to Vibrio fluvialis and Vibrio spp. that carried the indicated genes. The investigation demonstrated
that in waters of the beach line and adjacent areas to the extraction platform CX-11 of Z1 block, there are strains
of Vibrio fluvialis and Vibrio spp. with capacity to degrade hydrocarbons..

Keywords: bioremediation; degradation; oil; hydrocarbons; benzene; oxygenase.

Recibido: 04-12-2020.
Aceptado: 12-02-2021.

Esta obra está publicada bajo la licencia CC BY-NC 4.0

DOI: http://dx.doi.org/10.17268/manglar.2021.003
 R. Peralta Otero et al. 2021. Manglar 18(1): 21-26 22

INTRODUCCIÓN

En el mundo los derrames de petróleo ocasionan los microorganismos más utilizados para la biorre-
grandes impactos en el ambiente. Se ha estimado mediación son las bacterias, las cuales pueden po-
que entre 1970 y 2017 se han vertido más de 5,7 seer enzimas mono oxigenasas o dioxigenasas que
millones de toneladas de petróleo en los océanos; catalizan la conversión de alcanos lineales y aromá-
uno de los mayores derrames registrados fue el in- ticos a alcoholes primarios, como primer paso de su
cidente de la plataforma Deepwater Horizon en el degradación (Pi et al., 2016). La biorremediación
Golfo de México, en 2010, en tan solo éste se derra- microbiana del petróleo se fundamenta en la utili-
maron 3,19 millones de barriles de petróleo zación de los hidrocarburos como fuente de ener-
(Cerqueda-García et al., 2020; Singh et al., 2020); gía, por parte de los microorganismos. Varias in-
Los derrames de petróleo se han producido tam- vestigaciones han mostrado que se pueden usar
bién en la costa y selva peruana, por ejemplo, en bacterias para biorremediar el petróleo, así
1995 se vertieron varios cientos de barriles en el li- Cerqueda-García et al. (2020), encontraron que
toral de Conchán, posteriormente, el año 2000, más consorcios bacterianos obtenidos del agua y sedi-
de 101 barriles de petróleo, en La Libertad y 5500 mento marino tienen capacidad de degradar las
barriles en la amazonia, en el río Marañón. También distintas fracciones de petróleo, desde extraligeras
se han producido derrames en Pariñas (Piura) en hasta pesadas, pero en el caso de las comunidades
2002, en el río Marañón en 2007 y 2010, así en del sedimento incluso pudieron hacerlo con las
Trompeteros (Loreto) en 2012 (Austermühle, fracciones extrapesadas; por otra parte Dai et al.
2010). Tumbes también cuenta con explotación pe- (2020), ensayaron la combinación de un consorcio
trolera a cargo de la compañía BPZ Exploration and bacteriano (Brevibacillus sp., Bacillus sp. y
Production en zonas marítima cercanas a la costa; Acinetobacter sp.) y enzimas bacterianas inmovili-
en éstas también se han registrado incidentes por zadas en arena de playa contaminada con petróleo,
vertimiento de petróleo como la ocurrida en 2007 encontrando que pudieron degradar n-alcanos de
por un accidente en la plataforma Corvina (CX-11 26 a 35 carbonos e hidrocarburos aromáticos poli-
del Lote Z-1) (Geolab SRL, 2011). Existe por lo tanto cíclicos (PAHs) de 3 anillos. En otra investigación
el riesgo de derrames que afecten el mar y costa realizada por Lee et al. (2018), se utilizaron cepas
tumbesina, incluyendo la zona de los manglares, bacterianas de Bacillus algicola, Rhodococcus soli,
siendo por lo tanto necesario buscar métodos para Isoptericola chiayiensis y Pseudoalteromonas
minimizar los posibles daños y acelerar la recupe- agarivorans para degradar petróleo, encontrando
ración de los ambientes contaminados. El petróleo además que dichas cepas fueron productoras de
es un mezcla compleja de hidrocarburos no polares surfactantes lo que ayudó a su actividad biorreme-
y polares; los primeros son relativamente de menor diadora. Un género de bacterias que se ha empledo
peso molecular, pudiendo ser saturados (alcanos li- mucho en bioremediar petróleo es el género Vibrio,
neales, ramificados, cíclicos) y no saturados (alque- incluso se ha afirmado que las bacterias del dicho
nos y aromáticos); en los hidrocarburos polares, se género están entre las principales y más abundan-
presentan los más complejos y pesados como los tes degradadoras de PAHs (Liu et al., 2021). El gé-
naftalenos y resinas; el petróleo constituye pues nero Vibrio abarca a más de 100 especies, de baci-
una mezcla de sustancias tóxicas, mutagénicas, in- los Gram negativos muy comunes en ecosistemas
cluso carcinogénicas y perjudiciales para el am- acuáticos (Baker-Austin et al., 2018); las cepas que
biente (Ławniczak et al., 2020; Li et al., 2019; poseen actividad biorremediadora de hidrocarbu-
Odukoya et al., 2019; Sari et al., 2019). La contami- ros corresponden a las especies: Vibrio fluvialis, V.
nación por petróleo es problemática en todos los parahaemolyticus, V. alginolyticus y Vibrio spp.
ecosistemas, pero lo es aún más cuando se produce (Bravo, 2018; Çardak et al., 2007; Fernandes et al.,
en las playas; normalmente el contaminante es ver- 2020; Hernández et al., 2015; Li et al., 2019;
tido en el mar y llevado por las olas y mareas hasta Quintana-Saavedra et al., 2012); La existencia de
las orillas, donde es difícil de remover y puede per- bacterias biorremediadoras de petróleo
manecer largo tiempo debido a sus características (portadoras de genes oxigenasas) en la zona
de viscosidad, baja solubilidad, alta estabilidad quí- costera de Tumbes, fue reportada por Ramírez et al.
mica y bioacumulación (Dai et al., 2020); por ello (2016), quienes lograron aislar e identificar cinco
las tecnologías para eliminar tales contaminantes cepas bacterianas del manglar, una de las cuales fue
son esenciales, una de ellas, muy prometedora, es identificada como Vibrio fluvialis, estas cepas
la biorremediación (Lee et al., 2018). La biorreme- bacterianas mostraron poder reducir los hidro-
diación usando microorganismos tiene como obje- carburos totales del petróleo (TPH) en suelo, en un
tivo metabolizar los compuestos contaminantes del 77% a 82%, siendo prometedoras como potencia-
petróleo, complejos y pesados, para hacerlos más les biorremediadores. Por ello en esta investigación
sencillos y livianos, y de ser posible llegar a redu- se buscó aislar de una zona costera de Tumbes,
cirlos a CO2 y metano (Logeshwaran et al., 2018); cepas de Vibrio capaces de degradar petróleo.

MATERIAL Y MÉTODOS

La investigación se realizó entre febrero a diciem- Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar
bre de 2019 en los Laboratorios de Biología Mole- (FIPCM) de la Universidad Nacional de Tumbes.
cular y de Microcultivos, ubicados en Villa Puerto La caracterización de las cepas de Vibrio spp. se
Pizarro (Tumbes, Perú), en las instalaciones de la realizó como sigue:
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Obtención de la muestra conteniendo 1 ml de caldo de tripticasa soya (TSB)

Se recolectaron siete muestras: cuatro en la línea con 150 μl de glicerol a 4 °C.
de playa y tres en el área de extracción de petróleo
del lote Z-1 plataforma CX-15 y CX-11. La Tinción de Gram
recolección de las muestras de agua en la línea de Una colonia de cada una de las cepas puras se
playa se hizo durante la baja marea y en forma procedió a colocar con un asa de siembra en una
aleatoria, a lo largo de un recorrido de 2500 m en lámina porta objeto se fijó con fuego y se cubrió con
playa Caleta Grau. La recolección en el mar cristal violeta por 1 min, luego se lavó con agua
adyacente a la zona de extracción de petróleo destilada (los sucesivos lavados también se
(plataformas de extracción petrolera y buque hicieron con ésta), se aplicó lugol por 1 min y se
tanque de almacenamiento) se hizo de manera volvió a lavar, se cubrió con acetona por 30 s y se
aleatoria con una embarcación de fibra de vidrio lavó. Se aplicó safranina por 1 min y se volvió a
con motor fuera de borda, a 17 km mar adentro de lavar, dejándose secar a temperatura ambiente,
Caleta La Cruz. En cada punto de muestreo, tanto en para luego ser observadas al microscopio a una
playa como en mar, se tomaron dos submuestras de resolución de 1000X.
agua utilizando envases de vidrio de 250 ml
esterilizados, una en la superficie del agua y la otra Prueba de catalasa y oxidasa
a 30 cm de profundidad. Las coordenadas de las Se tomó algunas colonias de las cepas de bacterias
zonas de muestreo fueron registradas con un puras crecida en placas petri con TSA por 24 h a
equipo GPS (Garmin modelo Etrex-10). Se 35 °C, se colocaron en láminas portaobjeto y se les
registraron los parámetros fisicoquímicos del agua aplicó una gota de agua oxigenada comercial
de mar: salinidad, pH, oxígeno disuelto y (peróxido de hidrogeno al 3%), verificándose si se
temperatura utilizando un refractómetro (ATC), un formaban burbujas, como indicador de una cepa
pH metro portátil (Hanna modelo HI-98103), y un catalasa positiva.
oxímetro (YSI Modelo DO200A). Las muestras Para la prueba de oxidasa se tomó algunas de las
fueron transportadas en una caja térmica de cepas de bacterias, se colocaron en láminas
tecnopor a una temperatura promedio de 7 °C portaobjeto, se les agregó solución salina al 0,85%,
hasta el Laboratorio de Biología Molecular de la se procedió a colocar sobre ellas, tiras de oxidasa
FIPCM. (Oxoid) y se observó por 1 min si se produjo un
cambio de color de la tira a azul violáceo, indicador
Siembra de las muestras de una cepa oxidasa positiva.
Las muestras de agua fueron sembradas
inicialmente para su enriquecimiento, en matraces Extracción de ADN de las cepas bacterianas
de 120 ml adicionándose 60 ml de caldo Bushnell Para la extracción de ADN se tomó una muestra de
Haas (marca Himedia) al cual se agregó 500 μl de 950 µl de cultivo bacteriano puro en TSB, el cual fue
crudo mesa 30 como fuente de carbono, los centrifugado a 16 000 xg a 4 °C por 5 min en una
matraces fueron colocados en un agitador de centrifuga (Orto Alresa modelo Digicen 21R). Se
laboratorio (Labnet modelo Orbit-1000). El desechó el líquido de la parte superior y se aplicó
aislamiento de las bacterias con capacidad de 500 μl de tampón fosfato salino (PBS) 1X (Sigma-
degradar petróleo, se realizó en placas petri con Aldrich), se colocó en la centrífuga a 12 000 xg a
agar Bushnell Haas (marca Himedia) 4 °C por 2 min; descartándose el líquido sobrena-
complementado con 60 μl de crudo mesa 30, y con dante e incorporándose 200 μl de TE 1X (Tris 10
agar triptona soya (TSA) (marca Oxoid) mM y EDTA 1mM), pH 8, después fue calentado por
enriquecido con 3 % de NaCl y complementado con 10 min a 100 °C colocándose rápido en hielo por 5
60 μl de crudo mesa 30, en las que se sembró 20 μl min. A continuación el producto lisado fue
del agua de la muestra extraída, mediante el centrifugado a 16 000 xg por 1 min, recuperándose,
método de barrido y se dejó incubar a 35 °C por 24 en un nuevo tubo, el líquido sobrenadante (en el
a 48 horas en una incubadora (Memmert modelo cual se halla el ADN). A continuación, se realizó
SN76). dilución 1:10 del sobrenadante en agua ultrapura
(AUP), Al final se adicionó 2 μl de ARNasa,
Caracterización fenotípica de las colonias incubándose por 30 min a 37 °C, para eliminar
bacterianas cualquier residuo de ARN y purificar el ADN.
La caracterización fenotípica de las bacterias, se
realizó observando al estereoscopio, colonias Identificación genómica de cepas bacterianas
bacterianas aisladas del agar Bushnell Haas, Se realizó mediante reacción en cadena de la
tomándose en cuenta color, forma y tamaño. polimerasa (PCR) dirigida al gen 16S ARNr, para lo
cual se colocó en un microtubo de 200 μl; 2,5μl de
Obtención de colonias puras tampón para PCR 10X (50 mM de KCl, 10 mM de
Las colonias puras se obtuvieron luego de repetidas Tris-HCl, 1,5 mM de MgCl2, ajustado a pH 8,3), 1,5
siembras, por la técnica por agotamiento, en placas μl de solución 25 mM de MgCl2; 0,5 μl de solución
petri con medio agar Bushnell Haas (BHA) (marca 10 mM de deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs);
Himedia) y con TSA enriquecido con 3% de NaCl. Se 17,4 μl de agua ultrapura (AUP), 0,5 μl del cebador
confirmó la pureza de las colonias bacterianas en forward 27F y 0,5 μl del cebador reverse 1492R, 0,1
las placas de medio selectivo utilizando la tinción μl de Taq ADN polimerasa platinium (Invitrogen),
Gram y las pruebas de oxidasa y catalasa. Las cepas al cual se adicionó 2 μl del ADN extraído de cepa
puras fueron conservadas en microtubos de 1,5 ml bacteriana pura. La reacción tuvo lugar en un
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volumen de 25 µl en un Termociclador (Applied solución 25 mM de MgCl2, 17,4 μl de AUP, 0,5 μl de

Biosystems modelo SimpliAmp), programado con solución 10 mM de dNTPs, 0,5 μl del cebador
pre desnaturalización por 5 min a 94 °C, a forward BenF (5’-AGC GTC TGG GTA GTA TAG AG-
continuación 35 ciclos de proceso (desnatu- 3’), 0,5 μl del cebador reverse BenR (5’-AGA AGG
ralización por 30 s a 94 °C, hibridación a 54 °C por TAC GTA CGT AGT GTC TGA-3’), 0,1 μl de Taq ADN
40 s, polimerización por 1 min 30 s a 72 °C) y un polimerasa platinium (Invitrogen) y 2 μl del ADN
paso final de extensión por 4 min a 72 °C. El extraído de cepa bacteriana pura. La PCR se realizó
producto de amplificación fue enviado a la Empresa en un Termociclador (Applied Biosystems modelo
BTS Consultores para su secuenciamiento. Una vez SimpliAmp), programado con pre desnatura-
recibidas las secuencias nucleotídicas, se realizó lización por 5 min a temperatura de 95 °C, al cual
una búsqueda en la base de datos de GenBank para siguió 35 ciclos de proceso (desnaturalización por
la identificación de las cepas. 30 s a 94 °C, hibridación por 15 s a 58 °C,
polimerización por 45 s a 72 °C) y un paso final de
Detección de genes codificadores de di extensión por 10 min a 72 °C. El producto de
oxigenasas amplificación fue migrado en un equipo de
Realizó la amplificación de un fragmento del gen electroforesis para visualizar las bandas fluorescentes
codificador de benceno dioxigenasa mediante PCR que indicaran la presencia del fragmento del gen
en un volumen de reacción total de 25 μl, benceno di oxigenasa.
conteniendo: de tampón para PCR 10X, 1,5 μl de

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De 156 cepas cultivables aisladas y purificadas se Tabla 2

identificaron y caracterizaron, seis cepas de Vibrio Caracterización de las cepas de Vibrio aisladas
procedentes de la zona de estudio, en la cual el agua
Cepa* Medio Forma Catalasa
de mar tuvo una salinidad de 40 ‰, pH 8, oxígeno
disuelto de 6,60 mg/l y temperatura de 23,30 °C. T2-1#2 BHA Bacilococo (+)
P1M52 TSA Bacilococo (+)
Caracterización fenotípica de las colonias P3M21 TSA Bacilo (-)
bacterianas P3M31 BHA Bacilo (-)
Las colonias de las cepas de Vibrio aisladas, mostra- 2K-BII-#5 TSA Bacilococo (+)
ron las características que se muestran en la tabla 3K-AII#2 BHA Bacilococo (+)
1, cuando fueron cultivadas en TSA, siendo algunas * Todas las cepas fueron Gram negativas y oxidasa positivas
blancas cremosas circulares de borde liso, otras
blancas cremosas irregulares y algunas cremosas Identificación genómica de las cepas de Vibrio
circulares; los diámetros de las colonias formadas La búsqueda de las secuencias nucleotídicas de las
estuvieron en el rango de 0,5 a 2 mm; que son ca- cepas de Vibrio se realizó usando Basic Local
racterísticas típicas de colonias de Vibrio al crecer Alignment Search Tool (BLAST) implementada en
en dicho medio como lo señalan Sabir et al. (2013) la base de datos GenBank, esto permitió identificar
y Aguirre (2019). a las seis cepas con un porcentaje de similitud alto
(entre 99,80 y 100 %); encontrándose que las
Tabla 1 cepas; T2-1#1, 2K-BII-#5 y 3K-AII#2, corres-
Características fenotípicas de las colonias de Vibrio pondieron a Vibrio spp. y P1M52, P3M21 y P3M31,
aisladas a Vibrio fluvialis (Tabla 3).
Diámetro
Cepa Características fenotípicas
(mm) Tabla 3
T2-1#2 Blanco cremoso circular borde liso 0,5 Identificación genómica de las cepas de Vibrio aisladas
P1M52 Blanco cremoso circular borde liso 1,0
P3M21 Blanco cremoso borde irregular 2,0 Similitud
Cepa Identificación
P3M31 Blanco cremoso borde irregular 2,0 (%)
2K-BII-#5 crema circular borde liso 0,5
T2-1#1 Vibrio spp. 99,8
3K-AII#2 crema circular borde liso 1,5
P1M52 Vibrio fluvialis 100,0
P3M21 Vibrio fluvialis 100,0
Caracterización de las cepas mediante tinción P3M31 Vibrio fluvialis 99,8
de Gram, y las pruebas de catalasa y oxidasa 2K-BII-#5 Vibrio spp. 100,0
Las seis cepas al ser observadas con tinción Gram, 3K-AII#2 Vibrio spp. 100,0
mostraron ser Gram negativas y con formas de
bacilococos o bacilos Gram negativos; adicional- Detección del gen de benceno dioxigenasa
mente todas ellas mostraron ser oxidasa positivas, La PCR dirigida al gen benceno dioxigenasa mostró
mientras que la mayoría fueron catalasa positivas, que las seis cepas de Vibrio aisladas poseyeron tal
a excepción de las cepas P3M21 y P3M31 (Tabla 2). gen, lo que se evidenció en las bandas fluorescentes
Las características mostradas son comunes en que se observaron en el gel de agarosa utilizado en
Vibrio: bacilos Gram negativos, generalmente oxi- la electroforesis (Figura 2), esto es consistente con
dasa positivos y catalasa positivos, aunque algunas un producto de alrededor de 200 pb, que es el
cepas pueden ser catalasa negativo (Aguirre, 2019; tamaño del fragmento esperado para los cebadores
Baker-Austin et al., 2018; Hoffmann et al., 2012). empleados.
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Fernandes et al. (2020), Hernández et al. (2015),

quienes afirmaron que Vibrio spp. ve favorecido su
crecimiento en aguas contaminadas con hidrocar-
buros, pues las cepas de este género tienen la capa-
cidad de degradar y transformar los contaminantes
complejos en compuestos más sencillos de cadena
más cortas (Hernández et al., 2002).
Estos hallazgos se suman a los ya realizados por
Ramírez et al. (2016), quienes aislaron e
identificaron cepas bacterianas del manglar de
Figura 1. Gel de migración mostrando las bandas de 200 Tumbes, ente ellas de la especie Vibrio fluvialis con
pb indicadoras de la presencia del gen benceno capacidad de biorremediar petróleo, indicando que
dioxigenasa. existen cepas bacterianas nativas con capacidad
videograbadora de hidrocarburos, que pueden
El aislamiento de seis cepas de Vibrio con capacidad utilizarse para desarrollar tratamientos de
de biorremediar petróleo al poseer el gen de la biorremediación biológica ante posibles futuros
benceno dioxigenasa en el litoral de Tumbes, es derrámenes de petróleo que se produzcan en el
compatible con lo expresado por Bravo (2018), mar y zona litoral de la región Tumbes.

CONCLUSIONES

En esta investigación se aisló, a partir de muestras zona litoral, que puedan producirse en el futuro.
de agua marina del lote Z1 en Tumbes (Perú), seis Como siguiente paso, se debe desarrollar
cepas de Vibrio spp. y Vibrio fluvialis, que portan el investigaciones para evaluar el efecto de dichas
gen de la benceno di oxigenasa y que por lo tanto cepas por separado o como consorcios en la
poseen capacidad para degradar ciertas fracciones degradación de hidrocarburos en un ensayo de
de hidrocarburos del petróleo, lo que les otorga una campo, a fin de determinar si tales cepas son
potencial utilidad como cepas nativas para capaces de mostrar capacidades similares de
biorremediar derrames de petróleo en el mar y degradación a las que han tenido en el laboratorio.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de Tumbes por financiar ejecución del Proyecto. A la Mg. Yeni Emperatriz
esta investigación que se desarrolló como parte del Seminario Yamunaqué y al Mg. Erick Antonio
Proyecto de Investigación Científica formativa Suárez Peña, quienes apoyaron en la identificación
financiado con fondos de Canon y Sobrecanon del microbiológica y análisis de PCR, de igual manera a
año 2018, autorizado mediante Resolución de la Br. en Ingeniería Pesquera, Sigrid Campoverde
Consejo Universitario 0904-2018/UNTUMBES-C- Peña, por su apoyo en la ejecución de esta
U. A los estudiantes de la Facultad de Ingeniería investigación.
Pesquera y Ciencias del Mar que colaboraron en la

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