Tincion de Gram

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
Tincion de
Gram
GALEANA ESPINOSA MARIAN
21 de Abril 2023
FROTIS
¿que es un frotis?
Es una extension de una muestra o
cultivo axenico, que se realiza sobre
un portaobjetos con el objetivo de
separar microorganismos y observar
su morfologia microscopica
Los frotis puden realizarse a partir

de medio solido o liquido
PASOS DE UN FROTIS EN MEDIO
LIQUIDO
La concentración de bacterias en medio liquido
es menor que en medio sólido, por lo que será
necesario agregar de 2 a 3 capas para crear
una densidad parecida a la de medio sólido.
01 02 03 04
Tomar un inoculo de crear una película dejar secar y repetir dejar secar al aire y
medio liquido con homogénea en el este procedimiento fijar con calor
ayuda de la tensión centro del
superficial que brinda portaobjetos
la punta del asa
bacteriológica
PASOS DE UN FROTIS EN MEDIO
SOLIDO
a comparación del medio líquido, la cantidad
de bacterias que existen en una asada de
medio sólido es mucho mayor, por lo que a
penas un toque basta para obtener nuestra
muestra sin necesidad de agregar otra capa.
01 02 03 04
Colocamos una gota En condiciones Resuspender de forma Dejar secar al aire y

de agua en el centro asépticas, se da un homogénea en la gota fijar con calor
del portaobjetos toque al medio solido de agua, en cuanto se
note turbidez,
esterilizar el asa para
evitar que nuestro
frotis sea demasiado
grueso
¿PORQUE MI FROTIS SALIO MAL?
1)Exceso de muestra: crea un frotis grueso, en el que los

microorganismos no se separan.
2)Exceso de agua: crea una extensión muy grande, que hace que
tarde mucho tiempo en secar.
3)Muestra no homogeneizada: es importante homogeneizar nuestro
medio líquido, para evitar que los microorganismos queden
sedimentados
4)Frotis no fijado: los microorganismos se lavan por la acción
mecánica del agua. Si no se seca el agua antes de fijarlo, esta hervirá,
modificando la estructura de la célula.

Introducción.
La tincion de Gram fue desarrollada por el danes Hans
Christian Gram en 1884, y permitio clasificar a las
bacterias en dos grandes grupos, Gram (-) y Gram (+).
Es una tincion diferencial.
Su fundamento se basa en la composiscion

y el grosor de la pared celular
Compuesta de una red macromolecular denominada

peptidoglicano, que puede ser solitaria o puede estar
combinada con otras sustancias
COMPOSICION DE LA PARED CELULAR BACTERIANA
Esquema de peptidoglicanos
El peptidoglicano esta compuesto por
un disacartido repetitivo (muchas
subunidades identicas) unido por
polipeptidos, formando una malla que
rodea y protege a toda la celula.

El disacarido se compone de dos

monosacaridos
N-acetilglucosamina (NAG)
Acido N-acetilmuramico (NAM)

tiene una fraccion glicana y una

peptidica
LA PARED CELULAR
Gram Positivas Gram Negativas

Conformada por una capa Posee una capa delgada de
homogenea, gruesa y rigida de peptidoglicanos de 2-7 nm de
20 a 80 nanometros de grosor, rodeada por una
peptidoglicanos por encima de membrana externa de 7-8 nm
la membrana plasmatica
LA PARED CELULAR

LA PARED CELULAR

TINCION DE GRAM.
Las diferentes clases de bacterias reaccionan
diferente a la tincion de gram debido a las
diferencias estructurales que determinan la
retencion o escape de los colorantes.
Esta tincion es valiosa en el area diagnostica,

debido a que las bacterias Gram(+) son
destruidas por penicilinas y cefalosporinas.
Debido a la composicion de su pared, las Gram(-)
tiene una mayor resistencia a antibioticos.
En bacteriología, se utlizan preferentemente
los colorantes artfciales básicos, debido a
la gran basoflia del citoplasma bacteriano,
rico en ARN. Los colorantes ácidos se utlizan
preferentemente como colorantes de Los colorantes básicos (donde el
contraste auxocromo se carga positvamente
como resultado de ganar un ion
hidrógeno o perder un ion hidróxido)
atraen las cargas negatvas en la
superfcie de la mayoría de las células
bacterianas.
PASOS DE LA TINCION
Cristal violeta.
colorante principal de la tincion, tiñe tanto a las
estructuras Gram(+) como Gram(-), debido a
que ingresa al citoplasma de ambas celulas.
El peptidogrlicano no se tiñe, mas bien, retiene
el cristal violeta al actuar como una barrera de
permeabilidad
Composicion.
Cristal violeta (2.0g)
etanol de 95 grados (20 mL)
oxalato de amonio (0.8g)
agua destilada (80 mL)
Los colorantes básicos se unen a moléculas cargadas negativamente

como ácidos nucleicos, muchas proteínas y la superficie de células procariotas.
PASOS DE LA TINCION
Lugol.
Mordiente. determina la formacion
de cristales con el colorante, los
cuales no pueden atravesar la pared
por su gran tamaño, es decir que
favorece la retencion del colorante
Composicion.
Yoduro de potasio (2.0 g)
yodo metalico (1.0 g)
PASOS DE LA TINCION
Alcohol Acetona
En el caso de Gram(+), se cree que el alcohol
acetona contrae los poros de su gruesa pared de
peptidoglicanos, en consecuencia, el compuesto
cristal violeta-lugol no es eliminado en esta fase
denominada decoloracion.
La aplicacion de este compuesto deshidrata el
peptidoglicano de estas celulas y las vuelve aun mas
impermeables para los cristales formados.
Composicion.
Acetona (100 mL)
etanol 95 grados (200 mL)
PASOS DE LA TINCION
Safranina.
Como las baterias Gram(-) se tornan incoloras
despues del lavado con alcohol, el agregado de
zafranina (tincion de contraste), determina que las
celulas adquieran un color rosado.
las Celulas Gram(+) tambien tienen apetencia por la
zafranina, sin embargo esta es opacada por el
morado intenso del colorante violeta.
Composicion.
Safranina (0.5 g)
PASOS DE LA TINCION
MORFOLOGIA
MICROSCOPICA
DE BACTERIAS
forma
Bacilos Cocos Espirilos Vibrios
Tamaño relativo
Largos Cortos
Agrupacion
Agrupacion
Agrupacion
Agrupacion
Esporas
Deformantes No deformantes
subterminal Central subterminal Central

MORFOLOGIA
MICROSCOPICA
DE HONGOS
FILAMENTOSOS
tamaño de los filamentos o
hifas
- Macrosifonado (hongos filamentosos)
-Microsifonado (actinomicetos
filamentosos, gram positivos)
COLOR DE LA HIFA O
MICELIO
- Pigmentado
- Hialino.
PRESENCIA DE SEPTOS
- Septado
- Cenocítico
NÚMERO DE NÚCLEOS
- Mononucleada
- Multinucleada
TIPO DE ESPORAS
- Asexual
- Sexual
AULEROCONIDIOS
Clamidoconidios
Muestras
obtenidas.
Ejemplos de muestras obtenidas.
Muestra en cultivo de Bacillus megaterium Escherichia coli

bacterias de la tierra
Bacilos, en estreptos o cadenas, Bacilos, aislados, cortos, gram
Bacilos fusiformes, aislados, largos, gram(+) y formadores (-), no formadores de esporas
largos, Gram (-), con esporas de esporas de posicion central
ausentes.
B. megaterium. Staphylococcus aureus Arthrospira

Bacilos, en estreptos o cadenas, Cocos, en racimo, Gram forma de espirilos.
largos, Gram(+) y formadores positivos, no formadores de
de esporas de posicion central esporas
Actinomiceto en cultivo de Alternaria Aspergillus flauus

tierra
Bacterias microsifonadas, gram bacterias macrosifonadas,
(+)
Fuentes
Brock, Biología de los Microorganismos. Madigan. Ed.
Pearson. Introducción a la Microbiología. Tortora. Ed.
Panamericana
David, T. Kysela. Diversity takes shape: understanding the
mechanistic and adaptative basis of bacterial morphology.
PLOS Biology.
Bonifaz,A (2012). Micología Médica Básica,4 Edicion,
McGrawHill:México.
Prescott, L. M., Harley, J. P., Klein, D. A., Gamasa de la
Rasilla, C., & Lasa Uzcudum, I. (2004). Microbiología
(Quinta edición). McGraw-Hill Interamericana de España.
Tortora, G. J. (2017). Introducción a la Microbiología (12th
ed.).
Molina López, J., & Manjarrez Zavala, E. (2015).
Microbiología, bacteriología y virología (Segunda edición).
Méndez Editores.
Gamazo C, López I, Díaz R. Manual práctco de
microbiología. 3a ed. Barcelona: Editorial Masson; 2005.
Gracias.

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Colocamos una gota En condiciones Resuspender de forma Dejar secar al aire y

1)Exceso de muestra: crea un frotis grueso, en el que los

Su fundamento se basa en la composiscion

Compuesta de una red macromolecular denominada

El disacarido se compone de dos

tiene una fraccion glicana y una

Gram Positivas Gram Negativas

Gram Positivas Gram Negativas

Gram Positivas Gram Negativas

Esta tincion es valiosa en el area diagnostica,

Los colorantes básicos se unen a moléculas cargadas negativamente

subterminal Central subterminal Central

Muestra en cultivo de Bacillus megaterium Escherichia coli

B. megaterium. Staphylococcus aureus Arthrospira

Actinomiceto en cultivo de Alternaria Aspergillus flauus

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