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capitulo 22

Micropropagación de violeta africana (santapaulia

ionanthaWendl.)

Mukund Shukla, J. Alan Sullivan, Shri Mohan Jain,

Susan J. Murch y Praveen K. Saxena

Resumen

La micropropagación es una herramienta importante para la multiplicación rápida y la creación de variabilidad genética en
las violetas africanas (santapaulia ionanthaWendl.). La propagación in vitro exitosa depende de los requisitos específicos y
la manipulación precisa de varios factores, como el tipo de explantes utilizados, el estado fisiológico de la planta madre,
los reguladores del crecimiento de las plantas en el medio de cultivo y las condiciones de crecimiento. El desarrollo de
protocolos rentables con una alta tasa de multiplicación es un requisito fundamental para la aplicación comercial de la
micropropagación. El capítulo actual describe un protocolo optimizado para la micropropagación de violetas africanas
utilizando explantes de hojas obtenidos de plantas cultivadas in vitro. En este proceso, la regeneración de la planta ocurre
a través de la embriogénesis somática y la organogénesis de los brotes simultáneamente en los explantes inducidos con el
regulador de crecimiento tidiazurón (TDZ;norte-fenilo-norte¢-1,2,3-tidiazol-5-ilurea). El protocolo es simple, rápido y
eficiente para la propagación a gran escala de la violeta africana y las rutas duales de regeneración permiten múltiples
aplicaciones de la tecnología desde la simple propagación clonal hasta la inducción o selección de variantes para la
producción de semillas sintéticas.

Palabras clave:violeta africana,santapaulia ionantha, Micropropagación, Embriogénesis somática,

Organogénesis, Regeneración, Iniciación radicular, Thidiazuron

1. Introducción

violeta africana (santapaulia ionanthaWendl.; Gesneriaceae) es una especie de

planta ornamental de interior comercialmente importante y muy valorada en
muchas partes del mundo. Miles desantapaulialos cultivares han sido seleccionados
por el tamaño de la planta, los colores florales, las formas y patrones de las hojas, el
crecimiento, la floración uniforme y un mejor rendimiento como planta de interior.
Si bien estas plantas se propagan más comúnmente mediante esquejes de hojas
vegetativas, los métodos in vitro se usan ampliamente tanto para la producción a
gran escala como para la introducción de variabilidad genética para el desarrollo de
nuevos cultivares. Micropropagación de violeta africana

Mauricio Lambardi et al. (eds.),Protocolos para la micropropagación de plantas hortícolas económicamente importantes seleccionadas,
Métodos en Biología Molecular, vol. 994, DOI 10.1007/978-1-62703-074-8_22, © Springer Science+Business Media Nueva York 2013

279
280 M. Shukla et al.

de varios tipos de explantes, incluidos discos de hojas, pecíolos, pétalos y

anteras, ha sido informado por varios investigadores (1–8). La
regeneración de la violeta africana se ha logrado mediante la
diferenciación directa de brotes de diferentes explantes (9–12) así como
un modo indirecto de organogénesis con una fase intermedia de callo (13,
14). Se ha demostrado que los tejidos de la hoja y el pecíolo de la violeta
africana se regeneran a través de la organogénesis y la embriogénesis
somática.7) tras la inducción con tidiazurón (TDZ). TDZ es un regulador del
crecimiento vegetal (PGR) muy potente conocido por estimular una serie
de respuestas fisiológicas diferentes en las plantas, incluida la
regeneración de plantas de novo (15–22). El modo de acción específico de
TDZ en los tejidos vegetales sigue sin determinarse y se sigue
proponiendo un papel dual para el PGR como estimulador sintético del
metabolismo de las auxinas y las citoquininas.8, 17, 23, 24).
En este capítulo, describimos un protocolo eficiente para la
micropropagación de violeta africana basado en el uso de TDZ como señal
inductiva de regeneración y cultivos de brotes axénicos (ASC) como fuente
de los explantes. Las diversas etapas del desarrollo de las plántulas en
este proceso incluyen: (1) iniciación de ASC, (2) micropropagación a través
de organogénesis de brotes y embriogénesis somática simultáneas a
partir de explantes de ASC, (3) enraizamiento y crecimiento de raíces de
los brotes regenerados y somáticos plántulas derivadas de embriones, y
(4) aclimatación y trasplante en invernadero de plántulas regeneradas.

2. Materiales

2.1. Superficie 1. Agua del grifo.

Esterilización 2. Etanol 70% (v:v).
de material de origen
3. Agua destilada esterilizada en autoclave; Alícuotas de 250 mL en frascos de 500 mL
con tapón de rosca.

4. Solución de lejía comercial (p. ej., “CLOROX®" lejía; NaClO al 5,5 %

(v/v), diluido 2:10 (v:v) con agua destilada esterilizada en
autoclave.
5. Tween 20 (Fisher BioReagents, EE. UU.).
6. Agitador magnético, barra magnética, vaso de precipitados de 600 mL (autoclavado).

7. Instrumental (bisturí, fórceps, esterilizador de perlas de vidrio), banco de

flujo laminar.
8. Instalaciones de preparación de medios y cultivo de tejidos, sala de cultivo.

9. Plantas en maceta de violeta africana cv. Benjamin obtenido de un

invernadero comercial (Harster Greenhouses Inc., Dundas, ON,
Canadá).
 22 Micropropagación de violeta africana (santapaulia ionanthaWendl.) 281

tabla 1
Medio basal de Murashige y Skoog (MS) con vitaminas

constituyentes Fórmula química Concentración (mg/L)

macroelementos Nitrato de amonio NH NO

4 3
1,650
Nitrato de potasio KNO 3 1,900
Cloruro de calcio CaCl·2H
2
O2 332.2
Sulfato de magnesio MgSO 4·7H O 2
180.7
Fosfato de potasio KH PO
2 4
170
microelementos Yoduro de potasio KI 0.83
Ácido bórico HBO
3 3
6.2
sulfato de manganeso MnSO 4·4H O 2
16.9
Sulfato de cinc ZnSO 4·7H O2 8.6
Ácido molíbdico (sal de sodio) Na2MoO·2H4
O2 0.25
sulfato cúprico CuSO·5H4
O2 0.025
Cloruro de cobalto CoCl·6H
2
O2 0.025

Hierro Sulfato de hierro FeSO 4·7H O

2
27.80
Na2EDTA·2H O2 37.26

vitaminas mioinositol 100

Glisina 2.0
Ácido nicotínico 0.5
Piridoxina-HCl 0.5
Tiamina-HCl 0.1

2.2. Medios culturales 1. Los medios de cultivo contenían sales y vitaminas según
Murashige y Skoog (25) y PGR a saber. BA, NAA y TDZ
(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, Difco, Detroit, MI y
Phytotechnology, KS, EE. UU.).
2. La formulación de los medios se enumeran en las tablas1y2por
(a) Establecimiento de cultivo in vitro a partir de explantes de hojas y
pecíolos.
(b) Regeneración a partir de ASC.
(c) Inducción de raíces en brotes regenerados.
3. Placas de Petri (100×15 mm; Phytotechnology, KS, EE. UU.).
4. Cajas magenta (3×3×4²;Fitotecnología, KS, EE. UU.).
5. Otros artículos de vidrio (Fisher Scientific, EE. UU.).

2.3. Aclimatación 1. Agua del grifo.

de Plantas Regeneradas 2. Macetas de plástico (6 pulgadas; ITML Horticultural Products, Middlefield,
en invernadero OH, EE. UU.).
282 M. Shukla et al.

Tabla 2
Preparación y almacenamiento de diferentes reguladores de crecimiento vegetal (PGR) utilizados para la

propagación in vitro de violeta africana

Preparación y almacenamiento

regulador de crecimiento Peso molecular Solvente Diluyentes Almacenamiento (°C)

PANECILLO EN ESCOCIA 225.3 NaOH 1N Agua 0–5

NAA 186.2 NaOH 1N Agua 0–5
TDZ 220.2 DMSO Agua 0–5

3. Bandejas de plástico con tapa (72 celdas; ITML Horticultural Products,

Middlefield, OH, EE. UU.).
4. Mezcla sin tierra preparada combinando ProMix™ y Perlite
(Therm-O-Rock East, Inc., New Eagle, PA, EE. UU.) (1:1 por
volumen).
5. Sol®mezcla de cultivo profesional (Sun Gro Horticulture,
Vancouver, BC, Canadá).
6. Cámara de crecimiento de plantas.

7. Invernadero.

3. Métodos

3.1. Preparación La composición del medio basal que contiene los componentes minerales
de Medios de Cultura del medio MS suplementado con vitaminas (25) se proporciona en la Tabla
1. Los reguladores de crecimiento y las condiciones de su
almacenamiento se enumeran en la Tabla2. El medio se solidifica con 2,5
g/L de Gelrite (Sigma, EE. UU.) y el pH del medio se ajusta a 5,7 antes del
autoclave a 121 °C y 1,1 kg/cm2durante 20 min. Los volúmenes de medio
de cultivo dispensados en cada placa Petri y caja Magenta son de 15 mL y
50 mL, respectivamente.

3.2. Establecimiento 1. Mantener las plantas deS. ionanthaWendl. CV. Benjamin en macetas de 6
y mantenimiento pulgadas llenas de una mezcla de tierra artificial (Sunshine®mezcla de
de material de origen cultivo profesional) en el invernadero. La temperatura en el invernadero
debe estar dentro de un rango de 20-24°C con un fotoperíodo de 16/8 h
(día/noche). La intensidad de la luz debe estar entre 80 y 85metromol/s/m
2 y la humedad relativa en 55–60%. Seleccione las plantas sanas con hojas
completamente expandidas para iniciar la micropropagación. Utilice el
disco de la hoja o los explantes de pecíolos de las plantas cultivadas en
invernadero para generar ASC.
2. Preparar la solución de lejía desinfectante diluyendo la lejía
comercial (20 mL de hipoclorito de sodio al 5,4 %), con
 22 Micropropagación de violeta africana (santapaulia ionanthaWendl.) 283

80 mL de agua destilada estéril, y añadiendo tres gotas del humectante

“Tween 20”. Desinfecte el tejido de la hoja colocando de 2 a 4 hojas en un vaso
de precipitados estéril de 250 ml y enjuague con etanol al 70 % durante 1 min.
Decantar el etanol y verter suavemente la solución de lejía diluida sobre las
hojas para sumergirlas completamente para la esterilización de la superficie.
Revuelva el contenido suavemente durante 15 a 20 min. Enjuague las hojas
cinco veces con agua destilada desionizada estéril para eliminar la lejía. Cada
enjuague debe ser por un período de 3 a 4 minutos.

3. Para preparar los explantes de hojas, corte las hojas maduras (4–6 cm de
largo) en discos rectangulares, de aproximadamente 1,5 × 1 cm de
tamaño, con un bisturí. Retire los explantes de pecíolo y seccionarlos
transversalmente (<0,25 mm de espesor) con un bisturí afilado. Mantenga
los explantes en agua esterilizada antes del cultivo.
4. Cultivar los explantes de disco y pecíolo de la hoja en medio MS que
contenga sales MS, vitaminas, sacarosa al 3 % y una combinación de
reguladores de crecimiento de 1metroM benciladenina (BA), y 1metroM
ácido naftaleno acético (NAA) o 5metroM TDZ (norte-fenilo-norte¢-1,2,3-
tidiazol-5-ilurea). Cultivar los explantes del disco de la hoja en tubos de
ensayo (5 × 15 cm) o cajas magenta mientras que los explantes del pecíolo
en placas de Petri. Coloque el explante de hoja con la superficie abaxial en
contacto con el medio y asegúrese de que la orientación de los explantes
de pecíolo sea tal que la superficie más alejada de la hoja esté expuesta al
medio de cultivo. Mantener los cultivos en un cuarto de crecimiento a
24°C bajo un fotoperiodo de 16 h (50metromol/s/m2) proporcionada por
lámparas fluorescentes blancas frías.
5. Los brotes de novo y los embriones somáticos se desarrollarán en 3 a 4
semanas (Fig.1a–d) y brotes bien formados después de 6 semanas (Fig.1e
). Los embriones somáticos se desarrollan a partir de las células
epidérmicas que rodean los cortes del pecíolo y se unen de forma laxa a
los tejidos maternos mediante un suspensor de células transparentes y se
extraen fácilmente con pinzas (Fig.1b, c). Los explantes cultivados con la
superficie de corte más cercana a la lámina de la hoja expuesta al medio
pueden no formar embriones somáticos o producir pocos embriones con
poca frecuencia y con un desarrollo detenido.
6. Retire los brotes (Fig.1d) con ayuda de bisturí y fórceps y
subcultivo en caja Magenta que contiene medio basal MS (50 mL)
con sacarosa al 3%. Estas ASC se mantienen subcultivando en
medio basal a intervalos de 4 semanas (Fig.1f).

3.3. Micropropagación 1. Se ha informado de la regeneración de la violeta africana a través de la

organogénesis de los brotes o la embriogénesis somática a partir de varios
explantes. El protocolo que se describe a continuación utiliza el ASC como
fuente principal de explantes para la micropropagación. Retire las hojas
completamente expandidas de ASC y colóquelas en una placa de Petri estéril
que contenga unas gotas de agua estéril para evitar la desecación. Cortar las
hojas en segmentos de aproximadamente 1 cm con un bisturí afilado. Cultivar
hojas escindidas en el medio de inducción que contiene el
284 M. Shukla et al.

Fig. 1. Micropropagación de violeta africana. (a) Regeneración a partir de explantes de hojas de plantas cultivadas en invernadero. (b)
Desarrollo de embriones somáticos a partir de la región epidérmica de explantes de peciolo. (C) Un embrión somático débilmente adherido al
explante. (d) Brotes y embriones somáticos en diversas etapas de crecimiento y elongación. (mi) Regeneración de brotes a partir de explantes
de discos foliares. (F) Un cultivo de brotes axénicos (ASC) con hojas bien formadas. (gramo) Una planta madura cultivada in vitro con flores bien
formadas. (h) Trasplante en invernadero de plántulas regeneradas. (i) Una quimera abigarrada de violeta africana procedente de plántulas
regeneradas.

ingredientes del medio MS (Tabla1) y varias

concentraciones de TDZ (Tabla3).
2. Cultive cinco explantes en cada placa de Petri que contenga 15 ml de
medio. Asegúrese de que la superficie abaxial de la hoja esté en contacto
con el medio de cultivo. Selle las placas de Petri con Parafilm y coloque los
cultivos en las mismas condiciones de crecimiento descritas
anteriormente para ASC.
3. La frecuencia de regeneración se ve afectada por el tipo y la duración
de la exposición de los explantes al medio de inducción. Tanto la
concentración de TDZ como la duración de la exposición deben
optimizarse para cada cultivar o genotipo. Seleccione el óptimo
 22 Micropropagación de violeta africana (santapaulia ionanthaWendl.) 285

Tabla 3
Efecto de la concentración de TDZ y la duración
de exposición (3 o 9 días) sobre número medio de regenerantes por
explante

Número de regenerantes por explante

concentración de TDZ (metroMETRO) 3 días 9 días

0.0 0 0
1.0 6–10 8–12
2.0 19–26 20–23

5.0 16–21 15–18

10.0 15–21 10–18

concentración de TDZ para inducir el desarrollo de novo de brotes y

embriones somáticos (Tabla3). Para el cv. Benjamin, la concentración
óptima de TDZ es 1-5metroM con un período de exposición de 9 días
para producir un número significativamente mayor de regenerantes
(brotes y embriones) en comparación con otras concentraciones
(Tabla3). Concentraciones de TDZ superiores a 5metroM aumenta el
número de embriones somáticos en comparación con los brotes,
aunque el número total de regeneración sigue siendo similar.

4. Transfiera los explantes inducidos en TDZ durante 9 días al medio basal MS

sin reguladores de crecimiento en cajas magenta que contengan cada
una 50 ml de medio para 2 o 3 explantes en regeneración.
5. Se desarrollan brotes múltiples y embriones somáticos después de 3 a 5
semanas en los explantes inducidos con 5metroM TDZ de manera similar
observada para los pecíolos cultivados en invernadero (Fig.1a–e). Los
embriones somáticos se adhieren sin apretar al tejido de origen y el brote
también se puede extirpar fácilmente para su posterior desarrollo en
plántulas. Retire con cuidado los brotes en regeneración y los embriones
germinados y transfiéralos al medio basal MS para una mayor expansión y
crecimiento en brotes bien formados en aproximadamente 4 a 5 semanas. Las
etapas de regeneración de brotes y desarrollo de embriones somáticos se
asemejan a las que se muestran en la Fig.1a–e. Varios pasos de la
micropropagación de la violeta africana se muestran en la Fig.2.

3.4. Enraizamiento Separe los brotes y los embriones somáticos germinados con o sin raíces
y plántula visibles. Transferir estos brotes (aproximadamente 4,0 cm de largo) a medio
Desarrollo MS suplementado con 0,60metroMNAA. Un sistema de raíces bien formado se
desarrollará después de 1 a 2 semanas y estas plántulas se cultivan fácilmente
hasta convertirse en plantas con flores maduras (Fig.1g) tras el trasplante en
invernadero.
286 M. Shukla et al.

Fig. 2. Protocolo para micropropagación de violeta africana (santapaulia ionanthaWendl.).

3.5. Aclimatación 1 Aclimate las plántulas enraizadas y regeneradas antes de transferirlas a

y Crecimiento en el el invernadero. Retire con cuidado las plántulas del medio de cultivo y
Invernadero lávelas cuidadosamente con agua corriente del grifo, asegurando un
daño mínimo al tejido. Transplante las plantas limpias en bandejas de 72
celdas que contengan una mezcla sin tierra preparada combinando
ProMix™ y perlita en volúmenes iguales. Cubrir las bandejas
 22 Micropropagación de violeta africana (santapaulia ionanthaWendl.) 287

con tapas de plástico transparente y colocar en las cámaras de

crecimiento a ciclo de 16 h luz (24°C) y 8 h oscuridad (20°C) y 95% de
humedad relativa. Reduzca la humedad relativa en las cámaras cada
semana en un 5 % durante 3 semanas y luego manténgala constante
alrededor del 80 %. Retire las cubiertas de plástico al final de la
tercera semana.
2 Transferir los pisos al invernadero al final del cuarto
semana y trasplante en 6-in. macetas estándar llenas de Sunshine
®mezcla de cultivo profesional (Fig.1h). Cultive las plantas en

macetas en las condiciones típicas de un invernadero para

evaluar su rendimiento de crecimiento y floración.
Ocasionalmente, variantes espontáneas como quimeras con
hojas jaspeadas (Fig.1i) se ven en la progenie regenerada, aunque
con baja frecuencia.

4. Notas

1. Para la micropropagación de la violeta africana, los explantes más

utilizados son los discos foliares y los pecíolos. Las ASC son una mejor
fuente de explantes debido a su disponibilidad constante, uniformidad
fisiológica y preacondicionamiento in vitro. Además, el uso de ASC elimina
la necesidad de esterilización superficial. Sin embargo, el proceso de
establecer ASC también se puede usar de manera efectiva para la
micropropagación directa de las plantas cultivadas en invernadero y,
presumiblemente, de las plantas cultivadas en entornos naturales. Tanto
los discos foliares como los pecíolos se pueden utilizar como explantes,
pero la frecuencia de regeneración variará de un cultivar a otro. La
eficiencia de regeneración de los explantes de hojas y pecíolos de plantas
in vitro y cultivadas en invernadero también varía (7, 8) y requiere la
optimización de las concentraciones de PGR.
2. Este protocolo de micropropagación de violeta africana implica la
inducción de organogénesis de brotes y embriogénesis somática en el
mismo explante. Los embriones somáticos se desarrollan frecuentemente
en concentraciones más altas (5–10metroM) en comparación con brotes a
bajas concentraciones (1–2metroM) de TDZ. La embriogénesis somática
es una característica única de las células vegetales para obtener una gran
cantidad de plantas genéticamente similares en poco tiempo. La
producción de embriones somáticos en violeta africana es de importancia
comercial ya que es un cultivo de alto valor con problemas potenciales de
variación somaclonal y plantas quiméricas. Además, la regeneración a
través de la embriogénesis somática es ventajosa para la manipulación
genética y la propagación de esta especie debido al origen unicelular y al
hábito de crecimiento bipolar de los embriones. La embriogénesis
somática también facilita la encapsulación de embriones con geles
sintéticos para desarrollar semillas artificiales y la criopreservación
288 M. Shukla et al.

para la conservación de germoplasma a largo plazo. Independientemente de

la naturaleza de la regeneración, el protocolo de micropropagación descrito
aquí se puede adaptar aún más para la propagación a gran escala mediante
biorreactores.

3. TDZ es un regulador de crecimiento único y muy potente que

puede sustituir los requisitos de auxina y citoquinina de la
organogénesis y la embriogénesis somática en varias especies (7,
8, 17, 26). La embriogénesis somática de violeta africana inducida
por TDZ también proporcionará un sistema para la investigación
de los factores bioquímicos y moleculares que controlan el
desarrollo de embriones somáticos, incluido el transporte de
compuestos endógenos y exógenos que interactúan.

Reconocimiento

Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Asuntos Rurales de Ontario y el Consejo de
Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá.

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