INDUCCIÓN Y MANTENIMIENTO DE CALLOS

Acevedo, S. Lusdey1, Anaya, M. Aura2 ,Begambre, M. Nataly3 , Cárdenas, H. Melissa4 ,Ríos,

F. Yulieth5
1,2,3,4,5
Estudiantes de Cultivo de Tejidos, Programa de Biología, Departamento de Biología y
Química, Facultad de Educación y Ciencias, Universidad de Sucre.

RESUMEN

En cultivos de tejidos vegetales, se considera un callo como una masa amorfa producto de la
proliferación de células del parénquima, generalmente formados en el corte de un tallo o raíz.
Una de las características importantes de un callo, de manera funcional, es su irregular
crecimiento, teniendo el potencial para desarrollar raíces normales, brotes y embriones que
forman plántulas, debido a ello, la inducción de callos se utiliza en los procesos in vitro para
innumerables objetivos. Esta práctica consistió en la socialización de la temática referente a
la preparación para inducción y mantenimiento de callos mediante la observación de
contaminaciones, inducciones de callos y formación de raíces en los diferentes tratamientos
establecidos, donde el material vegetal que se utilizó fue la zanahoria, la cual no se obtuvo de
tejidos in vitro. La siembra de tejidos para la inducción de callos consistió de 7 tratamientos
con 4 repeticiones cada uno (3 muestras de tejido en cada repetición), para un total de 84
medios, donde se obtuvo como resultado la formación de colonias oscuras en el medio, lo
cual nos indicó contaminación por hongos en uno de los tratamientos. Los porcentajes más
altos se obtuvieron por bacterias con 28% y oxidación por mal procedimiento con 13,0%, y el
menor porcentaje por contaminación se obtuvo por hongos con 3,5%, indicando que los
procedimientos de asepsia en los explantes fueron deficientes o dichos contaminantes se
introdujeron durante la manipulación de los medios. Por lo tanto, la inducción de callos puede
ser utilizada para diferentes propósitos, tales como la micropropagación y el mejoramiento
vegetal, la contaminación por bacterias y hongos en los explantes es generada por las técnicas
deficientes de esterilización, el ambiente de los laboratorios de trabajo y los operadores, y la
presencia de hormonas de crecimiento en los medios de inducción, estimulan la formación de
callos y raíces en los explantes.

PALABRAS CLAVES: contaminación, cultivo in vitro, callos, inducción.

ABSTRACT

In plant tissue cultures, a callus is considered an amorphous mass arising from the
proliferation of parenchymal cells, generally formed in the cut of a stem or root. One of the
important characteristics of a callus, in a functional way, is its irregular growth, having the
potential to develop normal roots, shoots and embryos that form seedlings, due to this, callus
induction is used in in vitro processes for countless objectives. In this laboratory practice,
which was carried out in a virtual way, the topic regarding the preparation for induction and
maintenance of calluses was socialized by observing contaminations, callus inductions and
root formation in the different established treatments, where the plant material that The carrot
was used, which was not obtained from in vitro tissues. The seeding of tissues for callus

1
induction consisted of 7 treatments with 4 repetitions each (3 tissue samples in each
repetition), for a total of 84 media, where the formation of dark colonies in the medium was
obtained, which indicated fungal contamination in one of the treatments. The highest
percentages were obtained by bacteria with 28% and oxidation by poor procedure with
13.0%, and the lowest percentage by contamination was obtained by fungi with 3.5%,
indicating that the aseptic procedures in the explants were deficient or these contaminants
were introduced during handling of the media. Therefore, callus induction can be used for
different purposes, such as micropropagation and plant improvement, contamination by
bacteria and fungi in the explants is generated by poor sterilization techniques, the
environment of the work laboratories and the operators, and the presence of growth hormones
in the induction media, stimulate callus and root formation in the explants.

KEY WORDS: contamination, in vitro culture, callus, induction.

INTRODUCCIÓN

Un callo consiste de una masa amorfa surgida de la proliferación de células del parénquima.
Frecuentemente es el resultado de una herida, un callo se forma en el corte de un tallo o raíz.
Los callos no tienen patrones predecibles de organización, están presentes en centros
localizados de actividad meristemática y a menudo aparecen en regiones cambiales
rudimentarias con zonas de diferenciación vascular. Una de las características importantes del
callo, desde un punto de vista funcional, es su irregular crecimiento, teniendo el potencial
para desarrollar raíces normales, brotes y embriones que forman plántulas, debido a ello son
utilizados en los procesos in vitro para innumerables objetivos, como la transformación
genética, la producción de metabolitos secundarios, el cultivo de células en suspensión y
embriogénesis somática. Los callos pueden originarse a partir de cualquier parte de la planta
con un balance hormonal de auxina/citoquinina moderado. Los resultados pueden generar la
formación de callo friable o callo compacto. Estos se diferencian en la suavidad del tejido y
en su fácil manipulación; se recomienda utilizar callo friable, pues este permite mejor
disociación de células y rápido crecimiento (Correia S, J. Canhoto. 2010).

La inducción de callos, también denominada callogénesis puede ser utilizada para diferentes
propósitos, tales como la micropropagación y el mejoramiento vegetal. La producción de
callos requiere de un explante inicial, el que puede tener una alta diferenciación de sus
tejidos, como un trozo de raíz, tallo u hoja, o bien la utilización de tejidos menos
diferenciados como hipocótilos y cotiledones de plántulas recién germinadas e incluso
embriones cigóticos maduros e inmaduros, en cualquier caso, la inducción de callo representa
un proceso de desdiferenciación y división celular intensiva, el cual depende principalmente
del explante, genotipo, medio de cultivo, tipo de regulador de crecimiento como también su
concentración y combinación (Correia S, J. Canhoto. 2010).

En la práctica de laboratorio se socializó la temática referente a la preparación para

inducción y mantenimiento de callos. Por tanto, en este informe se hará una discusión más
amplia de los resultados obtenidos tras la observación de contaminaciones, inducciones de
callos y formación de raíces en los diferentes tratamientos establecidos.

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METODOLOGÍA

Como material vegetal para la inducción de callos se utilizó la zanahoria, la cual no se obtuvo
de tejidos in vitro. Se procedió con la predesinfección y desinfección del mismo. En la
predesinfección se lavó la zanahoria con agua jabonosa(1%), se peló y posteriormente se
cortó en rodajas(donde se aprecia la zona central o médula, la corteza y entre estas dos, la
zona de cambium). Para la desinfección, en el área de transferencia, específicamente en la
cámara de flujo laminar, el proceso a seguir fue: las rodajas de zanahoria se introdujeron en
un beaker con agua destilada estéril. Posteriormente se introdujeron por 30 segundos en otro
beaker que contenía una solución de etanol(70%) y se enjuagó en agua destilada estéril
nuevamente. Seguido a esto, se flameó el borde del beaker,se introdujeron las rodajas y se les
agregó peróxido de hidrógeno(𝐻2𝑂2) al 5% por 5 minutos, se enjuagó en agua destilada
agitándolo constantemente. Por último, se adicionó el hipoclorito de sodio(𝑁𝑎𝑂𝐶𝑙)más 2
gotas de Tween 20. Se mantuvo la agitación durante 5 minutos y se enjuagó en tres
oportunidades con agua destilada estéril. A continuación, se inocularon los cultivos en los
medios preparados en el laboratorio número 3(medio MS suplementado con 0,6 gr de
agar-agar, hormonas 2,4-D y Picloram) para los 7 tratamientos hechos. Sobre el papel filtro
estéril y el uso de pinzas, se retiró el tejido muerto de las rodajas de zanahoria y se cortó en
triángulos de 5mm de grueso y 1 cm de largo. Se separaron 3 muestras de tejido por frasco,
por tanto, fueron 12 tejidos en total para cada tratamiento. Para el caso del tejido tipo hojas,
se utilizó material estéril obtenido del banco de germoplasma de la Universidad. Se cortó
parte del pecíolo y la parte superficial y se colocó dos hojas por cada frasco. Al inocular los
medios, se taparon los medios con papel aluminio y se sellaron con cinta transparente. Luego,
se marcaron los frascos para cada tratamiento y se llevó a crecimiento en oscuridad. La
evaluación de los tratamientos se realizó cada 15 días durante 10 semanas. Durante ese
tiempo se identificaron contaminaciones, oxidaciones u oscurecimientos, inducción de callos
y formación de raíces en los diferentes tratamientos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La siembra de tejidos para la inducción de callos consistió de 7 tratamientos con 4

repeticiones cada uno (3 muestras de tejido en cada repetición), para un total de 84 medios.

Se identificó la formación de colonias oscuras en el medio, lo cual indica contaminación por

hongos en uno de los tratamientos.

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Figura 1. Contaminación por hongos.

Un explante presentó una coloración amarillenta de aspecto cremoso ocasionada por

bacterias endófitas, indicando así una contaminación por estas.

Figura 2. Contaminación por bacterias.

Este tratamiento presentó oscurecimiento en los explantes, lo cual indica una oxidación
ocasionada por un mal procedimiento durante la preparación de los cultivos.

4
Figura 3. Oxidación de los tejidos.

Inducción de callos en los tratamientos de 1,5 mg/ml con las hormonas 2,4 D y Picloram,
respectivamente. La inducción se presentó entre la sexta y octava semana.

Figura 4. Inducción de callos con 2,4-D (A y B).

Se observó la formación de estas en el tratamiento 1,5 mg/ml con la hormona 2,4 D. La

formación se presentó en la sexta semana.

Figura 5. Formación de raíces con 2,4 D.

La tabla 1 muestra los resultados en términos de porcentajes (%) correspondientes para las
observaciones de contaminación, inducción de callos y formación de raíces en cada uno de
los tratamientos establecidos.

Tabla 1. Porcentajes para los distintos tratamientos establecidos.

Los porcentajes más altos de contaminación se obtuvieron por bacterias con 28% y oxidación
por mal procedimiento con 13,0%. El menor porcentaje por contaminación se obtuvo por
hongos con 3,5% (Tabla 1). Los medios contaminados presentan características peculiares,
por ejemplo, la formación de colonias oscuras en la superficie indicó contaminación por
hongos (Figura 1), coloración amarillenta de aspecto cremoso en interior del explante indicó
presencia de bacterias endófitas (Figura 2) y el oscurecimiento en los tejidos señaló oxidación

5
(Figura 3). Estos resultados indicaron que los procedimientos de asepsia en los explantes
fueron deficientes o dichos contaminantes se introdujeron durante la manipulación de los
medios (Debergh y Zimmerman, 1991). Según autores como George (1991) y Leifert et al,.
(1994), mencionan que los contaminantes más frecuentes en condiciones in vitro son por
hongos y bacterias, denominados "vitropatógenos", este término se refiere a aquellos
organismos que no son patógenos para las plantas en campo, pero si en tejidos cultivados in
vitro (Leifert, 1989). Otro factor a tomar en cuenta es el ambiente de trabajo, puesto que es
una fuente de contaminación tanto directa como indirecta, ya que las corrientes de aire y el
suelo están cargados de esporas o células de microorganismos, los cuales son removidos por
acción del operador e ingresan por los acondicionadores de aire, donde proliferan y son
esparcidas en el ambiente.

Los tratamientos suplementados con las auxinas 2,4 D (Figura 3.a) y Picloram (Figura 3.b)
generaron callos entre la sexta y octava semana de incubación. El porcentaje más alto de
callogénesis se obtuvo en los tratamiento 1,5 mg/ml de Picloram con 10,7% y en menor
porcentaje en los tratamientos 1,5 mg/ml de 2,4 D con 7,1%, sin embargo, el mejor
comportamiento en cuanto a formación de raíz fue con 2,4 D con 1,1%, formación que se
observó a la sexta semana de incubación (Figura 5), en comparación a los tratamientos con
picloram los cuales no presentaron formación de raíces. El estímulo inductor del 2,4 D y
picloram sobre los explantes de médula zanahoria, señala que la aplicación de estas auxinas
forman callos en medio MS (Murashige- Skoog, 1962), además, Montero (2001) menciona
que la auxina 2,4-D es necesaria para inducir la formación de callos.

Las hormonas vegetales juegan un papel importante en el establecimiento de la

embriogénesis somática; durante este proceso las células vegetales revierten su estado de
diferenciación adquiriendo pluripotencialidad, llevando dichas células hacia el destino
embriogénico, demostrando la relación entre las hormonas vegetales y las vías moleculares
que controlan el proceso: remodelación de la cromatina, patrón de expresión génica, división
celular, regulación y modificación en la síntesis de proteínas (Jiménez y Thomas, 2005).

CONCLUSIONES

La inducción de callos puede ser utilizada para diferentes propósitos, tales como la
micropropagación y el mejoramiento vegetal.

La contaminación por bacterias y hongos en los explantes es generada por las técnicas
deficientes de esterilización, el ambiente de los laboratorios de trabajo y los operadores.

Los tratamientos suplementados con la hormona de crecimiento 2,4-D mostraron mejor

respuesta en la formación de raíces en comparación con picloram. Sin embargo los
tratamientos con picloram tuvieron mejor respuesta en la formación de callos.

La presencia de hormonas de crecimiento en los medios de inducción, estimulan la formación

de callos y raíces en los explantes.

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CUESTIONARIO

1. ¿Por qué los explantes que contienen células de cambium son excelentes selecciones
para la iniciación de cultivos de callos?

Según Gauthered, 1959 (citado por Dodd y Lorin, 1982) los explantes de las zonas
cercanas al cambium tienen una alta frecuencia de división celular, por tanto las
células se desarrollan y proliferan vigorosamente y sus derivados más cercanos se
dividen vigorosamente y forman un callos grandes.

2. Describa dos de las metodología (s) más adecuadas para medir el crecimiento de
callos?

Con el fin de determinar la producción de callos, en base a varios días de cultivo se

puede calcular utilizando los métodos de peso fresco y peso seco (g) de callos
inducidos (Suárez I. 2020).

Pesado en fresco: Para ello, se toma una muestra al azar de cierta cantidad de callos.
Pesado en fresco inicial, empleando una balanza analítica. Lo siguiente es realizar un
pesado al cabo de varios días peso final y finalmente realizar la siguiente ecuación:

ΔPeso= P.fresco(f)- P.fresco (i)/t

Peso seco: Para la obtención del peso seco, los callos se sometieron a un proceso de
secado en una estufa a ±70 ºC durante 24 horas.

ΔPeso= P.seco(f)- P.seco (i) /t

3. Explique tres razones que justifican la necesidad de subcultivo del tejido inicial para
la inducción de callo.

Es recomendable que los cultivos deben ser subcultivados antes para mantener su
viabilidad al renovarse y así evaluar su rendimiento frente el medio de cultivo antes
del agotamiento de los nutrientes. Por lo cual, los callos son fáciles de mantener y son
los más ampliamente utilizados (Bandyopadhyay S, C Karen, R Gillian, D John.
1999).

4. ¿A cuantas partes por millón equivalen las concentraciones de los reguladores

utilizados en el medio para callo, y cual es su equivalencia en moles para cada una de
ellas? Indique los cálculos.

5. Diga cuáles son las posibles etapas en el desarrollo del callo y su posible
significado. Si no todos los tejidos iniciaron callo, explique por qué?

Los callos proliferan de las células del parénquima. Frecuentemente es el resultado de

una herida o un corte que se haya realizado. Los callos no tienen patrones predecibles
de organización, están presentes en centros localizados de actividad meristemática y a
menudo aparecen en regiones cambiales rudimentarias con zonas de diferenciación
vascular. Una de las características importantes del callo, desde un punto de vista

7
 funcional, es su irregular crecimiento, teniendo el potencial para desarrollar raíces
normales, brotes y embriones que forman plántulas. Al momento de crecimiento de
los callos por cortes o heridas, solo la parte afectada desarrolla callos debido a la
capacidad de manejo adecuado de las condiciones nutricionales y hormonales. (Smith
R. 2012).

6. ¿Fue la contaminación un problema? Explique y recomiende un posible control.

Como en cualquier proceso que involucre técnicas de cultivo, la contaminación por

diversos organismos es muy frecuente y puede que esta práctica de laboratorio no
haya sido la excepción. Nuestros resultados mostraron que más de la mitad de los
frascos evaluados presentaron contaminación bacteriana y fúngica. Ahora bien, las
recomendaciones para evitar estos contaminantes son tener más cuidado al momento
de realizar esta metodología. Durante esta práctica puede pasar que cometan errores
como el de no introducir pinzas o bisturí dentro de los frascos con alcohol antes de
realizar los cortes, o no flamearse en el mechero, estos pasos son importantes ya que
si no se tienen en cuenta puede que agentes contaminantes ya sea por vía aérea, o que
el área de trabajo esté sucio, etc, contaminen dichos instrumentos y por ende de igual
manera las muestras a manipular, se recomienda trabajar siempre cerca del mechero y
usar tapabocas al igual que guantes.

7. Describa tres aplicaciones prácticas del cultivo de callos para la agricultura y/o la
industria.

El tejido calloso tiene un amplio rango de aplicaciones, por ejemplo es empleado

directamente como fuente de material celular para estudios bioquímicos, producción
de metabolitos secundarios; también son utilizados como paso inmediato para la
iniciación de suspensiones celulares. (Shiram V, V Kumar, M Shitole. 2008).

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8
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