Tesis2 Trips en Zarzamora

ii
iii
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue financiada por el proyecto 264756 del Fondo Sectorial SAGARPA-
CONACYT y la beca CONACYT No. 745898 al primer autor para apoyo de estudios de
posgrado dentro del Plan Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC).
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DATOS BIOGRÁFICOS
Datos personales
Nombre Yesica Paola Cubillos Salamanca
Fecha de nacimiento 31 de diciembre de 1992
Lugar de nacimiento Pacho, Cundinamarca, Colombia
Profesión Ingeniera Agroecológica
Cédula profesional 25345-309847 de Colombia
Desarrollo académico
Licenciatura Ingenieria Agroecológica. Corporación
Universitaria Minuto de Dios, Sede Zipaquirá,
Cundinamarca, Colombia (2015)
Maestría Maestría en Ciencias en Protección Vegetal.
Universidad Autónoma Chapingo, Texcoco,
Edo. México, México. (2017)
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RESUMEN
Yesica Paola Cubillos Salamanca
Especies de Trips asociadas a cultivos comerciales de zarzamora en Michoacán y Jalisco
y estado de la resistencia a insecticidas de uso común.
(Noviembre 22, 2017)
(Bajo la dirección de Angel Rebollar Alviter Ph. D).
Los trips son una plaga primaria del cultivo de zarzamora (Rubus sp.) en México. El
objetivo de este estudio fue conocer las especies de trips asociadas al cultivo de zarzamora
en Michoacán y Jalisco y la susceptibilidad de 13 poblaciones de campo de Frankliniella
occidentalis contra malatión, bifentrina y spinosad, tres de los insecticidas más
comúnmente utilizados en el área de producción. La identificación se realizó mediante
técnicas morfológicas y moleculares y la evaluación de la resistencia mediante bioensayos
con el método de inmersión foliar, las CL50 y CL95 se calcularon mediante análisis probit.
Los estudios moleculares indicaron que las principales especies asociadas a zarzamora
fueron F. occidentalis y F. borinquen. Además, la identificación morfológica añadió a F.
tolucensis, Retanathrips funestus, Tenothrips frici y una nueva especie del género
Frankliniella. Todas las poblaciones evaluadas mostraron diferencias significativas en la
sensibilidad a bifentrina, malatión y spinosad con la población susceptible (LC=95%) y
mostraron resistencia a los tres insecticidas. Las proporciones de resistencia obtenidas en
este estudio indica la existencia de resistencia de F. occidentalis a los tres insecticidas. Se
sugiere establecer planes de gestión de resistencia en el contexto de MIP.
PALABRAS CLAVE: resistencia, organofosforados, spinosinas, piretroides, manejo
integral de plagas.
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ABSTRACT
Yesica Paola Cubillos Salamanca
Thrips Species associated with commercial crops of Blackberry in Michoacan and
Jalisco and state of resistance to common Insecticides
November 22, 2017
(Under the direction of Angel Rebollar Alviter Ph. D.)
Thrips are a primary pest of blackberry (Rubus sp.) cultivation in Mexico. The objective
of this study was to know the thrips species associated with blackberry crop in Michoacán
and Jalisco and the susceptibility of 13 field populations of Frankliniella occidentalis
against the malathion, bifenthrin and spinosad three of the insecticides most commonly
used in the production area. The identification was made by morphological and molecular
techniques and the evaluation of resistance by bioassays with the leaf immersion method,
the LC50 and CL95 were calculated by probit analysis. Molecular studies indicated that
the main species associated with blackberry were F. occidentalis, F. borinquen. In
addition, morphological idenfication added F. tolucensis, Retanathrips funestus,
Tenothrips frici and a new species of the genus Frankliniella. All the tested populations
showed significant differences in sensitivity to bifenthrin, malathion and spinosad with
the susceptible population (LC=95%) and showed resistance to the three insecticides. The
proportions of resistance obtained in this study indicated revels the existence of resistance
of F. occidentalis to the three insecticides. It is suggested to establish Resistance
Management plans in the context of IPM.
KEY WORDS: resistance, organophosphorus, spinosyns, pyrethroids, integral
management of pests.
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TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………..14
2. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………...17
3. HIPÓTESIS…………………………………………………………………….18
4. OBJETIVOS……………………………………………………………….......19
4.1. Objetivo general……………………………………………………………….19
4.2. Objetivos específicos…………………………………………………………..19
5. REVISIÓN DE LITERATURA……………………………………………….20
5.1. El cultivo de Zarzamora en México…………………………………………..20
5.2. Biología de los Trips………………………………..……………..…………..21
5.2.1. Taxonomía…………………………………………………..……….....22
5.2.2. Ciclo de vida…………………………………………………………….23
5.3. Especies reportadas en Rubus sp……………………………………………..24
5.4. Hospederos…………………………………………………………………….25
5.5. Identificación morfológica y molecular de los trips….……………….…….26
5.5.1. Técnicas de identificación morfológica………………………………..26
Montaje y preparación…………………………………………26
Claves taxonómicas…………………………………………….28
5.5.2. Técnicas de identificación molecular………………………………….28
Extracción de ADN…………………………………………….28
Genes a amplificar y primer específicos……………………….29
5.6. Evaluación de la resistencia a insecticidasen insectos……………………….31

viii
5.6.1. Definición de resistencia………………………………………………31
5.6.2. Factores que contribuyen al desarrollo de la resistencia……………31
5.6.3. Tipos de resistencia……………………………………………………32
5.6.4. Mecanismos de resistencia a insecticidas…………………………….34
5.6.5. Métodos de detección de resistencia………………………………….35
5.6.6. Insecticidas autorizados para el cultivo de zarzamora………………36
6. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………..38
6.1. Ubicación y áreas de muestreo de trips………………………………………38
6.2. Identificación de especies de trips asociadas zarzamora……………………38
6.2.1. Métodos de colecta y conservación de trips…………………………..38
6.2.2. Identificación morfológica…………………………………………….39
6.2.3. Identificación molecular………………………………………………39
Extracción y cuantificación de ADN…………………………..39
Amplificación del ADN………………………………………...41
Secuenciación y análisis filogenético…………………………..41
6.3. Evaluación de resistencia a insecticidas……………………………………...42
6.3.1. Poblaciones de F. occidentalis…………………………………………42
6.3.2. Cría de F. occidentalis………………………………………………….42
6.3.3. Intensidad de uso de insecticidas en las regiones de Michoacán y
Jalisco…………………………………………………………………...44
6.3.4. Insecticidas……………………………………………………………..45
6.3.5. Bioensayos……………………………………………………………...45
6.3.6. Análisis de datos de la evaluación de resistencia…………………….46
7. RESULTADOS………………………………………………………………...47
ix
7.1. Especies de trips asociadas a Zarzamora…………………………….47
7.2. Resistencia de Frankliniella occidentalis a spinosad, bifentrina y
malation………………………………………………………………………...54
8. DISCUSIÓN……………………………………………………………………60
9. CONCLUSIONES……………………………………………………………..70
10. ANEXOS…………………………………………………………………...…..71
11. LITERATURA CITADA……………………………………………………...73
x
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Insecticidas autorizados por Anaberries (2017) para el control de F.
occidentalis en cultivos de zarzamora en México............................................................ 24
Cuadro 2. Zonas de colecta de trips, en cultivo de zarzamora, para la identificación
morfológica y molecular. ................................................................................................. 27
Cuadro 3. Origen de las poblaciones sometidas a evaluación de resistencia a insecticidas
y sistemas de producción de zarzamora. 2016-2017 ........................................................ 30
Cuadro 4. Concentraciones seleccionadas para evaluación de la resistencia en
poblaciones de F. occidentalis provenientes de zarzamora (Rubus sp.) cultivada en
Michoacán y Jalisco, México. .......................................................................................... 34
Cuadro 5. Pendientes, concentraciones letales y proporciones de resistencia de las
poblaciones de F. occidentalis tratadas con spinosad en 13 poblaciones provenientes de
zonas productoras de zarzamora de Michoacán y Jalisco, Mexico. ................................. 44
Cuadro 6. Pendientes, concentraciones letales y proporciones de resistencia en las
poblaciones de F. occidentalis tratadas con malation en 13 poblaciones provenientes de
zonas productoras de zarzamora de Michoacán y Jalisco, Mexico.................................. 45
Cuadro 7. Pendientes, concentraciones letales y proporciones de resistencia en las
poblaciones de F. occidentalis tratadas con bifentrina en 13 poblaciones provenientes de
zonas productoras de zarzamora de Michoacán y Jalisco, Mexico. ................................. 46
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Método de Espinosa et al. (2002) para cría masiva de F. occidentalis. A y B)
vainas de frijol en proceso de desinfección, C) recipientes de cría y D) cámara
bioclimática. ..................................................................................................................... 31
Figura 2. Evaluación de resistencia de acuerdo al método propuesto por Bielza et al.,
(2009). A) Secado en cámara de flujo laminar de las secciones de hoja de frijol
impregnadas con los insecticidas, B) tubos eppendorf de 1.5 mL y D) Estereoscopio. .. 34
Figura 3. A) Hembra adulta de Frankliniella occidentalis (Pergande) colectado en el
municipio de los Reyes de Salgado, Michoacán (8-10/2016) B) III y IV segmento antenal
en forma de cono bifurcado, C) Pronoto, D) Tergitos IX y X. ........................................ 36
Figura 4. A) Hembra adulta de Frankliniella borinquen (Hood) Colectado en el municipio
de Ziracuaretiro, Michoacán (23-09/2016). B) antena, pedicelo y segmentos IV – VIII, C)
Tergitos IV y V, D) Tergito VIII D) Tergitos IX y X ...................................................... 36
Figura 5. Productos de PCR, fotodocumentacion en gel de agarosa. Las muestras 17, 19
y 21 corresponden a individuos colectados en el municipio de Ziracuaretiro, las muestras
26 y 27 corresponden a individuos colectados en el municipio de los Reyes de Salgado y
las muestras 51, 52, 58, 63, 67, 68 y 72 corresponden a muestras colectadas en el
municipio de Tacámbaro. La muestra N hace referencia al control negativo. Las dobles
barras que se observan en las muestras 17, 58, 63, 67, 68 y 72 obedecen a grandes
cantidades de ADN. ......................................................................................................... 37
Figura 6. Árbol filogenético mediante el método Neighbor joining que muestra relación
genética basada en secuencias de COI de tres especies de trips identificadas en cultivos de
xii
zarzamora en Michoacán y Jalisco. Las letras corresponden al municipio donde se
colectaron los individuos y el número a la muestra asi: Z = Ziracuaretiro (24, 58, 8, 7, 6,
1, 63, 24 y 4), T = Tacámbaro (16, 15, 14 y 19), R = Reyes de Salgado (12, 9 y 10) y M =
Mazamitla (22, 23 y 21). .................................................................................................. 40
Figura 7. Gráfica comparativa entre la CL95 de la población susceptible y CL95 de la
población resistente para cada insecticida A) Z5 (spinosad), B) R2 (malation) y C) Z3
(bifentrina)........................................................................................................................ 43
xiii
1 INTRODUCCIÓN
El cultivo de zarzamora (Rubus sp.) se considera como un cultivo no tradicional y
relativamente nuevo en México, pero en la década de los 90`s, se posicionó como un
sistema productivo en auge y prometedor. Durante los últimos 10 años, México multiplicó
2.7 veces la producción de berries, siendo la zarzamora la segunda en importancia después
de la fresa (Fragaria sp.) (SAGARPA, 2014).
Según el SIAP (2017), el cultivo de zarzamora cuenta con 12,433 hectáreas cultivadas, de
las cuales el 93.5%; es decir 11,625 ha son cosechadas, con una producción total de
182,861 toneladas y un rendimiento promedio de 15.7 ton ha-1, representando
exportaciones de 5000 millones de pesos (mdp), siendo el estado de Michoacán el más
representativo, el cual contribuye con el 96% de la producción nacional y el 98% del valor
total generado, posicionándose como el principal productor y exportador de zarzamora del
país, resaltando además que la región de Jalisco es líder en producción de arándano
(Vaccinium sp.) y frambuesa (Rubus idaeus) y tiene una de las tasas de crecimiento más
importante del país. Sin embargo la elevada concentración del cultivo de zarzamora en
dichas regiones ha implicado un riesgo potencial, debido a la aparición de nuevos
problemas fitosanitarios, y al crecimiento de plagas y enfermedades. Dentro de los
principales problemas fitosanitarios se han documentado enfermedades como mildiu
(Peronospora sparsa Berk.) (Boyzo-Marin et al., 2015), moho gris, Fusarium oxysporum
(Rebollar-Alviter et al., 2016) y trips principalmente del género Frankliniella (Johansen-
Naime et al., 2003).

1
Entre estos problemas fitosanitarios sobresalen los trips, que son considerados una plaga
cosmopolita identificada desde la década de los 90 en la región de California. De este
grupo se han reportado más de 5000 especies pertenecientes al orden Thysanoptera, entre
las cuales destaca el trips occidental de las flores Frankliniella occidentalis Pergande,
1895 (Thysanoptera: Thripidae), por su distribución mundial, su capacidad de sobrevivir
bajo condiciones muy cambiantes y por su alto potencial reproductivo (Mound, 2017).
Frankliniella occidentalis ha sido reportado atacando más de 250 plantas cultivadas entre
los que se destacan cultivos de cacahuate (Arachis hypogaea), zarzamora (Rubus sp.),
fresa (Fragaria sp.), aguacate (Persea americana), hortalizas, flores, ornamentales, entre
otros (Ripa et al., 2008; Castresana et al., 2008).
Plagas de este tipo se han manejado desde hace cerca de 50 años con aplicaciones de
agroquímicos, como legado de la revolución verde, sin embargo, por causa del uso
intensivo, varios de los insecticidas han perdido eficacia debido a que los insectos tienen
la capacidad inherente de evolucionar, adaptarse y desarrollar resistencia para asegurar su
supervivencia, situación que es muy común en zonas de cultivos intensivos (Cloyd y
Cowles, 2011). Entre estos, los trips son una de las principales plagas que ha presentado
resistencia a diferentes moléculas químicas, que hace algunos años eran eficaces en su
control (IRAC, 2013). Se han reportado poblaciones de F. occidentalis resistentes a los
grupos toxicológicos de los organoclorados, organofosforados, piretroides (Inmaraju et
al., 1992; Espinosa et al., 2002), carbamatos (Bielza et al., 2009) y spinosinas en gran
variedad de cultivos hortícolas (Bielza et al., 2007).
En poblaciones de F. occidentalis de cultivos hortícolas bajo invernadero en Almería se
determinó que la resistencia ligada a spinosad es de tipo genética (Bielza et al., 2007),
2
otras poblaciones colectadas en cultivos de rosas, claveles y crisantemos de San Diego
California fueron resistentes a bifentrina, permetrina, metomilo, clorpirifos y abamectina
con resistencia de tipo metabólica por aumento de las oxidasas de función múltiple (MFO)
(Inmaraju et al., 1992) y en poblaciones del sureste de España colectadas en pimiento
dulce, tomate, lechuga, alcachofa, melón, pepino, clavel, habichuelas, durazno y ciruelo
se evidenció resistencia a metamidofós, acrinatrina, endosulfán, deltametrina y
formetanato (Espinosa et al., 2002).
Los productores de zarzamora de los estados de Michoacán y Jalisco reportan fallas en el
control por los insecticidas autorizados y pérdidas significativas de rendimiento y calidad
a causa de los trips. Sin embargo, no se cuenta con estudios que evidencien la existencia
de resistencia a insecticidas y las especies presentes en dichos cultivos. Estudios
preliminares (no publicado) de la frecuencia de uso de insecticidas para el control de trips
en Michoacán y Jalisco indicaron que el malatión, bifentrina y spinosad fueron los más
usados. Dicha problemática probablemente se ve incrementada por la falta de
conocimiento de las especies de trips que se asocian a este cultivo en las zonas productoras
de estos estados.
Por lo anterior el objetivo de esta investigación fue identificar las especies de trips
asociadas a cultivos comerciales de zarzamora en Michoacán y Jalisco y evaluar el estado
de resistencia de la especie predominante a los insecticidas de mayor uso en las principales
zonas productoras. Los resultados contribuirán al diseño de estrategias de manejo más
efectivas que reduzcan los daños con una visión en el contexto del manejo integrado de
plagas.
3
2 JUSTIFICACIÓN
Los sistemas agrícolas actuales se enfrentan a grandes retos derivados de diversos factores
como el aumento en la demanda mundial de alimentos y los efectos adversos del cambio
climático. En los sistemas intensivos de producción, se han presentado plagas y
enfermedades cada vez más difíciles de combatir, debido a que generan resistencia a
moléculas insecticidas que han sido usadas indiscriminadamente (Savary et al., 2011;
García-Méndez et al., 2016). Por ello, se hace necesario implementar nuevas técnicas de
control que permitan desarrollar estrategias de manejo capaces de hacer frente a las
poblaciones de plagas cambiantes, partiendo del estudio y conocimiento del estado de
resistencia a insecticidas. Rodríguez-Romero et al. (2011) consideraron la identificación
de la plaga como la base para el desarrollo de un manejo integrado y García-Méndez et
al. (2016) proponen los estudios de resistencia como una estrategia fundamental para
elaborar dichos planes de manejo, puesto que conociendo el nivel de la susceptibilidad del
blanco biológico a diferentes insecticidas, se pueden generar técnicas que combatan
eficientemente la plaga. Estos estudios deben realizarse para cada zona específica teniendo
en cuenta el historial del uso de insecticidas. Por ello, fue necesario identificar las especies
de trips asociadas a cultivos de zarzamora en Michoacán y Jalisco y evaluar el estado de
resistencia de la especie dominante a las moléculas insecticidas de mayor uso en la zona.
Con dicho estudio se generó información relevante para los productores de la región
respecto a las especies presentes en cada zona, el estado de la resistencia y contribuir al
diseño de planes de manejo integrado de plagas basados en el manejo de la resistencia a
insecticidas.
4
3 HIPÓTESIS
Ho1: F. occidentalis es la especie con mayor prevalencia en los cultivos de zarzamora en
la regiones productoras de los estados de Michoacán y Jalisco.
Ho2: al menos una población de F. occidentalis presenta resistencia a una molécula
insecticida evaluada.
5
4 OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
 Identificar las especies de trips asociadas a cultivos comerciales de zarzamora en
Michoacán y Jalisco y evaluar el estado de resistencia de la especie predominante
a los insecticidas de mayor uso en la zona.
4.2. Objetivos Específicos
 Identificar taxonómica y molecularmente las diferentes especies de trips asociadas
a cultivos de zarzamora en la región de Michoacán y Jalisco.
 Determinar el estado de resistencia en la especie de trips con mayor prevalencia
en los cultivos de zarzamora frente a las moléculas insecticidas de mayor uso en
las principales zonas productoras de los estados de Michoacán y Jalisco.
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5 REVISIÓN DE LITERATURA
5.1. El Cultivo de Zarzamora en México
La zarzamora pertenece al género Rubus, el cual comprende aproximadamente 700
especies; es una planta arbustiva espinosa, que alcanza alturas entre los 150 y 200 cm.
Posee flores blancas o rosadas y frutos o polidrupas en forma de baya rojos, púrpuras o
negros, se encuentra en forma de vida silvestre en grandes extensiones de las regiones
templadas del mundo. El cultivo de zarzamora (Rubus sp.) se considera no tradicional y
relativamente nuevo en México, se inició en Tetela de Volcán, Morelos en el año de 1985
(Pérez-Barraza y Vázquez-Valdivia, 2004); hacia la década de los 90 se posicionó como
un sistema productivo en auge y en solo una década (de 1995 a 2006) alcanzó un
crecimiento medio anual del 40% en su producción y del 170% referente a exportaciones
(Sánchez, 2008).
Durante los últimos 10 años, la producción de berries se multiplicó 2.7, siendo la
zarzamora la segunda en importancia después de la fresa; México se catalogó, para el año
2008, como el mayor exportador de zarzamora en fresco a nivel mundial. El mayor estado
productor actualmente es Michoacán que representa el 96% de la producción nacional,
actualmente la zarzamora cuenta con 12,433 hectáreas sembradas, con una producción
total de 182,861 toneladas y un rendimiento promedio de 15.7 ton ha-1 (SIAP, 2017).
La zarzamora ha logrado éxito comercial debido al mejoramiento genético de variedades
y la producción de híbridos, sin embargo debido a la alta concentración del cultivo, en
7
zonas determinadas y por más de 10 años, se han presentado diferentes problemas
fitosanitarios dentro de los cuales destacan los trips que se han convertido en limitantes
para el cultivo (Albendin et al., 2012; Aguirre et al., 2013).
5.2. Biología de los trips
Los trips son insectos del orden Thysanoptera, el cual reúne cerca de 5000 especies. Se
caracterizan por medir entre 1 y 5 mm. La mayoría de especies son tetrápteros con alas
membranosas semejantes entre sí; sin embargo otras especies pueden ser ápteras o
braquípteras (Triplehorn y Johnson, 2005). La cabeza es pequeña de tipo hipognato, con
ojos compuestos, ocelos, antenas (moniliformes o filiformes) y aparato bucal raspador
chupador (Capinera, 2001). Tienen la capacidad de reproducirse de forma anfigónica y
por partenogénesis. Las hembras son de mayor tamaño y se caracterizan por tener el
abdomen ovalado, la oviposición la realizan insertando los huevos en el interior de tejidos
vegetales o sobre éstos (Triplehorn et al., 2005). La mayoría son de hábitos fitófagos, sin
embargo existen especies fungívoras, zoófagas y depredadoras (Mannion et al., 2001). La
metamorfosis es intermedia o neometábola: presentando huevo, larva (estado 1 y 2), ninfa
(estado 1 y 2) y adulto.
Los trips son considerados una plaga de importancia económica debido a su corto ciclo de
vida, el alto potencial reproductivo, el gran número de hospederos, alta movilidad
facilitada por las corrientes de aire que permite su rápida distribución (Johansen-Naime et
al., 2003; Triplehorn et al., 2005; Albendin et al., 2012) y la capacidad de transmitir virus
como el de la marchitez manchada del tomate (TSWV) en cultivos como tomate y
crisantemo (Margaria et al., 2014).
8
Las especies fitófagas causan dos tipos de daños: directos (Broughton et al., 2015) e
indirectos (Margaria et al., 2014). Los daños directos se producen como resultado de la
alimentación de la plaga donde laceran y desgarran tejidos vegetales, afectando
severamente la calidad de la fruta causando manchado, coloraciones plateadas, frutos
agrietados, partidos, deformes e incluso pueden causar la caída de estos (Aguirre et al.,
2013). Los daños indirectos se producen por la entrada de patógenos a través de las heridas
(Ripa et al., 2008), principalmente del virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV)
(Margaria et al., 2014).
5.2.1. Taxonomía
El orden Thysanoptera (Haliday, 1836) pertenece al reino Animalia, Phylum Arthropoda,
Clase Insecta, Subclase Pterygota, Superorden Exopterygota. El orden Thysanoptera
posee dos sub-ordenes: Terebrantia y Tubulifera. En el suborden Terebrantia se
encuentran la mayoría de especies fitófagas y se clasifican aquellas especies donde la
hembra presenta terebra, el abdomen es en forma cónica, mientras que en los machos es
redondeado, las alas presentan microtriquias, las alas anteriores son paralelas con
nervadura costal dispuestas en estado de reposo a lo largo del cuerpo (Mound, 2013).
En el suborden Tubulifera, la mayoría de especies son zoófagas y fungívoras, sin embargo
algunas son fitófagas; la hembra no presenta terebra, el último segmento abdominal es
tubular en ambos sexos, poseen alas anteriores sin microtriquias y sin nervadura costal
(Mound, 2013).
Dentro del suborden Terebrantia se encuentran las familias Adiheterothripidae,
Aeolothripidae, Fauriellidae, Hemithripidae, Heterothripidae, Karataothripidae,
9
Melanthripidae, Merothripidae, Thripidae, Triassothripidae y Uzelothripidae. Este
suborden es el de mayor importancia económica debido a que se encuentra distribuido a
nivel mundial e incluye cerca de 2400 especies; la familia Thripidae es la más numerosa
con 2060 especies descritas, dentro de esta familia se encuentran los géneros Frankliniella
que incluye 233 especies (Mound, 2007; Albendin et al., 2012). La familia Thripidae a su
vez se divide en cuatro subfamilias: Thripinae que contienen 225 géneros con 1700
especies dentro de las que destaca Thrips tabaci y F. occidentalis, la subfamilia
Panchaetothripinae cuenta con 35 géneros dentro de los cuales están 125 especies, de las
que destacan Heliothrips haemorroidalis (Bouché) y Selenothrips rubrocinctus (Giard),
la subfamilias Dendrothripinae y Sericothripinae poseen 13 y 3 géneros, respectivamente
(Torres-Vila et al., 1998; Mound, 2007).
Dentro del suborden Tubulifera se encuentra la familia Phlaeothripidae, dividida en dos
subfamilias: Phlaeothripinae e Idolothripinae, la subfamilia Phlaeothripinae cuenta con
370 géneros que incluyen a 2800 especies, aunque más de la mitad de especies presentan
hábitos alimenticios fungívoros, algunas especies del genero Liothrips, Haplothrips y
Gynaikothrips han sido reportadas asociadas a cultivos de aguacate, liliaceas y
orchidaceas (Mound, 2007).
5.2.2. Ciclo de vida
Los trips tienen un ciclo de vida corto, entre 15 y 23 días, con condiciones ambientales
favorables: temperaturas entre 13°C y 25°C (considerando que algunas especies toleran
niveles máximos de 50°C y mínimos de 5°C), y humedad relativa del 60%, las hembras
pueden vivir en promedio 45 días y los machos cerca de 60 días (Bustillo, 2009).
10
Los trips pasan por cuatro estadios: huevo, larva (L1 y L2), ninfa (proninfa y ninfa) y
adulto, la mayoría de especies ovipositan dentro de los tejidos vegetales, sin embargo
algunas especies poseen ovipositor débil y realizan las posturas en la superficie de la
planta. El huevo puede ser oblongo, alargado u oval, de color blanquecino de 0.27 mm de
longitud aproximadamente y eclosionan entre 3 y 4 días (Zhang et al., 2007). El primer
instar larval es de amarillo claro y hasta el segundo instar se logra diferenciar los sexos,
poseen gran actividad alimenticia y movilidad, las ninfas ciclan en el suelo, tienen baja
actividad alimenticia y poca movilidad, los adultos presentan coloración oscura, órganos
desarrollados y las hembras son de mayor tamaño que los machos (Goldarazena, 2011).
Su reproducción puede ser de forma anfigónica o por partenogénesis de tres tipos: telitoca
donde la especie se perpetúa por hembras no fecundadas, la partenogénesis arrenotoca
(característico del genero F. occidentalis) donde las hembras no fecundadas dan lugar a
machos haploides y la partenogénesis deuterótoca que está influenciada por la
temperatura, dándose origen a una nueva generación de machos si la temperatura es fresca
y de hembras si son temperaturas altas (Nault et al., 2006; Kummy Moritz, 2008).
5.3. Especies de trips documentadas en Rubus sp.
A nivel mundial, en el cultivo de zarzamora se han documentado principalmente especies
de trips de los géneros Frankliniella y Thrips en países de sur, centro y norteamerica y en
el oriente español (Johansen-Naime et al., 2001; Ripa et al., 2008). Liñán (1998) reportó
las especies Aeolothrios intermedius Bagnal, Drepanothrips reuteri Uzel, Frankliniella
intonsa Trybom, F. occidentalis, Thrips angusticeps Uzel, Thrips meridionalis Priesner,
asociadas a cultivos de rosáceas.
11
En México se ha documentado con mayor frecuencia las especies F. occidentalis y T.
tabaci, afectando cultivos de zarzamora y fresa (Johansen-Naime et al., 2003; Ávila-
Quezada et al., 2005; Aguirre et al., 2013). Sin embargo Johansen-Naime et al. (2001)
indicaron que existen 54 especies de trips fitófagos identificadas en México, como plagas
de importancia económica asociadas a frutales. Dentro de los principales géneros se
encuentran Frankliniella, Scirtothrips, Thrips y Bravothrips, afectando cultivos de
rosáceas, aunque no se especifica si en zarzamora. Otra especie documentada en México
en cultivos de zarzamora silvestre fue Neohydatothrips signifer (Priesner) (Johansen-
Naime et al., 2001; Ripa et al., 2008).
5.4. Hospederos
Las principales especies de trips reportadas en zarzamora pertenecen a los géneros
Frankliniella y Thrips (Johansen-Naime et al., 2001). Dentro de estos géneros destacan
las especies F. occidentalis y T. tabaci. Sin embargo F. occidentalis es una especie
altamente polifaga, de distribución cosmopolita que puede afectar a mas de 250 especies
vegetales distribuidas en 65 familias que figuran como hospederos, dentro de las que
destacan solanáceas como papa (Solanum tuberosum), tomate (Solanum lycopersicum),
rosáceas como durazno (Prunus pérsica), ciruelo (Prunus domestica), zarzamora (Rubus
sp.), fresa (Fragaria sp.), caryophyllaceas como el clavel (Dianthus caryophillus),
asteráceas como el crisantemo (Chrysanthemun sp.), fabáceas como el frijol (Phaseolus
vulgaris) y chícharo (Pisum sativum), cucurbitáceas como el melón (Cucumis melo),
calabaza (Cucurbita maxima) y pepino (Cucumis sativus) malváceas dentro de las que
destaca el algodón (Gossypium sp.), lauráceas como el aguacate (Persea americana), entre
otras (CABI, 2017).
12
En Mexico F. occidentalis se ha documentado asociada a cultivos de aguacate, durazno
(Prunus persica), rosas (Rosa centifolia), calabaza, crisantemo. Sin embargo para el caso
especifico de zarzamora silvestre se ha detectado a la especie F. brunnescens (Johansen-
Naime et al., 2001). Respecto a T. tabaci, tambien es una especie con distribución
cosmopolita y además de encontrarse en zarzamora, se ha reportado asociada a cultivos
de cebolla (Allium cepa), ajo (Allium sativum), puerro (Allium ampeloprasum), repollo
(Brassica oleracea), frijol, tomate, pepino, espárragos (Asparagus officinalis), alfalfa
(Medicago sativa), algodón y ornamentales (Alston y Drost, 2008).
5.5. Identificación morfológica y molecular de los trips
La identificación de trips normalmente se realiza mediante carácteres morfológicos; sin
embargo, para mayor precisión se requiere reforzar esta identificación mediante técnicas
moleculares ya que estas brindan mayor certeza en el diagnóstico, detección e
identificación de especies; la identificación morfológica se ve limitada a los especímenes
adultos, puesto que no existen claves taxonómicas adecuadas para identificación de otros
estadios como huevo, larva o ninfa, mientras la identificación molecular permite utilizar
cualquier estadio de la plaga.
5.5.1. Técnicas de identificación morfológica
Montaje y preparación
Para la identificación morfológica existen diversos protocolos que describen los procesos
de colecta de individuos, preservación, montaje y preparación para revisión al
microscopio. Mound y Kibby (1998) desarrollaron un protocolo aceptado a nivel mundial
13
en la identificación de plagas fitófagas del orden Thysanoptera. Este protocolo indica que
se deben transferir los especímenes del líquido de conservación (alcohol al 75%) a etanol
al 70%, usando alfileres entomológicos se debe desplegar las patas, alas y antenas. Cada
espécimen se ubica con la parte ventral hacia arriba en una gota de Medio Hoyer sobre el
centro de un portaobjetos y se cubre con el cubreobjetos. Posteriormente se debe introducir
el portaobjeto a un horno de secado a 40ºC durante 6 horas y por último se procede a hacer
el estudio.
Echeverria-Flores et al. (2004) realizaron el proceso de identificación morfológica de trips
en el cultivo de aguacate mediante separación de morfos de acuerdo a colecciones de
referencia y recomendaron el envió de muestras a especialistas para corroboración.
El protocolo desarrollado por Johansen-Naime y Mojica-Gúzman (1997) es utilizado
cuando se requiere identificar gran cantidad de especímenes, debido a la rapidez del
método; el protocolo descrito consiste en someter a los especímenes en un proceso de
deshidratación progresiva en alcoholes al 70, 80, 96 y 100%, donde se dejan en reposo
por espacio de 10 minutos en cada concentración. Posteriormente, los insectos se
transfieren a aceite de clavo por 5 minutos con el objetivo de ser aclarados y por último
se montan de forma individual en una gota de bálsamo de Canadá sobre un portaobjetos,
dejando secar los montajes a temperatura ambiente. Este procedimiento también es
conocido como preparación rápida para estudio de identidad taxonómica y técnica
permanente del bálsamo de Canadá (Lacasa et al., 1988).
14
Claves taxonómicas
Las claves taxonómicas más utilizadas para identificación de trips son las de Lewis (1968),
Johansen-Naime (1987), Mound et al. (1993), Soto y Retana (2003), Johansen-Naime y
Mojica-Gúzman (2003) y Mound y Kibby (1998).
5.5.2. Técnicas de identificación molecular
La identificación molecular consiste en la aplicación de técnicas biotecnológicas para
identificar organismos mediante estudio de su ADN (Herrera-Vásquez y Barba-Alvarado,
2013). Existen diversos protocolos específicos para identificar toda clase de organismos.
Sin embargo, la mayoría obedece a técnicas de extracción de ADN, amplificación con
PCR (reacción en cadena de la polimerasa), PLFR (polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción), electroforesis y secuenciación.
Extracción de ADN
La extracción de ADN puede realizarse de huevos, larvas, pupas o adultos, incluso de
individuos incompletos, para la extracción de ADN los trips se maceran en un tampón de
lisis en un microtubo (de 1.5 ml), utilizando un micromortero. El homogeneizado se
recoge con un equipo de extracción de ADN a base de una proteinasa-K. Otro método
consiste en moler el individuo en 50 μl de agua libre de nucleasas, antes de añadir 50 μl
de un compuesto 1:1 (volumen por volumen) de resina Chelex 100 y agua libre de
nucleasas, calentado a 95ºC y centrifugado a 11.000 g durante 5 minutos. El sobrenadante
se transfiere a un microtubo y se almacena a −20ºC (Mound y Morris, 2007).
15
Genes a amplificar y primers específicos
Estudios de Toda y Komazaki (2002) describen el procedimiento de PCR - PLFR basado
en la secuencia ITS2 para la identificación de nueve especies de trips (del género Thrips
y Frankliniella). El método consiste de una PCR convencional donde se utilizaron primers
localizados en las regiones 5.8 S y 28 S flanqueando la región ITS2 de ADN ribosomal,
estos fueron: 5′-TGTGAACTGCAGGACACATGA-3` y 5′-
GGTAATCTCACCTGAACTGAGGTC-3′. Para la mezcla de reacción se utilizaron 20 μl
compuestos de: 1 μM de cada primer, 250 μM de dNTPs, 1 unidad de AmpliTaq Gold
DNA polimerasa, 5,2 μl de tampón de reacción 10x (con 25 mM de MgCl2) y 0,5 µl de
ADN. La PCR se realizó en un termociclador convencional con las siguientes condiciones:
9 minutos a 95ºC, 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, y 1 minuto a 72ºC,
seguido de una extensión final de 7 minutos a 72ºC y el proceso de enfriado fue a
temperatura ambiente. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de
agarosa al 20% donde se digirieron 5 μl de producto de la PCR sin purificación con la
enzima RsaI.
Brunner et al. (2002) documenta el procedimiento mediante PCR-PLFR basado en la
secuencia del citocromo oxidasa subunidad I (COI) para la identificación de 10 especies
de trips. Los primers específicos empleados se encuentran localizados en la secuencia del
gen mitocondrial COI, estos son: mtD-7.2F (5′-ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCATT-
3′) y mtD9.2R (5′-CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTCTG-3′).
Estos primers amplifican un fragmento de 433 pb en todas las especies. Se empleó 50 μl
de mezcla de reacción, compuestos de: 0,76 μM de cada primer, 200 μM de dNTPs, 1
16
unidad de Taq ADN polimerasa, 5 μl de tampón de reacción 10x (con 15 mM de MgCl2),
1 µl de ADN. La PCR se realizó en un termociclador estándar con las siguientes
condiciones: 1 min a 94ºC, 40 ciclos de 15 Segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 45
segundos a 72ºC, seguido de una extensión final de 10 minutos a 72ºC y proceso de
enfriado a temperatura ambiente. Posteriormente se analizaron 5 µl de producto de la PCR
por electroforesis en gel de agarosa al 1.0-2.0% para medir el tamaño del fragmento
producido después de la amplificación. Por último se digieren 5 µl de producto de la PCR
sin purificación con las enzimas AluI y Sau3AI en reacciones separadas.
Los productos de la PCR digeridos se separan por electroforesis en gel de agarosa y
posteriormente se realiza la secuenciación. La amplificación por PCR en tiempo real o
PCR-PLFR también se realiza en una muestra sin ADN sirviendo como control negativo
indicando una posible contaminación del reactivo y falsos positivos; con todos los
métodos moleculares se debe usar controles apropiados, se debe incluir un extracto de las
especies de trips de interés, positivo validado, como muestra adicional para asegurar que
la amplificación tenga éxito (Brunner et al., 2002). Para el orden Thysanoptera existen
cuatro primers específicos: ITS1 (5´-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3´), ITS2 (5´-
TGTGAACTGCAGGACACATG-3´) c, CS249 (5´- TCGTAACAAGGTTTCCG-3´) y
CS250 (5´-GTTRGTTTCTTTTCCTC-3´) (Rodríguez-Romero et al. 2011). Las
condiciones de PCR recomendadas para estos primers son: desnaturalización inicial a
95ºC por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1 minuto, alineamiento a
54ºC por 1 minuto, extensión a 72ºC por 1 minuto y 45 segundos, por ultimo 1 ciclo de
extensión prolongada a 72ºC por 15 minutos, las electroforesis se realizaron en un gel de
agarosa al 1% utilizando la solución amortiguadora TBE 1X (Rugman et al., 2006).
17
5.6. Evaluación de la resistencia a insecticidas en insectos
5.6.1. Definición de resistencia
Según el Comité de acción de resistencia a Insecticidas (IRAC, 2017) la resistencia a
insecticidas se define como “un cambio heredable en la sensibilidad de una población de
una plaga que se refleja en repetidos fallos de un producto para alcanzar los niveles de
control esperados al ser usado de acuerdo con las recomendaciones de la etiqueta para
esa plaga”.
La resistencia se ha convertido en un limitante en la protección de cultivos, derivada del
uso abusivo o mal uso de insecticidas en el control de una plaga, que conlleva a la
selección de los individuos que poseen características fenotípicas de resistencia y a la
evolución de la población (IRAC, 2017).
Todas las poblaciones se distribuyen de forma normal existiendo individuos altamente
susceptibles, otros altamente resistente y la mayoría de la población se encuentra dentro
de la media, debido a la variabilidad natural. Cuando se usa un insecticida de forma
intensiva ya sea aumentando la dosis porque la anterior no ejercía el control esperado o
aumentando la frecuencia de aplicaciones, se está ejerciendo una presión de selección que
obliga a la evolución de la población (Lagunes-Tejeda et al., 2009).
5.6.2. Factores que contribuyen al desarrollo de la resistencia
Los factores que contribuyen al desarrollo de la resistencia se clasifican en tres tipos:
genéticos, ecológicos o poblaciones y operacionales (Georghiou y Taylor, 1977). Dentro
de los factores genéticos se encuentra la frecuencia de genes de resistencia, todas las
18
poblaciones tienen una cantidad de individuos resistentes que se encuentra entre el orden
de 10-2 hasta 10-13, la evolución de la resistencia depende en gran parte de la frecuencia
inicial de dichos genes ya que entre mayor número de individuos resistentes existan en
una población, la evolución de la resistencia será más rápida; la dominancia de los genes
de resistencia es un factor genético que se puede ver favorecido por factores operacionales,
debido a que cuando se utilizan dosis subletales se están seleccionando individuos
homocigotos susceptibles (SS) y heterocigotos (RS) y por tanto la resistencia es
funcionalmente dominante, mientras que cuando se aplican dosis letales se seleccionan
individuos homocigotos resistentes (RR) y la resistencia es de tipo recesiva (Georghiou y
Taylor, 1977; Després et al., 2007).
En cuanto a los factores biológicos o poblacionales se hace referencia al potencial biótico
de la plaga, entre mayor número de generaciones por año y mayor descendencia tenga
dicha plaga la resistencia evoluciona más rápidamente. El ácaro de los frutales
Panonychus ulmi presenta hasta 10 generaciones por año y ha desarrollado resistencia a
diferentes insecticidas mientras que el ácaro Bryobia rubrioculus presenta dos
generaciones por año y no se han documentado casos de resistencia, por último los factores
operacionales son aquellos manipulados por el hombre y hacen referencia al uso de
insecticidas, dosis, frecuencia, tipo de aplicación entre otros (Georghiou, 1981).
5.6.3. Tipos de resistencia
Los tipos de resistencia a insecticidas se clasifican en resistencia cruzada positiva,
resistencia cruzada negativa y resistencia múltiple La resistencia cruzada positiva hace
referencia a la protección contra varios insecticidas debido a la expresión de un solo
19
mecanismo de resistencia. Por ejemplo, los organofosforados y carbamatos son dos grupos
de insecticidas químicamente diferentes, sin embargo comparten el mismo mecanismo de
resistencia (inhibición de la acetilcolinesterasa) y pueden presentar resistencia cruzada
positiva (Mani, 1985). Una población de Phenacoccus solenopsis resistente a spinosad, la
cual evidencío altos niveles de resistencia a spinetoram teniendo en cuenta que dicha
población nunca estuvo expuesta a este último insecticida (Azfal y Shad, 2017).
La resistencia cruzada negativa hace referencia al fenómeno de que entre más resistente
sea una población a determinado insecticida más susceptible es a otro, por ejemplo se
reportó que la resistencia a organofosforados en moquitos Culex quinquefasciatus
aumentó la susceptibilidad a piretroides (Lagunes, 1980). En F. occidentalis se determinó
que el pirimicarb, oxamil y propamocarb sirvieron como potenciadores contra poblaciones
resistentes a acrinatrina cuando este se aplicaba en mezcla con dosis subletales de alguno
de dichos carbamatos (Bielza et al., 2009). Los mismos resultados se obtuvieron en el
caso de spinosad en mezcla con tiametoxan como medida para combatir poblaciones de
F. occidentalis resistentes a spinosad (Guillen y Bielza, 2012).
La resistencia múltiple se da cuando existe protección contra varios insecticidas debido a
la coexistencia de varios mecanismos de resistencia seleccionados de manera
independiente. Un individuo es resistente a diferentes clases de insecticidas que comparten
diferentes modos de acción y diferentes enzimas que los metabolizan, debido a la
presencia de múltiples mecanismos de resistencia. Por ejemplo, la catarinita de la papa
Leptinotarsa decemlineata ha desarrollado resistencia a cerca de 38 insecticidas diferentes
(Mota-Sánchez et al., 2002).
20
5.6.4. Mecanismos de resistencia a insecticidas
Los mecanismos de resistencia hacen referencia a las estrategias que utilizan y desarrollan
las plagas para tolerar el efecto de un insecticida y estas estrategias son de cuatro tipos:
resistencia por comportamiento, resistencia por penetración reducida en el integumento,
resistencia metabólica y resistencia genética (Miller, 1988).
La resistencia por comportamiento consiste en pautas de comportamiento modificadas en
aquellos insectos resistentes que hacen que evaden las zonas contaminadas con insecticida
y al no entrar en contacto con éste no mueren. El mecanismo por penetración reducida
otorga niveles de resistencia muy bajos, y hace referencia a modificaciones y/o desarrollo
de una cutícula más gruesa y cerosa que evita que el insecticida penetre en el cuerpo del
insecto en suficiente cantidad como para causar su muerte (Bielza, 2013).
La resistencia metabólica es el mecanismo más universal y uno de los primeros en
desarrollarse, éste se da cuanto se produce mayor cantidad de enzimas de detoxificación
(Esterasas, P-450 monooxigenasas u oxidasas de función múltiple MFO y glutatión S-
transferesas). Por ejemplo, los piretroides son metabolizados principalmente por MFO
mientras que los organofosforados se ven afectados por las esterasas (Zhang et al., 2008).
La resistencia genética confiere el nivel de resistencia más alto en una población, este tipo
de resistencia hace referencia a una alteración o mutación genética en uno o más
nucleótidos que codifican para la proteína responsable del efecto biológico. También
llamada punto de acción la cual se vuelve inmune al efecto de dicho insecticida; esta
resistencia es heredable y es muy difícil de revertir, sin embargo solo se presenta cuando
21
se hace uso de elevadas dosis y altas frecuencias de aplicación de un mismo insecticida o
insecticidas que comparten el mismo MoA (Bielza, 2013).
5.6.5. Métodos de detección de resistencia
La detección temprana de la resistencia constituye una herramienta fundamental para la
protección de cultivos, ésta se realiza en primera instancia mediante la determinación de
la línea base de respuesta que es el rango natural de variación presente en una población
sin que existan alelos de resistencia en un nivel detectable (Lagunes-Tejeda et al., 2009).
La determinación de la línea base permite conocer los rangos normales de respuesta de
una población a un insecticida para así poder monitorear y detectar a tiempo cambios
potenciales en la susceptibilidad de la población y la frecuencia de aparición de genes de
resistencia (Bernardi et al., 2014).
La metodología para determinar la línea base de respuesta son los bioensayos donde se
somete una población a diferentes concentraciones de un insecticida y se evalúa la
mortalidad después de un tiempo establecido. Con base en esto se puede calcular la
concentración que causa la mortalidad de determinado porcentaje de la población
conocida como concentración letal (CL50, CL90, CL95) la cual sirve como punto de
referencia para comparar diferentes poblaciones de campo y tomar medidas para el manejo
de la resistencia a insecticidas (MRI) (Lagunes-Tejeda et al., 2009).
Existen diversas metodologías documentadas para la detección y evaluación de los niveles
de resistencia. Para el caso de trips, las metodologías más usadas son por inmersión de un
medio que sirve como alimentación para el insecto como vainas de frijol (IRAC, 2009) y
hojas de frijol o pimiento (Bielza et al., 2009).
22
Otra metodología usada es mediante ensayos tópicos donde se pone el insecticida en
contacto directo con el integumento del insecto (Inmaraju et al., 1992; Espinosa et al.,
2005; Bielza et al., 2007). Para todos los bioensayos se recomiendan usar hembras adultas
debido a su mayor tamaño, peso y esperanza de vida, ya que que una dosis que sea capaz
de matar una hembra podrá causar la mortalidad de los machos y el restante de la
población (Bielza et al., 2009).
5.6.6. Insecticidas autorizados para el cultivo de zarzamora
Los insecticidas autorizados por la Asociación Nacional de Exportadores de Berries
(Aneberries) para control de F. occidentalis en zarzamora en México (Cuadro 1), se
clasifican en cuatro grupos de acuerdo a su MoA: piretroides, neonicotinoides, spinosinas
y organofosforados (IRAC, 2017). Además se cuenta con cuatro productos biorracionales.
23
Cuadro 1. Insecticidas autorizados por Anaberries (2017) para el control de F.
occidentalis en cultivos de zarzamora en México.
Insecticida Grupo químico *IRAC MoA Nombre comercial
Esfenvalerato Piretroide 3A Modulador del canal de Sumialpha MX
sodio
Zeta-cipermetrina Piretroide 3A Modulador del canal de Mustang Max EW,
sodio Fury EW
Bifentrina Piretroide 3A Modulador del canal de Talstar 100 CE
sodio
Acetamiprid Neonicotinoide 4A Moduladores Rescate 20 PS,
competitivos del Mospilan 20 PS
receptor nicotínico de la
acetilcolina
Tiametoxam Neonicotinoide 4A Moduladores Unikum, Actara 25
competitivos del GS, Actara
receptor nicotínico de la
acetilcolina
Spinosad Spinosina 5 Modulador alostérico Entrust SC
del receptor nicotínico
de la acetilcolina
Spinetoram Spinosina 5 Modulador alostérico Exalt
del receptor nicotínico
de la acetilcolina
Malation Organofosforado 1B Inhibidor de la Luchation 1000-E,
acetilcolinesterasa Malation 1000-CE,
Fyfanon 1000-CE
24
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Ubicación y áreas de muestreo de Trips
El desarrollo de la investigación consistió de dos fases; la primera correspondió a la
recolección de los individuos en los municipios de Ziracuaretiro, Los Reyes de Salgado y
Tacámbaro, en el estado de Michoacán y en los municipios de Mazamitla, Jocotepec y
Zacoalco de Torres, en el estado de Jalisco, en cultivos de zarzamora (Cuadro 2).
La segunda etapa correspondió a la evaluación de resistencia de diferentes poblaciones de
F. occidentalis a los insecticidas malation, bifentrina y spinosad.
6.2. Identificación de especies de trips asociadas a zarzamora
6.2.1. Métodos de colecta y conservación
Para la colecta de los trips, se seleccionaron al azar 30 plantas de zarzamora en cada
parcela muestreada (Cuadro 2). De estas plantas se cortaron 3 flores por planta y se
depositaron en recipientes de plástico de 11 cm de diámetro por 17 de altura, provistos de
cinco capas de papel absorbente en el fondo y tapa de rosca con un agujero de 6 cm de
diámetro con tela organza para permitir la aireación.
El 50% de los ejemplares se conservaron en viales de 2 ml con alcohol al 75% para la
identificación morfológica y el 50% restante se conservaron vivos en los recipientes de
colecta para la identificación molecular. Cada muestra se etiquetó con sus respectivos
datos de recolección.
25
6.2.2. Identificación morfológica
La identificación morfológica se realizó por parte del Dr. Jacinto Berzosa Duran de la
Universidad Complutense de Madrid, España. Se enviaron cinco ejemplares adultos de
cada sitio muestreado (Cuadro 2) de cultivos de zarzamora en tubos eppendorf de 1.5 mL
con alcohol al 75%. Adicionalmente se enviaron ejemplares colectados en un cultivo de
arándano en el municipio de Mazamitla. Un 5% de los individuos se conservaron y se
montaron de acuerdo con el protocolo de Johansen-Naime y Mojica-Gúzman (1997) para
corroboración de la identificación. Las preparaciones fueron revisadas por el Dr.
Francisco José Avendaño (Universidad Michoacana de San Nicolas de Hidalgo, Facultad
de Agrobiología, Morelia Michoacán, México) siguiendo las claves taxonómicas de
Johansen-Naime (1987) y Johansen-Naime y Mojica-Gúzman (2003).
6.2.3. Identificación molecular
Extracción y cuantificación de ADN
La identificación molecular se realizó en el Laboratorio de Genética de Semillas del
Colegio de Posgraduados Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México. La extracción
de ADN se realizó de acuerdo al protocolo propuesto por Doyle (1991) mediante el
método CTAB 2% y acetato de sodio con algunas modificaciones: por cada muestra se
procesó solamente un individuo para evitar tener mezcla de especies, se utilizaron tubos
para maceración de 2 ml debido al tamaño de los trips. Para los lavados con isopropanol
se utilizaron tubos de 1.5 ml debido a los bajos volúmenes que se manejaron. Para la
suspensión de la pastilla de ADN) en HPLC se usaron 20 µl debido al tamaño de esta. La
cuantificación de ADN se realizó en un NanoDrop 200 Thermo Scientific R MA
(Wilmington, Delaware USA).
26
Cuadro 2. Zonas de colecta de trips, en cultivo de zarzamora, para la identificación
morfológica y molecular.
Municipio Ubicación Fecha de colecta
Ziracuaretiro 19.686356 N – 101.237611 W Septiembre 2016
19.421750 N – 101.928456 W Septiembre 2016
19.422244 N – 101.928658 W Septiembre 2016
19.421643 N – 101.923072 W Septiembre 2016
19.337309 N – 101.904036 W Septiembre 2016
19.349755 N – 101.928753 W Septiembre 2016
19.385355 N – 101.917974 W Septiembre 2016
Los Reyes de 19.546267 N – 102.410477 W Octubre 2016
Salgado 19.575181 N – 102.462801 W Octubre 2016
19.557960 N – 102.509841 W Octubre 2016
19.613603 N – 102.488224 W Octubre 2016
19.653716 N – 102.457993 W Octubre 2016
Tacámbaro 19.226306 N – 101.480483 W Noviembre 2016
19.222212 N – 101.522260 W Noviembre 2016
19.217533 N – 101.475304 W Noviembre 2016
19.208585 N – 101.446778 W Noviembre 2016
19.209575 N – 101.445288 W Noviembre 2016
19.209797 N – 101.450205 W Noviembre 2016
19.212891 N – 101.447591 W Noviembre 2016
Mazamitla 19.570060 N – 103.042621 W Febrero 2017
19.925054 N – 103.064569 W Febrero 2017
Jocotepec 20.337366 N – 103.484107 W Octubre 2017
Zacoalco 20.220336 N – 103.543769 W Octubre 2017
27
Amplificación del ADN
Se amplificó el gen citocromo oxidasa I (COI) , utilizando los primers LCO y HCO (5´-
GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG – 3´, 5´-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA - 3´) (Folmer et al., 1994), los cuales
permitieron la amplificación de un fragmento de 658 pb mediante PCR convencional en
un Termociclador C1000 Touch TM BioRad Foster (California, USA) con las siguientes
condiciones térmicas: desnaturalización inicial a 94ºC por 1:00 min, seguida por 5 ciclos
de 94ºC por 30 s, 45ºC por 1:30 min, 72ºC por 1:00 min, 35 ciclos de 94ºC por 30 s, 57ºC
por 1:30 min, 72ºC por 1:00 min y extensión final de 72ºC por 5:00. Los productos de
PCR tuvieron un volumen final de 15 µL y se conservaron a 4ºC hasta realizar la
electroforesis en gel de agarosa al 1% para determinar el tamaño del fragmento y revelado
en un fotoducumentador (Infinity-3026/WL/LC/26MX, ICT, S.L. Barcelona, España).
Secuenciación y análisis filogenético
Los productos de PCR se purificaron y limpiaron con exosap (Affymetrix, DNA Link,
Inc., CA, USA) y se secuenciaron en el Laboratorio de Genética de Semillas del Colegio
de Postgraduados Campus Montecillo, Texcoco, Estado de México, en un secuenciador
3130 DNA Analyzer de 4 capilares (Applied Biosystems CA, USA). Las secuencias se
analizaron con el software BioEdit v.7.0.1. y se compararon con las depsositadas en la
plataforma BLAST (Altschul et al., 1997), Instrumento de Búsqueda de Alineamientos
Locales Básicos de la base de datos del Centro Nacional para la información
Biotecnológica (NCBI). El análisis filogenético se realizó con el software MEGA 7,
utilizando el método “neighbor joining” con corrección de Poisson (Saitou y Nei, 1987).
28
6.3. Evaluación de resistencia a insecticidas
6.3.1. Poblaciones de F. occidentalis
Se recolectaron 13 poblaciones de campo de F. occidentalis provenientes de cultivos de
zarzamora en etapa de floración (Cuadro 3) en los meses de febrero, abril y octubre de
2017, bajo sistema de producción convencional en los municipios de Ziracuaretiro, Los
Reyes de Salgado, Michoacán y Mazamitla, Jocotepec y Zacoalco de Torres, Jalisco.
Asimismo, se incluyó una población colectada en un cultivo de zarzamora bajo
producción orgánica, en el municipio de Mazamitla, Jalisco (M2).
La población susceptible se obtuvo de un cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) del
invernadero de Toxicología del Colegio de Posgraduados Campus Montecillo Texcoco
Estado de México, la cual ha estado libre de aplicaciones de plaguicidas por 10 años. Se
seleccionó la especie F. occidentalis para los ensayos de resistencia debido a que fue la
de mayor frecuencia en la zona de estudio (82.4%).
6.3.2. Cría de F. occidentalis
Los insectos de campo se trasladaron al laboratorio donde se sacudieron de las flores sobre
un papel blanco y se transfirieron a los recipientes de cría con un aspirador bucal. Para la
cría masiva de F. occidentalis se utilizó el protocolo propuesto por Espinosa et al. (2002)
con algunas modificaciones que consistieron en utilizar envases de plástico similares a los
que se implementaron en la colecta, de 11 cm de diámetro por 17 cm de altura, provistos
de cinco capas de papel absorbente y una esponja de poliuretano en el fondo que actuó
como refugio para las ninfas de los insectos.
29
Cuadro 3. Origen de las poblaciones sometidas a evaluación de resistencia a insecticidas
y sistemas de producción de zarzamora. 2016-2017
Población Municipio de colecta Ubicación Producción
Z1 Ziracuaretiro 19.686356 N - 101.237611 W Convencional
R1 Los Reyes de Salgado 19.575181 N - 102.462801 W Convencional
M1 Mazamitla 19.570062 N - 103.042621 W Convencional
M2 Mazamitla 19.925054 N -103.064561 W Orgánica
J1 Jocotepec 20.337366 N – 103.484107 W Convencional
ZT1 Zacoalco de Torres 20.220336 N – 103.543769 W Convencional
SUSC Texcoco de Mora 19.464170 N – 98.908634 W Convencional
Los recipientes de cría contaron con tapas de rocas con una abertura de 6 cm de diámetro
con tela organza para permitir la aireación y evitar el exceso de humedad. Como fuente
de alimentación se utilizaron vainas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) previamente
desinfectadas con hipoclorito de sodio al 2% durante cinco minutos y remojadas en una
solución de agarosa al 5% para hacerlas más apetecibles a los insectos. Las vainas se
dejaron secar a temperatura ambiente antes de ser depositadas en los recipientes de cría.
30
Después de un periodo de cinco días, las vainas ovipositadas se retiraron y se transfirieron
a recipientes con las mismas condiciones y se mantuvieron en cámaras bioclimáticas
(MOD TFFU2065FWA Thermo Scientific™ Precision™, Asheville, USA) a 25 ± 2ºC,
humedad relativa del 50 ± 5% y fotoperiodo de 12:12 h (Luz: oscuridad) hasta la
emergencia de los adultos (Figura 1). Las vainas de frijol se renovaron cada vez que fue
necesario.
A B
C
D
Figura 1. Método de Espinosa et al. (2002) para cría masiva de F. occidentalis. A y B)
vainas de frijol en proceso de desinfección, C) recipientes de cría y D) cámara
bioclimática.
6.3.3. Intensidad de uso de insecticidas en las regiones de Michoacán y Jalisco
Con base en estudios previos de diagnóstico de la resistencia (Rebollar-Alviter no
publicado) se encontró que los trips estuvieron entre las principales plagas que afectan los
cultivos de zarzamora en Michoacán y que los tres grupos insecticidas de mayor uso para
el control de trips en los años 2012 y2013 fueron las spinosinas, organofosforados y
31
piretroides. Dentro de las spinosinas, el spinosad fue el producto más usado, seguido por
malation dentro del grupo de organofosforados y bifentrina dentro de los piretroides.
6.3.4. Insecticidas
Se emplearon formulaciones comerciales de malation 520 g kg-1 CE (Lucathion®;
Química Lucava SA de CV, Celaya, Guanajuato México), bifentrina 100 g kg-1 CE
(Talstar®; FMC Agroquímica de México S. de R.L. de C.V., Zapopan, Jalisco, México)
y spinosad 120 g kg-1 SC (SpinTor®; Dow AgroSciences, Tetla, Tlaxcala, México).
Los insecticidas fueron seleccionados con base en la frecuencia de uso en la zona de
estudio, según los resultados obtenidos del estudio previo de frecuencia de uso de
insecticidas en el cultivo (Rebollar-Alviter no publicado).
En primera instancia se calculó la ventana de respuesta biológica que corresponde al rango
de dosis decrecientes logarítmicamente que causan entre el 0 y 100% de mortalidad de la

-1
población de referencia (1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0 mg.L ), con ello se
definieron las concentraciones a evaluar de cada uno de los insecticidas (Cuadro 4).
6.3.5. Bioensayos
Los bioensayos se realizaron en el Laboratorio de Toxicología Agrícola del Colegio de
Postgraduados Campus Montecillo Texcoco Edo de México.
La técnica de inmersión de hoja se usó para evaluar la resistencia a insecticidas en trips
hembras adultos (Figura 2) (Bielza et al., 2009). Se utilizaron tubos eppendorf de 1.5 mL
en los cuales se introdujo una sección de hoja de frijol (30 x 5 mm) del tercio medio de
plantas de 45 días variedad flor de mayo, las cuales se sumergieron previamente durante
32
10 s en la solución insecticida y posteriormente se dejaron secar por 15 minutos en cámara
de flujo laminar. En cada tubo se depositaron 15 trips adultos de la F1 con un aspirador
bucal. Se usaron tres repeticiones por dosis (n = 15) y ocho dosis por tratamiento más un
testigo (Cuadro 4). Para el testigo, las hojas se sumergieron en agua destilada. Los tubos
se cerraron con papel parafilm y se mantuvieron en posición vertical en cámara
bioclimática en condiciones de 25 ± 2ºC, humedad relativa del 50 ± 5% y fotoperiodo de
12:12 h (Luz: oscuridad).
La mortalidad se evaluó 24 horas después de la aplicación de los tratamientos y los
insectos que no presentaron movimiento se consideraron muertos. Cada ensayo se repitió
dos veces.
6.3.6. Análisis de datos de la evaluación de resistencia
Previo al análisis de datos, se corrigió la mortalidad observada en el testigo (Abbot, 1925),
la cual no excedió más del 10%. Para el análisis de los datos se usó el Procedimiento
Probit incluido en el sofware SAS ver 9.3 (Statistical Analysis System, Cary, NC USA).
Se estimaron las concentraciones letales 50 (CL50) y 95 (CL95), tomando los totales de
las tres repeticiones de cada uno de los experimentos (n = 90). Las poblaciones se
consideraron significativamente diferentes si sus límites fiduciales no se traslaparon con
un nivel de confianza del 95% (Robertson y Preisler, 1992).
Para determinar las proporciones de resistencia 50 y 95 (RR50 y RR95), se dividió la
CL50 y CL95 de cada una de las poblaciones de campo sobre la CL50 y CL95 de la
población de referencia.
33
A B C
Figura 2. Evaluación de resistencia de acuerdo al método propuesto por Bielza et al.,
(2009). A) Secado en cámara de flujo laminar de las secciones de hoja de frijol
impregnadas con los insecticidas, B) tubos eppendorf de 1.5 mL y D) Estereoscopio.
Cuadro 4. Concentraciones seleccionadas para evaluación de la resistencia en
poblaciones de F. occidentalis provenientes de zarzamora (Rubus sp.) cultivada en
Michoacán y Jalisco, México.
-1 -1 -1
Spinosad (mg.L ) Malation (mg.L ) Bifentrina (mg.L )
100 1000 100
30 300 30
10 100 10
3 30 3
1 10 1
0.3 3 0.3
0.1 1 0.1
0.03 0.3 0.03
0 0 0
34
7. RESULTADOS
7.1. Especies de trips asociadas a zarzamora
Con base en los estudios morfológicos, reportados por el especialista, las muestras
colectadas en la fecha 08 de octubre de 2016 en el municipio de Los Reyes de Salgado se
identificaron tres especies de trips asociadas a cultivos de zarzamora: Frankliniella
occidentalis Pergande, 1895, (Thysanoptera: Thripidae) (5 hembras) (Figura 3), F.
tolucensis Watson, 1942 (Thysanoptera: Thripidae) (1 hembra) (en las parcelas 19.575181
N – 102.462801 W y 19.613603 N – 102.488224 W),) y Retanathrips funestus (en la
parcela 19.546267 N – 102.410477 W) Hood, 1915 (Thysanoptera: Thripidae) (1 hembra).
En el municipio de Tacámbaro de las muestras colectadas en la fecha 11 de noviembre de
2016 las especies encontradas fueron: Tenothrips frici Uzel, 1895 (Thysanoptera:
Thripidae) (1 macho), F. occidentalis (3 hembras) (19.222212 N – 101.522160 W) y una
nueva especie del género Frankliniella (1 macho) (19.226305 N – 101.480483 W).
En el estado de Jalisco en el municipio de Mazamitla en cultivos de zarzamora de las
muestras colectadas el 16 de febrero de 2017 se encontraron las especies F. occidentalis
(1 hembra) y Tenothrips frici (1 hembra) (19.57006 N – 103.04262 W) y en arándano
(Vaccinium sp.) la especie F. occidentalis (2 hembras) (19.925054 N – 103.064569 W).
Sin embargo, mediante el análisis molecular se encontró una especie mas: F. borinquen
(Figura 4). Todas las especies identificadas morfológicamente corresponden a muestras
colectadas en las mismas parcelas de las que se obtuvieron las especies para identificación
molecular, a excepción de las parcelas donde se obtuvieron las especies de F. borinquen.
35
Figura 3. A) Hembra adulta de Frankliniella occidentalis (Pergande) colectado en
el municipio de los Reyes de Salgado, Michoacán (8-10/2016) B) III y IV segmento
antenal en forma de cono bifurcado, C) Pronoto, D) Tergitos IX y X.
B C D
Figura 4. A) Hembra adulta de Frankliniella borinquen (Hood) Colectado en el
municipio de Ziracuaretiro, Michoacán (23-09/2016). B) antena, pedicelo y
segmentos IV – VIII, C) Tergitos IV y V, D) Tergito VIII D) Tergitos IX y X
36
Como resultados de la fotoducumentacion se observ' que se amplificaron fragmentos de
cerca de 600 pb (Figura 5).
1Kb 17 19 21 26 27 51 52 58 63 67 68 72 N 1Kb
Figura 5. Productos de PCR, fotodocumentacion en gel de agarosa. Las muestras
17, 19 y 21 corresponden a individuos colectados en el municipio de
Ziracuaretiro, las muestras 26 y 27 corresponden a individuos colectados en el
municipio de los Reyes de Salgado y las muestras 51, 52, 58, 63, 67, 68 y 72
corresponden a muestras colectadas en el municipio de Tacámbaro. La muestra
N hace referencia al control negativo. Las dobles barras que se observan en las
muestras 17, 58, 63, 67, 68 y 72 obedecen a grandes cantidades de ADN.
La identificación basada en análisis molecular y filogenético (Figura 6) comparando las
secuencias depositadas en el Genbank indicó la presencia de tres especies en todas las
zonas de estudio: F. occidentalis, F. borinquen y Frankliniela spp. Para F. occidentalis se
evidenciaron tres haplotipos (F-COI2, F-COI3 y F-COI9) en 14 de las 19 muestras
tomadas distribuidas en 16 cultivos comerciales de zarzamora en las diferentes zonas de
muestreo la distribución fue la siguiente: siete en el municipio de Ziracuaretiro (19.686356
37
N – 101.237611 W, 19.337309 N- 101.904036 W, 19.349755 N – 101.928753 W,
19.385355 N – 101.917974 W, 19.397276 N – 101.916708 W), tres en el municipio de
Los Reyes de Salgado (19.546267 N – 102.410477 W, 19.575181 N – 102.462801 W,
19.613603 N – 102.488224 W), dos en Tacámbaro (19.222212 N – 101.522160 W) y dos
en Mazamitla (19.57006 N – 103.04262 W), uno en un cultivo de arándano (19.925054 N
– 103.064569 W).
Las secuencias presentaron identidad del 100% con las documentadas en aguacate en
Michoacán. Además se encontró una especie no identificada mediante técnicas
morfológicas la cual fue F. borinquen asociada a cultivos de zarzamora en dos zonas de
Ziracuaretiro (19.422244 N – 101.928658 W, 19.421643 N – 101.933070 W) y una en
Tacámbaro (19.209797 N – 101.450205 W). Frankliniella sp., se encontró en una zona de
zarzamora en Tacámbaro (19.226305 N – 101.480483 W) y en una de Mazamitla
(19.925054 N – 103.064569 W).
De acuerdo al análisis filogenético las especies de F. occidentalis se agruparon en tres
clados. En el primer clado se encontraron secuencias de especies de los municipios de
Ziracuaretiro (Z24, Z58, Z8, Z7, Z6, Z1, Z63), Tacambaro (T16, T15) y Los Reyes de
Salgado (R12) con una identidad de 98%. En el segundo clado se agrupó una sola
secuencia de F. occidentalis perteneciente al municipio de Ziracuaretiro (Z24) y en el
tercer clado las especies agrupadas de F. occidentalis correspondieron a los municipios
de Mazamitla, Jalisco (M22, M23) y Los Reyes de Salgado (R9, R10) y son las que
presentan identidad del 100% con las secuencias de F. occidentalis reportadas en aguacate
en el municipio de Periban (KR092419.1).
38
Las secuencias de Frankliniella sp., tanto de Mazamitla (M21) como de Tacámbaro (T14)
se agruparon en un clado (5) con identidad de 98%. Por último las secuencias de F.
borinquen de Ziracuaretiro (Z4, Z5) y Tacámbaro (T19) se agruparon en un clado (6) con
99% de identidad. La secuencia de T. tabaci se tomó como referencia (Figura 6).
Se infiere que estas agrupaciones se deben a la cercanía entre los sitios de colecta; por
ejemplo, en el primer clado se agrupan especies de los tres municipios de Michoacán, en
el segundo clado se agruparon secuencias de Los Reyes y Mazamitla que aunque no
pertenecen al mismo estado, se encuentran geográficamente cerca (94 km de distancia).
Tomando en cuenta las diferentes zonas de muestreo, la frecuencia de F. occidentalis fue
de 14 (82.4%), mientras que la de F. borinquen y Frankliniella spp., fue 3 (17.6%) y 2
(11.8%), respectivamente. De estas especies, la de mayor frecuencia y que se asoció a la
deformación de frutos en zarzamora por falta de polinización fue F. occidentalis.
39
Clado I
Clado II
Clado III
Clado IV
Clado V
Figura 6. Árbol filogenético mediante el método Neighbor joining que muestra relación genética basada en secuencias
de COI de tres especies de trips identificadas en cultivos de zarzamora en Michoacán y Jalisco. Las letras corresponden
al municipio donde se colectaron los individuos y el número a la muestra asi: Z = Ziracuaretiro (24, 58, 8, 7, 6, 1, 63,
24 y 4), T = Tacámbaro (16, 15, 14 y 19), R = Reyes de Salgado (12, 9 y 10) y M = Mazamitla (22, 23 y 21).
40
7.2. Resistencia de Frankliniella occidentalis a spinosad, bifentrina y malation
La estimación de la CL50 y CL95 indicó que la población de referencia mostró una alta
susceptibilidad para los tres insecticidas evaluados, con valores de CL50 de 0.01, 0.11 y
0.0140 mg L-1 y CL95 de 0.47, 4.73 y 0.39 mg L-1 para spinosad, malation y bifentrina
respectivamente (Figura 7).
Para el caso de spinosad existieron diferencias significativas (LC = 95%) en las CL50
estimadas entre 12 de las poblaciones de campo evaluadas y la población susceptible
(Cuadro 5). La población M2 correspondiente a individuos colectados en el sistema de
producción de zarzamora orgánica en Mazamitla Jalisco, no presentó diferencias
significativas con la población susceptible con base en la separación de sus límites
fiduciales (Cuadro 5). Para el municipio de Ziracuaretiro las poblaciones Z2 y Z5
presentaron los valores de CL50 más altos con 1.45 y 2.48 mg L-1 y con del orden de 145
y 248 respectivamente. Para el caso del municipio de los Reyes de Salgado, R4 fue la
población que presentó la CL50 más alta (1.20 mg L-1), con RR50= 120. Los municipios
de Jocotepec y Zacoalco de Torres presentaron las RR50 más bajas después de la
población M2 con RR50 de 6 y 7 respectivamente.
A nivel de CL95, las poblaciones Z1 proveniente de Ziracuaretiro, Michoacán, y M2 de
Mazamitla, Jalisco, no presentaron diferencias significativas con la población susceptible
(LC = 95%), las RR95 estuvieron más bajas comparadas con las RR50 y en este caso las
poblaciones Z5 y R3 fueron las que presentaron los valores más altos con RR95 iguales a
214 y 159 respectivamente (Cuadro 5).
41
Para el caso de malatión, todas las poblaciones evaluadas presentaron diferencias
significativas con la población susceptible tanto a nivel de CL50 como de CL95 (LC =
95%). Los valores de CL50 estuvieron dentro del rango de 3.96 a 274.8 mg L-1, con RR50
entre 36 para el caso de la población Z1 que fue la más baja y 2498 para la población R2
proveniente de Los Reyes de Salgado con el valor más alto (Cuadro 6). Respecto a las
CL95 se obtuvieron valores entre 34.23 – 8640 mg L-1 para las poblaciones Z1 y Z3, las
dos pertenecientes al municipio de Ziracuaretiro, con RR95 de 7 y 1272 respectivamente
(Cuadro 6).
Con relación a bifentrina la CL50 de la población susceptible fue de 0.014 mg L-1 y las 13
poblaciones de campo evaluadas fueron significativamente diferentes a esta (LC=95%)
basados en la separación de sus límites fiduciales (Cuadro 7). Las CL50 variaron entre
0.06 mg L-1 para el caso de la población Z1 y 13.63 mg L-1 para la población Z3 con RR50
de 4 y 974 respectivamente, tambien pertenecientes la municipio de Ziracuaretiro. Las dos
poblaciones de Mazamitla, junto con la de Jocotepec y Zacoalco de Torres presentaron
los valores más bajos de RR50 (11, 9, 6 y 9 respectivamente). En cuanto a las CL95, la
población Z1 presentó el valor mas bajo (0.93 mg L-1) y la población Z3 presentó el valor
mas alto (711.16 mg L-1) con RR95 de 2 y 1823, respectivamente, las dos provenientes de
Ziracuaretiro (Cuadro 7).
Entre los tres insecticidas evaluados, los mayores niveles de resistencia se presentaron
para malation y de los dos estados, Michoacán fue el que presentó los mayores problemas
de resistencia.
42
A
Figura 7. Gráfica comparativa entre la CL95 de la población
susceptible y CL95 de la población resistente para cada
insecticida A) Z5 (spinosad), B) R2 (malation) y C) Z3
(bifentrina)
43
Cuadro 5. Pendientes, concentraciones letales y proporciones de resistencia de las poblaciones de F. occidentalis tratadas con spinosad
en 13 poblaciones provenientes de zonas productoras de zarzamora de Michoacán y Jalisco, México.
Población n b ± EE CL50 (95%LC) CL95 (95%LC) Pr > χ² RR50 RR95
Susceptible 786 0.99 ± 0.07 0.01 (0.01 – 0.02) 0.47 (0.30 – 0.82) 0.96 1 1
Z1 582 1.62 ± 0.16 0.08 (0.06 – 0.10) 0.82 (0.50 – 1.62) 0.81 8 2
Z2 568 1.34 ± 0.13 1.45 (1.08 – 1.92) 24.50 (14.70 – 51.23) 0.90 145 52
Z3 579 1.08 ± 0.12 0.68 (0.49 – 0.99) 22.33 (10.17 – 74.06) 0.93 68 48
Z4 585 0.96 ± 0.09 0.70 (0.50 – 0.98) 36.08 (17.63 – 99.87) 0.97 70 77
Z5 564 1.02 ± 0.09 2.48 (1.78 – 3.48) 100.42 (51.63 – 255.15) 0.92 248 214
R1 639 1.13 ± 0.12 0.28 (0.20 - 0.38) 7.85 (4.21 - 19.56) 0.85 28 17
R2 658 1.42 ± 0.17 0.74 (0.56 - 1.00) 10.47 (5.76 – 26.91) 0.65 74 22
R3 661 0.71 ± 0.10 0.37 (0.19 – 0.61) 74.76 (25.13 - 523.77) 0.97 37 159
R4 668 1.51 ± 0.13 1.20 (0.93 – 1.56) 14.62 (9.29 – 27.09) 0.94 120 31
M1 582 1.00 ± 0.09 0.28 (0.20 – 0.39) 11.94 (6.01 – 31.36) 0.94 28 25
M2 604 1.07 ± 0,09 0.02 (0.01 – 0.03) 0.93 (0.53 - 2.04) 0.91 2 2
J1 533 1.29 ± 0.11 0.70 (0.53 – 0.93) 13.12 (7.84 – 26.37) 0.81 6 3
ZT1 556 1.04 ± 0.10 0.79 (0.55 – 1.09) 30.26 (16.60 – 70.52) 0.65 7 6
n = Número de individuos evaluados, b ± EE = pendiente, error estándar, CL50 y CL95 = Concentración letal que causa mortalidad del 50 y 95% de la población
(mg L-1), Pr > χ² = Probabilidad de que la línea log Dosis-Probit ajuste a una línea recta, RR50 y RR95 = proporciones de resistencia.
44
Cuadro 6. Pendientes, concentraciones letales y proporciones de resistencia en las poblaciones de F. occidentalis tratadas con malation
Susceptible 782 1.01 ± 0.07 0.11 (0.08 – 0.15) 4.73 (2.81 – 9.34) 0.96 1 1
Z1 587 1.76 ± 0.16 3.96 (3.15 – 5.00) 34.23 (23.01 – 58.81) 0.82 36 7
Z2 585 0.96 ± 0.09 71.69 (51.35 – 101.28) 3692 (1802 – 10201) 0.89 652 781
Z3 560 0.94 ± 0.09 158.47 (112.49 – 223.63) 8640 (4219 – 24035) 0.95 1441 1827
Z4 578 1.41 ± 0.11 216.22 (167.71 – 278.96) 3188 (2052 – 5707) 0.84 1966 674
Z5 592 1.31 ± 0.11 88.89 (66.92 – 116.21) 1596 (1014 – 2933) 0.94 808 337
R1 663 1.27 ± 0.11 96.93 (72.72 – 127.52) 1925 (1199 – 3632) 0.87 881 407
R2 674 1.23 ± 0.12 274.80 (204.46 – 365.49) 6015 (3492 – 13015) 0.96 2498 1272
R3 669 1.13 ± 0.12 96.60 (70.85 – 132.26) 2771 (1468 – 6977) 0.91 878 586
R4 676 1.25 ± 0.12 28.57 (21.44 – 37.89) 590.42 (341.57 – 1288) 0.77 260 125
M1 573 1.17 ± 0.11 30.01 (21.83 - 40.34) 768.42 (459.50 – 1549) 0.83 273 162
M2 591 1.03 ± 0.09 20.04 (14.67 – 27.58) 777.52 (411.21 – 1881) 0.82 182 164
J1 531 0.94 ± 0.10 21.32 (13.87 – 30.90) 1199 (615.85 – 3147) 0.75 194 253
ZT1 561 0.98 ± 0.12 21.72 (14.79 – 31.08) 1031 (481.03 - 3388) 0.73 197 218
45
Cuadro 7. Pendientes, concentraciones letales y proporciones de resistencia en las poblaciones de F. occidentalis tratadas con bifentrina
Susceptible 799 1.14 ± 0.07 0.014 (0.010 – 0.017) 0.39 (0.26 – 0.65) 0.71 1 1
Z1 582 1.37 ± 0.13 0.06 (0.04 – 0.08) 0.93 (0.58 – 1.80) 0.84 4 2
Z2 583 1.33 ± 0.13 7.53 (5.57 – 9.96) 129.70 (78.78 – 263.88) 0.83 538 333
Z3 615 0.95 ± 0.09 13.63 (9.62 – 19.15) 711.16 (357.52 – 1889) 0.84 974 1823
Z4 581 0.93 ± 0.09 2.07 (1.45 – 2.96) 123.62 (58.36 – 361.99) 0.88 148 317
Z5 583 1.00 ± 0.09 1.17 (0.83 – 1.61) 51.41 (27.42 – 123.99) 0.96 84 132
R1 672 1.04 ± 0.09 0.71 (0.51 – 0.97) 26.94 (14.28 – 64.79) 0.91 51 69
R2 680 1.27 ± 0.12 0.88 (0.66 – 1.17) 17.20 (10.17 – 36.02) 0.98 63 44
R3 670 1.23 ± 0.12 0.84 (0.63 – 1.12) 18.08 (10.40 – 39.74) 0.91 60 46
R4 669 1.17 ± 0.12 1.01 (0.75 – 1.37) 25.53 (14.02 – 60.33) 0.84 72 65
M1 589 1.07 ± 0.10 0.16 (0.11 – 0.21) 5.43 (2.95 – 12.61) 0.89 11 14
M2 599 1.25 ± 0.11 0.12 (0.09 – 0.16) 2.47 (1.52 – 4.75) 0.95 9 6
J1 522 1.45 ± 0.14 0.67 (0.50 – 0.89) 9.18 (5.75 – 17.66) 0.75 6 2
ZT1 535 1.07 ± 0.10 1.00 (0.71 – 1.39) 34.87 (19.22 – 80.21) 0.79 9 7
46
8. DISCUSIÓN
Los trips han sido una plaga de importancia económica en los últimos años para la región
productora de zarzamora en los estados de Michoacán y Jalisco, México. Los resultados
de la identificación morfólogica indicaron la presencia de cinco especies, sobresaliendo;
entre ellas; F. occidentalis, en las principales áreas productoras de zarzamora de
Michoacán y Jalisco. Los estudios moleculares y filogenéticos tambièn coincidieron en la
presencia de F. occidentalis como especie principal, pero no coincidieron en las demás
especies determinadas con métodos morfológicos.
En el caso de los métodos moleculares se detectó la presencia de dos especies y una
probable nueva especie. La presencia de haplotipos de F. occidentalis evidencia la posible
variación genética en las poblaciones de esta especie en zarzamoras, que motiva su estudio
desde el punto de vista morfologico y molecular a fin de corroborar si las especies
determinadas morfológicamente, efectivamente son tal o corresponden a variaciones
genéticas de una misma especie. Schutze et al., (2015) documentaron resultados similares
con diferentes especies del género Bactrocera, donde mediante técnicas de identificación
morfológica lograron distinguir el complejo de Bactrocera en cuatro de las especies mas
relevantes: B. dorsalis, B. papayae, B. philippinensis y B. carambolae; sin embargo,
mediante técnicas de identificación molecular (análisis multi-locus) no encontraron
diferenciación genética entre B. dorsalis, B. papayae y B. philippinensis, indicando que
posiblemente estas tres especies representan una sola especie fenotípicamente plástica,
indistinguible genéticamente y con la capacidad de distribuirse por todo el mundo.
47
Por el contrario, Hoddle et al., (2008) obtuvieron resultados opuestos en la determinación
de relaciones entre especies de tisanópteros del género Scirtothrips mediante técnicas
morfológicas y moleculares. A nivel molecular determinaron que la especie S. dorsalis
estaba compuesta por almenos tres especies separables identificables pero indistinguibles
morfológicamente. Otro caso de ello se documentó en áfidos del género Hyalopterus
donde mediante técnicas morfológicas se describieron dos especies (H. pruni y H.
amygdali), pero mediante técnicas moleculares los datos proporcionaron fuerte evidencia
de tres especies dentro de este género (Lozier et al., 2008).
Lo anterior evidencia la necesidad de conciliar los métodos morfológicos y moleculares a
través de la complementariedad de dichas técnicas para la definición de especies.
Ambas técnicas coincidieron en la presencia de F. occidentalis, siendo la principal especie
causante de deformaciones y falta de calidad en los frutos de zarzamora. El trips occidental
de las flores, es una de las plagas más importantes de los cultivos, al atacar más de 250
especies (CABI, 2017). En zarzamora las pérdidas en campo pueden superar el 70% si no
se realizan acciones de control efectivas (Rebollar-Alviter, comunicación personal).
Tanto F. occidentalis como las demás especies detectadas en este estudio, constituyen el
primer reporte en México en zarzamoras cultivadas. F. occidentalis ha sido ampliamente
reportada en otros cultivos en México, entre los cuales sobresalen durazno, rosas,
calabaza, crisantemo y cabe destacar que algunas de estas especies también se han
reportado como plagas fitofagas asociadas a cultivos de aguacate (Persea americana) de
Michoacán, en especial F. occidentalis (Johansen-Naime et al., 2001).
48
La existencia de F. borinquen, es una especie fitófaga que ha sido previamente reportada
en la cuenca del valle de México (Johansen-Naime et al., 2009) asociada a malezas como
Senecio praecox aledañas a cultivos de S. tuberosum (Lot y Cano-Santana, 2009), Tithonia
diversifolia aledaña a cultivos de crisantemo (Dendranthema grandiflora) (Ochoa-
Martínez et al., 1999; Goldarazena et al., 2008) y en la zona del Soconusco Chiapas se
reportó asociada a cultivos de mango (Mangifera indica) (López-Guillen et al., 2014). En
Ziracuaretiro y Tacámbaro, Michoacán es comun la presencia de T. diversifolia en las
zonas productoras de zarzamora. Para cultivos de zarzamora de la Región de Michoacán
y Jalisco este es el primer reporte de esta especie.
La especie F. tolucensis fue descrita por primera vez en plantas del género Eryngium a
3900 msnm en el volcán Nevado de Toluca de la ciudad de Toluca estado de México
(Watson, 1942). Sin embargo, no ha sido documentada como plaga de cultivos, y en
específico en Rubus sp., más estudios se requieren a fin de confirmar si efectivamente los
ejemplares identificados por el especialista corresponden a esta especie, dadas las
condiciones contrastantes del nevado de Toluca y Los Reyes, Michoacán.
R. funestus es una especie presente en Centroamérica y en países como Puerto Rico,
México, Jamaica, Trinidad y Costa Rica (Mound y Marullo, 1996). T. frici, conocido
como el trips mediterráneo del diente de león (Taraxacum sp.), ha sido asociado a plantas
de la familia Asteraceae, particularmente a malezas como Hypochaeris sp., y Centaura
sp. Sin embargo, no se ha observado causando daños a cultivos, su distribución es
mundial, pero habita principalmente en áreas templadas cálidas, ha sido reportado en
países de África, Asia, Australia, Nueva Zelanda, Europa, Norte, Centro y Suramérica
49
(Mound y Marullo, 1996; Moritz et al., 2001). No existen reportes previos que consignen
a esta especie como plaga de importancia en Rubus sp.
Los resultados obtenidos en esta parte del estudio evidencian como la especie de trips
plaga más importante a F. occidentalis usando métodos morfológicos y moleculares,
incluyendo la presencia de haplotipos, lo que evidencia parcialmente un proceso de
diversificación genética que requiere un estudio a mayor profundidad de la estructura
genética de la población. Las especies identificadas solo con base en la morfología,
deberán ser corroboradas por métodos moleculares en estudios posteriores.
Respecto a la evaluación de resistencia, los resultados indicaron que malation fue el
insecticida que presentó los valores más altos de CL50, CL95 y RR, en especial en el
municipio de Los Reyes de Salgado, Michoacán, seguido de Ziracuaretiro. Es probable
que al ser uno de los insecticidas más utilizados, la presión de selección haya sido mayor,
pues en estas zonas de producción de zarzamora, dicho insecticida se usa desde hace más
de 25 años. Resultados similares se encontraron en poblaciones de F. occidentalis
colectadas en cultivos de manzana, chile, algodonero, lechuga, durazno, clavel, fresa y
tomate en Australia, donde evidenciaron niveles medios (1.8) a altos (2.8) de resistencia
a malation debido a que este fue uno de los productos autorizados para el control de dicha
plaga y uno de los de mayor historial de uso (Herron y James, 2005).
Por otro lado, Dagh y Tung (2007) documentan la existencia de diferentes poblaciones de
F. occidentalis que no mostraron resistencia al malatión, a pesar de la intensidad en las
aplicaciones y el tiempo en el mercado. Los autores sugieren que posiblemente fue por las
condiciones de la zona donde se colectaron, ya que los genes de resistencia se mantuvieron
en una frecuencia baja por la alta tasa de inmigración de individuos susceptibles.
50
De los tres insecticidas evaluados, el spinosad fue la última molécula insecticida en
ingresar al mercado, su comercialización a nivel mundial inicio en 1999 (Thompson et al.,
2000). Por su elevada eficacia en el control de trips, alta disponibilidad comercial del
producto y costo accesible, este compuesto ha sido usado ampliamente en las zonas
productoras de zarzamora de Michoacán y Jalisco, donde se llegaron a realizar hasta nueve
aplicaciones por temporada de acuerdo a información obtenida de campo en el desarrollo
de esta investigación. No tuvieron en cuenta las recomendaciones incorporadas en la
etiqueta para manejo de la resistencia a insecticidas (MRI), donde se describe que el uso
se debe limitar a un máximo de tres aplicaciones por ciclo de cultivo (Bielza et al., 2007),
dando como resultado poblaciones con altas RR50, por ejemplo Z5 con RR = 248.
Adicionalmente, el spinetoram, otra espinosina, es ampliamente usado en zarzamora para
el control de la mosca del vinagre de las alas manchadas, Drosophila suzukii M. (Diptera:
Drosophilidae), lo que incrementa aún más la presión de selección sobre los trips. En
invernaderos de España donde se realizaron más de 10 aplicaciones de spinosad por ciclo
de cultivo, similar al número de aplicaciones realizadas en Michoacán, se encontraron
poblaciones con RR>13500 en Almería y RR>3682 en Murcia en dos años de uso del
producto (Bielza et al., 2007a). En poblaciones de Beijing China se documentaron
proporciones de resistencia más bajas debido a la menor presión de selección, donde se
obtuvieron RR de 35.38 y 80.8 en una población de laboratorio y campo respectivamente
(Wang et al., 2011).
Al respecto, se ha observado que la resistencia de F. occidentalis a spinosad está asociada
a una modificación en el punto de acción (Espinosa et al., 2002); es decir, es de tipo
genético debido a la mutación G275E en el receptor nicotínico de la acetilcolina (nAChR)
51
donde ocurre el cambio de un nucleótido en la secuencia que codifica para la subunidad
alfa 6 (Foα6) del nAChR, este cambio es el remplazo de una glicina (g) en insectos
susceptibles, por acido glutámico (E) en insectos resistentes (Puinenan et al., 2013).
Asimismo, en otras plagas como Bactrocera dorsalis (Hendel) también se encontró que
la insensibilidad en el sitio de acción es la responsable de la resistencia hacia spinosad y
las alteraciones fueron detectadas en el mismo gen (subunidad Bdα6 del nAChR). Las
secuencias de individuos resistentes presentaron inserciones, deleciones y codones de
parada prematuros modificando la secuencia de 1467 pb que codifican para el nAChR
haciéndolo insensible al spinosad (Hsu et al., 2012). Resultados similares se obtuvieron
para Plutella xylostella (Linneo) en las secuencias del ADNc de la subunidad alfa 6
(Pxylα6) de individuos resistentes a spinosad, donde también se encontraron codones de
paradas prematuros, mientras que en los individuos susceptibles no, por lo que se concluyó
que las proteínas producidas a partir de estas transcripciones se vieron alteradas y no
cumplieron la función de receptor (Rinkevich et al., 2010).
Para el caso de bifentrina, los resultados indicaron que las RR50 variaron entre 4 y 974.
Para poblaciones de F. occidentalis colectadas en invernaderos de San Diego y Santa
Bárbara, California, se reportaron RR entre 70 - 106 y 142 – 275, respectivamente. Sin
embargo, la RR50 más alta obtenida que se estimó en este estudio fue de 974 para la
población Z3 colectada directamente de campo en el municipio de Ziracuaretiro. Las
poblaciones de San Diego y Santa Bárbara, California, se sometieron a aplicaciones con
sinergistas como butóxido de piperonilo (PBO) donde se evidenció que este sinergista
sinergizó el efecto de bifentrina, causando mayor mortalidad de la plaga, indicando que
las MFO fueron el mecanismo de resistencia. Aunque para bifentrina no se determinó el
52
tipo de resistencia, para permetrina -otro insecticida que comparte el mismo modo de
acción, se concluyó que la resistencia asociada fue de tipo metabólica por aumento de la
producción de MFO (Inmaraju et al., 1992). En New South Wales y Queensland,
Australia, se obtuvieron RR de 23 – 61, para poblaciones de campo. Sin embargo, el tipo
de resistencia de F. occidentalis hacia bifentrina en este estudio tampoco se determinó
(Thalavaisundaram et al., 2008). La resistencia en F. occidentalis es autosómica no
influenciada por efectos maternos (Zhang et al., 2008) y se expresa como un rasgo
recesivo, relacionado con un solo locus (Bielza et al., 2007).
Desde el primer reporte de D. suzukii en noviembre del 2011 en México (García-Ávila et
al., 2016), las aplicaciones de piretroides (Por ejemplo zeta-cipermetrina y bifentrina) y
spinosinas (spinetoram y spinosad), se han incrementado de manera alarmante, dado el
riesgo que representa la presencia de esta plaga invasora en las áreas productoras de
berries en México y esta situación aumenta la presión de selección sobre los trips.
Los productos autorizados para diferentes grupos de insectos pueden ejercer presión de
selección sobre diversas poblaciones, aunque estas no sean la plaga objetivo (blanco), ya
que la resistencia a un grupo de insecticidas también afecta a otro grupo cuando comparten
mecanismos de resistencia. Por ejemplo, cuando se realiza una aplicación de zeta-
cipermetrina para controlar D. suzukii también se está ejerciendo presión de selección
sobre otras plagas como trips y ácaros, aunque estos no sean el blanco biológico. En
poblaciones de F. occidentalis procedentes de Dinamarca, Kenia y Suiza resistentes al
insecticida diclorvós se evidenció resistencia cruzada a metiocarb, teniendo en cuenta que
este último insecticida no se aplicó nunca en el cultivo (Brodsgaar, 1994). En poblaciones
de Choristoneura rosaceana colectadas en cultivos hortícolas de Washington que nunca
53
estuvieron expuestas a spinetoram se detectó resistencia cruzada a este insecticida por uso
previo del spinosad (Sial et al., 2010).
Los problemas de resistencia de F. occidentalis representan un obstáculo para el éxito de
los sistemas productivos y el manejo de la plaga a largo plazo; por ello, se deben
implementar planes de manejo de la resistencia a Insecticidas (MRI). Existen diferentes
métodos de manejo de la resistencia dentro de los cuales destacan el manejo por
moderación, saturación y ataque múltiple. El manejo de la resistencia por moderación hace
referencia al uso de todas las técnicas disponibles que buscan mantener la población plaga
por debajo del umbral de acción con el objetivo de reducir el número de aplicaciones de
insecticidas. El manejo por saturación hace referencia al uso de elevadas dosis de
insecticidas en espacios combinados, por ejemplo en cebos, trampas o aplicaciones con
sinergistas. El manejo por ataque múltiple hace referencia al uso diversificado de
insecticidas, es decir a aplicaciones rotacionales de acuerdo a los modos de acción
(Georghiou, 1994).
Para el caso específico de Michoacán donde se presentaron los mayores problemas de
resistencia, se plantea la posibilidad de integrar los tres tipos de manejo, iniciando con la
suspensión temporal de los insecticidas que presentaron altas RR, rotar con otros
insecticidas que presenten diferente modo de acción, como los neonicotinoides
(Broughton y Herron, 2009) e integrar tácticas no químicas como el control físico,
cultural, legal, biológico y genético.
54
En el caso de Jalisco se recomienda que los insecticidas se usen sólo cuando sean
imprescindibles, seleccionándolos cuidadosamente basados en monitoreos previos y
estableciendo umbrales de acción bien fundamentados (Zhao et al., 2002).
Los insecticidas de reciente incorporación deben usarse bajo un programa de MRI con el
objetivo de prolongar su efectividad y mantener la susceptibilidad de las poblaciones
mediante monitoreo periódico, ya que es una herramienta valiosa para el éxito en el control
de la plaga (Thalavaisundaram et al., 2008). El éxito de programas de MRI se ha reportado
en diversas plagas, como Helicoverpa armiguera en cultivos de algodón en el Norte de la
India (Aggarwal et al., 2006).
Contra F. occidentalis se han reportado casos exitosos de MRI en cultivos de pepino en
Estados Unidos (Reitz et al., 2003) y en el sur de España (Sánchez et al., 2000), donde las
tácticas no químicas desempeñaron un papel fundamental y la rotación de insecticidas
retrasó y revirtió el desarrollo de la resistencia, conservando altas frecuencia de genes
susceptibles en las poblaciones. Para poblaciones de F. occidentalis resistentes a spinosad,
acrinatrina, metiocarb y formetanato colectadas en cultivos de Murcia y Almeria, España,
se propuso al ciantraniliprol como una nueva herramienta valiosa para el control de trips
basado en la rotación de insecticidas de acuerdo a los MoA (Bielza y Guillen, 2014).
ShengYin et al., (2014) recomendaron el uso de inibidores enzimáticos (sinergistas) para
aumentar el efecto insecticida sobre poblaciones de F. occidentalis que evidenciaron
resistencia de tipo metabolica. Broughton et al., (2015) recomendaron el uso de trampas
amarillas adhesivas con semioquimicos como parte del manejo integrado de F.
occidentalis en cultivos bajo sistemas de invernadero. F. occidentalis es una plaga con
55
diferentes características que le dan una alta propensión a desarrollar resistencia a
insecticidas, como alto potencial biótico, corto ciclo de vida y flexibilidad para habitar
diferentes ambientes. Diferentes programas de manejo han sido exitosos, cuando se basan
en tácticas no químicas, usando principalmente técnicas de control biológico y resistencia
en la planta huésped (Gao et al., 2012). El MRI es un componente importante del MIP,
resaltando que cada vez existen mayores probabilidades de perder herramientas para su
control y se crea la necesidad de establecer mejores estrategias y prácticas de manejo.
Este estudio representa el primer reporte de especies de trips asociadas a cultivos de
zarzamora en la región productora de Michoacan y Jalisco, México. Tambien representa
el primer estudio sobre resistencia de 13 poblaciones de campo de F. occidentalis a tres
de los insecticidas mas usados en la zona y pertenecientes a diferentes grupos químicos
de acuerdo a su clasificación por MoA del IRAC. Estos resultados brindarán las bases
para ajustar las técnicas para el diseño de programas de manejo de la resistencia y de
programas de manejo Integrado de trips en zonas productoras de zazamora y futuros
estudios sobre evaluación de estrategias de manejo integrado de trips bajo el escenario de
resistencia.
56
9. CONCLUSIÓN
Mediante técnicas morfológicas y moleculares se identificaron las especies de trips
asociadas a cultivos de zarzamora y arándano de Michoacán y Jalisco: Las especies
encontradas fueron F. occidentalis, siendo esta la más frecuente (82.4%), seguida por F.
borinquen (17.6%). Adicionalmente, los estudios morfológicos sugieren la presencia de
F. tolucensis, R. funestus, T. frici y una especie no identificada del género Frankliniella
(11.8%). Respecto a los estudios de resistencia se encontraron diferencias significativas
en todas las poblaciones evaluadas en cada uno de los insecticidas con la población de
referencia con base en la separación de sus límites fiduciales (LC = 95%), con RR para
malation, bifentrina y spinosad entre 36-2498, 4-974 y 2-248 respectivamente. Las
poblaciones de trips colectadas en el estado de Michoacán presentaron los valores más a
altos de RR de resistencia a los tres insecticidas ensayados.
57
10. ANEXOS
ANEXO 1: Protocolo de Extraccion de ADN (Doyle, 1991)
1. En un tubo de 2 mL previamente marcado se agregó 100 µl de CTAB, se introdujo
el insecto vivo el cual fue macerado con micromorteros previamente
desinfectados, y se agregó 900 µl más de CTAB.
2. Luego se incubó a baño maría a 96ºC por 60 minutos.
3. Posteriormente se centrifugó a 11,000 xg por 5 min, y se pasó el sobrenadante con
una micropipeta a tubos de 2 mL nuevos.
4. Se agregó 500 µL de cloroformo-alcohol Isoamilico (24:1) y se agitó por inversión
por 10 min.
5. Luego se centrifugó a 11,000 xg durante 10 min y se extrajo la fase acuosa con
micropipeta y se depositó en tubos nuevos de 2 mL.
6. Se agregó 700 µL de cloroformo-alcohol Isoamilico (24:1), y nuevamente se agitó
por inversión durante 10 min y centrifugó a 11,000 xg por 10 min.
7. Se transfirió la fase acuosa (sobrenadante) con una micropipeta a tubos nuevos de
1.5 mL con 950 µL de Etanol al 100% previamente enfriados a -20ºC y se mezcló
por inmersión al menos 10 veces. Luego se incubó por al menos 2 horas a – 20ºC.
8. Pasadas las dos horas se centrifugó a 11,000 xg durante 30 min y se decantó
evitando perder la pastilla.
9. Se suspendió la pastilla en 400 µL de agua HPLC y se incubó a 55ºC por 15 min.
58
10. Se añadió 34 µL de NaOAc 3M (Acetato de Sodio 3 Molar) y 1mL de Etanol al
95% e incubó a –20ºC por 1 hora
11. Se centrifugó a 11,000 xg durante 5 min y se decantó el sobrenadante
12. Lavado: se agregó 600 µL de Isopropanol al 70% y se centrifugó por 10 min a
11,000 xg y se decantó evitando perder la pastilla. Luego se secó la pastilla por al
menos 30 min en la cámara de flujo laminar.
13. Por último se suspendió la pastilla en 20 µl de HPLC y se incubó a 80°C durante
10 min.
59
11. LITERATURA CITADA
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ii

posgrado dentro del Plan Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC).

Nombre Yesica Paola Cubillos Salamanca

Fecha de nacimiento 31 de diciembre de 1992

Lugar de nacimiento Pacho, Cundinamarca, Colombia

Profesión Ingeniera Agroecológica

Cédula profesional 25345-309847 de Colombia

Licenciatura Ingenieria Agroecológica. Corporación

Universitaria Minuto de Dios, Sede Zipaquirá,

Cundinamarca, Colombia (2015)

Maestría Maestría en Ciencias en Protección Vegetal.

Universidad Autónoma Chapingo, Texcoco,

Edo. México, México. (2017)

Yesica Paola Cubillos Salamanca

Especies de Trips asociadas a cultivos comerciales de zarzamora en Michoacán y Jalisco

y estado de la resistencia a insecticidas de uso común.

(Noviembre 22, 2017)

(Bajo la dirección de Angel Rebollar Alviter Ph. D).

en Michoacán y Jalisco y la susceptibilidad de 13 poblaciones de campo de Frankliniella

occidentalis contra malatión, bifentrina y spinosad, tres de los insecticidas más

comúnmente utilizados en el área de producción. La identificación se realizó mediante

técnicas morfológicas y moleculares y la evaluación de la resistencia mediante bioensayos

fueron F. occidentalis y F. borinquen. Además, la identificación morfológica añadió a F.

Frankliniella. Todas las poblaciones evaluadas mostraron diferencias significativas en la

sensibilidad a bifentrina, malatión y spinosad con la población susceptible (LC=95%) y

mostraron resistencia a los tres insecticidas. Las proporciones de resistencia obtenidas en

este estudio indica la existencia de resistencia de F. occidentalis a los tres insecticidas. Se

sugiere establecer planes de gestión de resistencia en el contexto de MIP.

PALABRAS CLAVE: resistencia, organofosforados, spinosinas, piretroides, manejo

Yesica Paola Cubillos Salamanca

Thrips Species associated with commercial crops of Blackberry in Michoacan and

Jalisco and state of resistance to common Insecticides

November 22, 2017

(Under the direction of Angel Rebollar Alviter Ph. D.)

and Jalisco and the susceptibility of 13 field populations of Frankliniella occidentalis

the main species associated with blackberry were F. occidentalis, F. borinquen. In

addition, morphological idenfication added F. tolucensis, Retanathrips funestus,

showed significant differences in sensitivity to bifenthrin, malathion and spinosad with

of F. occidentalis to the three insecticides. It is suggested to establish Resistance

Management plans in the context of IPM.

KEY WORDS: resistance, organophosphorus, spinosyns, pyrethroids, integral

4.1. Objetivo general……………………………………………………………….19

4.2. Objetivos específicos…………………………………………………………..19

5.1. El cultivo de Zarzamora en México…………………………………………..20

5.2. Biología de los Trips………………………………..……………..…………..21

5.2.2. Ciclo de vida…………………………………………………………….23

5.3. Especies reportadas en Rubus sp……………………………………………..24

5.5. Identificación morfológica y molecular de los trips….……………….…….26

5.5.1. Técnicas de identificación morfológica………………………………..26

5.5.2. Técnicas de identificación molecular………………………………….28

Genes a amplificar y primer específicos……………………….29

5.6. Evaluación de la resistencia a insecticidasen insectos……………………….31

5.6.2. Factores que contribuyen al desarrollo de la resistencia……………31

5.6.3. Tipos de resistencia……………………………………………………32

5.6.4. Mecanismos de resistencia a insecticidas…………………………….34

5.6.5. Métodos de detección de resistencia………………………………….35

5.6.6. Insecticidas autorizados para el cultivo de zarzamora………………36

6.1. Ubicación y áreas de muestreo de trips………………………………………38

6.2. Identificación de especies de trips asociadas zarzamora……………………38