UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS - DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Curso: Química Orgánica - Laboratorio

Título de la práctica: Cromatografía

Integrantes:

● Beuzeville Calderón, Alexandra - 20210670

● López Ormachea, Viviana Marjory - 20210700
● Quinteros Altamirano, Percy Julio - 20210713
● Ramos Núñez, Luis Alonso - 20210715
● Ulloa Cavero, Ana Lucía - 20210723

Horario de la práctica: Lunes 4:00pm - 5:00pm

Grupo de la práctica: 05

Profesor de la práctica: Amelia Devorah, Arias Durand

Fecha de realización de la práctica: 03 de Enero del 2022

Fecha de entrega del informe: 10 de Enero del 2022

1. INTRODUCCIÓN

La cromatografía es un método físico de separación de mezclas, es usada por casi todos

los químicos en investigación. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo propósito es separar los distintos tipos de componentes de una mezcla,
permitiendo identificar las características y determinar las cantidades de dichos componentes
(Corzo, 2019).

En la cromatografía se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles, esta

característica es la que le distingue de la mayoría de los métodos físicos. Una fase estacionaria y
la otra móvil. Una muestra puede ser introducida en la fase móvil y es transportada a lo largo de
la columna que contiene a la fase estacionaria dispersa (Anónimo, 2008).

Si los componentes de la mezcla presentan diferentes afinidades por alguna de las fases,
sus velocidades medias de avance a lo largo del sistema serán diferentes. La afinidad viene
determinada por fuerzas de tipo Van der Waals, puentes de hidrógeno o transferencia de carga.
Los componentes que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se moverán más
lentamente a lo largo de dicha fase que aquellos que se unen débilmente (SENNOVA, 2018).

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos generales

● Comprender el proceso de cromatografía en capa fina y en columna. Así mismo,

entender los factores y características que en ellas intervienen.

2.2. Objetivos específicos

● Calcular y comprender la Relación de Frente (Rf) que se desarrolló en la separación de

cromatografía en capa fina.
● Analizar el comportamiento de las sustancias y relacionarlo con su polaridad.
● Realizar la separación de sustancia por medio de la cromatografía en columna.

3. MARCO TEÓRICO

3.1. Cromatografía

Es una técnica basada en el principio de retención selectiva, que es utilizada para la

separación, identificación y cuantificación de las diversas sustancias químicas que se encuentren
en mezclas complejas, para esto descompone aquella mezcla para luego analizar las especies
químicas que la constituyen. Se puede apoyar de otros métodos como la espectrofotometría o la
espectrometría de masas, para optimizar la separación de dichos compuestos. (Corzo, 2019).

3.1.1. Cromatografía líquida (LC)

3.1.1.1. Cromatografía en capa fina (CC). Es una técnica analítica que se basa en la
separación de mezclas orgánicas mediante comparación de estructura química,
liposolubilidad e hidrosolubilidad, pues se analiza la extracción de los
componentes de la muestra respecto a las fuerzas intermoleculares que
presenta al interactuar con la fase estacionaria y móvil. La fase estacionaria
usualmente está constituida por gel de sílice, alúmina, silicato de magnesio,
celulosa, de material absorbente, dispuesto en un soporte plástico de 0,1mm.
La fase móvil, también llamada eluyente puede ser hexano, tetraclorohexano,
cloroformo o acetona, y su función es excluir los constituyentes por
mecanismos de arrastre (Ruiz, 2020). La fuerza que impulsa la separación es
la acción capilar del adsorbente, que permite al disolvente ascender desde la
parte inferior de la placa. (Durst y Gokel, 2021).

Figura 2. Representación gráfica de separación de componentes de una

mezcla por cromatografía en capa fina ascendente.
Fuente: UNT, 2010.

3.1.1.2. Cromatografía en columna (TLC). Empleado para separar y purificar

muestras a una escala preparativa. La fase estacionaria o adsorbente, por lo
general es gel de sílice o alúmina introducido en una columna de vidrio. La
fuerza que propicia este método es la fuerza de gravedad, puesto que gracias a
ella el disolvente se puede desplazar a través de la columna (Lamarque et al.,
2008). Asimismo, se logra aislar los compuestos de la mezcla gracias a la
retención del absorbente sobre los correspondientes constituyentes, debido a
las afinidades y fuerzas que se presentan entre las fases y la muestra
analizada (Durst y Gokel, 2021).
 Figura 3. Separación de una mezcla de dos componentes por cromatografía
de elución en columna.
Fuente: UNT, 2010.

3.1.2. Cromatografía gaseosa (GC). En la cromatografía gaseosa, la fase estacionaria se

encuentra contenida en la columna, la cual puede ser empaquetada o de relleno y
capilares abiertos. En este método, la fase estacionaria entra en contacto con la fase
móvil dentro de la columna, de modo que la fase móvil siempre se presenta en
estado gaseoso. Sin embargo, el estado de agregación de la fase estacionaria puede
ser líquido o sólido, y de ello dependerá el tipo de cromatografía que se ejecutará
(Rohner, 2018).

3.2. Sistema cromatográfico

● Fase estacionaria (FE): Componente que permanece fijo con ayuda del soporte. Puede
encontrarse en estado líquido o sólido.

● Fase móvil (FM): Compuesto químico o una mezcla de ellos que fluye sobre la fase
estacionaria. Su función es separar los componentes de la mezcla mediante el arrastre de
los mismos. Se puede presentar en estado líquido o gaseoso.

● Soporte: Elemento físico que retiene la fase estacionaria. Puede ser papel, placas de
vidrio cubiertas con gel de sílice o columnas de vidrio o de acero inoxidable. (Corzo, 2019)

3.3. Fenómeno de adsorción

Es el efecto que ejerce la retención superficial ya sea física o química sobre una especie
química en determinados sitios activos de una superficie sólida. (Scariglia, Soberón,
Sampietro y Vattuone, 2010). Este fenómeno es utilizado en la técnica de cromatografía
gas-sólido, cromatografía en capa fina y en columna.

4. PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA

4.1. Metodología
 Figura 4. Cromatografía
Fuente: Elaboración propia (2022)

4.2. Cromatografía en Capa Fina

4.2.1. Insumos químicos

A. Propanol
B. Acetona
C. Agua
D. Anaranjado de metilo
E. Azul de metileno
F. Silicagel de la placa cromatográfica

Figura 5. Insumos químicos utilizados en la cromatografía en capa fina.

Fuente: Elaboración propia, (2021)

4.2.2. Materiales

A. Lápiz
B. Regla
C. Soporte de aluminio para placa cromatográfica
 D. Cámara cromatográfica

Figura 6. Materiales utilizados en la cromatografía en capa fina.

Fuente: Elaboración propia, (2021)

4.2.3. Procedimiento

Figura 7. Secuencia gráfica de la cromatografía en capa fina

Fuente: Elaboración propia, (2021)

4.3. Cromatografía en Columna

4.3.1. Insumos químicos

A. Etanol
B. Silicagel
C. Agua acidulada
 Figura 8. Insumos químicos utilizados en la cromatografía en columna.
Fuente: Elaboración propia, (2021)

4.3.2. Materiales

A. Algodón
B. Columna de vidrio
C. Colectores (tubos de ensayo)
D. Soporte universal
E. Bagueta
F. Vaso precipitado

Figura 9. Materiales utilizados en la cromatografía en capa fina.

Fuente: Elaboración propia, (2021)

4.3.3. Procedimiento
 Figura 10. Secuencia gráfica de la cromatografía en columna.

Fuente: Elaboración propia, (2021)

5. RESULTADOS

Tabla 1
Cromatografía en capa fina (C.C.F.)

Recorrido (cm)
Relación con el frente
(Rf):
Muestras 𝑅𝑐 OBSERVACIONES
Solvente 𝑅𝑓 =
Compuesto (Rc) 𝑅𝑠
(Rs)

1. Anaranjado 5.4
5.4 cm 5.9 cm 𝑅𝑓 = = 0. 915
de metilo 5.9

El anaranjado de
metilo se reconoce
ya que en la mezcla
2. Mezcla Anaranjado Azul de 5.4 1.1 recorre lo mismo.
(1+2) de metilo metileno 5.9 cm 𝑅𝑓 = 5.9
𝑅𝑓 = 5.9
(Rm1 o Rm2) 5.4 1.1 𝑅𝑓 = 0. 915 𝑅𝑓 = 0. 186

Fuente: Elaboración propia (2022)

Tabla 2.
Características de la cromatografía en capa fina.

Solvente de desarrollo o fase

Propanol, acetona y agua
móvil
 Fase fija o estacionaria Sílica gel

Fenómeno físico
Capilaridad y Adsorción
predominante

Fuente: Elaboración propia (2022)

Tabla 3.
Características de la Cromatografía en Columna: Separación de 2 colorantes.

Observaciones (de la
Solvente 1º Solvente 2do extracción por los diferentes
Fase fija Muestra
eluyente eluyente eluyentes)

Sílica gel Anaranjado Etanol - La mezcla de Sílica de Gel y

de metilo etanol permitió que el
adsorbente se compactara
bien en la parte inferior,
pegado al algodón.

Azul de - Agua El agua acidulada permitió

metileno acidulada aumentar la velocidad de
separación.

Fuente: Elaboración propia (2022)

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS

En la Tabla 1, lo primero a resaltar, es que podemos observar a simple vista las manchas de los
recorridos de cada compuesto, hecho el cual es relevante ya que caso contrario se tendría que
usar luz ultravioleta o algún otro agente revelador (Seco, et al., 2009). Se observa que la muestra
de anaranjado de metilo recorre una distancia de 5.4 cm y la mezcla se separa en dos
compuestos los cuales recorren 1.1 cm y 5.4 cm respectivamente. Se puede apreciar como uno
de los compuestos de la mezcla recorre la misma distancia que la muestra de anaranjado de
metilo. Esta igualdad en la distancia recorrida nos permite apreciar como, primero, la mezcla se
separó eficazmente por lo que marca una distancia entre cada componente y segundo, que tanto
el anaranjado de metilo en la mezcla, como la muestra libre, a pesar de sus diferentes
presentaciones recorren la misma distancia lo que se explica a partir de que el Rf es característico
de cada sustancia y siempre existirá la relación constante entre la distancia recorrida del
compuesto y la distancia que recorre el disolvente (Seco, et al., 2009).

Además podemos observar que el Rf del anaranjado de metilo (0.915) es mayor que el Rf del azul
de metileno (0.186), debido a que el valor más cercano al cero (el azul de metileno) tiene mayor
afinidad por la fase estacionaria y el valor más cercano al uno (el anaranjado de metilo) significa
 que el analito tiene más afinidad por la fase móvil, es decir, es menos retenida por la fase
estacionaria (Corzo, 2019) .

La Tabla 2 nos detalla el fenómeno que lo podemos explicar a partir de la elución y retención
selectiva dada la polaridad de cada sustancia. La sílica gel es un compuesto polar por lo que
presentará mayor atracción por lo polar. Esto nos permite predecir que el azul de metileno es más
polar que el anaranjado de metilo dado que al haber la elución, es el azul de metileno el que
queda retenido.

En la Tabla 3, en la cromatografía en columna se aplica la definición de que la cromatografía no

sólo es cualitativa, sino que también permite cuantificar los componentes de una muestra (UNLP,
2017) y es que por medio de esta técnica logramos separar y saber la cantidad de anaranjado de
metilo y azul de metileno en la mezcla. Además, por la cromatografía en capa fina fue posible
predecir qué compuesto saldría primero de la columna ya que el anaranjado de metilo era menos
polar. Adicionalmente, se puso en práctica el concepto de que más de un eluyente puede ser
empleado, en nuestro caso fue etanol en primer lugar y en segundo lugar agua acidulada, los
cuales se demostró que presentan diferente polaridad, por lo que el orden no fue aleatorio. Dicha
afirmación se debe que al emplear el etanol como eluyente, si bien es cierto logró separar el
anaranjado de metilo, el azul de metileno se separa con poca velocidad y al momento de agregar
el agua acidulada aumento la velocidad de separación con lo que se puede afirmar que el agua
acidulada es más polar que el etanol dado que tuvo mayor adsorción con la muestra.

7. CONCLUSIONES

● Gracias al material audiovisual brindado en clase fue posible tener un mayor entendimiento
acerca del método cromatográfico, principalmente en la cromatografía en capa fina y en
columna.

● En la práctica cromatográfica en capa fina se utiliza propanol, acetona y agua como fase
móvil, quién empieza a ascender por el cromatofolio gracias al fenómeno de capilaridad.
También se utilizó sílica gel como fase estacionaria el cual es muy polar.

● Se utilizó el Rf del anaranjado de metilo y azul de metileno para comparar las polaridad de
ambas sustancias. A mayor polaridad, mayor tiempo de retención y mayor Rf; es por ello
que el anaranjado de metilo recorre 5.4 cm, mientras que el azul de metileno solo recorre
1.1 cm obteniendo así, Rf de anaranjado de metilo 0.915 y Rf de azul de metileno 0.186.

● En la cromatografía en columna se logró separar la mezcla y cuantificar los componentes

colorantes anaranjado de metilo y azul de metileno. La primera desciende con mayor
facilidad debido a la afinidad que se tiene con la fase móvil, en el segundo se necesita una
fase más polar como el agua acidulada para permitir un descenso del azul de metileno por
la columna.

8. BIBLIOGRAFÍA

Anónimo (2008). Cromatografía. Principios generales. Recuperado de:

https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8246/7/T2cromagraf.pdf
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Durst, H. P. y Gokel G. W. (2021). Química orgánica experimental. Barcelona, España: Reverté.

Hernández, D. M. (2014). Cromatografía. Recuperado de

https://www.slideshare.net/S0G3R1/tipos-de-cromatografia

Iabuckas, D., Lamarque, A., López, L., Maestri, D., Torres, M. y Zygadlo, J. (2008). Fundamentos
teórico-prácticos de química orgánica. Córdoba, Argentina: Encuentro.

Rohner, P. (2018). Métodos cromatográficos aplicados al análisis de aguas de consumo y

residuales (Tesis de maestría). Universidad Nacional de Educación a Distancia, España.
Recuperado de:
http://e-spacio.uned.es/fez/eserv/bibliuned:master-Ciencias-CyTQ-Prohner/Rohner_Hernan
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Sgariglia M. A., Soberón, J. R., Sampietro, D. A., y Vattuone, M. A. (2010). CROMATOGRAFÍA:

CONCEPTOS Y APLICACIONES. Arakuku. Recuperado de
https://ri.conicet.gov.ar/bitstream/handle/11336/75465/CONICET_Digital_Nro.3655a360-b0
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Seco, M., Casamitjana, N., Angurell, I., Caubet, A., Dinarès, M., Llor, N.,...Velasco, D. (2009).
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SENNOVA (2018). Guía sobre principios básicos de cromatografía y sus aplicaciones.

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https://repositorio.sena.edu.co/bitstream/handle/11404/4694/guia_cromatograf%EDa.pdf;js
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UNIVERSIDAD NACIONAL LAS PALMAS. (2017). INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES

ANALÍTICAS. Recuperado de:
https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/pluginfile.php/35288/mod_resource/content/1/2%20crom
atografia%202017.pdf
 CUESTIONARIO DE CROMATOGRAFÍA

1. ¿Qué es el concepto de Rf? y ¿para qué nos sirve determinarlo?

La relación de frente (Rf) es un parámetro que indica la distancia que recorre el

componente de una muestra analizada sobre la fase estacionaria respecto a la distancia
total recorrida por la fase móvil (eluyente).

Se calcula de la siguiente manera:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑢𝑛 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝐴

𝑅𝑓 = 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝐹𝑀

De este parámetro pueden resultar valores entre 0 y 1. Es de gran utilidad para determinar
la naturaleza del analito, debido a que mientras tenga más afinidad con la fase estacionaria
(adsorbente), es decir, es más retenido, demostraría valores cercanos a 0. De lo contrario,
al presentar valores cercanos al 1, significa que el analito tiene mayor afinidad con el
eluyente, en otras palabras, se desplaza más.

Fuente:

Desconocido, (2019). CROMATOGRAFÍA. Recuperado de

https://aulavirtual.agro.unlp.edu.ar/pluginfile.php/43719/mod_resource/content/2/Cro
matograf%C3%ADa.pdf#:~:text=La%20relaci%C3%B3n%20de%20frentes%20Rf,fr
ente%20del%20solvente%20(FM).

2. ¿Cuáles son las características de los métodos cromatográficos evaluados?

En ambos métodos se utiliza alúmina o gel de sílice en la fase estacionaria (adsorbente) y

una fase móvil orgánica. Se caracterizan por apoyarse en el principio de adsorción, ya que
la fase estacionaria es la que se encarga de la exclusión de los distintos constituyentes, de
acuerdo a la afinidad que presente con cada uno de ellos, a través de fuerzas de distinta
intensidad, que podemos identificar al medir las distancias.

Fuente:

Durst, H. P. y Gokel G. W. (2021). Química orgánica experimental. Barcelona, España:

Reverté.

3. ¿En qué otro tipo de muestras se puede aplicar los métodos estudiados?

Las diferentes técnica de la cromatografía tienen aplicación en muestras que contengan

compuestos orgánicos (Nollet, 2006)

- Determinación del porcentaje de formación de una molécula de síntesis, en una

planta de síntesis orgánica.
- Determinación del porcentaje de solvente en un producto agroquímico terminado.
- Control de calidad de pureza de solventes, como alcohol etílico anhidro, tolueno,
xileno, benceno, que entran como materias primas a una planta.
4. Desarrolle un cuadro comparativo entre las diferencias de la cromatografía en capa fina,
cromatografía de papel y cromatografía en columna?

Cromatografía en capa Cromatografía Cromatografía en

fina de papel columna

La fase estacionaria es La fase estacionaria es un La fase estacionaria es una

sílica gel o alúmina papel de celulosa columna empaquetada

Fase móvil asciende por Fase móvil asciende por Fase móvil desciendo por
capilaridad capilaridad efectos de la gravedad

No necesita un tampón de No necesita un tampón de Necesita un tampón de

elución elución elución (algodón)

Determinación por el factor Determinación por el factor Determinación

de retención de retención espectrofotométrica
Fuente: Elaboración propia (2022).

5. Interprete los valores de Rf 0.05; 0.60 y 0.98.

En el primer caso encontramos que hay una gran diferencia con respecto a la distancia
recorrida por el solvente y por el compuesto, debido probablemente a que el compuesto es
muy polar, por lo que tiende a mantenerse apegado a la sílica y no se ve tan influenciado
por la parte móvil. En cambio, en el segundo caso con un Rf de 0.98 podemos observar
que el avance del compuesto es muy cercano al avance del solvente debido a no verse tan
afectado por la parte polar

6. ¿Qué entiende por cromatografía? y ¿Qué utilidad tiene la cromatografía en capa fina
(ccf)?

Se entiende por cromatografía a un método físico que trae como resultado la separación
de componentes de una mezcla para determinar la cantidad de éstos. Está conformado por
un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva y su utilidad es
variada para todas las ramas de la ciencia.

En cuanto a la cromatografía en capa fina, encontramos entre sus usos más frecuentes la
determinación de los componentes de una mezcla, determinación de la identidad de dos
sustancias, ayudar a seguir el curso de una reacción y/o a determinar las condiciones
apropiadas para la separación de mezclas en cromatografía en columna (cc).

Fuente: Recursos educativos de química (2022). Recuperado de:

https://www.dequimica.info/cromatografia-ccf#:~:text=La%20cromatograf%C3%ADa%20de
%20capa%20fina%20%28CCF%29%20es%20una,dos%20sustancias.%20Seguir%20el%
20curso%20de%20una%20reacci%C3%B3n.

7. Mencione y explique brevemente 3 clases de cromatografía.

 - Cromatografía líquida LC: Se utiliza para separar componentes de una muestra
mediante las interacciones químicas o físicas de ésta con dos fases, una móvil y
otra estacionaria. El análisis permite determinar si un componente específico está
presente o ausente y, si está presente, cuánto de él hay.

La cromatografía líquida de alta resolución HPLC, como su nombre sugiere, es la

variante de rendimiento utilizada para separaciones de alta eficiencia con alta
resolución cromatográfica. Los componentes separados también se pueden aislar
después de la detección como medio de purificación, utilizando un colector de
fracciones.

Fuente: Giles (2021). Recuperado de:

http://www.news-courier.com/analysis/articles/liquid-chromatography-including-hplc-
uhplc-and-lcxlc-344048

- Cromatografía gaseosa (GC): Esta técnica cromatográfica se lleva a cabo en un

cromatógrafo de gases y a diferencia de los dos otros tipos de técnicas, en esta la
fase móvil no interactúa con las moléculas del analito puesto que su única función
es la de transportar el analito a través de la columna.

En el proceso la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de un mechero de

una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil
de gas inerte.

Fuente: CROMTEK (2019). Recuperado de:

https://www.cromtek.cl/cromatografia-gaseosa-gc/

- Cromatografía de fluidos supercríticos: Ésta sirve para separar los compuestos

inestables o no volátiles que no pueden separarse con el gas o aquellos que no se
pueden detectar mediante el HPLC.

No se aumenta la velocidad de elución modificando la temperatura, sino la presión

del SF. a diferencia de la cromatografía de gases. El aumento de presión, al
aumentar la densidad, permite una mayor interacción analito-fase móvil y disminuye
los tiempos de elución. Esto se suele emplear en las eluciones una primera etapa
isobárica, para luego aumentar la presión lineal o asintóticamente hasta el final de
la elución.

Fuente: Lumitos (2022). Recuperado de:

https://www.quimica.es/enciclopedia/Cromatograf%C3%ADa_de_fluidos_supercr%
C3%ADticos.html

8. ¿Qué es un eluyente y revelador en una ccf?

Un eluyente es el solvente que se emplea en la preparación de la fase móvil, y se le

conoce así dado que eluye, es decir extrae un soluto de la fase estacionaria. En el caso de
un revelador, es el agente que se emplea para observar los componentes una vez se
separa la mezcla, existen métodos físicos en los que se emplea por ejemplo un
fluorescente y los métodos químicos en los que se suele usar yodo o ácido sulfúrico para
que reaccionen y produzcan las manchas.

Fuente:

Revista Arakuku (2010). Recuperado de:

https://ri.conicet.gov.ar/bitstream/handle/11336/75465/CONICET_Digital_Nro.3655a360-b0
3b-44c8-8519-bc747d073f7c_A.pdf?Sequence=2&isallowed=y

República Bolivariana de Venezuela. Recuperado de:

http://criminalistica.mp.gob.ve/wp-content/uploads/2015/07/T%C3%A9cnica-de-Cromatogra
f%C3%ADa-en-Capa-Fina.pdf

Nota 17