UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

“Validación de la metodología de identificación y cuantificación de Colorantes

Artificiales (Rojo Allura FD& C rojo No. 40 (16,035) y Amarillo Ocaso FD&C amarillo No.6
(15,985)) en mermeladas de fresa en presentación de tarro de vidrio 290g distribuidas
en la Ciudad Capital de Guatemala”

Sindy Alejandra Palacios Castillo

Química Farmacéutica

Guatemala, noviembre de 2018

 UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

“Validación de la metodología de identificación y cuantificación de Colorantes

Artificiales (Rojo Allura FD& C rojo No. 40 (16,035) y Amarillo Ocaso FD&C amarillo No.6
(15,985)) en mermeladas de fresa en presentación de tarro de vidrio 290g distribuidas
en la Ciudad Capital de Guatemala”

Informe de Tesis

Presentado por

Sindy Alejandra Palacios Castillo

Para optar el título de

Química Farmacéutica

Guatemala, noviembre de 2018

 JUNTA DIRECTIVA

Dr. Rubén Dariel Velásquez Miranda Decano

M.A. Elsa Julieta Salazar Meléndez de Ariza Secretaria

MSc. Miriam Carolina Guzmán Quilo Vocal I

Dr. Juan Francisco Pérez Sabino Vocal II

Lic. Carlos Manuel Maldonado Aguilera Vocal III

Br. Byron Enrique Pérez Díaz Vocal IV

Br. Pamela Carolina Ortega Jiménez Vocal V

 DEDICATORIA

A DIOS: Por ser mi inspiración, por brindarme de su amor y sabiduría, por

darme las fuerzas para seguir adelante y nunca dejarme
desamparada. Porque cuando estaba a punto de caer, siempre me
recordaste tu palabra y tus promesas.

A MIS PADRES: Jaime Palacios y Verónica Castillo. Por ser mis dos luceros y mis
motores para cumplir mis sueños. Les agradezco todo su apoyo y
su amor incondicional, sin ustedes esta meta no podría ser posible.
Ustedes son mis dos ejemplos a seguir. Los amo.

A MIS HERMANOS: Jaime Palacios y Paula Palacios. Por ser mis dos razones para seguir
adelante y darles un buen ejemplo. Por su apoyo, pero sobre todo
por ser mi fuente de alegría, por sus risas y su amor.

A MI FAMILIA: A mi abuela, abuelo, tías, tíos, primas y primos. Gracias por su

cariño, por estar pendientes de mi progreso y por sus palabras de
ánimo.

A MIS AMIGOS: A quienes conocí durante la universidad y me han acompañado en

toda esta trayectoria. Muchas gracias por todos esos momentos
especiales, risas, aventuras y por las palabras de ánimo. A mis
amigas, que a pesar de no estar en la misma carrera siempre han
estado pendientes de mí, les agradezco su cariño, apoyo y por
estar siempre cuando las he necesitado. A todos aquellos que he
conocido a lo largo de mi vida y que han sido de motivación y
apoyo para culminar esta etapa. Muchas gracias.
 AGRADECIMIENTOS

A: La Universidad de San Carlos y a la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia. Por ser mi casa de estudios y por brindarme los conocimientos
necesarios para formarme profesionalmente.

A: Licenciada Julia Amparo García Bolaños, por ser mi asesora y mi

compañera durante la realización de este trabajo. Gracias por todo su
apoyo, cariño y tiempo dedicado.

A: Licenciada Aylin Santizo Juárez, por ser mi revisora y por brindarme sus
conocimientos para que este trabajo fuera un éxito. Gracias por sus
observaciones y su tiempo dedicado.

A: Doctora Sully Margot Cruz, por su apoyo al brindarme amablemente los

materiales que necesitaba en su momento.

A: Mis catedráticos, por brindarme sus conocimientos durante toda mi etapa

universitaria y por ayudarme a desarrollarme y desenvolverme en
diferentes áreas académicas.

A: Todas las personas que de alguna u otra forma fueron parte de este
proceso, muchas gracias.
 ÍNDICE

Página

1. RESUMEN 1

2. INTRODUCCIÓN 3

3. ANTECEDENTES 4

4. JUSTIFICACIÓN 35

5. OBJETIVOS 36

6. HIPÓTESIS 37

7. MATERIALES Y MÉTODOS 38

8. RESULTADOS 46

9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 59

10. CONCLUSIONES 64

11. RECOMENDACIONES 65

12. REFERENCIAS 66

13. ANEXOS 68
 1

1. RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo principal evaluar los colorantes artificiales indicados en la
etiqueta de las mermeladas de fresa y verificar su cumplimiento con los límites establecidos por el
Reglamento Técnico Centroamericano -Alimentos y Bebidas procesadas. Aditivos Alimentarios-
RTCA 67.04.54:10.

Con el fin de tener resultados certeros y al mismo tiempo tener un método que se pueda seguir
utilizando en investigaciones futuras, se realizó la validación de la metodología de identificación y
cuantificación de colorantes. Por lo tanto, el proceso se dividió en tres etapas; validación
incluyendo la verificación del porcentaje de recobro utilizando lana de oveja, identificación y
cuantificación de los colorantes presentes en las muestras de mermeladas.

Para la primera etapa de validación se llevaron a cabo pruebas para determinar los parámetros de
linealidad, exactitud, precisión y robustez, tomando como referencia a lo establecido en la
“Política de Selección y Validación de Métodos de ensayo” emitido por la Organización de
Acreditación de Guatemala (OGA). Se llevaron a cabo diferentes curvas de calibración para cada
colorante, en donde se pudo observar coeficientes de determinación no inferiores a 0.9998. Se
llevó a cabo la verificación del porcentaje de recobro del colorante a través de la lana, en donde se
observaron que los porcentajes de recobro se mantuvieron altos, con un promedio no menor al
98.0%. Así como también se observaron coeficientes de variación menores al 3% siendo un
porcentaje aceptable. Asimismo, se obtuvieron resultados de robustez satisfactorios tras analizar
cambios de pH y longitudes de onda.

En la segunda etapa se realizaron pruebas con diferentes fases móviles, con el fin de determinar
una fase móvil que lograra arrastrar adecuadamente a los estándares y muestras en la sílica gel y
así se lograra identificar adecuadamente la presencia o ausencia de los colorantes. Luego de
someter a identificación a las tres marcas de mermeladas se observó que efectivamente una
marca no presentaba colorante como lo indicaba su etiqueta y las otras dos marcas si presentaron
los colorantes reportados.
 2

En la tercera etapa se prosiguió a cuantificar los colorantes reportados en las otras dos marcas de
mermeladas. Se tomaron lectura de sus absorbancias a las longitudes de onda máxima
determinadas utilizando el espectrofotómetro UV-Visible. Y tras realizar los cálculos
correspondientes se observó que todas las muestras de mermeladas cumplieron con los límites
establecidos en el Reglamento Técnico Centroamericano -Alimentos y bebidas procesadas.
Aditivos Alimentarios- RTCA 67.04.54:10.
 3

2. INTRODUCCIÓN

“La elaboración de mermeladas sigue siendo uno de los métodos más populares para la
conservación de las frutas en general. Una verdadera mermelada debe presentar un color brillante
y atractivo, reflejando el color propio de la fruta.” (Grupo Latino Editores, 2008)

Es por ello que en su elaboración se incorpora el uso de colorantes artificiales. Sin embargo, la
seguridad de los colorantes artificiales certificados ha recibido una gran atención pública en los
últimos años. Debido a su asociación con hiperactividad en niños y reacciones alérgicas como
urticaria y asma, especialmente cuando se mezcla con otro color sintético en productos
alimenticios. (Rovina, Siddiquee, & Shaarani, 2016)

Debido a esto se puede observar que en el Reglamento Técnico Centroamericano. –Alimentos y

Bebidas procesadas. Aditivos alimentarios- (RTCA 67.04.54:10) se han establecido límites para
cada uno de los colorantes, según el alimento al que se le desea añadir. En este caso, existen
límites para Rojo Allura y Amarillo Ocaso en mermeladas, siendo estos 500mg/kg y 300mg/kg
respectivamente. Siendo importante también, que el alimento cumpla con lo que aparece en la
etiqueta y que la misma incluya la lista de ingredientes completa, para evitar que las personas
consuman alimentos que contienen componentes a los que puede ser alérgico. Por otro lado,
existe poco control de los alimentos después de que estos son sacados al mercado. No hay
monitoreo que verifique que el alimento realmente sigue cumpliendo con lo establecido en la
etiqueta estando ya disponible para el consumidor.

Para verificar que se esté cumpliendo con los límites establecidos, existe un método que se basa
en la extracción del colorante alimenticio a través de lana de oveja junto a reactivos ácidos-
básicos, su identificación basándose en cromatografía en capa fina y su cuantificación utilizando
espectrofotometría UV-Visible. Sin embargo, es un método que no está validado. “Siendo el
objetivo principal de la validación analítica el de asegurar que un procedimiento analítico
seleccionado dará resultados reproducibles y confiables que sean adecuados para el propósito
previsto”. (CDER, 2016)

Es por ello que se llevó a cabo la validación de la metodología y su respectiva aplicación en la

identificación y cuantificación de Rojo Allura y Amarillo Ocaso en mermeladas de fresa.
 4

3. ANTECEDENTES
3.1 Mermeladas

“Se define a la mermelada de frutas como un producto de consistencia pastosa o gelatinosa,

obtenida por cocción y concentración de frutas sanas, adecuadamente preparadas, con adición de
edulcorantes, con o sin adición de agua. La fruta puede ir entera, en trozos, tiras o partículas finas
y deben estar dispersas uniformemente en todo el producto.” (Grupo Latino Editores, 2008)

Según el Reglamento Técnico Centroamericano. Aditivos Alimentarios. RTCA 67.04.54:10. La

mermelada es una pasta de fruta espesa y para untar preparada con la fruta entera, la pulpa o el
puré de fruta que se ha hervido con azúcar para espesarla, y a la que puede añadirse pectina y
trozos de fruta y trozos de piel de fruta.

Según el Codex Alimentarius, es el producto preparado con fruta entera, pulpa, puré, zumo (jugo),
extracto acuoso o cáscara de frutos cítricos, mezclados con azúcares y/o edulcorantes
carbohidratos como la miel, con o sin la adición de agua, y elaborado hasta adquirir una
consistencia gelatinosa adecuada. Contiene trozos de cáscara de frutos cítricos (la cáscara de
frutos cítricos es siempre un ingrediente clave en el producto final, sin importar la fase de la
producción en la que ésta se añade).

“La elaboración de mermeladas sigue siendo uno de los métodos más populares para la
conservación de las frutas en general. Una verdadera mermelada debe presentar un color brillante
y atractivo, reflejando el color propio de la fruta. Además debe aparecer bien gelificada sin
demasiada rigidez, de forma tal que pueda extenderse perfectamente. Debe tener por supuesto
un buen sabor afrutado. También debe conservarse bien cuando se almacena en un lugar fresco,
preferentemente oscuro y seco.” (Grupo Latino Editores, 2008)

La mermelada de fruta es un producto pastoso obtenido por la cocción y la concentración de una

o más frutas adecuadamente preparadas con edulcorantes, sustancias gelificantes y acidificantes
naturales, hasta obtener una consistencia característica.

La preparación de mermeladas ha pasado de ser un proceso casero, para convertirse en una

importante actividad de la industria de procesamiento de frutas. La conservación de este producto
 5

se basa en las características de las materias primas que se emplean y los varios efectos que se
ejercen sobre los microorganismos potencialmente deteriorantes de las mermeladas.

En primer lugar la materia prima empleada son las frutas, y éstas en su mayoría se caracterizan
por ser ácidas con un valor de pH que oscila entre 2.8 a 3.8, propiedad que limita el desarrollo de
microorganismos patógenos, siendo las mermeladas atacables por hongos y levaduras.

En segundo lugar, el tratamiento de concentración se hace a temperaturas que pueden variar

entre 85 y 96°C durante períodos de 15 a 30 minutos cuando menos. Este tratamiento térmico
elimina de manera importante formas vegetativas de microorganismos y la mayoría de
esporuladas.

Un tercer efecto conservante es la alta concentración de sólidos solubles que alcanza el producto
final. La alta presión osmótica que presenta un producto con 65 a 68% de sólidos solubles impide
el desarrollo de microorganismos. (Grupo Latino Editores, 2008)

3.1.1 Ingredientes

Los ingredientes que se incluyen comúnmente en la elaboración de mermeladas son

frutas, agentes edulcorantes, gelificantes, acidificantes y otros aditivos que permita la
legislación en cuanto a calidad y cantidad. (Grupo Latino Editores, 2008)

3.1.2 Las frutas

Lo primero a considerar es la fruta, que será tan fresca como sea posible. Con frecuencia
se utiliza una mezcla de fruta madura con fruta que recién ha iniciado su maduración y los
resultados son bastante satisfactorios. La fruta demasiado madura no resulta apropiada
para preparar mermeladas, ya que no gelificará bien. La calidad final de la mermelada va a
depender necesariamente de las características de sanidad, madurez y composición de las
frutas que se empleen.
 6

3.1.3 Azúcares

“El azúcar es un ingrediente esencial. Desempeña un papel vital en la gelificación de la

mermelada al combinarse con la pectina. Los azúcares o edulcorantes más comúnmente
usados en la elaboración de este tipo de conservas son la sacarosa, glucosa, jarabe
invertido y las mieles. El contenido en azúcar de una conserva está expresado en
porcentaje de sólidos solubles o grados Brix (°Bx). Estos se determinan directamente
mediante lectura en refractómetro a 20°C y se expresan en porcentaje de sacarosa.”
(Grupo Latino Editores, 2008)

3.1.4 Ácido cítrico

El ácido cítrico es importante no solamente para la gelificación de la mermelada sino

también para conferir brillo al color de la mermelada, mejora el sabor, ayuda a evitar la
cristalización del azúcar y prolonga su tiempo de vida útil. El ácido cítrico se añade antes
de cocer la fruta ya que ayuda a extraer la pectina. (Grupo Latino Editores, 2008)

3.1.5 Pectinas

Las pectinas son hidrocoloides que en solución acuosa presentan propiedades espesantes,
estabilizantes y sobre todo gelificantes. Su uso está muy extendido en la industria
transformadora de frutas debido a su propiedad funcional de gelificación en medio ácido
azucarado. (Grupo Latino Editores, 2008)

Las manzanas, las ciruelas, las moras y las naranjas son ricas en pectinas. Las zarzamoras,
las fresas, las frambuesas y las piñas contienen cantidades moderadas, mientras que los
duraznos, las peras y las cerezas son muy bajas en pectinas naturales. (Kirk, Sawyer, &
Egan, 2008)

3.1.6 El ácido

El fenómeno de la gelificación está estrechamente ligado a la acidez activa, expresada

como pH. La exacta valoración del pH es extremadamente importante, ya que una mínima
 7

diferencia en la zona del óptimo de gelificación influye definitivamente sobre la rigidez y

consistencia de un gel.

El ácido debe ser introducido al final de la cocción ya que con esto se crean las condiciones
necesarias para la gelificación y se inicia el proceso. Los ácidos más usados son el cítrico, el
tartárico y menos comúnmente el láctico y el fosfórico. El ácido cítrico es considerado
generalmente más propicio por su agradable sabor. (Grupo Latino Editores, 2008)

3.2 Elaboración industrial de mermeladas

Al procedimiento seguido en la preparación de mermeladas y al tipo de materias primas

empleadas, se unen además ciertas condiciones fundamentales de carácter general, relacionadas
con la formulación necesaria para que se logre obtener un producto que cumpla con las exigencias
de calidad.

Las fórmulas de fabricación están constituidas por varios factores que contribuyen, en forma
unida, a lograr las cualidades peculiares del producto terminado. Estos factores son:

 Sólidos solubles del producto terminado (expresados como °Brix).

 El óptimo de azúcar invertido.
 Acidez total y el pH del producto.

“Los otros factores como las características fisicoquímicas de la fruta, de la pectina y del agua,
constituyen variables que provocan un continuo adaptamiento y ajuste de las fórmulas de
elaboración, tarea a cargo del especialista experimentado en la preparación de este tipo de
conservas.” (Grupo Latino Editores, 2008)

“En el hogar se parte de frutas frescas troceadas, sobre todo de las que tienen pectinas
gelificantes como manzanas, cáscaras de cítricos y manzanillo, ya que en la fresa y la piña no están
presentes. Las frutas, añadidas de azúcar y jugo de limón (ácido cítrico), se calientan a ebullición
por horas para concentrar los sólidos y así se envasan.” (Badui, s.f)

En la gran industria se parte de frutas congeladas, se les añaden pectinas comerciales, azúcar o
jarabe de fructosa y ácido cítrico; se cierra el evaporador y las bombas de vacío reducen la presión
 8

a 460-480 mm Hg para vaporizar el agua a 65°C hasta alcanzar una concentración de 55 a 65 °Brix
en un corto tiempo; en estas condiciones se destruyen microbios y enzimas, pero no se propicia
tan intensamente la reacción de Maillard y el oscurecimiento del producto, y tampoco se pierden
los sabores naturales de las frutas. La gelificación de las pectinas es la base de las mermeladas y
por eso el azúcar y el ácido se deben añadir en las proporciones correctas; en exceso, la sacarosa
cristaliza y causa mal aspecto, pero si son insuficientes las pectinas no gelifican.

Una vez alcanzada en el evaporador la concentración requerida en grados Brix, los envases de
vidrio o de plástico se llenan con la mermelada caliente, prácticamente estéril en ese momento; el
enfriamiento posterior del envase produce la condensación interna del vapor de agua y con ello un
ligero vacío que hace cóncava su tapa. Sin embargo, una vez abierto puede contaminarse con
hongos, como lo hacen otros alimentos de humedad intermedia, razón por la que se le añade
benzoato de sodio en 100 partes por millón (ppm). (Badui, s.f)

“El principio básico en la fabricación de conservas y mermeladas es hervir en conjunto la fruta

(preparada adecuadamente), azúcares ( jarabe de sacarosa, jarabes de glucosa de alta conversión
y en menor grado en la actualidad, jarabe de azúcar invertida) y agua. En el caso de la mermelada,
las cáscaras se cuecen aparte antes de mezclarlas. Durante la ebullición, aumenta la proporción de
la materia sólida en la mezcla (debido a la evaporación del agua), una porción de la sacarosa se
hidroliza en azúcar invertida y se produce un gel al enfriarse. Cuando la fruta es baja en pectina o
en ácido, la deficiencia se compensa agregando soluciones de dichos ingredientes al final de la
ebullición.” (Kirk, Sawyer, & Egan, 2008)

Cuando el proceso se lleva a cabo en condiciones atmosféricas, el punto de ebullición se alcanza a

cerca de 106°C, el azúcar tiende a caramelizar en forma excesiva y el sabor puede deteriorarse.
Dicho deterioro de la calidad es menos probable que ocurra si la ebullición se efectúa al vacío (al
bajar el punto de ebullición aproximadamente a 71°C). Sin embargo, el proceso al vacío es menos
adecuado para efectuar la eliminación del dióxido de azufre de las pulpas sulfitadas. Las pulpas
sulfitadas tienen su color natural fuertemente blanqueado por el SO2, de modo que es necesario
añadir colorantes para restablecer la apariencia.
 9

El análisis de rutina de las conservas, jaleas y mermeladas debe incluir las determinaciones de los
sólidos solubles, el dióxido de azufre y los metales traza, así como un examen del tipo de los
colorantes adicionados y de la fruta presente. (Kirk, Sawyer, & Egan, 2008)

3.3 Aditivos

Legalmente se consideran como aditivos aquellas sustancias añadidas de manera intencional a los
alimentos para mejorar sus propiedades físicas, sabor, conservación, etc., pero no aquellas
añadidas con el objetivo de aumentar su valor nutritivo.

El uso correcto de aditivos permite:

 Conservar la calidad nutricional.

 Proporcionar ingredientes necesarios para grupos con necesidades dietéticas especiales.
 Aumentar la estabilidad o mejorar propiedades sensoriales, sin engañar.
 Ayudar en la fabricación, transporte o almacenamiento, sin encubrir defectos.

Para ello existen normas que regulan el uso de aditivos, colocando una lista de aditivos permitidos,
y su cumplimiento es obligatorio. (Grupo Latino Editores, 2008)

Anteriormente Guatemala se basaba en la Norma GOGUANOR 34 192 “Aditivos alimentarios para

consumo humano”. Sin embargo, esta norma ha dejado de estar vigente con la actualización de las
Normas COGUANOR publicado en noviembre del 2016. Por lo tanto, a partir de tal fecha, para
determinar los aditivos y sus cantidades permitidas en cada alimento se recurre al Reglamento
Técnico Centroamericano. –Alimentos y Bebidas procesadas. Aditivos alimentarios- (RTCA
67.04.54:10), en el cual se indican los aditivos permitidos para las mermeladas junto con su nivel
máximo permitido, como se puede observar en el Cuadro No. 1.

Cuadro No.1 Aditivos permitidos en mermeladas.

Categoría de Alimentos No 0.4.1.2.6 Confituras, jaleas, mermeladas

Aditivo Nivel Máximo Aceptado
Acesulfame Potásico 1000 mg/kg
Adipatos 2000 mg/kg
Alginato de propilenglicol 5000 mg/kg
 10

Alitame 100 mg/kg

Amarillo de Quinoleina 500 mg/kg
Amarillo Ocaso FCF 300mg/kg
Aspartame 1000 mg/kg
Azul Brillante FCF 500 mg/kg
Benzoatos 1000 mg/kg
Cantaxantina 200 mg/kg
Carmines 200 mg/kg
Carotenoides 500 mg/kg
Carotenos Vegetales 1000 mg/kg
Ciclamatos 1000 mg/kg
Color Caramelo, Clase III BPM
Color Caramelo, Clase IV 1500 mg/kg
Dimetilpolisiloxano 30 mg/kg
EDTAs 130 mg/kg
Eritrosina BPM
Esteres de Sorbitan de Acidos Grasos 5000 mg/kg
Extractos de Bija, Bixina, Norbixina, Annato 20 mg/kg
Glicosidos de esteviol 360 mg/kg
Indigotina 500 mg/kg
Marron HT 500 mg/kg
Neotamo 70 mg/kg
Óxidos de Hierro 200 mg/kg
Pectinas (Amida y no amida) BPM
Ponceau 4R 100 mg/kg
Riboflavinas 200 mg/kg
Rojo Allura AC 500 mg/kg
Sacarina 200 mg/kg
Sales de Aspartamo y Acesulfamo 1000 mg/kg
Sorbatos 1000 mg/kg
Sucralosa 400 mg/kg
Sulfitos 100 mg/kg
Tartracina 500 mg/kg
Tartratos BPM
Verde Sólido FCF 400 mg/kg
Fuente: Reglamento Técnico Centroamericano. –Alimentos y Bebidas procesadas. Aditivos alimentarios-
(RTCA 67.04.54:10)
 11

3.4 Colorantes

Colorante es cualquier compuesto químico ya sea natural o sintético que tiene la propiedad de dar
color. Si son de origen natural también se les denomina “pigmentos” y están presentes en las
células y tejido animal y vegetal. A los sintéticos se les llama colorantes y lacas.

Cuando los alimentos se cocinan pierden su color natural, razón por la cual se puede mejorar su
aspecto óptico con colorantes. Sólo unos pocos colorantes están permitidos para casi todos los
alimentos, los demás se pueden utilizar sólo en determinados alimentos. Puede haber cierto
riesgo con algunos colorantes para las personas alérgicas. (Grupo Latino Editores, 2008)

Estos compuestos confieren, acentúan o modifican el color de cereales, bebidas embotelladas,

postres, sopas, yogures, quesos, cárnicos y muchos otros alimentos. (Badui, s.f)

Los colorantes naturales se dividen en tres categorías:

1. De origen vegetal, como la clorofila, los carotenoides, las antocianinas y las betalainas.
2. De origen animal, como la cochinilla.
3. De origen mineral, principalmente el dióxido de titanio de color blanco.

Por otra parte, los colorantes sintéticos o artificiales tienen mayor poder de tinción que los
naturales y se pueden dividir en hidrosolubles, adecuados para alimentos con agua y en lacas para
productos secos y con grasa. Su grupo cromóforo, responsable del color, tiene diferentes orígenes
químicos. (Badui, s.f)

“Los colorantes artificiales son solubles en agua, debido a la presencia de grupos de ácido
sulfónico, y consecuentemente son fáciles de utilizar, generalmente en forma de sales sódicas, en
líquidos y materiales pastosos. Además de mucho más fáciles de utilizar que los colorantes
naturales, los colorantes artificiales son también, en general, más resistentes a los tratamientos
térmicos, pH extremos, luz, etc., que los colorantes naturales. Solamente la eritrosina, el índigo y
el verde lisamina son relativamente sensibles a la acción de la luz.” (Calvo, 2004)
 12

3.4.1 Aspectos Regulatorios

En Estados Unidos, el uso de colorantes está regulado por el suplemento “Color Additive
Amendment” publicado en 1960 que completa el “Food, Drug and Cosmetic Act” de 1938
de la Food and Drug Administration (FDA). Este suplemento clasifica los colorantes en dos
categorías colorantes certificados y colorantes exentos de certificación. Los colorantes
certificados son compuestos sintéticos que no se encuentran en la naturaleza. El proceso
de certificación conlleva que el colorante debe cumplir determinadas especificaciones de
calidad establecidas por el gobierno. Se deben enviar muestras de cada lote de producción
a los laboratorios de la FDA para que se confirme el cumplimiento de estas
especificaciones. Si el lote cumple tales requisitos se le asigna un número de lote oficial.
Además los colorantes certificados se clasifican a su vez en provisionales o permanentes.
Un colorante certificado provisionalmente puede utilizarse legalmente a la espera de
completar todas las investigaciones científicas necesarias para determinar si se incluye o
no en la lista de colorantes certificados permanentemente. (Srinivasan, Kirk, & Owen,
2008)

El Color Additive Amendment incluye una nomenclatura simplificada de los colorantes

certificados. En lugar de emplear nombres comunes largos y difíciles, a los colorantes
certificados se les asigna un número junto a la abreviatura FD&C, D&C, o Ext. (externa)
D&C. Los FD&C son colorantes que pueden utilizarse en alimentos, fármacos y cosméticos.

Cuadro No.2 Colorantes certificados

Nombre Colorante Nombre Común Número Eа

FD&C Blue No. 1 Permanente Azul Brillante FCF E 133
FD&C Blue No. 2 Permanente Indigotina E 132
C
FD&C Green No. 3 Permanente Verde Sólido FCF
FD&C Red No. 3 Permanente Eritrosina E 127
FD&C Red No. 40 Permanente Rojo Allura E 129
FD&C Yellow No. 5 Permanente Tartrazina E 102
FD&C Yellow No.6 Permanente Amarillo Anaranjado S E 110
а Números E: Números listados en la Comunidad Económica Europea.
c No listada.
Fuente: (Srinivasan, Kirk, & Owen, 2008)
 13

3.4.2 Propiedades de los colorantes certificados

La seguridad de los colorantes certificados ha recibido una gran atención pública en los
últimos años. El origen de esta preocupación puede atribuirse en parte a la desafortunada
asociación entre los colorantes sintéticos con el término original de tintes “derivados de
alquitranes”. La imagen que tiene el público del alquitrán es la de una sustancia negra
espesa inadecuada para usarla en los alimentos. La realidad es que las materias primas
utilizadas en la síntesis de colorantes son altamente purificadas antes de su empleo. El
producto final es una especie química que guarda muy poca relación con el término
alquitrán. (Srinivasan, Kirk, & Owen, 2008)

Los colorantes certificados caen en cuatro clases químicas básicas: los tipos azo,
trifenilmetano, xantina e índigo.

3.4.3 Colorantes azoicos

Los colorantes azoicos deben su color a la presencia de un grupo azo conjugado con anillos
aromáticos por ambos extremos. Como en el caso de los demás colorantes artificiales, los
colorantes azoicos autorizados para su utilización como aditivos alimentarios son todos
solubles en agua, debido a la presencia de grupos sulfónicos.

Los colorantes azoicos se han cuestionado reiteradamente, debido a que muchos

colorantes de esta familia (no los autorizados para uso alimentario) han demostrado ser
cancerígenos en experimentos con animales. Una diferencia fundamental es que los
colorantes cancerígenos son poco polares, solubles en grasas, y atraviesan con cierta
facilidad la barrera intestinal, incorporándose al organismo. En cambio, los colorantes
autorizados, que son muy polares y solubles en agua, no se absorben. (Calvo, 2004)

Dentro de los colorantes a estudiar, pertenecen a este grupo los siguientes:

Amarillo anaranjado S
Rojo Allura AC
 14

a) Amarillo anaranjado S

También conocido como “amarillo ocaso”, este colorante se utiliza en la mayor parte de
los países del mundo, incluyendo Estados Unidos (con el código FD&C Yellow #6).
Su fórmula empírica es C16 H10 N2 O7 S2 Na2 con peso molecular de 452 gramos.
Perteneciente a la clasificación monoazo que da una tonalidad amarillo rojiza. Soluble en
agua y escasamente soluble en etanol.

La ingesta diaria aceptable de amarillo anaranjado S o amarillo No. 6 es de 3.75 mg/kg/día,

o 112.5 mg para un niño de 30 kg. La producción promedio actual per cápita de amarillo
No. 6 es equivalente a aproximadamente 14 mg/día, por lo que es el tercer colorante más
utilizado. Considerando que las estimaciones de la FDA para "consumidor frecuente"
promedio que consume alrededor de cinco veces más colorante que un “consumidor
promedio” durante sus vidas, algunos niños pueden estar consumiendo cantidades
superiores a la ingesta diaria admisible. (Kobylewski, 2010)

Imagen No.1: Molécula de Amarillo anaranjado S o Amarillo Ocaso

Fuente: (Kobylewski, 2010)

b) Rojo Allura

El colorante aniónico Rojo 40 es ampliamente utilizado en la industria textil, alimentaria y

de tintas de tatuajes. Es un colorante ácido de la clase de los monoazos, también llamado
Rojo allura, con fórmula química C18H14N2Na2O8S2; peso molecular de 496.42 gramos.
Además, tiene propiedades ácidas y una estructura aromática constituida por tres anillos
bencénicos. Se han establecido para este colorante características de toxicidad y
patogenicidad en la mayoría de productos alimenticios en los cuales es adicionado, como
bebidas gaseosas, productos lácteos y de repostería, de tal forma que su consumo no es
recomendado para la población infantil en algunos países de Europa. (Kobylewski, 2010)
 15

La ingesta diaria aceptable para el Rojo No. 40 o Rojo Allura es de 7 mg/kg/día. Lo que se
traduce en 210 mg para un niño de 30kg.

Imagen No.2: Molécula de Rojo Allura

Fuente: (Kobylewski, 2010)

3.4.4 Valores Permitidos de Colorantes en Mermeladas

Según el Reglamento Técnico Centroamericano. –Alimentos y Bebidas procesadas. Aditivos

alimentarios- (RTCA 67.04.54:10), estos son los valores máximos permitidos en el alimento
en estudio; mermeladas, para cada uno de los colorantes artificiales.

Cuadro No.3 Límites máximos permitidos para el colorante artificial amarillo ocaso.

AMARILLO OCASO
Categoría de alimentos Nivel Máximo
Confituras, jaleas mermeladas 300mg/kg
Productos para untar a base de frutas 300mg/kg
Fuente: Reglamento Técnico Centroamericano RTCA 67.04.54:10. Anexo de la resolución No. 283-
2012 (COMIECO-LXII).

Cuadro No.4 Límites máximos permitidos para el colorante artificial Rojo Allura.

ROJO ALLURA
Categoría de alimentos Nivel Máximo
Confituras, jaleas mermeladas 500mg/kg
Productos para untar a base de fruta 500mg/kg
Fuente: Reglamento Técnico Centroamericano RTCA 67.04.54:10. Anexo de la resolución No. 283-2012
(COMIECO-LXII).
 16

3.5 Etiquetado de alimentos

Por etiquetado se entiende las menciones, indicaciones, marcas de fábrica o comerciales, dibujos
o signos relacionados con el producto que figure en el envase, documento, rótulo, etiqueta, faja o
collarín que acompañen o se refieran a dicho producto alimenticio. Todos los alimentos deben
tener un nombre, que por sí solo los definan perfectamente. El etiquetado no debe inducir a error
al consumidor sobre las características del producto, sobre su naturaleza, cantidad, composición,
duración o identidad. (Grupo Latino Editores, 2008)

3.5.1 Información obligatoria del etiquetado

Como norma general requiere las siguientes indicaciones:

 Cantidad de ingredientes.
 Cantidad neta.
 Condiciones de conservación y utilización.
 Denominación de venta.
 Fecha de caducidad.
 Identificación de la empresa.
 Lista de ingredientes.
 Lote.
 Lugar de origen o procedencia.
 Otras indicaciones obligatorias adicionales para diversas categorías o tipos de productos
alimenticios. Si se trata de un producto alimenticio envasado, estas indicaciones deben
figurar en el envase o en una etiqueta unida al mismo. (Grupo Latino Editores, 2008)

Uno de los objetivos principales que se persigue con la legislación alimentaria, es asegurar que
los consumidores disponen de una información completa sobre los productos que adquieren.
Esta información es importante desde el punto de vista sanitario y económico. Una
información completa y veraz, permite comparar los productos y elegir los más competitivos.
La lista de ingredientes es útil para evitar el consumo de alimentos que contienen
componentes a los que un individuo puede ser alérgico. Asimismo, la indicación de los
 17

colorantes que el alimento contiene contribuye a evitar riesgos sanitarios innecesarios en

individuos alérgicos. (Potter & Hotchkiss, s,f)

Según el Reglamento Técnico Centroamericano -Etiquetado General de los alimentos

previamente envasados- RTCA 67.01.07:10. Dentro de la lista de ingredientes se deberán
indicar los coadyuvantes de elaboración, así como también es un requisito obligatorio
adicional el etiquetado cuantitativo de los ingredientes, colocando el porcentaje de los
mismos.

3.6 Efectos toxicológicos de los colorantes

Los adulterantes son sustancias químicas o biológicas que se agregan a los alimentos con la
intención de reducir intencionalmente el costo de fabricación e inflar artificialmente la calidad de
los alimentos que causan enfermedades a los consumidores. (Rovina, Siddiquee, & Shaarani, 2016)

Algunos colorantes alimentarios sintéticos pueden ser tóxicos para organismos acuáticos y así
mismo tienen efectos cancerígenos en humanos, particularmente cuando son consumidos en
exceso. Se han llevado a cabo estudios sobre diferentes colorantes, uno de ellos el Rojo Allura, el
cual evidenció causar dolor de cabeza en adultos mientras que en niños se produce distracción e
hiperactividad. La Opinión Científica del Panel de la EFSA (Autoridad Europea de Seguridad
Alimentaria) ha concluido que Rojo Allura puede causar reacciones alérgicas como urticaria y
asma, especialmente cuando se mezcla con otro color sintético en productos alimenticios. (Rovina,
Siddiquee, & Shaarani, 2016)

Un estudio llevado a cabo en Inglaterra determinó el efecto de 6 colorantes (Amarillo anaranjado

E-110, amarillo de quinoleína E-104, Carmoisina E-122, Rojo allura AC E-129, Tartrazina E-102 y
rojo cochinilla E -124) y el benzoato de sodio en bebidas refrescantes en grupos de niños de 3, 8 y
9 años de edad. Encontrándose un aumento en el Trastorno por déficit de atención (TPDA) y la
hiperactividad. (Colores Alimentarios en la salud , 2012)
 18

“La mayoría de colorantes utilizados son de origen sintético, estos son más baratos, colorean de
manera más intensa y son más estables que sus contrapartes naturales. Sin embargo, hay
controversia porque se ha encontrado una asociación entre estos colores artificiales y las
reacciones intolerantes en niños.” (Lindsay, 1997)

El amarillo anaranjado S que aparece en mermeladas, galletas y productos de pastelería, refrescos

de naranja, sopas instantáneas, etc. Se considera cancerígeno y frecuente alérgeno. (Sánchez,
2013)

3.7 Métodos de extracción de colorantes

3.7.1 Fibras naturales

Existen dos grupos de fibras, las artificiales que son producidas mediante síntesis química
como el poliéster, entre otros y las naturales, que pueden ser de origen vegetal o animal.

3.7.2 Fibras animales

Las fibras de origen animal son muy variadas. Están compuestas por una serie de
moléculas proteínicas, que son ordenaciones atómicas en estructuras alargadas, que se
encuentran unidas unas a otras, éstas cadenas a su vez se encuentran enlazadas entre sí
de forma paralela por eslabones laterales. Estos últimos puntos de enlaces son más
débiles que las propias uniones de las cadenas, además son químicamente activos, por lo
que cualquier cambio en el medio químico donde se encuentre la fibra, afectará la
condición de estos puentes de enlace hasta adaptarse al nuevo medio, es decir,
equilibrarse. Es posible encontrar tres tipos de puentes laterales, los salinos, los
hidrogenados y los sulforados. Los puentes salinos ocurren entre dos cadenas individuales,
al coincidir áreas cargadas de radicales ácidos o básicos, son fácilmente debilitados por el
agua. Por su parte los puentes de hidrógeno son los que se rompen en presencia de
soluciones salinas o metálicas, dichas soluciones vienen a ser los denominados
mordientes. Los puentes sulforados son los más fuertes, aunque es posible romperlos no
 19

conviene hacerlo, ya que la fibra se torna quebradiza e inservible. (Teñido de fibras

naturales con pigmentos, 2009)

3.7.3 Lana

3.7.3.1 Propiedades químicas de la lana

 Efecto de los álcalis: la proteína de la lana, que recibe el nombre de queratina, es

particularmente susceptible al daño de álcalis. Por ejemplo, soluciones de hidróxido de
sodio al 5%, a temperatura ambiente, disuelven la fibra de lana.

 Efecto de los ácidos: la lana es resistente a la acción de los ácidos suaves o diluidos, pero
en cambio los ácidos minerales concentrados, como por ejemplo, el sulfúrico y el nítrico
provocan desdoblamiento y descomposición de la fibra. Sin embargo, soluciones diluidas
de ácido sulfúrico son usados durante el proceso industrial de la lana, para carbonizar la
materia vegetal adherida a las fibras.

 Efecto de los solventes orgánicos: la mayoría de los solventes orgánicos usados

comúnmente para limpiar y quitar manchas de los tejidos de lana, son seguros, en el
sentido que no dañan las fibras de lana.

3.7.3.2 Teñido de la lana

Se selecciona el producto del que se desea obtener el color para teñir la lana, el cual se
hierve en agua y se agrega la lana mojada enmadejada, después de un período de cocción,
se agrega una sustancia que fije el color como sal, vinagre, piedra lumbre o sulfato de
cobre. (Franco, s.f.)

“Una de las aplicaciones primarias de los colorantes es en el teñido de la lana, mediante el

desarrollo de interacciones iónicas entre los colorantes y las proteínas de la lana. A pH
bajo las proteínas adquieren una carga neta positiva que formar interacciones iónicas con
los colorantes ionizados, aunque también se desarrollan puentes de hidrógeno e
 20

interacciones hidrofóbicas, reteniendo el color después del lavado. Este proceso se puede
revertir al calentar la lana teñida en un álcali diluido.” (Ponce, 2012)

3.8 Métodos de Identificación

3.8.1 Cromatografía en capa fina

Para la cromatografía en capa fina (TLC) que actualmente se conoce como cromatografía
en capa delgada (Christian, 2009), la fase estacionaria es una capa de partículas de unos
milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte sólido de aluminio, plástico o vidrio.
Asimismo, la fase estacionaria puede ser papel conocida como cromatografía en papel
(CP), actualmente no muy utilizada por la baja resolución y poca sensibilidad (Skoog, Holler
, & Crouch, 2007).

Después de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente

empieza a producir la separación. La ventaja principal de la TLC es que la muestra y el
patrón se analizan simultáneamente, mientras que, para la cromatografía en columna, las
muestras se deben analizar individual y secuencialmente (Rubinson & Rubinson, 2001).

Después del desarrollo, las manchas individuales de soluto se ven o se hacen visibles
tratándolas con un reactivo que forme un derivado colorido. En general, las manchas se
mueven a cierta fracción de la velocidad con la que se mueve el disolvente y se caracteriza
por su valor de Rf:

Distancia que recorre el soluto

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒 𝑒𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

donde las distancias se miden desde el centro donde se depositó la muestra, en el lado
inferior de la placa. El frente de disolvente será una línea que cruza la placa. La distancia
recorrida por el soluto se mide desde el centro de la mancha del soluto, o a su densidad
máxima si se presenta corrimiento. Debido a pequeñas variaciones en las placas, siempre
se aconseja determinar el valor del Rf en cada juego de placas (Christian, 2009).
 21

3.8.2 Desarrollo del cromatograma

Imagen No.3: Disposición para la cromatografía de capa delgada

Fuente: Biomodel. (s.f.). Cromatografía. Obtenido de Biomodel: http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/TLC-

ascen.opt.svg

En la imagen No. 3 se ve un ejemplo del dispositivo para cromatografía de capa delgada.

Se traza una línea delgada con lápiz que cruce la placa algunos centímetros arriba del
fondo y sobre ella se colocan los puntos de aplicación (las manchas). La mancha debe ser
tan pequeña como sea posible para tener una separación máxima y un mínimo de arrastre
(o prolongación excesiva). Lo mejor es hacerlo gota a gota. La placa se coloca en una
cámara cerrada (a presión) para saturar la atmósfera con el disolvente y evitar que éste se
evapore de la placa al ir subiendo. El desarrollo puede durar 10 minutos a 1 hora, pero no
requiere tiempo de operador. La cantidad de desarrollo dependerá de la complejidad de la
mezcla de solutos que se esté preparando. Si se usa una placa ancha, se pueden depositar
varias muestras y patrones a lo largo del lado inferior para desarrollarlos al mismo tiempo
(Christian, 2009).

Es posible obtener tiempos de desarrollo de 5 minutos usando pequeños portaobjetos

como placas de TLC, y se pueden hacer separaciones preliminares con ellas para
determinar cómodamente las condiciones óptimas de desarrollo. Lo normal es que los
tamaños de muestra vayan de 10 a 100 μg por punto de aplicación. Los puntos de
aplicación de la muestra deben tener 2 a 5 mm de diámetro.

Una de las principales ventajas de esta técnica es que puede lograrse mayor poder de
separación usando la cromatografía bidimensional de capa delgada; para ello se usa una
 22

placa grande y cuadrada, y la muestra se deposita en una de sus esquinas inferiores.

Después del desarrollo con determinado sistema de disolventes, la placa se gira 90° y se
sigue desarrollando con un segundo sistema de disolventes. Entonces, si no se resuelven
dos o más solutos por completo con el primer disolvente, será posible con un segundo.
Con frecuencia es importante hacer un buen control de pH para lograr separaciones
eficientes (Christian, 2009).

3.8.3 Detección de las manchas

Se puede aplicar una diversidad de procedimientos para localizar los componentes de la

muestra después de la separación. Dos de los métodos comunes, que se utilizan con la
mayoría de las mezclas de sustancias orgánicas, consisten en rociar sobre la placa una
solución de ácido sulfúrico o colocar la lámina en una cámara que contiene algunos
cristales de yodo (Skoog, Holler , & Crouch, 2007). Sin embargo, con ello se descartan los
análisis cuantitativos que podrían hacerse raspando la placa y eluyendo los compuestos
para medirlos (Christian, 2009).

Si los compuestos fluorescen (compuestos aromáticos), se pueden detectar iluminando la

placa con una lámpara de luz ultravioleta. Se traza una línea con lápiz, rodeando las
manchas, para tener su identificación permanente. Con frecuencia se usan reactivos que
desarrollen color. Por ejemplo, los aminoácidos y las aminas se detectan rociando la placa
con una solución de ninhidrina, que forma un color azul o púrpura. Después de identificar
las manchas, se pueden raspar y se lavan (eluyen) los solutos, para identificar
cuantitativamente con un micrométodo (Christian, 2009).

3.8.4 Fases estacionarias para cromatografía de capa delgada

“Las fases estacionarias que se usan con más frecuencia son adsorbentes. Las más
populares son el gel de sílice, la alúmina y la celulosa pulverizada. Las partículas de gel de
sílice contienen grupos hidroxilo en su superficie que forman puentes de hidrógeno con
moléculas polares. El agua adsorbida evita que otras moléculas polares lleguen a la
superficie, por lo que el gel se activa por medio de calentamiento para eliminar el agua
 23

adsorbida. También la alúmina contiene grupos hidroxilo o átomos de oxígeno. Se prefiere

la alúmina para separar compuestos débilmente polares, pero el gel de sílice es preferido
para compuestos polares, como aminoácidos y azúcares” (Christian, 2009).

3.8.5 Fases móviles para cromatografía de capa delgada

El poder eluyente de los disolventes incrementa al aumentar su polaridad (por ejemplo, de

hexano a acetona a alcohol a agua). Siempre que sea posible, debe usarse un solo
disolvente, o dos o tres cuando mucho, porque los disolventes mezclados tienden a
cromatografiarse al subir por la capa delgada y causan un cambio continuo en la
composición del disolvente en función de la distancia en la placa. Eso puede causar valores
variables de Rf, dependiendo de hasta donde se permita subir las manchas. Los
disolventes deben ser de gran pureza. La presencia de cantidades pequeñas de agua u
otras impurezas pueden causar cromatogramas irreproducibles (Christian, 2009).

3.9 Espectrometría

La espectrometría es el conjunto de técnicas que utilizan la luz para medir las concentraciones
químicas.

3.9.1 Propiedades de la luz

Es conveniente describir la luz tanto en términos de partículas como de ondas. Las ondas
de luz constan de campos eléctricos y magnéticos que oscilan en planes perpendiculares
entre sí. En la figura No. 2 se muestra una onda polarizada en el plano. En esta figura el
campo eléctrico se encuentra en el plano xy, y el campo magnético en el plano xz. La
longitud de onda, λ, es la distancia entre las crestas de dos ondas. La frecuencia, ν, es el
número de oscilaciones completas de una onda en un segundo (Harris, 2013).
 24

Imagen No. 4: Propiedades de la luz

Fuente: Christian, G. (2009). Química Analítica. México: Mc-Graw-Hill.

En la Imagen No.4 están marcadas las distintas regiones del espectro electromagnético. No
hay cambios bruscos en las características de la radiación electromagnética cuando
pasamos de una región a otra, por ejemplo, al pasar del visible al infrarrojo (IR). La luz
visible, que es la forma de radiación electromagnética que vemos, representa solo una
pequeña fracción del espectro electromagnético (Harris, 2013).

Imagen No.5: Espectro electromagnético

Fuente: Christian, G. (2009). Química Analítica. México: Mc-Graw-Hill.

 25

3.9.2 Absorción de luz

Cuando una molécula absorbe un fotón aumenta la energía de la molécula. Se dice que la
molécula ha pasado a un estado excitado. Si una molécula emite un fotón, disminuye la
energía de la molécula. El estado de mínima energía de una molécula se llama estado
fundamental. La radiación de IR estimula el movimiento vibracional de las moléculas
cuando la absorben, y las radiaciones visible y UV hacen que los electrones pasen a
orbitales de mayor energía. Los rayos X y la radiación UV de longitud de onda corta
rompen enlaces químicos y ionizan a las moléculas (Harris, 2013).

Cuando una muestra absorbe luz, la irradiancia del haz de luz disminuye. La
irradiancia, P, es la energía por segundo y por unidad de área del haz de luz. La luz se hace
pasar por un monocromador (prisma, red de difracción o incluso un filtro) para seleccionar
una longitud de onda. La luz de una sola longitud de onda se llama monocromática, o sea,
de “un color”. La luz monocromática, con una irradiancia P0 incide en una muestra de
longitud b. La irradiancia del haz que emerge por el lado opuesto de la muestra es P. Como
la muestra puede haber absorbido algo de luz, P ≤ P0.

La transmitancia, T se define como la fracción de la luz incidente que pasa a través

de la muestra.

𝑃
𝑇=
P0

Por tanto, T puede valer de 0 a 1. El porcentaje de transmitancia es simplemente 100T y

puede valer desde 0 a 100%. La absorbancia se define como:

𝑃
𝐴 = log ( ) = − log 𝑇
𝑃0

Cuando no se absorbe luz, P = P0 y A = 0. Si se absorbe el 90% de luz, se transmite el 10%, y

P = P0/10. Este cociente vale A = 1. Si solamente se transmite el 1% de luz, A = 2. La
absorbancia es importante porque es directamente proporcional a la concentración, c, de
la especie que absorbe la luz en la muestra (Harris, 2013).
 26

3.10 Ley de Beer

𝐴 = Ԑbc

La absorbancia es adimensional. La concentración de la muestra, c, normalmente viene dada en

unidades de mol/L (M). El camino óptico, b, normalmente se expresa en centímetros. La cantidad
Ԑ (épsilon) se llama absortividad molar (o coeficiente de extinción en libros antiguos y tiene
unidades M-1cm-1, y así el producto Ԑbc es adimensional). La absortividad molar es la característica
de una sustancia que nos dice cuanta luz absorbe a una longitud de onda determinada (Christian,
2009) (Harris, 2013).

La cantidad de radiación monocromática que absorbe una muestra obedece a la ley de Beer-
Bourguer-Lambert, que comúnmente se conoce como ley de Beer. Esta ley, afirma que la
absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente. La fracción
de luz que pasa a través de una muestra (transmitancia) se relaciona logarítmicamente, no
linealmente, con la concentración de la muestra (Harris, 2013).

3.10.1 Casos en los que no se cumple la ley de Beer

En disoluciones concentradas, las moléculas de soluto interaccionan entre sí debido a su

proximidad. Cuando las moléculas de soluto se aproximan entre sí, sus propiedades (entre
las que se encuentra la absortividad molar) cambian. A concentraciones muy altas, los
solutos se convierten prácticamente en disolvente. Las propiedades de una molécula no
son exactamente las mismas en diferentes disolventes. Los solutos de una disolución que
no absorben también pueden interaccionar con las especies absorbentes y alterar la
absortividad. Si la molécula absorbente participa en un equilibrio químico que depende de
la concentración, la absortividad cambia con la concentración (Harris, 2013).

3.10.2 Medida de la absorbancia

La luz procedente de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que

selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Esta luz
“monocromática” atraviesa una muestra de camino óptico b, y mide la irradiancia de la luz
que emerge.
 27

En espectroscopía visible y UV se coloca una muestra liquida normalmente en una celda

llamada cubeta, que tiene paredes lisas de sílice fundida (SiO2). El vidrio es adecuado para
espectroscopía visible, pero no para UV, porque absorbe radiación UV. Las cubetas más
utilizadas tienen una longitud de camino óptico de 1.000 cm (Harris, 2013).

Cuando se registra un espectro de absorbancia, primero se registra el espectro de la línea

base con las disoluciones de referencia (disolvente puro o blanco) en las dos cubetas. Si el
instrumento fuese perfecto, la línea base sería siempre 0. En un mundo imperfecto, la
línea base normalmente presenta pequeñas absorbancias positivas y negativas.

“En análisis espectrofotométrico, normalmente se escoge la longitud de onda de máxima

absorbancia por dos razones: (1) La curva es relativamente aplanada en las proximidades
del máximo, de manera que apenas varía la absorbancia si se desajusta un poco el
monocromador o si varía algo la anchura de la banda escogida. La ley de Beer se cumple
mejor cuando la absorbancia es casi constante a lo largo de la banda de longitudes de
onda escogida. (2) La sensibilidad del análisis es máxima en el máximo de absorbancia (es
decir, se consigue la máxima respuesta para una concentración dada de analito).” (Harris,
2013)

Para evitar errores de lectura es necesario mantener cubiertos todos los recipientes para
que no entre polvo. El polvo dispersa la luz, que aparece como absorbancia en un
espectrofotómetro. Filtrar las disoluciones finales a través de un filtro de puro muy fino
puede ser necesario en trabajos críticos. Manipular las cubetas con un pañuelo fino para
evitar dejar huellas de los dedos en sus caras, y mantenerlas escrupulosamente limpias.
(Katz, 2009)

3.11 Validación Analítica

El objetivo principal de la validación analítica es el de asegurar que un procedimiento analítico

seleccionado dará resultados reproducibles y confiables que sean adecuados para el propósito
previsto. De ahí que sea necesario definir debidamente tanto las condiciones en que el
procedimiento ha de emplearse como el objetivo previsto para el mismo. Por ejemplo, un proceso
de fabricación validado es uno cuyo cumplimiento de lo que propone o representa hacer está
 28

comprobado. La evidencia de validación se obtiene mediante la recolección y evaluación de datos,

preferentemente desde la fase de desarrollo del proceso hasta la fase de producción inclusive.
(CDER, 2016)

Todas las mediciones químicas requieren un punto de referencia. Por lo general, el material de
referencia o "estándar", que son compuestos químicos específicos, se pueden comprar a un
proveedor de productos químicos y, en ocasiones, de un instituto nacional de metrología. Cuando
se utiliza con fines de referencia, una declaración debe acompañar el material que certifica la
identidad, la pureza y su incertidumbre. (AOAC, 2013)

Los métodos instrumentales modernos dependen de la comparación de una señal de la

concentración desconocida de un analito a la de una concentración conocida del mismo analito o
similar. Es por ello que se requiere la disponibilidad de un estándar de referencia. En donde el
procedimiento de calibración más simple requiere la preparación de una serie de soluciones
estándar a partir del material de referencia, por dilución de una solución madre, cubriendo un
rango razonable de respuesta de señal del instrumento.

3.11.1 Características de validación

Aunque no todas las características de validación son aplicables para todos los tipos de
pruebas, las características de validación típicas son:
• Especificidad
• Linealidad
• Exactitud
• Precisión (repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad)
• Rango
• Límite de cuantificación
• Límite de detección (FDA, 2015)
 29

“En el siguiente cuadro se muestran los parámetros de desempeño que FDA, ICH y USP
recomiendan incluir en la validación y/o verificación de diferentes métodos de ensayo
para productos farmacéuticos y afines (cosméticos, productos higiénicos y odontológicos,
dispositivos médicos, etc.), según el propósito del ensayo. La misma metodología puede
ser utilizada para varios propósitos, por lo cual se deberá hacer una validación para cada
caso.” (OGA,2017)

Fuente: OGA. (2007).

“Política de
Selección y
Validación de
Métodos de
ensayo.
Guatemala:
Oficina de
Acreditación
Guatemala.

NOTA:
(-) Significa que este parámetro normalmente no se evalúa.
(+) Significa que este parámetro normalmente se evalúa.
(1) En casos en los que se ha evaluado la reproducibilidad, no es necesaria la precisión intermedia.
(2) La falta de especificidad para un procedimiento analítico puede ser compensada agregándole un
segundo procedimiento analítico.
(3) Puede ser necesario en algunos casos.
(4) Puede no ser necesario en algunos casos.
(5) La falta de especificidad para un ensayo para liberar puede ser compensado por la
determinación de impurezas.
 30

A continuación, se describen los diferentes tipos de ensayo para productos farmacéuticos

y afines que se presentaron en el cuadro anterior.

 Identificación del analito: Aquellas pruebas que se realizan para asegurar la

identidad de un analito en una muestra (Análisis cualitativo). Esto normalmente se
realiza por comparación de una propiedad de la muestra, contra la de un estándar
de referencia, por ejemplo espectros, comportamiento cromatográfico,
reactividad química y pruebas microcristalinas.
 Determinación de impurezas: Pueden ser pruebas cuantitativas o una prueba
cualitativa para determinar si la impureza está presente en la muestra por encima
o por debajo de un valor límite especificado. Cualquiera de los dos pretende
reflejar las características de pureza de la muestra.
 Ensayo de medición: Constituyen procedimientos de ensayo que miden
propiedades del medicamento, por ejemplo la prueba de disolución.
 Ensayos específicos: Constituyen procedimientos químicos o microbiológicos que
cuantifican el (los) analito(s) presente(s) en una muestra determinada; esto
incluye el análisis de materias primas y producto terminado en cuanto a
ingredientes activos, preservantes y otros componentes principales. (OGA, 2007)
 31

Según el Anexo 5 del informe 32, las características que deben tomarse en cuenta para los
diferentes tipos de procedimiento analítico son las siguientes.

Fuente: OMS. (1992). Comité de Expertos de la OMS en especificaciones para las preparaciones
farmacéuticas. Informe 32. Anexo 5. "Validación de los procedimientos analíticos empleados en el examen de
los materiales farmacéuticos".

Clase A: Pruebas destinadas a establecer identidad, ya sea de sustancias farmacéuticas a

granel o de un ingrediente en particular en una forma farmacéutica acabada.
Clase B: Métodos destinados a detectar y cuantificar impurezas en una sustancia
farmacéutica a granel o en una forma farmacéutica acabada.
Clase C: Métodos empleados para determinar cuantitativamente la concentración de una
sustancia farmacéutica a granel o de un ingrediente principal en una forma farmacéutica
acabada.
Clase D: Métodos empleados para evaluar las características de las formas farmacéuticas.

3.11.2 Exactitud
La exactitud del procedimiento empleado consiste en la proximidad de los resultados
obtenidos al valor real. La exactitud puede determinarse aplicando el procedimiento a las
muestras del material a examinarse, cuando han sido preparadas con exactitud
 32

cuantitativa. Siempre que sea posible, esas muestras deben contener todos los
componentes del material, incluyendo el analito. (OMS,1992)
La fracción o porcentaje del analito que se recupera cuando la muestra de prueba se
realiza a través de todo el método es la recuperación. Los mejores materiales de
referencia para determinar la recuperación son materiales de referencia certificados por
analito (CRM) distribuidos por laboratorios metrológicos, pero en la mayoría de los casos
el material certificado por un proveedor comercial debe ser aceptado. (AOAC, 2013)

 Procedimiento
Para evaluar la exactitud se deben preparar muestras en un rango que contenga al menos
cinco concentraciones diferentes del analito, las cuales aproximadamente estén
espaciadas entre 50% (concentración más baja) y 150% (concentración más alta) del rango
de trabajo esperado. Usar por lo menos seis réplicas por concentración. Analizar muestras
de acuerdo al método en cuestión, usando la matriz del producto o la matriz de la muestra
ambiental. (OGA, 2007)

3.11.3 Precisión
La precisión del procedimiento es el grado de concordancia entre los resultados de los
análisis individuales. Se mide por la dispersión de los resultados individuales de la media, y
usualmente se expresa como una desviación patrón o como el coeficiente de variación
(desviación patrón relativa) cuando el procedimiento completo se aplica repetidas veces a
muestras separadas e idénticas, obtenidas del mismo lote de material homogéneo. (OMS,
1992)

La precisión puede considerarse en tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y

reproducibilidad. La precisión debe investigarse con muestras homogéneas y auténticas.
Sin embargo, si no es posible obtener una muestra homogénea, puede investigarse
utilizando muestras preparadas artificialmente o una solución de muestra. La precisión de
un procedimiento analítico generalmente se expresa como la varianza, la desviación
estándar o el coeficiente de variación de una serie de mediciones.
 33

 La repetibilidad expresa la precisión bajo las mismas condiciones de operación

durante un corto intervalo de tiempo. La repetibilidad también se denomina
precisión intraensayo.
 La precisión intermedia expresa las variaciones dentro del laboratorio: diferentes
días, diferentes analistas, diferentes equipos, etc.
 La reproducibilidad expresa la precisión entre los laboratorios (estudios
colaborativos, generalmente aplicados a la estandarización de la metodología).
(FDA, 2010)

 Procedimiento
Hay dos posibles procedimientos a seguir para determinar la precisión intraensayo, o
repetibilidad, trabajando con submuestras de una misma muestra homogénea, bajo las
mismas condiciones de operación a lo largo de un intervalo corto de tiempo:
 Hacer un mínimo de 9 determinaciones que cubran el intervalo especificado para
el análisis, esto es, 3 réplicas a cada una de 3 concentraciones diferentes.
 Hacer un mínimo de 6 determinaciones a una concentración que corresponda con
la de la muestra problema. (OGA, 2007)

3.11.4 Linealidad y alcance

La linealidad de un procedimiento analítico es la posibilidad de que éste produzca
resultados que sean directamente proporcionales a la concentración del analito en la
muestra. El alcance del procedimiento es una expresión de los niveles más bajo y más alto
de analito que, según se haya demostrado, pueden ser determinables con precisión,
exactitud, y linealidad aceptable. Estas características son determinadas mediante la
aplicación del procedimiento a una serie de muestras que tienen concentraciones de
analito que cubren el alcance atribuido al procedimiento. (OMS, 1992)

La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad (dentro de un rango dado)

para obtener resultados de prueba que son directamente proporcionales a la
concentración (cantidad) de analito en la muestra. Para el establecimiento de la linealidad,
se recomienda un mínimo de 5 concentraciones. (FDA, 2010)
 34

“Para verificar la linealidad, se debe preparar las soluciones individuales por dilución de
una solución madre común para evitar los errores aleatorios que probablemente se
introducirán al pesar pequeñas (mg) cantidades para estándares individuales. Siempre que
la pureza del material de referencia sea del 95%. A menudo se recomienda un alto
coeficiente de correlación (p. Ej.,> 0,99).” (AOAC, 2013)

 Procedimiento
Preparar soluciones patrón de por lo menos cinco diferentes concentraciones del analito,
que estén distribuidas regularmente y que cubran del 50% (concentración más baja) al
150% (concentración más alta) del intervalo de trabajo esperado. Los rangos del 75% al
125% no son atípicos de la industria farmacéutica. Usar por lo menos seis réplicas por
concentración. Las soluciones patrón deberían prepararse en la misma matriz utilizada con
las muestras, si es posible. Analizar las soluciones patrón conforme el método en cuestión.
(OGA, 2007)

3.11.5 Robustez
La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para no verse
afectado por pequeñas, pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y
proporciona una indicación de su fiabilidad durante el uso normal. (FDA, 2010)

 Procedimiento
La determinación de la capacidad del método para no verse afectado por variaciones
pequeñas pero deliberadas en las condiciones de trabajo, se logra al considerar aquellas
condiciones que, durante el desarrollo del método, se vió que pueden afectar los
resultados. El procedimiento es específico para cada caso; por ejemplo, para un método
de análisis por cromatografía líquida de alta resolución, se evalúa el efecto de pequeñas
variaciones en el tiempo de extracción del analito, durante la preparación de las muestras,
y en el pH y la composición de la fase móvil, así como la columna y las condiciones de
temperatura y flujo, durante el trabajo cromatográfico; también se evalúa el centrifugar
las muestras en vez de filtrarlas, el usar diferentes tipos de filtros y la estabilidad de las
soluciones patrón y de muestra. (OGA, 2007)
 35

4. JUSTIFICACIÓN

Las mermeladas son un producto alimenticio que se consume frecuentemente en la

ciudad de Guatemala, debido a que estas ya están listas para consumir, y la facilidad con la que se
pueden adquirir en el supermercado, las hacen un producto de alta demanda. En la actualidad por
parte de las entidades regulatorias, existe poco control sobre los productos alimenticios que
contienen colorantes artificiales en su composición, las mermeladas entre uno de ellos; mismos de
los cuales se ha evidenciado que pueden producir alteraciones en la salud de las personas, hasta el
punto de adquirir enfermedades de tipo cancerígenas.

Según el Reglamento Técnico Centroamericano de Alimentos y Bebidas Procesadas. Aditivos

Alimentarios (RTCA) 67.04.54:10, en mermeladas el nivel máximo de colorantes artificiales: Rojo
Allura FD&C rojo No. 40 (16,035) no deberá exceder los 500 mg/Kg y para Amarillo Ocaso FD&C
amarillo No. 6 (15,985) el límite máximo es de 300 mg/Kg.

Entre la población que consumen este tipo de alimentos se encuentran desde niños hasta
personas de la tercera edad; los niños y las personas de la tercera edad constituyen un blanco
importante en la adquisición de mermeladas, ya que muchas veces requieren dietas livianas a base
de productos no sólidos en su alimentación diaria. Dado que las estrategias de marketing
pretenden atraer al consumidor con productos altamente atractivos a la vista, los colorantes
artificiales juegan un papel importante en este ámbito.

En esta investigación se pretendió identificar y cuantificar los colorantes artificiales en

mermeladas de fresa distribuidas en la Ciudad Capital de Guatemala, con el fin de determinar si
dichos colorantes se encuentran dentro de los límites establecidos por el RTCA de Alimentos y
Bebidas Procesadas. Aditivos Alimentarios (RTCA) 67.04.54:10. Así mismo, llevar a cabo la
validación de la metodología, con el fin de que los resultados obtenidos sean reproducibles y que
se garantice que la cuantificación se está llevando a cabo de manera exacta y precisa obteniendo
así resultados verídicos.
 36

5. OBJETIVOS

5.1 General

Evaluar que los colorantes artificiales indicados en la etiqueta de las mermeladas de fresa
en presentación de tarro de vidrio de 290gr, distribuidas en la ciudad de Guatemala,
cumplan con los límites establecidos por el Reglamento Técnico Centroamericano
-Alimentos y bebidas procesadas. Aditivos Alimentarios- RTCA 67.04.54:10.

5.2 Específicos

5.2.1 Validar la metodología de cuantificación evaluando los parámetros de linealidad,

precisión, robustez y exactitud.
5.2.2 Verificar que el proceso de extracción de los colorantes utilizando lana de oveja pueda
recuperar la mayor cantidad de colorante determinando el porcentaje de recobro.
5.2.3 Identificar y cuantificar los colorantes artificiales presentes en las mermeladas de fresa.
5.2.4 Verificar que las etiquetas respectivas para las distintas mermeladas de fresa cumplan
con las especificaciones del Reglamento Técnico Centroamericano -Etiquetado General
de los alimentos previamente envasados- RTCA 67.01.07:10.
 37

6. HIPÓTESIS

Las mermeladas de fresa en presentación de tarro de vidrio de 290g distribuidos en la Ciudad

Capital de Guatemala cumplen con los límites permitidos de colorantes artificiales según el
Reglamento Técnico Centroamericano -Alimentos y bebidas procesadas. Aditivos Alimentarios-
RTCA 67.04.54:10.
 38

7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1 Universo de Trabajo: Mermeladas de fresa.

7.2 Muestra: Mermeladas de fresa en presentación de tarro de vidrio de 290g distribuidas en la

Ciudad Capital de Guatemala.

7.3 Recursos:

7.3.1 Recursos Humanos:

7.3.1.1 Investigadora: Sindy Alejandra Palacios Castillo

7.3.1.2 Asesora: Licda. Julia Amparo García Bolaños

7.3.1.3 Revisora: Licda. Aylin Santizo Juárez

7.3.2 Recursos Materiales:

7.3.2.1 Mermeladas de fresa recolectadas en los diferentes supermercados de la

Ciudad Capital de Guatemala.

7.3.2.2 Instalaciones y equipo de laboratorio del Departamento de Análisis

Aplicado.

7.3.3 Equipo de Laboratorio:

 Balanza Analítica OHAUS Adventurer

 Estufa Eléctrica Cole-Parmer Spin Master Model 4803
 Centrifugadora Zeny 800-1
 Espectrofotómetro UV-VIS Thermo Scientific Genesys 10S
 Potenciómetro BANTE PHS-25CW/3BW
 Equipo general para cromatografía en capa fina
 Campana de Extracción

7.3.4 Materiales de Laboratorio:

 Lana desengrasada
 Balones aforados de 10, 25, 50 y 100 mL
 Beakers de 50mL
 39

 Beakers de 100 mL
 Beakers de 250 mL
 Probeta de 25mL
 Pipetas volumetricas 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 10mL
 Embudo de vidrio
 Kitasato
 Manguera para filtrar al vacío
 Embudo de Büchner
 Microcapilares
 Masking tape
 Papel filtro
 Micropipetas
 Placas cromatográficas
 Varillas de vidrio
 Pizeta
 Pipeteador
 Papel encerado
 Papel limpialentes
 Papel Kraft

7.3.5 Reactivos:

 Ácido acético al 96% GR

 Agua destilada
 Alcohol etílico al 95% GR
 Hidróxido de sodio al 15% GR
 Hidróxido de amonio concentrado GR
 Fase Móvil: n-butanol, etanol, amoníaco, agua.
 40

7.3.6 Estándares de Colorantes

 FD&C Rojo No.40 (Rojo Allura) Lote: 30710
 FD&C Amarillo No.6 (Amarillo Ocaso) Lote: 28734

7.4 Metodología

7.4.1 Procedimiento de recolección de muestras:

Se recolectaron 3 lotes diferentes de 3 marcas de mermeladas distribuidas en la ciudad

capital de Guatemala. Dos muestras de diferente supermercado por lote, para tener un
total de 18 muestras de mermeladas de fresa en presentación de 290g para evaluar.
Identificándolas como marca A, B y C. Lote 1, 2 y 3. Y al tener dos muestras por lote la
nomenclatura de 1-1 y 1-2 indicando muestra 1 y muestra 2 de un mismo lote, por
ejemplo.

7.4.2 Procedimiento de Validación, identificación y cuantificación:

La validación de la metodología se dividió en cuatro etapas, incluyendo así mismo la

respectiva identificación y cuantificación de las muestras.

7.4.2.1 Etapa 1: Curvas de calibración e identificación de longitudes de onda máxima

 Se prepararon soluciones estándar a partir de una solución madre de 0.025% de cada

uno de los colorantes artificiales a analizar, amarillo No.6 y rojo No. 40.

 En cinco balones aforados de 50 mL, se midió de 1 a 5 mL de la solución madre y se

aforó a 50 mL con agua desmineralizada, para cada uno de los colorantes a evaluar.

 Se llevó a cabo un barrido en el UV-VIS para identificar la longitud de onda a la cual

cada colorante artificial poseía mayor absorbancia.

 Se elaboraron 6 curvas de calibración para cada colorante artificial, con los estándares
de cada colorante por separado a cinco concentraciones diferentes. Debido a que en
las muestras de mermeladas hay mezclas de colorantes, en la validación se leyeron las
 41

curvas de calibración a las longitudes de onda máximas de cada colorante a evaluar

para su adecuada cuantificación.

 Para el tratamiento de resultados se calcularon los valores de la ecuación de la recta y

valores de r2. Se analizaron los resultados y se obtuvo el parámetro de linealidad.

7.4.2.2 Etapa 2: Tratamiento de lana y porcentaje de recobro

 Se llevó a cabo el desengrasado de la lana con solución de hidróxido de sodio al 15%,
sumergiéndola en la solución por 1 minuto, posteriormente se lavó con alcohol etílico
al 95% por 30 segundos para eliminar el restante de grasa que pudiera quedar y por
último se lavó con abundante agua desmineralizada, verificando que el pH de la lana
fuera neutro y no básico. Finalmente se dejó secar la lana sobre papel kraft.

 Se prepararon soluciones estándar a partir de seis soluciones madre de 0.025% de

cada uno de los colorantes artificiales a analizar.

 En cinco balones aforados de 50 mL, se midieron de 1 a 5 mL de la solución madre y se

aforó a 50 mL con agua desmineralizada, realizando así las curvas de calibración para
cada colorante.

 Se leyeron las absorbancias de las curvas de calibración en el UV-VIS y se elaboraron

las ecuaciones de la recta, obteniendo valores de r2.

 Se sometieron las soluciones de las diferentes curvas de calibración a extracción del

colorante a través de la lana. Agregando 10mL de cada solución hija coloreada en
beaker de 50mL y agregando un trozo de lana con un peso aproximado de 0.5 – 1.0g,
se adicionó 10 gotas de ácido acético al 96% y se sometió a calentamiento por 20
minutos sin dejar que hirviera.

 Se dejó enfriar la solución para luego sacar la lana y lavarla con agua desmineralizada
fría para fijar los colorantes, hasta que no se percibiera olor a ácido acético.
 42

 Se trasladó la lana a un beaker de 50mL y se agregaron 10 mL de agua desmineralizada

y 15 gotas de hidróxido de amonio concentrado (amoníaco). Se llevó a calentamiento
suavemente por 15 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Por último, se
exprimió la lana perfectamente sobre la solución resultante llevándola a un tubo de
ensayo para colocarlo en la centrifugadora.

 Se centrifugaron las soluciones obtenidas por 10minutos a 1000rpm con el fin de que
los restos de lana quedaran como sedimento.

 Posteriormente las soluciones resultantes se filtraron al vacío a través de un filtro de

papel colocado en un embudo de Büchner; obteniendo la solución en un kitasato.

 Por último, se llevó la solución coloreada a un balón aforado de 10mL y se llevó al

aforo realizando pequeños lavados al embudo con agua destilada.

 A través del espectrofotómetro UV-VIS se leyó la absorbancia de la solución y se

realizaron los cálculos correspondientes para obtener el porcentaje de recobro.

7.4.3 Etapa 3: Identificación y Cuantificación de colorantes en Mermeladas

 Se pesó aproximadamente 5 g de muestra de mermelada de fresa en un beaker de
50mL y se agregaron 10mL de agua destilada, se dejó reposar por 15 minutos agitando
eventualmente con una varilla de vidrio. Posteriormente se trasvasó a un balón
aforado de 25mL y se aforó con agua destilada.

 Los 25mL se filtraron a través de papel filtro y un embudo, obteniendo la solución en

un beaker de 50mL. Se agregó un trozo de lana desengrasada de 0.5g-1.0g y se
adicionaron 20 gotas de ácido acético 96%. Se calentó por 20minutos sin que hirviera y
se dejó enfriar a temperatura ambiente.

 Se sacó la lana y se lavó con agua desmineralizada fría para fijar los colorantes, hasta
que no se percibiera olor a ácido acético.
 43

 Se trasladó la lana a un beaker de 50mL y se agregaron 10 mL de agua desmineralizada

y 20 gotas de hidróxido de amonio concentrado (amoníaco). Se llevó a calentamiento
suavemente por 15 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Por último, se
exprimió la lana perfectamente sobre la solución resultante llevándola a un tubo de
ensayo para colocarlo en la centrifugadora.

 Se centrifugaron las soluciones obtenidas por 10minutos a 1000rpm con el fin de que
los restos de lana quedaran como sedimento.

 Posteriormente las soluciones resultantes se filtraron al vacío a través de un filtro de

papel colocado en un embudo de Büchner y obteniendo la solución en un kitasato.

 Por último, se llevó la solución coloreada a un balón de 10mL y se aforó realizando

pequeños lavados al embudo con agua destilada. Esta solución es “la solución
coloreada final” la cual sirvió para llevar a cabo la identificación, la cuantificación y
más adelante la que sirvió para verificar cambios en longitud de onda y pH.

7.4.3.1 Identificación:
 Con tubos microcapilares se agregaron 10 microlitros de “la solución coloreada final”
obtenida de la muestra en la placa cromatográfica a una distancia de por lo menos 10
mm entre cada mancha, junto con los estándares de los 2 colorantes declarados en la
etiqueta, se dejaron secar las manchas y se procedió a la identificación de las
muestras.

 Se colocó la mezcla de solventes para la fase móvil; n-butanol, etanol, hidróxido de

amonio, agua desmineralizada (25:13:5:7) dentro de la cámara cromatográfica y se
esperó 1 hora para alcanzar una saturación adecuada dentro de la misma.

 Posteriormente se sumergió la placa cromatográfica y se dejó correr la fase móvil

hasta que alcanzara el frente del solvente aproximadamente 1.5 cm antes de llegar al
final de la placa.
 44

 Se sacó la placa para secarse dentro de la campana de extracción, identificando con un

lápiz las manchas obtenidas para medir y calcular los valores de Rf. Se compararon los
valores Rf y color en los cromatogramas de las muestras y estándares, interpretando
así los resultados.

7.4.3.2 Análisis cuantitativo:

 Se prepararon soluciones estándar a partir de una solución madre de 0.025% de cada

uno de los colorantes artificiales a analizar, amarillo No.6 y rojo No. 40 (declarados en
la etiqueta).

 En cinco balones aforados de 50 mL, se midió de 1 a 5 mL de la solución madre y se

aforó a 50 mL con agua desmineralizada, construyendo así una curva de calibración
para cada colorante.

 Debido a la mezcla de colorantes en las muestras, se leyeron las absorbancias de las

curvas de calibración a las longitudes de onda máximas de ambos colorantes.

 Posteriormente se realizó la lectura de absorbancia de “la solución coloreada final”

aforada en el balón de 10mL de la muestra de mermelada, llevándose a cabo el mismo
procedimiento para cada una de las muestras de mermeladas. Tomando siempre en
cuenta que las lecturas debían realizarse a las longitudes de onda máxima de ambos
colorantes.

 Se llevaron a cabo los cálculos correspondientes para observar la precisión y el

cumplimiento de las mermeladas con los límites de colorantes establecidos.

7.4.4 Etapa 4: Cambios en longitud de onda y pH

 A “la solución coloreada final” obtenida en el procedimiento de identificación y
cuantificación para cada muestra de mermelada, se le tomaron lecturas de
absorbancias a 3nm por encima y 3nm por debajo de la longitud de onda máxima
establecida para cada colorante. Obteniendo resultados para verificar el parámetro de
robustez.
 45

 Así mismo se llevó a cabo nuevamente todo el procedimiento para identificación y

cuantificación de los colorantes en cada muestra de mermelada, pero con el fin de
variar el pH y observar su comportamiento. Por lo que a la “solución coloreada final”
obtenida se le varió el pH adicionando 1 gota de hidróxido de amonio para elevar 0.2
el valor normal y se elaboró una mezcla de 2.5mL de agua y 1mL de ácido acético para
bajar 0.2 el valor normal de pH para cada muestra.

 Se realizaron lecturas de la absorbancia a los diferentes pH para observar el

comportamiento de las muestras. Verificando así mismo el parámetro de robustez.
 46

8. RESULTADOS

Con el objetivo de identificar la longitud de onda en la que presentan el máximo de absorción los
colorantes a evaluar se realizó un barrido espectrofotométrico en el UV-Visible Thermo Scientific
Genesys 10S con diluciones de cada uno de los estándares de los colorantes.

Cuadro No. 5: Longitud de onda en la que presentaron mayor absorbancia cada estándar de
colorante artificial.
Colorante Longitud de onda máxima absorbancia
FD&C Amarillo No.6 (Amarillo Ocaso) 485nm
FD&C Rojo No.40 (Rojo Allura) 496nm
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

8.1 Linealidad

Se llevaron a cabo 6 soluciones madre para cada colorante, de las cuales se obtuvieron curvas de
calibración para observar la linealidad esperando un coeficiente de determinación cercano a 1 y
no menor a 0.9996.

Cuadro No.6: Regresión lineal y coeficientes de determinación de curvas de calibración de

colorantes.

Ecuación de la curva Coeficiente de Ecuación de la curva Coeficiente de

Colorante Curva a 485nm determinación r² a 496nm determinación r²
1 y = 21195x + 0.0174 0.9999 y = 20115x + 0.0184 0.9999
2 y = 21219x + 0.013 0.9998 y = 20179x + 0.0124 0.9998
3 y = 21174x + 0.0023 0.9999 y = 20071x + 0.0012 0.9999
Amarillo 6
4 y = 21296x - 0.0016 0.9998 y = 20197x - 0.0015 0.9998
5 y = 21394x - 0.0013 0.9999 y = 20286x - 0.0015 0.9999
6 y = 21443x + 0.0077 0.9999 y = 20367x + 0.0083 0.9999
1 y = 18416x - 0.0009 0.9999 y = 20697x + 0.0026 0.9999
2 y = 18348x + 0.0003 0.9999 y = 20611x + 0.0044 0.9999
3 y = 18177x + 0.0027 0.9999 y = 20421x + 0.0067 0.9999
Rojo 40
4 y = 18703x + 0.0008 0.9999 y = 20977x + 0.007 0.9999
5 y = 18679x + 0.0019 0.9998 y = 20961x + 0.0085 0.9998
6 y = 18517x + 0.0035 0.9998 y = 20752x + 0.0103 0.9998
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 47

8.2 Precisión

Se analizaron los diferentes lotes de muestras de mermeladas, 3 lotes por cada marca y se llevó a
cabo un total de 3 repeticiones para cada lote. Calculando así el promedio, desviación estándar y
coeficiente de variación. Debido a que se analizan dos colorantes se observan los cuadros de
resultados para la precisión de cada colorante a su respectiva longitud de onda.

Cuadro No.7: Precisión para el colorante Rojo No.40 a 496nm en mermeladas de fresa marca A.

Lote 1 Lote 2 Lote 3

Marca Peso g Absorbancia Peso g Absorbancia Peso g Absorbancia
5.0100 0.327 5.0054 0.302 5.0327 0.320
A 5.0858 0.317 5.0465 0.311 5.0412 0.309
5.0001 0.332 5.0648 0.322 5.0108 0.317
Promedio 5.0319 0.325 5.0389 0.311 5.0282 0.315
Desviación estándar 6.24E-03 8.18E-03 4.64E-03
Coeficiente variación
(%) 1.92 2.62 1.47
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.8: Precisión para el colorante Rojo No.40 a 496nm en mermeladas de fresa marca B.

Lote 1 Lote 2 Lote 3

Marca Peso g Absorbancia Peso g Absorbancia Peso g Absorbancia
5.0184 0.515 5.037 0.431 5.0874 0.467
B 5.0134 0.487 5.0055 0.448 5.0929 0.481
5.0404 0.499 5.0451 0.434 5.0504 0.478
Promedio 5.0240 0.500 5.0292 0.437 5.0769 0.475
Desviación estándar 1.15E-02 7.41E-03 6.02E-03
Coeficiente variación
(%) 2.29 1.69 1.27
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.9: Precisión para el colorante Amarillo No.6 a 485nm en mermeladas de fresa marca
B.

Lote 1 Lote 2 Lote 3

Marca Peso g Absorbancia Peso g Absorbancia Peso g Absorbancia
5.0184 0.526 5.0055 0.454 5.0874 0.480
B 5.0134 0.503 5.0451 0.435 5.0929 0.486
5.0404 0.502 5.037 0.440 5.0504 0.494
Promedio 5.0240 0.5103 5.0292 0.443 5.0769 0.487
Desviación estándar 1.11E-02 8.04E-03 5.73E-03
Coeficiente variación
(%) 2.17 1.82 1.18
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 48

En cuanto al colorante Amarillo No.6 se puede observar que únicamente se muestra la precisión
para mermeladas de fresa marca B ya que es la única marca que presenta una mezcla de
colorantes, tanto Rojo No.40 como amarillo No.6.

8.3 Robustez

Para verificar la robustez del método en cuanto a la variabilidad de la longitud de onda se leyó la
absorbancia de las muestras a la longitud de onda máxima reportada, siendo 485nm para amarillo
No.6 y 496nm para rojo No. 40 y se leyó la absorbancia obtenida hasta 3nm por debajo y hasta
3nm por encima de la longitud de onda máxima. Llevando a cabo el mismo procedimiento por
triplicado. De manera que la letra A o B indica la marca, la numeración 1, 2 ó 3 indica el lote
habiendo dos muestras para cada lote.

Cuadro No.10: Absorbancia a diferente longitud de onda para Amarillo No.6 y Rojo No.40 en
mermeladas de fresa marca (A) y marca (B). Repetición 1.¹

abs abs abs absorbancia a abs abs abs

Muestra Peso g 482nm 483nm 484nm 485nm 486nm 487nm 488nm
B1-1 5.0425 0.454 0.453 0.452 0.452 0.451 0.45 0.449
B1-2 5.0184 0.558 0.558 0.557 0.556 0.555 0.554 0.553
B2-1 5.037 0.443 0.442 0.441 0.440 0.440 0.439 0.438
B2-2 5.0055 0.457 0.456 0.455 0.454 0.453 0.452 0.451
B3-1 5.0238 0.452 0.451 0.450 0.450 0.449 0.449 0.448
B3-2 5.0331 0.463 0.463 0.462 0.462 0.461 0.460 0.460
abs abs abs absorbancia a abs abs abs
Muestra Peso g 493 nm 494nm 495nm 496nm 497nm 498nm 499nm
A1-1 5.0083 0.368 0.367 0.366 0.366 0.365 0.364 0.363
A1-2 5.1147 0.306 0.305 0.304 0.304 0.303 0.302 0.300
A2-1 5.0054 0.304 0.304 0.303 0.302 0.301 0.300 0.299
A2-2 5.1287 0.403 0.402 0.401 0.400 0.400 0.399 0.398
A3-1 5.0412 0.312 0.311 0.310 0.309 0.308 0.307 0.305
A3-2 5.0108 0.319 0.318 0.317 0.317 0.316 0.315 0.314
B1-1 5.0425 0.445 0.444 0.443 0.443 0.441 0.440 0.440
B1-2 5.0184 0.549 0.548 0.547 0.545 0.544 0.542 0.540
B2-1 5.037 0.434 0.433 0.432 0.431 0.430 0.429 0.427
B2-2 5.0055 0.450 0.450 0.449 0.448 0.447 0.446 0.445
B3-1 5.0238 0.444 0.442 0.441 0.441 0.439 0.438 0.436
B3-2 5.0331 0.456 0.456 0.455 0.455 0.453 0.452 0.451
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

¹El procedimiento desde el pesado hasta la cuantificación se llevó a cabo por triplicado en cada muestra de
mermelada de fresa. Es por ello que se observa repetición 1,2 ó 3.
 49

Cuadro No.11: Absorbancia a diferente longitud de onda para Amarillo No.6 y Rojo No.40 en
mermeladas de fresa marca (A) y (B). Repetición 2.¹

abs abs abs absorbancia a abs abs abs

Muestra Peso g 482nm 483nm 484nm 485nm 486nm 487nm 488nm
B1-1 5.0608 0.400 0.399 0.398 0.398 0.398 0.397 0.397
B1-2 5.0089 0.424 0.424 0.425 0.425 0.426 0.426 0.426
B2-1 5.0094 0.378 0.379 0.380 0.380 0.380 0.380 0.380
B2-2 5.0008 0.472 0.472 0.471 0.471 0.471 0.469 0.469
B3-1 5.0173 0.425 0.425 0.425 0.424 0.424 0.423 0.422
B3-2 5.0874 0.480 0.480 0.480 0.480 0.480 0.480 0.479
abs abs abs absorbancia a abs abs abs
Muestra Peso g 493 nm 494nm 495nm 496nm 497nm 498nm 499nm
A1-1 5.0100 0.331 0.329 0.329 0.327 0.326 0.325 0.324
A1-2 5.0858 0.319 0.318 0.317 0.317 0.316 0.315 0.313
A2-1 5.0909 0.391 0.389 0.386 0.384 0.382 0.380 0.380
A2-2 5.0783 0.352 0.352 0.351 0.350 0.349 0.349 0.347
A3-1 5.0503 0.362 0.360 0.359 0.358 0.356 0.355 0.353
A3-2 5.0327 0.322 0.321 0.321 0.320 0.319 0.318 0.317
B1-1 5.0608 0.394 0.393 0.392 0.391 0.390 0.389 0.388
B1-2 5.0089 0.426 0.426 0.425 0.425 0.424 0.423 0.423
B2-1 5.0094 0.379 0.378 0.378 0.377 0.376 0.376 0.375
B2-2 5.0008 0.465 0.463 0.462 0.460 0.459 0.458 0.457
B3-1 5.0173 0.419 0.418 0.417 0.416 0.414 0.414 0.412
B3-2 5.0874 0.470 0.469 0.468 0.467 0.465 0.464 0.463
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.12: Absorbancia a diferente longitud de onda para Amarillo No.6 y Rojo No.40 en
mermeladas de fresa marca (A) y (B). Repetición 3.¹

abs abs abs absorbancia a abs abs abs

Muestra Peso g 482nm 483nm 484nm 485nm 486nm 487nm 488nm
B1-1 5.0134 0.507 0.505 0.504 0.503 0.502 0.501 0.499
B1-2 5.0404 0.500 0.501 0.502 0.502 0.503 0.503 0.503
B2-1 5.0451 0.434 0.435 0.435 0.435 0.435 0.435 0.435
B2-2 5.0218 0.493 0.494 0.495 0.495 0.496 0.496 0.496
B3-1 5.0929 0.486 0.486 0.487 0.486 0.486 0.486 0.486
B3-2 5.0504 0.495 0.495 0.495 0.494 0.494 0.493 0.493
abs abs abs absorbancia a abs abs abs
Muestra Peso g 493 nm 494nm 495nm 496nm 497nm 498nm 499nm
A1-1 5.0001 0.334 0.333 0.333 0.332 0.331 0.33 0.329
A1-2 5.0663 0.340 0.339 0.337 0.336 0.335 0.334 0.332
A2-1 5.0465 0.315 0.314 0.313 0.311 0.31 0.309 0.307
A2-2 5.0648 0.326 0.324 0.323 0.322 0.321 0.320 0.319
A3-1 5.022 0.398 0.396 0.394 0.393 0.391 0.390 0.388
A3-2 5.032 0.355 0.353 0.352 0.351 0.350 0.350 0.348
B1-1 5.0134 0.492 0.491 0.489 0.487 0.486 0.484 0.482
B1-2 5.0404 0.502 0.501 0.5 0.499 0.498 0.496 0.495
B2-1 5.0451 0.435 0.435 0.435 0.434 0.434 0.434 0.433
B2-2 5.0218 0.495 0.495 0.494 0.493 0.492 0.491 0.490
B3-1 5.0929 0.483 0.482 0.481 0.481 0.480 0.478 0.477
B3-2 5.0504 0.481 0.480 0.479 0.478 0.477 0.476 0.475
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
¹El procedimiento desde el pesado hasta la cuantificación se llevó a cabo por triplicado en cada muestra de
mermelada de fresa. Es por ello que se observa repetición 1,2 ó 3.
 50

Así también, para observar que tan robusto es el método en cuanto al pH, se midió el pH de la
muestra original y se midió también su respectiva absorbancia. Posteriormente se modificó el pH
0.2 por encima y por debajo del valor normal y se volvió a medir la absorbancia para observar los
cambios que presentaba.

Cuadro No.13: Absorbancias de muestras de mermeladas a diferente valor de pH. Repetición 1.¹

absorbancia a absorbancia a absorbancia a

Muestra pH -0.2 496nm pH normal 496nm pH +0.2 496nm
A1-1 9.25 0.198 9.45 0.183 9.65 0.183
A1-2 9.41 0.226 9.6 0.217 10.01 0.219
A2-1 9.32 0.165 9.51 0.154 9.75 0.156
A2-2 9.4 0.245 9.63 0.239 9.86 0.241
A3-1 9.31 0.207 9.56 0.199 9.78 0.203
A3-2 9.25 0.226 9.48 0.222 9.62 0.222
B1-1 9.51 0.270 9.76 0.265 9.91 0.267
B1-2 9.6 0.369 9.89 0.364 10.03 0.365
B2-1 9.45 0.333 9.67 0.328 9.81 0.327
B2-2 9.63 0.314 9.8 0.309 10.02 0.306
B3-1 9.49 0.285 9.71 0.279 9.97 0.282
B3-2 9.29 0.311 9.52 0.305 9.71 0.307
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.14: Absorbancias de muestras de mermeladas a diferente valor de pH. Repetición 2.¹

absorbancia a absorbancia a absorbancia

Muestra pH -0.2 496nm pH normal 496nm pH +0.2 a 496nm
A1-1 9.17 0.207 9.35 0.196 9.55 0.198
A1-2 9.32 0.239 9.5 0.230 9.73 0.233
A2-1 9.24 0.168 9.46 0.157 9.68 0.159
A2-2 9.41 0.247 9.6 0.239 9.81 0.241
A3-1 9.22 0.221 9.4 0.213 9.65 0.213
A3-2 9.18 0.231 9.33 0.225 9.57 0.229
B1-1 9.00 0.276 9.26 0.269 9.43 0.273
B1-2 9.25 0.359 9.42 0.353 9.68 0.353
B2-1 9.15 0.314 9.34 0.309 9.56 0.311
B2-2 9.36 0.296 9.51 0.289 9.76 0.288
B3-1 9.21 0.299 9.43 0.291 9.62 0.292
B3-2 9.55 0.309 9.7 0.302 9.97 0.303
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

¹El procedimiento desde el pesado hasta la cuantificación se llevó a cabo por triplicado en cada muestra de
mermelada de fresa. Es por ello que se observa repetición 1,2 ó 3.
 51

Cuadro No.15: Absorbancias de muestras de mermeladas a diferente valor de pH. Repetición 3.¹

absorbancia a absorbancia absorbancia a

Muestra pH -0.2 496nm pH normal a 496nm pH +0.2 496nm
A1-1 9.4 0.201 9.61 0.190 9.82 0.193
A1-2 9.23 0.214 9.45 0.210 9.67 0.208
A2-1 9.15 0.157 9.34 0.149 9.5 0.151
A2-2 9.54 0.239 9.7 0.234 9.98 0.236
A3-1 9.25 0.206 9.43 0.198 9.66 0.201
A3-2 9.35 0.218 9.56 0.213 9.78 0.213
B1-1 9.52 0.280 9.72 0.274 9.99 0.276
B1-2 9.16 0.356 9.33 0.349 9.56 0.351
B2-1 9.26 0.312 9.44 0.307 9.61 0.307
B2-2 9.34 0.308 9.51 0.303 9.74 0.305
B3-1 9.25 0.309 9.48 0.305 9.65 0.304
B3-2 9.2 0.299 9.45 0.293 9.69 0.296
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

¹El procedimiento desde el pesado hasta la cuantificación se llevó a cabo por triplicado en cada muestra de
mermelada de fresa. Es por ello que se observa repetición 1,2 ó 3.
 52

8.2 Exactitud

Se llevaron a cabo 6 soluciones madre a partir de los estándares para cada colorante, de las cuales
se elaboraron 6 curvas de calibración con 5 concentraciones diferentes. Luego de obtener los
valores de absorbancias de las curvas se puso a prueba cada curva de calibración extrayendo el
colorante a través de lana de oveja y volviendo a leer su absorbancia con el fin de observar el
porcentaje de recuperación.

Cuadro No.16: Porcentajes de recuperación para el colorante Amarillo No.6 a 485nm y 496nm

Concentración Absorbancia a 485nm % recuperación Absorbancia a 496nm % recuperación

1.11062E-07 0.255 106% 0.241 105%
2.22124E-07 0.502 105% 0.474 104%
3.33186E-07 0.661 93% 0.645 95%
4.44248E-07 0.876 92% 0.825 91%
5.5531E-07 1.085 91% 1.03 91%
1.11504E-07 0.251 97% 0.246 104%
2.23009E-07 0.506 102% 0.477 102%
3.34513E-07 0.668 91% 0.632 91%
4.46018E-07 1.022 105% 1.008 109%
5.57522E-07 1.139 94% 1.083 94%
1.11504E-07 0.237 95% 0.232 98%
2.23009E-07 0.456 93% 0.444 95%
3.34513E-07 0.71 97% 0.673 97%
4.46018E-07 0.934 96% 0.937 102%
5.57522E-07 1.189 98% 1.161 101%
1.11947E-07 0.254 104% 0.251 108%
2.23894E-07 0.526 109% 0.499 108%
3.35841E-07 0.695 96% 0.658 95%
4.47788E-07 0.948 98% 0.898 98%
5.59735E-07 1.135 94% 1.123 98%
1.11947E-07 0.248 103% 0.241 105%
2.23894E-07 0.451 93% 0.440 96%
3.35841E-07 0.669 92% 0.635 92%
4.47788E-07 0.896 93% 0.891 97%
5.59735E-07 1.171 97% 1.124 98%
1.11504E-07 0.267 105% 0.259 106%
2.23009E-07 0.508 103% 0.482 103%
3.34513E-07 0.712 97% 0.672 96%
4.46018E-07 0.886 91% 0.848 92%
5.57522E-07 1.149 95% 1.057 92%
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 53

Cuadro No. 17: Porcentajes de recuperación para el colorante Rojo No.40 a 485nm y 496nm

Concentración Absorbancia a 485nm % recuperación Absorbancia a 496nm % recuperación

1.00403E-07 0.208 104% 0.232 101%
2.00806E-07 0.372 95% 0.414 94%
3.0121E-07 0.586 101% 0.629 96%
4.01613E-07 0.772 100% 0.831 96%
5.02016E-07 0.923 96% 0.995 93%
1.0121E-07 0.214 107% 0.243 106%
2.02419E-07 0.377 97% 0.438 99%
3.03629E-07 0.628 109% 0.700 108%
4.04839E-07 0.799 104% 0.865 101%
5.06048E-07 0.937 98% 1.024 96%
1.01613E-07 0.201 106% 0.231 107%
2.03226E-07 0.403 108% 0.461 109%
3.04839E-07 0.549 98% 0.614 98%
4.06452E-07 0.689 93% 0.766 92%
5.08065E-07 0.996 107% 1.057 102%
1.02016E-07 0.209 105% 0.247 109%
2.04032E-07 0.424 108% 0.478 108%
3.06048E-07 0.619 106% 0.674 102%
4.08065E-07 0.803 103% 0.870 100%
5.10081E-07 0.957 99% 1.023 94%
1.00806E-07 0.218 109% 0.236 102%
2.01613E-07 0.384 98% 0.410 92%
3.02419E-07 0.537 92% 0.601 91%
4.03226E-07 0.727 94% 0.791 91%
5.04032E-07 0.919 95% 1.04 96%
1.02016E-07 0.159 94% 0.193 96%
2.04032E-07 0.382 105% 0.417 101%
3.06048E-07 0.500 91% 0.567 91%
4.08065E-07 0.684 92% 0.768 91%
5.10081E-07 0.886 95% 0.963 91%
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 54

Cuadro No.18: Promedios de porcentajes de recuperación

Promedios Amarillo No.6

Concentración % recuperación a 485nm % recuperación a 496nm

1 101.68% 104.35%
2 100.86% 101.44%
3 94.27% 94.44%
4 95.88% 98.10%
5 94.86% 95.62%
Promedio 97.51% 98.79%
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Promedios Rojo No.40

Concentración % recuperación a 485nm % recuperación a 496nm

1 104.14% 103.51%
2 101.90% 100.51%
3 99.53% 97.69%
4 97.83% 95.05%
5 98.45% 95.19%
Promedio 100.37% 98.39%
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 55

8.5 Identificación y Cuantificación de colorantes en mermeladas de fresa

Para la identificación de los colorantes se tomaron en cuenta las manchas reportadas en la

cromatografía, así como también los valores de Rf comparándolos con los valores de los
estándares de colorantes Amarillo No. 6 y Rojo No. 40. Determinando de esta manera un resultado
“Positivo” para indicar su presencia en la mermelada de fresa y “negativo” indicando que la
mermelada carece del colorante indicado. Los cálculos de los valores de Rf se pueden observar en
anexos en el cuadro No.33.

Cuadro No. 19: Identificación de colorantes artificiales (Amarillo No. 6 y Rojo No. 40) en
mermeladas de fresa.

Colorante artificial a identificar / Resultado

Lote/
Marca Muestra Amarillo No.6 Rojo No.40
1-1 Negativo Positivo
1-2 Negativo Positivo
2-1 Negativo Positivo
A
2-2 Negativo Positivo
3-1 Negativo Positivo
3-2 Negativo Positivo
1-1 Positivo Positivo
1-2 Positivo Positivo
2-1 Positivo Positivo
B
2-2 Positivo Positivo
3-1 Positivo Positivo
3-2 Positivo Positivo
1-1 Negativo Negativo
1-2 Negativo Negativo
2-1 Negativo Negativo
C
2-2 Negativo Negativo
3-1 Negativo Negativo
3-2 Negativo Negativo
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Posteriormente se cuantificaron los colorantes que dieron “Positivo” en la identificación,

utilizando únicamente las dos marcas que reportaron colorante, es por ello que en los cuadros no
aparece la marca C. En los cuadros No. 20 al No.22 se puede observar lo que se obtuvo de
absorbancia para cada muestra y a su vez lo que corresponde a su cuantificación en mg/kg. Siendo
 56

los límites de colorante permitido 300mg/kg para Amarillo Ocaso (Amarillo No.6) y 500mg/kg para
Rojo Allura (Rojo No. 40). De manera que la letra A o B indica la marca, la numeración 1, 2 ó 3
indica el lote habiendo dos muestras para cada lote.

Cuadro No.20: Cuantificación de colorantes (Amarillo No.6 y Rojo No. 40) en mermeladas de
fresa. Repetición 1.¹

absorbancia a absorbancia a
Muestra Peso g 485nm 496nm Cuantificación mg/kg
A1-1 5.0083 0.366 17.389
A1-2 5.1147 0.304 14.122
A2-1 5.0054 0.302 14.335
A2-2 5.1287 0.400 18.570
A3-1 5.0412 0.309 14.566
A3-2 5.0108 0.317 15.037
B1-1 5.0425 0.452 0.443 20.009
B1-2 5.0184 0.526 0.515 23.363
B2-1 5.037 0.440 0.431 19.484
B2-2 5.0055 0.454 0.448 20.441
B3-1 5.0238 0.450 0.441 19.992
B3-2 5.0331 0.462 0.455 20.630
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.21: Cuantificación de colorantes (Amarillo No.6 y Rojo No. 40) en mermeladas de
fresa. Repetición 2.¹

absorbancia a absorbancia a
Muestra Peso g 485nm 496nm Cuantificación mg/kg
A1-1 5.0100 0.327 15.518
A1-2 5.0858 0.317 14.815
A2-1 5.0909 0.384 17.954
A2-2 5.0783 0.350 16.394
A3-1 5.0503 0.358 16.865
A3-2 5.0327 0.320 15.114
B1-1 5.0608 0.398 0.391 17.613
B1-2 5.0089 0.425 0.425 19.482
B2-1 5.0094 0.380 0.377 17.225
B2-2 5.0008 0.471 0.460 20.920
B3-1 5.0173 0.424 0.416 18.892
B3-2 5.0874 0.480 0.467 20.844
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

¹El procedimiento desde el pesado hasta la cuantificación se llevó a cabo por triplicado en cada muestra de
mermelada de fresa. Es por ello que se observa repetición 1,2 ó 3.
 57

Cuadro No.22: Cuantificación de colorantes (Amarillo No.6 y Rojo No. 40) en mermeladas de
fresa. Repetición 3.¹

absorbancia a absorbancia a
Muestra Peso g 485nm 496nm Cuantificación mg/kg
A1-1 5.0001 0.332 15.788
A1-2 5.0663 0.336 15.771
A2-1 5.0465 0.311 14.646
A2-2 5.0648 0.322 15.113
A3-1 5.022 0.393 18.630
A3-2 5.032 0.351 16.593
B1-1 5.0134 0.503 0.487 22.013
B1-2 5.0404 0.502 0.499 22.677
B2-1 5.0451 0.435 0.434 19.734
B2-2 5.0218 0.495 0.493 22.505
B3-1 5.0929 0.486 0.481 21.596
B3-2 5.0504 0.494 0.478 21.442
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.23: Promedios de cuantificación.

Promedios
Cumple/No cumple
Muestra Cuantificación mg/kg Límite 500mg/kg. ²
A1-1 16.232 Cumple
A1-2 14.903 Cumple
A2-1 15.645 Cumple
A2-2 16.692 Cumple
A3-1 16.687 Cumple
A3-2 15.581 Cumple
B1-1 19.878 Cumple
B1-2 21.841 Cumple
B2-1 18.814 Cumple
B2-2 21.288 Cumple
B3-1 20.160 Cumple
B3-2 20.972 Cumple
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

¹El procedimiento desde el pesado hasta la cuantificación se llevó a cabo por triplicado en cada muestra de
mermelada de fresa. Es por ello que se observa repetición 1,2 ó 3.
²Se colocó el límite del colorante rojo el cual corresponde a 500mg/kg debido a que todas las muestras lo
presentan, sin embargo, todas las muestras cumplen también con el límite del colorante amarillo el cual
corresponde a 300mg/kg.
 58

Finalmente se analizaron las etiquetas de cada marca de mermelada de fresa y se comparó con las
especificaciones del Reglamento Técnico Centroamericano -Etiquetado General de los alimentos
previamente envasados- RTCA 67.01.07:10. Determinando así el cumplimiento con el reglamento.

Cuadro No. 24: Etiquetado Obligatorio de los alimentos preenvasados Cumple/No cumple.

Marcas
A B C
Nombre del alimento Cumple Cumple Cumple
Lista de ingredientes Cumple Cumple Cumple
Contenido neto Cumple Cumple Cumple
Registro Sanitario Cumple Cumple Cumple
Nombre y dirección Cumple Cumple Cumple
País de origen Cumple Cumple Cumple
Lote Cumple Cumple Cumple
Fecha de vencimiento Cumple Cumple Cumple
Instrucciones para el uso Cumple Cumple Cumple
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 59

9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Con el fin de determinar las longitudes de onda a las que se iba a trabajar cada colorante, se
verificó la longitud de onda máxima del estándar de rojo No.40 o conocido también como Rojo
Allura y del amarillo No.6 o Amarillo Ocaso. Longitudes que se pueden observar en el cuadro No.5
de los resultados, siendo la longitud de onda máxima del amarillo 485nm y la del rojo 496nm.

La validación del método se inició con el parámetro de linealidad. En el cuadro No.6 se puede
observar las ecuaciones de la curva tanto a 485nm como a 496nm para ambos colorantes, así
como también se puede observar que los coeficientes de determinación se encuentran por encima
de 0.9998, siendo el valor mínimo aceptable de 0.9996, indicando de esta manera que el método
es lineal y por lo tanto se pueden obtener resultados directamente proporcionales a la
concentración del analito en una muestra. Todas las curvas realizadas para ambos colorantes se
pueden observar en las gráficas No.1 a la No.4 en Anexos.

El parámetro de precisión se evaluó con las muestras de mermeladas, para ello se analizaron los
tres lotes de cada marca y se tomaron en cuenta los resultados de las tres repeticiones realizadas.
Como se puede observar en el cuadro No.7, se muestra la marca, el lote, los pesos de las muestras
de mermeladas junto a las absorbancias obtenidas, los promedios, la desviación estándar y el
coeficiente de variación. En este caso el cuadro muestra los resultados para el colorante rojo
No.40 en la marca A. En donde se observa que la desviación estándar obtenida en general fue
pequeña y el coeficiente de variación oscila entre 1.47% - 2.62% siendo un porcentaje aceptable
ya que se encuentra debajo del límite establecido para alimentos según el Codex Alimentarius, al
mencionar que para concentraciones entre 0.1 g/kg – 1 g/kg el porcentaje de variación aceptado
oscila entre 6-8% (FAO/WHO Food Standars Programme, 2013). En el cuadro No.8 se observa la
precisión para el colorante rojo No.40 en la marca B, en donde se observa un comportamiento
similar, no superando un 2.29% de coeficiente de variación. Finalmente, el cuadro No.9 muestra
los resultados de precisión para el colorante amarillo No.6 en la marca B, teniendo un
comportamiento igual ya que presentó coeficientes de variación entre 1.18%-2.17%. Estos
resultados indican que a pesar de que la matriz de la muestra presenta diferentes componentes, el
método logra cuantificar de manera precisa los colorantes que están en estudio, dando así
resultados que siguen un patrón que se mantiene y que concuerdan entre sí.
 60

En cuanto al parámetro de robustez, éste se evaluó tomando en cuenta dos puntos importantes;
la longitud de onda y el pH. En los cuadros No. 10 al No. 12 se observa que se varió la longitud de
onda a la que se leía la muestra, se puede observar la absorbancia de cada muestra a 3nm por
debajo de la longitud máxima elegida y 3nm por encima. Todas las muestras se comportaron de la
misma manera y se observó una mínima variación en la absorbancia que va desde un 0.001 a
0.005 como máximo para el colorante amarillo No.6 y una variación desde un 0.001 a 0.007 como
máximo para el colorante rojo No.40. Por lo tanto, es un cambio que no interfiere en gran medida
con la cuantificación y le da una robustez aceptable al método.

El parámetro de robustez también se evaluó al modificar el pH de “la solución coloreada final”

obtenida para cada muestra de mermelada. En los cuadros No.13 al No.15 se observan dichos
resultados. Al centro del cuadro se indica el pH normal de la muestra y la absorbancia obtenida, se
registra también la absorbancia obtenida al disminuir 0.2 el pH inicial y la absorbancia obtenida al
incrementar 0.2 el pH inicial. En general se observó que hubo un mayor cambio en la absorbancia
al disminuir el pH que al incrementarlo. Es importante destacar que el pH se disminuyó con la
ayuda de ácido acético y se elevó con la ayuda de hidróxido de amonio. Se utilizaron estos
reactivos ya que son los reactivos que intervienen en el proceso de extracción del colorante con la
lana, por lo que no se incorporó un reactivo que no se haya tomado en cuenta inicialmente. En
cuanto a los resultados obtenidos, se puede observar que hubo una variabilidad mayor en las
absorbancias al disminuir el pH, obteniendo un promedio aproximado de 0.007 que se
incrementaba al valor normal de absorbancia de la muestra, mientras que al elevar el pH no se
observa mayor cambio siendo el promedio de 0.002 el valor que se incrementaba al valor normal
de absorbancia. Los cambios no son drásticos, pero para tener resultados más precisos es
importante que la metodología se maneje siempre al pH básico en el que se encuentra la muestra
al terminar su tratamiento y no adicionar ningún otro reactivo que pueda interferir con el pH.

Para el parámetro de exactitud se llevaron a cabo 6 soluciones madre a partir de los estándares de
cada uno de los colorantes a evaluar y se realizaron 6 curvas de calibración con 5 concentraciones
diferentes. Cada curva se leyó en el UV-VIS para obtener su absorbancia a las longitudes de onda
máxima. La base de datos completa se puede observar en Anexos en los cuadros No.27 y No.28.
Posteriormente, las mismas soluciones se pusieron a prueba junto a la lana de oveja desengrasada
para que ésta absorbiera el colorante con la ayuda del ácido acético y luego se extrajera con la
 61

ayuda de hidróxido de amonio para observar el porcentaje de recuperación del método. En el

cuadro No.16 y No.17 en los resultados se pueden observar las absorbancias obtenidas tras dicho
tratamiento, junto a su porcentaje de recuperación. Los valores oscilan entre un rango de 90%-
110% para ambos colorantes. En el cuadro No.18 se observan los promedios reportados para cada
colorante a diferente longitud de onda máxima. Para el amarillo No.6 se obtuvo un 97.51% a
485nm y 98.79% a 496nm. El colorante rojo No.40 obtuvo porcentajes un poco más altos; siendo
un 100.37% a 485nm y 98.39% a 496nm. Sin embargo, ambos colorantes tuvieron promedios
cercanos a un 100% siendo estos aceptables.

Durante el proceso de validación se observó que las absorbancias de las dos concentraciones más
bajas de la curva de calibración obtenían porcentajes de recobro bastante altos, llegando hasta un
150%, mientras que en las siguientes tres concentraciones más altas de la curva se observaban
porcentajes altos pero aceptables. Por lo que después de realizar varias modificaciones en el
método, se logró bajar esos porcentajes, al incorporar la etapa de centrifugación y filtrado a la
solución final obtenida de la extracción del colorante. Lo que estaba sucediendo era que las
muestras presentaban restos de lana en solución y esto provocaba que la absorbancia variara en
gran cantidad y las concentraciones más afectadas eran las más diluidas. Por lo tanto, se agregó la
operación de centrifugación por 10minutos a 1000rpm, lo que permitió que los restos de lana
quedaran como sedimento y la solución estuviera libre de partículas. Posteriormente, la solución
se filtró al vacío para disminuir la pérdida de colorante a través del papel filtro y así mismo tener
una solución más cristalina, la cual finalmente dio mejores resultados al someterse a la lectura de
la absorbancia y es por ello que se pudieron obtener muy buenos promedios de porcentajes de
recuperación.

Para determinar qué fase móvil utilizar para la identificación de los colorantes en las mermeladas,
se llevaron a cabo varias pruebas utilizado diferentes reactivos o en distintas proporciones con el
fin de determinar la fase móvil que separaba de mejor manera a los estándares de los colorantes y
las muestras; las pruebas que se realizaron inicialmente sobre papel filtro y luego sobre la sílica
gel, se pueden observar en la figura No.5 en Anexos. Determinando finalmente que la mejor fase
móvil estaba conformada por: n-butanol, etanol, hidróxido de amonio y agua desmineralizada; en
proporciones de 25mL, 13mL, 5mL y 7mL respectivamente. Sin embargo, debido a que las
moléculas de los colorantes son similares, estos fueron arrastrados a puntos cercanos en la fase
 62

estacionaria (sílica gel). Por lo tanto, dieron valores de Rf similares, como se puede observar en el
cuadro No.33 en Anexos, el Rf del estándar del colorante amarillo No.6 fue de 0.53 y el Rf del
estándar del colorante rojo No.40 fue de 0.55. Las muestras correspondientes de la marca A
reportaron valores de Rf de 0.55 y 0.56 verificando de esta manera la presencia del colorante Rojo
Allura tal y como lo menciona su respectiva etiqueta. Las muestras correspondientes de la marca B
reportaron valores de Rf de 0.52 y 0.53, lo cual indica la presencia del colorante amarillo No.6. Sin
embargo, al comparar las manchas entre marcas se observó que las manchas de las muestras de B
son más fuertes aparentando una doble banda, como se puede apreciar en la Imagen No. 6 en
Anexos, pero para cálculos del Rf se tomó como una sola banda. Es muy probable que esto se deba
a que en la etiqueta mencionan la presencia del colorante amarillo No.6 y del colorante rojo
No.40, pero por la cercanía de los valores de Rf las bandas no se lograron separar adecuadamente.
Por lo tanto, la cuantificación se llevó a cabo tomando en cuenta la presencia de ambos
colorantes. En cuanto a la marca C, ésta presentó valores de Rf de 0 ya que no se observó ninguna
mancha, concluyendo que esta marca no presenta colorantes artificiales tal y como lo indica su
etiqueta. En el cuadro No.19 en los resultados se puede observar con mayor claridad el resultado
positivo o negativo para cada muestra de mermelada.

Posteriormente, procediendo a la cuantificación de los colorantes en las mermeladas, el

procedimiento que se realizó fue igual al previamente validado, utilizando en este caso
aproximadamente 5g de muestra de mermelada, llevándola a un volumen definido en un balón
aforado, filtrándola y procediendo a la extracción del colorante a través de la lana de oveja tal y
como se indica en la metodología. Los resultados de cuantificación se pueden observar en los
cuadros No. 20 al No. 22, en donde se observa tanto la absorbancia obtenida como el equivalente
a mg/kg de esa absorbancia tras realizar los cálculos correspondientes aplicando la Ley de
Lambert-beer para mezcla de colorantes. Las muestras de la marca A contienen únicamente Rojo
Allura o rojo No.40, por lo tanto, es el único colorante que se observa cuantificado. Las muestras
de la marca B presentan ambos colorantes por lo tanto se observa la absorbancia obtenida a las
dos longitudes de onda máxima con las que se estaba trabajando y el equivalente a mg/kg incluye
la cuantificación de ambos colorantes. Finalmente se observa en el cuadro No.23 los promedios de
la cuantificación y el resultado de su cumplimiento. Se indica en el cuadro el límite de 500mg/kg,
el cual corresponde al límite para el colorante rojo No.40, ya que el límite para el colorante
 63

amarillo No.6 es de 300mg/kg en mermeladas pero el colorante rojo No.40 es el que ambas
marcas presentaron. Sin embargo, el promedio más alto reportado de colorante fue para la marca
B, lote 1, muestra 2; siendo el valor de 21.841 mg/kg, valor que se encuentra bastante alejado de
los límites establecidos. Por lo tanto, todas las muestras de mermelada de fresa cumplieron con el
límite establecido según el Reglamento Técnico Centroamericano -Alimentos y bebidas
procesadas. Aditivos Alimentarios- RTCA 67.04.54:10.

Asimismo, se llevó a cabo el análisis de la etiqueta de cada marca, con el motivo de verificar su
cumplimiento con lo determinando en el Reglamento Técnico Centroamericano -Etiquetado
General de los alimentos previamente envasados- RTCA 67.01.07:10. Como se observa en el
cuadro No.24 de los resultados, todas las marcas cumplieron con dicho reglamento al indicar en su
etiqueta los datos obligatorios, como lo son la lista de ingredientes, contenido neto, registro
sanitario, nombre y dirección, país de origen, lote, fecha de vencimiento y las instrucciones para el
uso.
 64

10. CONCLUSIONES

1. La metodología utilizada para la cuantificación de los colorantes demostró ser lineal al

tener coeficientes de correlación de 0.9998 y 0.9999.
2. La precisión del método es aceptable al mantener desviaciones estándar pequeñas y
valores de coeficientes de variación menores a un 3%, siendo el valor teórico aceptable
entre 6-8% según lo establecido por el Codex Alimentarius.
3. Las soluciones finales de las muestras listas para cuantificar se deben trabajar al pH básico
en el que se encuentran ya que se observó que al modificar el pH hay una pequeña
variabilidad en la absorbancia que podría modificar a los resultados obtenidos.
4. El método es robusto en cuanto al incremento de hasta 3nm y la disminución de hasta
3nm en la longitud de onda máxima establecida para llevar a cabo las lecturas en el
espectrofotómetro UV-VIS.
5. Luego de poner a prueba diferentes fases móviles se concluyó que la mejor para
identificar a los colorantes amarillo No.6 y rojo No.40 en mermeladas de fresa fue la fase
móvil compuesta por n-butanol, etanol, hidróxido de amonio y agua desmineralizada; en
proporciones de 25mL, 13mL, 5mL y 7mL respectivamente.
6. Para obtener porcentajes de recuperación altos se incluyó al método la etapa de
centrifugación por 10minutos a 1000rpm de la solución coloreada y el filtrado al vacío para
obtener soluciones cristalinas y libres de partículas.
7. La marca de mermelada de fresa C no presentó colorantes artificiales, cumpliendo de esta
manera con lo indicado en su etiqueta.
8. Tanto la marca de mermelada de fresa A como la B cumplieron con los límites establecidos
para colorantes amarillo No.6 y rojo No.40 según el Reglamento Técnico Centroamericano
-Alimentos y bebidas procesadas. Aditivos Alimentarios- RTCA 67.04.54:10.
9. Las tres marcas de mermeladas cumplieron con los datos obligatorios de la etiqueta según
lo determinando en el Reglamento Técnico Centroamericano -Etiquetado General de los
alimentos previamente envasados- RTCA 67.01.07:10.
 65

11. RECOMENDACIONES

1. Un material de gran importancia utilizado en la metodología de cuantificación es la lana de

oveja. Por lo tanto, esta debe tratarse adecuadamente; se debe realizar el lavado y el
tratamiento con NaOH al 15%, etanol y agua destilada según se menciona en la
metodología para obtener buenos resultados.

2. Es importante que se tome en cuenta las dos etapas incorporadas a la metodología, tanto
la centrifugación para eliminar restos de lana y el filtrado al vacío para obtener una
solución más cristalina y evitar al mismo tiempo la pérdida del colorante a través del papel
filtro, ya que de esta manera se obtienen resultados más exactos y precisos.

3. Si tras tomar todas las medidas respectivas con el uso de la lana las soluciones finales se
encuentran turbias, se puede llevar a cabo un segundo tratamiento a la lana antes de
utilizarla, de manera que se introduzca por 15 segundos dentro de una solución de ácido
acético al 33% y se exprima bien, luego se introduce por 15 segundos dentro de una
solución de hidróxido de sodio al 33%, se vuelve a exprimir bien y posteriormente se
introduce por 30 segundos en un beaker con agua destilada para eliminar restos de
reactivos, exprimiéndola bien y dejándola secar unos minutos antes de utilizarla. Esto con
el fin de realizarle un pequeño “remojo” a la lana en los reactivos y que ésta pueda sacar
los restos de contaminantes que son los que provocan la turbidez en los resultados finales.

4. Cuando se desea cuantificar una mezcla de colorantes es importante tomar en cuenta las
longitudes de onda máxima de cada colorante en estudio y tomar siempre las
absorbancias emitidas por cada colorante a cada longitud máxima para que la
cuantificación sea exacta y no exista errores en los cálculos.
 66

12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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 68

13. ANEXOS

Cuadro No. 25: Base de Datos para curvas de calibración (Amarillo No.6)

Volumen Molaridad Volumen Molaridad

Solución Solución Absorbancia a Absorbancia Peso dilución Solución dilución Soluciones
madre hija 485nm a 496nm Peso g Molecular 1 litro madre 2 hijas
1 0.252 0.241 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 1.11062E-05
2 0.489 0.466 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 2.22124E-05
Amarillo 6_1 3 0.721 0.686 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 3.33186E-05
0.0251g 4 0.965 0.918 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 4.44248E-05
5 1.191 1.132 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 5.5531E-05

1 0.252 0.240 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 1.11504E-05

2 0.487 0.463 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 2.23009E-05
Amarillo 6_2 3 0.714 0.679 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 3.34513E-05
0.0252g 4 0.965 0.917 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 4.46018E-05
5 1.196 1.138 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 5.57522E-05

1 0.237 0.224 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 1.11504E-05

2 0.479 0.453 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 2.23009E-05
Amarillo 6_3 3 0.706 0.668 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 3.34513E-05
0.0252g 4 0.948 0.897 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 4.46018E-05
5 1.183 1.121 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 5.57522E-05

1 0.239 0.226 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 1.11947E-05

2 0.477 0.453 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 2.23894E-05
Amarillo 6_4 3 0.704 0.668 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 3.35841E-05
0.0253g 4 0.957 0.908 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 4.47788E-05
5 1.191 1.129 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 5.59735E-05

1 0.241 0.228 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 1.11947E-05

2 0.478 0.453 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 2.23894E-05
Amarillo 6_5 3 0.710 0.673 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 3.35841E-05
0.0253g 4 0.959 0.910 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 4.47788E-05
5 1.198 1.135 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 5.59735E-05

1 0.25 0.238 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 1.11504E-05

2 0.485 0.462 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 2.23009E-05
Amarillo 6_6 3 0.721 0.686 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 3.34513E-05
0.0252g 4 0.962 0.915 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 4.46018E-05
5 1.207 1.147 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 5.57522E-05
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 69

Cuadro No. 26: Base de Datos para curvas de calibración (Rojo No. 40)

Volumen Molaridad Volumen Molaridad

Solución Solución Absorbancia Absorbancia Peso dilución Solución dilución Soluciones
madre hija a 485nm a 496nm Peso Molecular 1 litro madre 2 hijas
1 0.185 0.21 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 1.00403E-05
2 0.371 0.421 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 2.00806E-05
Rojo 40_1 3 0.549 0.623 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 3.0121E-05
0.0249g 4 0.738 0.833 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 4.01613E-05
5 0.926 1.043 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 5.02016E-05
1 0.19 0.216 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 1.0121E-05
2 0.37 0.420 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 2.02419E-05
Rojo 40_2 3 0.551 0.625 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 3.03629E-05
0.0251g 4 0.745 0.842 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 4.04839E-05
5 0.931 1.048 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 5.06048E-05
1 0.187 0.212 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 1.01613E-05
2 0.374 0.425 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 2.03226E-05
Rojo 40_3 3 0.557 0.631 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 3.04839E-05
0.0252g 4 0.737 0.832 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 4.06452E-05
5 0.929 1.046 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 5.08065E-05
1 0.194 0.222 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 1.02016E-05
2 0.382 0.436 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 2.04032E-05
Rojo 40_4 3 0.569 0.645 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 3.06048E-05
0.0253 g 4 0.764 0.864 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 4.08065E-05
5 0.957 1.078 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 5.10081E-05
1 0.189 0.218 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 1.00806E-05
2 0.384 0.437 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 2.01613E-05
Rojo 40_5 3 0.564 0.640 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 3.02419E-05
0.025 g 4 0.749 0.848 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 4.03226E-05
5 0.948 1.069 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 5.04032E-05
1 0.195 0.223 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 1.02016E-05
2 0.384 0.438 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 2.04032E-05
Rojo 40_6 3 0.563 0.639 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 3.06048E-05
0.0253 g 4 0.755 0.853 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 4.08065E-05
5 0.954 1.074 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 5.10081E-05
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 70

Gráficas No. 1: Curvas de calibración del colorante Amarillo No.6 a longitud de 485nm

Curva de Calibración 1 A6 a 485nm Curva de Calibración 2 A6 a 485nm

1.5 y = 21195x + 0.0174 1.5 y = 21219x + 0.013
Absorbancia

Absorbancia
1 R² = 0.9999 1 R² = 0.9998

0.5 0.5

0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de Calibración 3 A6 a 485nm Curva de Calibración 4 A6 a 485nm

1.5 1.5
y = 21174x + 0.0023 y = 21296x - 0.0016

Absorbancia
Absorbancia

1 R² = 0.9999 1 R² = 0.9998

0.5 0.5

0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de Calibración 5 A6 a 485nm Curva de Calibración 6 A6 a 485nm

1.5 1.5
y = 21394x - 0.0013 y = 21443x + 0.0077
Absorbancia
Absorbancia

R² = 0.9999 R² = 0.9999
1 1

0.5 0.5

0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración
 71

Gráficas No. 2: Curvas de calibración del colorante Amarillo No.6 a longitud de 496nm

Curva de Calibración 1 A6 a 496nm Curva de Calibración 2 A6 a 496nm

1.2 1.200
1 y = 20115x + 0.0184 1.000 y = 20179x + 0.0124
R² = 0.9999 R² = 0.9998
Absorbancia

Absorbancia
0.8 0.800
0.6 0.600
0.4 0.400
0.2 0.200
0 0.000
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de Calibración 3 A6 a 496nm Curva de Calibración 4 A6 a 496nm

1.2 1.2
y = 20071x + 0.0012 y = 20197x - 0.0015
1 1
R² = 0.9999
Absorbancia

Absorbancia

0.8 R² = 0.9998
0.8
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de Calibración 5 A6 a 496nm Curva de Calibración 6 A6 a 496nm

1.2 1.4
y = 20286x - 0.0015 1.2 y = 20367x + 0.0083
1
R² = 0.9999 R² = 0.9999
1
Absorbancia
Absorbancia

0.8
0.8
0.6
0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración
 72

Gráficas No. 3: Curvas de calibración del colorante Rojo No.40 a longitud de 485nm

Curva de calibración 1 R40 a 485nm Curva de calibración 2 R40 a 485nm

1 1
y = 18416x - 0.0009 y = 18348x + 0.0003
0.8 0.8

Absorbancia
Absorbancia

R² = 0.9999 R² = 0.9999
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de calibración 3 R40 a 485nm Curva de calibración 4 R40 a 485nm

1 1.2
0.8 y = 18177x + 0.0027 1 y = 18703x + 0.0008
Absorbancia

Absorbancia

R² = 0.9999 R² = 0.9999
0.6 0.8
0.6
0.4
0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de calibración 5 R40 a 485nm Curva de calibración 6 R40 a 485nm

1 1.2
0.8 y = 18679x + 0.0019 1 y = 18517x + 0.0035
Absorbancia

R² = 0.9998 R² = 0.9998
Absorbancia

0.6 0.8
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración
 73

Gráficas No. 4: Curvas de calibración del colorante Rojo No.40 a longitud de 496nm

Curva de calibración 1 R40 a 496nm Curva de calibración 2 R40 a 496nm

1.2 1.2
1 1
Absorbancia

Absorbancia
0.8 y = 20697x + 0.0026 y = 20611x + 0.0044
0.8
R² = 0.9999 R² = 0.9999
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de Calibración 3 R40 a 496nm Curva de calibración 4 R40 a 496nm

1.2 1.2
1 y = 20421x + 0.0067 y = 20977x + 0.007
1
R² = 0.9999 R² = 0.9999
Absorbancia

Absorbancia

0.8 0.8
0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de calibración 5 R40 a 496nm Curva de calibración 6 R40 a 496nm

1.2 1.2
y = 20961x + 0.0085
1 1
R² = 0.9998 y = 20752x + 0.0103
Absorbancia

Absorbancia

0.8 0.8 R² = 0.9998

0.6 0.6
0.4 0.4
0.2 0.2
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración
 74

Cuadro No. 27: Base de datos para porcentajes de recuperación (Amarillo No.6)

Volumen Molaridad Molaridad

Solución Solución Absorbancia Absorbancia Peso dilución Solución Volumen Soluciones
madre hija a 485nm a 496nm Peso Molecular 1 litro madre dilución 2 hijas
1 0.244 0.232 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 1.11062E-05
2 0.477 0.454 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 2.22124E-05
Amarillo 6_1 3 0.706 0.671 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 3.33186E-05
0.0251g 4 0.955 0.908 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 4.44248E-05
5 1.187 1.127 0.0251 452 100 1000 0.00055531 50 5.5531E-05
1 0.254 0.236 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 1.11504E-05
2 0.503 0.470 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 2.23009E-05
Amarillo 6_2 3 0.733 0.689 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 3.34513E-05
0.0252g 4 0.972 0.924 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 4.46018E-05
5 1.210 1.150 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 5.57522E-05
1 0.257 0.245 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 1.11504E-05
2 0.486 0.464 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 2.23009E-05
Amarillo 6_3 3 0.718 0.683 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 3.34513E-05
0.0252g 4 0.965 0.917 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 4.46018E-05
5 1.221 1.161 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 5.57522E-05
1 0.252 0.239 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 1.11947E-05
2 0.483 0.46 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 2.23894E-05
Amarillo 6_4 3 0.716 0.682 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 3.35841E-05
0.0253g 4 0.961 0.914 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 4.47788E-05
5 1.218 1.158 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 5.59735E-05
1 0.239 0.228 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 1.11947E-05
2 0.489 0.465 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 2.23894E-05
Amarillo 6_5 3 0.726 0.69 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 3.35841E-05
0.0253g 4 0.961 0.911 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 4.47788E-05
5 1.215 1.154 0.0253 452 100 1000 0.00055973 50 5.59735E-05
1 0.258 0.247 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 1.11504E-05
2 0.494 0.47 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 2.23009E-05
Amarillo 6_6 3 0.725 0.69 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 3.34513E-05
0.0252g 4 0.976 0.928 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 4.46018E-05
5 1.209 1.149 0.0252 452 100 1000 0.00055752 50 5.57522E-05
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 75

Cuadro No. 28: Base de datos para porcentajes de recuperación (Rojo No.40)

Volumen Molaridad Volumen Molaridad

Solución Solución Absorbancia Absorbancia Peso dilución Solución dilución Soluciones
madre hija a 485nm a 496nm Peso Molecular 1 litro madre 2 hijas
1 0.201 0.228 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 1.00403E-05
2 0.391 0.442 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 2.00806E-05
Rojo 40_1 3 0.577 0.65 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 3.0121E-05
0.0249g 4 0.772 0.869 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 4.01613E-05
5 0.956 1.069 0.0249 496 100 1000 0.000502016 50 5.02016E-05
1 0.200 0.228 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 1.0121E-05
2 0.394 0.447 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 2.02419E-05
Rojo 40_2 3 0.574 0.648 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 3.03629E-05
0.0251g 4 0.761 0.856 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 4.04839E-05
5 0.958 1.073 0.0251 496 100 1000 0.000506048 50 5.06048E-05
1 0.188 0.214 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 1.01613E-05
2 0.379 0.429 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 2.03226E-05
Rojo 40_3 3 0.557 0.629 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 3.04839E-05
0.0252g 4 0.735 0.828 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 4.06452E-05
5 0.932 1.045 0.0252 496 100 1000 0.000508065 50 5.08065E-05
1 0.199 0.226 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 1.02016E-05
2 0.395 0.448 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 2.04032E-05
Rojo 40_4 3 0.58 0.655 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 3.06048E-05
0.0253 g 4 0.78 0.878 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 4.08065E-05
5 0.969 1.086 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 5.10081E-05
1 0.203 0.231 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 1.00806E-05
2 0.393 0.446 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 2.01613E-05
Rojo 40_5 3 0.579 0.654 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 3.02419E-05
0.025 g 4 0.771 0.866 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 4.03226E-05
5 0.969 1.085 0.025 496 100 1000 0.000504032 50 5.04032E-05
1 0.171 0.2 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 1.02016E-05
2 0.363 0.417 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 2.04032E-05
Rojo 40_6 3 0.546 0.622 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 3.06048E-05
0.0253 g 4 0.75 0.847 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 4.08065E-05
5 0.934 1.051 0.0253 496 100 1000 0.000510081 50 5.10081E-05
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 76

Graficas No.5: Curvas de calibración que se utilizaron para cuantificar la mezcla de colorantes.

Curva de Calibración amarillo a Curva de Calibración amarillo a

485nm 496nm
1.5 1.5

Absorbancia
Absorbancia

y = 21195x + 0.0174 y = 20115x + 0.0184

1 1 R² = 0.9999
R² = 0.9999
0.5 0.5

0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

Curva de calibración rojo a Curva de calibración rojo a

485nm 496nm
1 1.5
Absorbancia

Absorbancia

y = 18416x - 0.0009 y = 20697x + 0.0026

R² = 0.9999 1
0.5 R² = 0.9999
0.5
0 0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0 0.00002 0.00004 0.00006
Concentración Concentración

485nm 496nm 485nm 496nm

21195.3785 Pendiente 20114.9004 18415.743 Pendiente 20696.5462
0.0174 intercepto 0.0184 -0.0009 intercepto 0.0026

0.99994984 correlación 0.9999443 0.99994926 correlación 0.99997731

 77

13.1 Cálculos para cuantificar mezcla de colorantes:

Debido a que hay una mezcla de colorantes (amarillo y rojo) se debe obtener cuatro ecuaciones de
la recta junto a sus valores de pendientes. Estas deben corresponder a la pendiente del colorante
amarillo a la longitud de onda máxima de dicho colorante, la pendiente del colorante amarillo a la
longitud de onda máxima del colorante rojo. Así como también tener el dato de la pendiente del
colorante rojo a la longitud de onda máxima de dicho colorante y la pendiente del colorante rojo a
la longitud de onda máxima del colorante amarillo.

Ejemplo: En el cuadro se observan las pendientes correspondientes a las curvas de calibración que
se observan en las gráficas No.5. Y están colocadas en el orden para su adecuada cuantificación.

Pendiente de amarillo a longitud máxima de amarillo + Pendiente de rojo a longitud máxima de amarillo = Absorbancia a 485nm
Pendiente de amarillo a longitud máxima de rojo + Pendiente de rojo a longitud máxima de rojo= Absorbancia a 496nm

Ejemplo:
21195.3785x1 + 18415.743x2= Abs (a 485nm)
20114.9004x1 + 20696.5462x2= Abs (a 496nm)

En donde dice Abs (a 485nm) y Abs (a 496nm) se coloca el dato de absorbancia que dio la muestra
leída a 485nm y leída a 496nm. Posteriormente se debe resolver el sistema de ecuaciones, en
donde x1 corresponderá para amarillo y x2 para rojo. Al obtener los valores de numerador y
denominador para cada incógnita ya se puede proseguir a la cuantificación como se observa más
adelante en los cuadros No.29 al No.31.
 78

Cuadro No.29: Base de datos para cuantificación de mezcla de colorantes en mermelada marca B.
Repetición 1.

Volumen
Peso mg Peso de Total
Concentración balón mg
numerador denominador molecular colorantes mermelada colorantes
(moles/L) aforado colorante
(g/mol) totales en Kg mg/Kg
1 L
6.77E+15 3.859E+20 1.75361E-05 452 0.01 0.0792631
B1-1 9.01E+12 2.066E+18 4.36128E-06 496 0.01 0.02163196 0.100895053 0.0050425 20.00893467
1.06E+15 5.146E+19 2.05491E-05 452 0.01 0.09288208
B1-2 2.03E+12 4.132E+17 4.91175E-06 496 0.01 0.02436228 0.117244365 0.0050184 23.36289747
4.41E+14 2.573E+19 1.7135E-05 452 0.01 0.07745022
B2-1 8.62E+12 2.066E+18 4.17128E-06 496 0.01 0.02068956 0.098139777 0.005037 19.48377553
3.24E+15 1.93E+20 1.67933E-05 452 0.01 0.07590584
B2-2 2.75E+12 5.166E+17 5.32475E-06 496 0.01 0.02641075 0.102316599 0.0050055 20.44083487
5.39E+15 3.087E+20 1.74692E-05 452 0.01 0.07896095
B3-1 8.95E+12 2.066E+18 4.32962E-06 496 0.01 0.02147489 0.10043584 0.0050238 19.99200614
2.94E+13 1.694E+18 1.73306E-05 452 0.01 0.07833423
B3-2 3.03E+11 5.904E+16 5.14082E-06 496 0.01 0.02549845 0.103832672 0.0050331 20.62996397
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.

Cuadro No.30: Base de datos para cuantificación de mezcla de colorantes en mermelada marca B.
Repetición 2.

Volumen
Peso mg Peso de Total
Concentración balón mg
numerador denominador molecular colorantes mermelada colorantes
(moles/L) aforado colorante
(g/mol) totales en Kg mg/Kg
2 L
6.51E+14 4.288E+19 1.51915E-05 452 0.01 0.06866557
B1-1 2.84E+12 6.887E+17 4.12748E-06 496 0.01 0.0204723 0.089137868 0.0050608 17.61339467
2.81E+15 1.976E+20 1.42049E-05 452 0.01 0.06420594
B1-2 5.56E+11 8.265E+16 6.72918E-06 496 0.01 0.03337674 0.097582682 0.0050089 19.48185876
4.45E+15 3.293E+20 1.35104E-05 452 0.01 0.06106706
B2-1 1.05E+13 2.066E+18 5.08488E-06 496 0.01 0.025221 0.086288065 0.0050094 17.22522959
2.89E+15 1.544E+20 1.87109E-05 452 0.01 0.08457308
B2-2 8.35E+11 2.066E+17 4.04092E-06 496 0.01 0.02004294 0.104616018 0.0050008 20.91985633
2.1E+15 1.286E+20 1.63304E-05 452 0.01 0.07381326
B3-1 1.82E+11 4.305E+16 4.22855E-06 496 0.01 0.0209736 0.094786854 0.0050173 18.89200449
2.68E+15 1.372E+20 1.95514E-05 452 0.01 0.08837233
B3-2 7.36E+12 2.066E+18 3.56222E-06 496 0.01 0.01766859 0.106040919 0.0050874 20.84383356
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC.
 79

Cuadro No.31: Base de datos para cuantificación de mezcla de colorantes en mermelada marca B.
Repetición 3.

Volumen
Peso mg Peso de Total
Concentración balón mg
numerador denominador molecular colorantes mermelada colorantes
(moles/L) aforado colorante
(g/mol) totales en Kg mg/Kg
3 L
5.44E+15 2.573E+20 2.11297E-05 452 0.01 0.0955064
B1-1 2.06E+12 6.887E+17 2.99458E-06 496 0.01 0.01485313 0.110359531 0.0050134 22.01291156
3.39E+15 1.93E+20 1.7588E-05 452 0.01 0.07949794
B1-2 1.45E+13 2.066E+18 7.01655E-06 496 0.01 0.03480209 0.114300035 0.0050404 22.67677865
4.57E+15 3.087E+20 1.4809E-05 452 0.01 0.06693647
B2-1 3.4E+12 5.166E+17 6.57692E-06 496 0.01 0.0326215 0.099557968 0.0050451 19.7335965
5.27E+15 3.087E+20 1.70842E-05 452 0.01 0.07722063
B2-2 1.49E+13 2.066E+18 7.21632E-06 496 0.01 0.03579294 0.113013569 0.0050218 22.5045937
3.39E+15 1.93E+20 1.7593E-05 452 0.01 0.07952037
B3-1 1.27E+13 2.066E+18 6.14202E-06 496 0.01 0.0304644 0.109984779 0.0050929 21.59570748
8.04E+15 3.859E+20 2.08289E-05 452 0.01 0.09414675
B3-2 2.95E+12 1.033E+18 2.85208E-06 496 0.01 0.01414633 0.108293074 0.0050504 21.44247465
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC

Numerador / denominador = concentración moles/Litro

por peso molecular (452 ó 496) por aforo final (0.01L) por mg (1000)
dividido (1mol*1g) = mg de colorante
dividido dentro del peso de mermelada (0.005kg) = mg/kg colorante
 80

Cuadro No. 32: Datos generales del proceso de validación de identificación y cuantificación de
colorantes en mermeladas.

Característica Datos definidos

Marca -
Lote/No. Muestra -
Fecha Vencimiento -
Peso g 5g
Min reposo 20min
mL agua agregada 25mL
mL muestra para tratar 25mL
peso promedio lana 0.5-1.0g
gotas ácido acético 20
tiempo calentamiento 20min
gotas hidróxido de amonio 20
tiempo de calentamiento 15min
velocidad de centrifuga 1000rpm
tiempo de centrifugación 10min
fase estacionaria Sílica Gel
fase móvil n-butanol etanol/NH4OH/ agua
tiempo de saturación 1 hora
3 repeticiones de 10uL de estándar y
cantidad de estándar y muestra 6 repeticiones de 10uL de muestra
tiempo de elución 1 hora
absorbancia de mx a 485nm -
absorbancia de mx a 496nm -
cuantificación según ecuación -
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC
 81

Cuadro No. 33: Valores de Rf reportados para la identificación de colorantes amarillo No.6 y rojo
No. 40.

Rf Rf estándar Rf estándar
Muestra
muestras amarillo No.6 rojo No.40
A1-1 0.56
A1-2 0.56
A2-1 0.56
A2-2 0.56
A3-1 0.55
A3-2 0.55
B1-1 0.53
B1-2 0.53
B2-1 0.53
B2-2 0.53
B3-1 0.52
B3-2 0.52
C1-1 0
C1-2 0
C2-1 0
C2-2 0
C3-1 0
C3-2 0 0.53 0.55
Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de Análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC

Cálculos para Rf= distancia recorrida por la mancha

distancia recorrida por el solvente

Ejemplo: Rf del estándar de amarillo No. 6

Rf= 4.0cm = 0.53

7.6cm
Imagen No. 6 Cromatoplaca con estándares y muestras

Fuente: Datos experimentales. Laboratorio de análisis Aplicado. Edificio T-12. USAC

 82

13.2 Proceso de validación desde limpieza de lana hasta obtención de resultados finales.

Figura No.1: Proceso de limpieza de lana.

Figura No.2: Proceso de tratamiento con NaOH 15%, alcohol y agua.

La limpieza de la lana se hizo con agua y un

cepillo para quitar los restos de materia
orgánica. Posteriormente se introdujo en la
solución de NaOH al 15% por 1min,
seguido de 30 segundos en alcohol y
finalmente se lavó con agua destilada para
eliminar el resto de reactivos. Se le tomó el
pH para verificar que estuviera neutro.
 83

Figura No.3: Realización de las soluciones madre y curvas de calibración a partir del estándar del
colorante.

Paso 1: Pesar el estándar Paso 2: Llevar a cabo la solución madre y las

de cada colorante. curvas de calibración para cada colorante.

Paso 3: Determinar longitud Paso 4: Leer absorbancias a

de onda máxima para cada las diferentes longitudes de
colorante. onda máxima reportadas.
 84

Figura No.4: Verificación del porcentaje de recobro utilizando lana de oveja.

Paso 1: Agregar un trozo de lana en 10mL Paso 2: Someter a calentamiento adicionando

de solución coloreada con concentración 10 gotas de ácido acético por 20min.
conocida.

Lana coloreada posterior al calentamiento.

Paso 3: Someter a calentamiento con 10mL Solución coloreada y lana sin color luego
de agua por 15min adicionando 15 gotas de del segundo calentamiento.
Hidróxido de amonio.
 85

Paso 4: Someter a centrifugación Paso 5: Filtrar al vacío.

por 10min.

Se obtiene una solución Paso 6: Lectura de la absorbancia

traslúcida. para determinar porcentaje de
recobro.
 86

Figura No.5: Determinación de tipo de fase móvil a utilizar.

Se prepararon diferentes fases móviles con el fin de observar el comportamiento de los

colorantes y muestras en cada una y determinar la mejor fase móvil.
 87

Figura No.6: Proceso de las muestras de mermeladas para su cuantificación.

Paso 1: Identificación y pesado de la muestra. Paso 2: Agregar 10ml de agua, reposar y agitar
continuamente.

Paso 3: Trasvasar a balón de 25ml y aforar. Paso 4: Filtrar solución coloreada obtenida.

Paso 5: Extracción del colorante a través de Paso 6: Centrifugación y filtrado.

lana de oveja.
 88

Paso 7: Aforar en balones de 10ml y Paso 8: Identificación en sílica gel.

proceder a identificación y cuantificación.

Paso 8: Cuantificación en
espectrofotómetro UV-Visible.
 89

13.3 Certificado de Calidad del estándar del colorante Amarillo No.6 y Rojo No. 40.
90
91