Prácticas de Bioquímica II Práctica: Determinación Cuantitativa de Proteínas

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE
PROTEINAS
Objetivos:
Al finalizar este trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de:
- Conocer el principio que rige la espectrofotometría.
- Interpretar el basamento químico de la Ley de Beer-Lambert.
- Conocer el principio que rige la determinación cuantitativa de proteínas por los
métodos de Biuret y Bradford.
- Calcular la concentración de proteínas en muestras biológicas.
Introducción:
Conceptos básicos sobre espectrofotometría
La espectrofotometría es uno de los métodos analíticos de mayor importancia y
utilidad en bioquímica ya que permite medir la cantidad relativa de luz absorbida o
transmitida por la materia (ej. moléculas biológicas en disolución acuosa: proteínas,
aminoácidos, metabolitos, etc.) medida como absorbancia (Abs) o transmitancia (%T),
respectivamente.

La absorbancia es la medida de la cantidad de luz bloqueada o absorbida por

una solución. Las moléculas que absorben luz se llaman cromóforos. El color de las
sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que
incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos, aquellas longitudes de onda no
absorbida. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que
parece ser completamente transparente, absorbe longitudes de ondas que pertenecen al
espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones visibles, ultravioleta e infrarrojas depende de la

estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

La transmitancia es el parámetro inverso de la absorbancia, constituye la

medida porcentual de la cantidad de radiación o luz que pasa a través de la solución.

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De este modo, una solución no coloreada no absorbente, mostrará 100% de

transmitancia en un espectrofotómetro calibrado, y 0,00 de absorbancia (Figura 1).

A= - Log (% T/100)
Luz Luz emergente no
incidente absorbida
T = 100 (Antilog –A)

Figura 1. Relación entre absorbancia y transmitancia.

Para medir la absorbancia y/o transmitancia de un compuesto en solución se

utiliza el espectrofotómetro, instrumento que permite determinar la radiación
absorbida o transmitida por una solución, a una determinada longitud de onda.

Los componentes básicos de cualquier espectrofotómetro son: 1.-Fuente de

luz o radiación la cuál tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que
abarca (usualmente es una lámpara de tungsteno para luz visible, y una de deuterio
para luz ultravioleta); 2. Monocromador que selecciona la longitud de onda deseada
del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra; 3.-Compartimiento para
la muestra y 4.-Fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por
la muestra (Figura 2).

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Figura 2. Componentes de un espectrofotómetro

Los avances tecnológicos de los últimos años han permitido mejorar la

precisión y versatilidad de los espectrofotómetros, por lo tanto hay diversos modelos
disponibles en el mercado, según la utilidad que se le va a dar.

Ley de Beer- Lambert.

La fracción de luz incidente que es absorbida por una solución depende de la

longitud de onda, de la concentración del compuesto absorbente en solución y de su
naturaleza química. La relación matemática entre estas variables fue establecida por
Beer- Lambert y se expresa con la siguiente ecuación:

A = åcl
Donde:
A = Absorbancia o densidad óptica, å = Coeficiente de absortividad molar (constante),
c = Concentración de la muestra y l = Longitud de onda
Si se mantiene constante l, tenemos que A es directamente proporcional a la
concentración de la muestra.

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De este modo, la ley de Beer- Lambert establece que la concentración de un

analito en solución, es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante
absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida.

Cuando se desconoce la concentración de un analito, ésta puede ser

determinada a partir de una curva de calibración que se construye graficando los
valores de absorbancia contra distintas concentraciones de un estándar o patrón. La
interpolación de la absorbancia de la muestra desconocida en la curva de calibración
nos permitirá conocer la concentración del analito.

Cuando el método de determinación del analito cumple la ley de Beer-Lambert,

la curva resulta una función lineal, por lo que se puede calcular la concentración del
analito aplicando la siguiente ecuación:

AA x CE
CA =
AE

Donde:

CA= Concentración del analito

AA= Absorbancia del analito
CE= Concentración del
estándar

Ventajas y aplicaciones de la espectrofotometría

Este método analítico presenta varias ventajas sobre otros métodos de
laboratorio, tales como: rapidez, precisión, versatilidad, fácil aplicación y eficiencia en
costo.
La espectrofotometría tiene diversas aplicaciones, entre las que se pueden
mencionar:

- Análisis cuantitativo de compuestos (orgánicos o inorgánicos)

-Identificación de compuestos según su espectro de absorción

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Determinación cuantitativa de proteínas por espectrofotometría

El contenido de proteínas de una muestra biológica es un parámetro de gran

utilidad tanto para el investigador como para profesionales del área clínica. Este dato
es importante para el bioquímico, ya que puede precisar la eficiencia de un método de
aislamiento proteico o la cantidad de proteínas de fluidos corporales o de una
determinada fracción subcelular. Para el Veterinario, Médico o el Bioanalista, la
concentración sérica o urinaria de proteínas puede reflejar la presencia de algún estado
patológico o simplemente verificar la condición fisiológica del animal.
Para determinar la cantidad de proteínas en muestras biológicas existe una
diversidad de métodos. Unos se basan en principios físicos como la refractometría,
otros en determinar la composición de nitrógeno total de la muestra y luego calcular la
cantidad de proteínas como el método de Kjeldhal. Sin embargo, estos métodos como
herramientas de trabajo en el laboratorio de Bioquímica son poco precisos. El
surgimiento del espectrofotómetro abrió camino a un gran número de pruebas,
basadas en la ley de Lambert y Beer, entre ellas la determinación cuantitativa de
proteínas. Alguno de los métodos para cuantificarlas son: Biuret, Lowry y Bradford.
Todos los métodos colorimétricos poseen distintas sensibilidades y rangos de
detección por lo que la escogencia del mismo dependerá de la naturaleza de la muestra
a ser analizada.

Método de Biuret
Este método recibe su nombre debido a que el color que se produce en esta reacción,
es similar al de la condensación de dos moléculas de urea, conocido en alemán como:
Biuret. Se fundamenta en la formación de un compuesto azul violeta por la reacción
del ión cúpicro con la proteína en medio alcalino. Este ión forma un enlace covalente
coordinado (Figura 1). Una condición indispensable para la positividad de la reacción
es que el compuesto analizado posea al menos dos enlaces peptídicos en su estructura.
En el caso de los aminoácidos y dipéptidos la reacción es negativa. Si se observa la
reacción se verá claramente porqué hacen falta dos enlaces:

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C O O C C O

N H H N NH
Cu ++
CH R R CH CH R
2 OH - Cu ++
C O O C C O

N H H N N H

Enlaces Peptídicos Enlace covalente coordinado

Figura 1. Reacción de Biuret
El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, por lo tanto es posible la
cuantificación de las proteínas presentes en una muestra desconocida, mediante la
comparación de la absorbancia de la muestra con la de los estándares de concentración
conocida. Este método detecta proteinas en un rango de 0,5 a 10 mg/mL, lo que es
suficiente para medir la cantidad de proteínas en algunos fluidos biológicos como el
suero y el plasma, ambos con concentraciones mayores de 6 g%.

Método de Bradford
Éste se basa en la capacidad que presenta el azul brillante de Coomasie G-250 de
unirse a las cargas positivas de la estructura proteica. El colorante presenta dos
estructuras, la roja predominante en solución (Absmax= 465 nm) y la azul, cuando se
encuentra asociado a las proteinas (Absmax= 595 nm).
OC 2 H 5

NH

CH 3 CH 3

C 2H5
N N H 5C2
CH 2 CH 2

-
OS 3
S3O -

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Figura 2. Estructura del azul de coomasie G250

Debido a que la respuesta del método es la misma para una gran cantidad de proteínas,
la cuantificación se puede llevar a cabo usando cualquier estándar disponible. La
interferencia de otros compuestos distintos a las proteínas es mínima. La sensibilidad
del método esta en el rango de 0,2 a 20 µg/mL. Es decir 1000 veces más sensible que
el método de Biuret.

MATERIALES Y REACTIVOS
- Reactivo de Biuret: 1,5 g de CuSO4 : 5 H2O y 6 g de tartrato de sodio y
potasio se disuelven en 500 mL de agua. Añadir 300 mL de NaOH al 10% y
aforar a 1L.
- Reactivo de Bradfrod: 100 mg de azul brillante de Coomasie G 250 se
disuelven en 50 mL de etanol al 95%. Añadir 100 mL de H3PO4 al 85%
(concentrado) y aforar a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de papel filtro
Whatman N° 1. Para probar el reactivo medir la absorbancia contra un blanco
de agua destilada a 595 nm, el valor debe estar entre 0,4 y 0,6 UA.
- Standard de proteína 2 g%
- Espectrofotómetro
- Cubetas para espectrofotometría
- Azul brillante de Coomasie G-250
- NaCl 0,9%
- Pipetas volumétricas de 1, 2 y 5 mL.
- 12 tubos de ensayo.

PARTE EXPERIMENTAL:
Experimento Nº 1 Determinación de proteínas por el método de Biuret
Procedimiento:
- Preparar una dilución 1:10 de plasma bovino en un tubo de ensayo (muestra
problema)
- Prepare los estandares, blanco y muestra como se indica en el siguiente cuadro:

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Estándar Estándar Estándar Estándar Muestra

Reactivos Blanco
0,2 g% 0,6 g% 1,0 g% 1,2 g% problema
Estándar
___ 0,1 mL 0,3 mL 0,5 mL 0,6 mL ___
albúmina 2 g%
NaCL 0,9% 1 mL 0,9 mL 0,7 mL 0,5 mL 0,4 mL ___
Plasma diluido
___ ___ ___ ___ ___ 1 mL
1:10
Reactivo de
5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Biuret
Una vez agregado el reactivo de Biuret, espere 10 minutos y proceda a leer la
absorbancia a 545 nm con ayuda del espectrofotómetro. Anote los resultados en la
tabla anexa para el posterior análisis.

RESULTADOS
TUBO ABSORBANCIA
Estándar 0,2 g%
Estándar 0,6 g%
Estándar 1,0 g%
Estándar 1,2 g%
Muestra problema

Experimento N° 2 Determinación de proteínas por el método de Bradford

Procedimiento:
- A partir del estándar de proteínas (2 g%) prepare por dilución 100 mL de una
solución que contenga 100 mg%, y a partir de ésta prepare 100 mL de
estándares que contengan 10, 25, 50 y 100 mg% de proteína.
- Prepare 100 mL de una dilución de plasma bovino 1:100 que se utilizará como
muestra problema.

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Prepare la siguiente serie de tubos:

Estándar Estándar Estándar Estándar Muestra
Reactivos blanco
10 mg% 25 mg% 50 mg% 100 mg% problema
Estándar ___ 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL ___
NaCl 0,9 %
0,1 mL ___ ___ ___ ___ ___
Plasma diluido
___ ___ ___ ___ ___ 0,1 mL
1:100
Reactivo de
5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Bradford

- Mezclar bien y leer la absorbancia con un espectrofotómetro a 595 nm dentro del

lapso de 15 a 20 minutos después de agregar el reactivo de Bradfrod.
Una vez obtenidos los resultados anótelos en la tabla que se suministra a continuación
para su posterior análisis y discusión.

RESULTADOS
TUBO ABSORBANCIA

10 mg%
25 mg%
50 mg%
100 mg%
Muestra problema

Con los datos de cada tabla construya una curva patrón para cada método (graficando
la concentración de proteinas en el eje “x” contra absorbancia en el eje “y”) y mediante
extrapolación, estime la concentración de proteínas de la muestra. Considere la
dilución realizada en el procedimiento de cada método. Discuta las diferencias
encontradas entre ambos métodos, así como sus ventajas y desventajas en el análisis de
muestras biológicas.

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Auto evaluación

1. Establezca diferencias entre el método de Kjelhdal y los estudiados en esta

práctica.
2. Que ventaja representa el hecho de que el reactivo de Bradford posea
absorbancia a dos longitudes de onda distintas, una libre y otra asociado a las
proteínas.
3. En base a la sensibilidad que presentaron los métodos estudiados, que
aplicaciones prácticas tiene cada uno de éstos.
4. Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos hasta llevar las
proteínas a aminoácidos libres. Si una proteína es incubada con estas enzimas
que sucederá con la absorbancia en el tiempo al medir la concentración de
éstas por alguno de los métodos estudiados. ¿En cuál la absorbancia se hace
cero primero?

Bibliografía
A.V. Chechetkin, V.I. Voroniaski, G.G. Pokusay. Prácticas de Bioquímica del ganado
y aves de corral.
Boyer, Rrodney. Modern Experimental Biochemistry. 2da Edición. Benjamin Cummins
Editores. 1993.
Bradford, M. “A rapid and sensitive meted for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”. Anal. Biochem. 72:
248-254. 1976.

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