HUMANA

CA
BIO UÍMI

- F
QB II
MED -
Q

CÁTEDRA 1
UB
.

A - DPTO

TRABAJO PRÁCTICO
DE LABORATORIO
DILUCIONES
CURVA DE CALIBRACIÓN

MATERIA: QUÍMICA BIOLÓGICA II

CÁTEDRA 1
DPTO. BIOQUÍMICA HUMANA
FMED - UBA
 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2024

TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº1

DILUCIONES Y CURVA DE CALIBRACIÓN

OBJETIVOS

 Familiarizarse con el trabajo y material de laboratorio.

 Comprender los principios de la espectrofotometría.
 Determinar la concentración de una muestra incógnita.

PRINCIPIOS DE COLORIMETRÍA

Una medición fotocolorimétrica consiste en la determinación de la concentración de una

sustancia por la cantidad de color que posee naturalmente o que puede producir luego de una reacción
cromática, convenientemente elegida. Este procedimiento está basado en el hecho que toda
sustancia coloreada absorbe luz de una determinada longitud de onda ().
La absorción de la energía radiante por una solución puede describirse por medio de una gráfica
de absorbancia en función de la longitud de onda. Esta gráfica se denomina espectro de absorción.
Por ejemplo, para el caso del NAD+ y NADH:

Espectro de absorción del NADH y NAD+

El espectro de absorción frecuentemente se utiliza para propósitos de identificación cualitativa.

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Espectroscopia de absorción
Considérese un haz de energía radiante con una intensidad inicial, I0, que incide sobre una celda
cuadrada y pasa a través de ella. La celda contiene una solución de un compuesto que absorbe energía
radiante de una cierta longitud de onda (). La intensidad de la energía radiante transmitida, Is, será
menor que I0. Parte de la energía radiante será reflejada por la superficie de la celda o absorbida por
la pared de la celda o el solvente. Por lo tanto, estos factores deben ser eliminados si se desea
considerar sólo la absorción del compuesto de interés. Esto se hace usando un blanco que contiene
todo menos el compuesto a ser determinado.

celda
Intensidad Intensidad
Incial Transmitida
(I0) (I s)

Absorbancia
(A)
La transmitancia óptica de un compuesto en solución se define como la fracción de luz incidente,
a una longitud de onda especificada, que pasa a través de la muestra.

Transmitancia = T = Is /I0

Usualmente esta razón se describe como un porcentaje (%T). El concepto de transmitancia es

importante porque sólo puede medirse la luz transmitida (no se puede medir la luz que absorbe el
compuesto en la cubeta).
Cuando la concentración de un compuesto en solución aumenta, más luz es absorbida por la
solución y menos es transmitida. El porcentaje de T varía inversa y logarítmicamente con la
concentración. Sin embargo, es más conveniente usar la absorbancia, A, la cual es directamente
proporcional a la concentración.
Por lo tanto:
A = –log Is/I0 = – log T = log (1/T)

Si se grafica A o %T en función de la concentración de la solución con el compuesto que absorbe

energía, se obtienen los siguientes gráficos:

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Transmitancia (%T)
Absorbancia (A)
Concentración Concentración

Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer (ley de Beer), establecida en 1852 por Beer, postuló que “la reducción
de la energía radiante de un haz de radiación monocromática es proporcional a la intensidad del haz y
a la cantidad de sustancia absorbente situada en su trayectoria”. O sea que establece que la
concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante
absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida. La
absorbancia también es directamente proporcional a la longitud de la trayectoria que atraviesa la
energía radiante a través de la celda.
La relación matemática entre la absorción de energía radiante, la concentración de la solución,
y la longitud del paso óptico se demuestra por la ley de Beer:

A = a.b.c

Donde A es la absorbancia
a, absortividad (constante relacionada con la naturaleza química del soluto)
b, longitud atravesada por la luz en el medio (centímetros);
c, concentración de la sustancia de interés.

Esta ecuación es la base del análisis cuantitativo por fotometría o espectroscopia de absorción.
Los valores de absorbancia no tienen unidades. La absortividad es una constante de proporcionalidad
relacionada con la naturaleza química del soluto y tiene unidades que son recíprocas con las de b y c.
Cuando c se expresa en moles por litro y b en centímetros, el símbolo ε, llamado absortividad molar
(o coeficiente de extinción molar), se usa en lugar de a y es una constante para un compuesto dado a
una determinada longitud de onda, bajo condiciones específicas de solvente, pH, temperatura, etc.
Tiene unidades de L/mol.cm (o sea: M-1.cm-1). Mientras mayor es la absortividad molar, mayor es la
absorbancia para la misma concentración en términos de masa de dos compuestos.
Si una sustancia sigue la ley de Beer a una longitud de onda específica (es decir, una gráfica
lineal de A contra c conteniendo el punto 0;0), la concentración de una solución de dicha sustancia
puede ser determinada midiendo su absorbancia e interpolando su concentración en la gráfica de

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calibración. Por el contrario, cuando el %T se grafica frente a la concentración, se obtiene una relación
curva (similares a las mostradas previamente).
La ley de Lambert-Beer es una relación matemática ideal que contiene varias limitaciones.
Existen desviaciones de esta ley que implican variaciones en la linealidad de la absorbancia contra la
concentración. Una de estas causas es la medición de concentraciones muy elevadas de una
sustancia. Por lo tanto, la ley de Beer es aplicable sólo a soluciones diluidas. También es sabido que,
si dos o más compuestos absorben a la longitud de onda de la energía radiante incidente, cada uno
con diferente absortividad, no se cumplirá la ley de Beer.
Los instrumentos que miden la absorbancia de soluciones contienen siete componentes
básicos:

1. una fuente estable de energía radiante;

2. entrada para el enfoque de la luz (colimador);
3. un selector de longitud de onda;
4. una hendidura de salida para el enfoque de la luz;
5. un dispositivo para colocar la cubeta que contiene la solución a ser medida;
6. un detector de energía radiante;
7. un dispositivo para leer la señal eléctrica generada por el detector.

Si se utiliza un filtro como selector de longitud de onda, se dispone solo de luz monocromática
a longitudes de onda discretas y el instrumento es llamado fotómetro. Si se usa un monocromador
(esto es, un prisma o una red de difracción) como selector de longitud de onda, el equipo puede
proporcionar luz monocromática sobre un intervalo continuo de longitudes de onda y es llamado
espectrómetro o espectrofotómetro.
En la fotocolorimetría se determina la cantidad de luz absorbida en un determinado intervalo
espectral por una determinada concentración de sustancia. En otras palabras, en los métodos
fotocolorimétricos, se comparan intensidades luminosas para un determinado intervalo de longitud de
onda.

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Curva de calibración
La curva de calibración se utiliza para determinar la concentración de una sustancia en una
muestra desconocida. Este método requiere la existencia de una relación proporcional entre la
concentración de esa sustancia y una determinada señal analítica que se mide (como la
absorbancia). Conociendo esta relación, será posible conocer la concentración en una muestra dada
mediante la medida de esa señal. La relación concentración – señal se suele representar en un gráfico
conocido como curva de calibración.

Para elaborar una curva de calibración se necesitan varias diluciones con una concentración
conocida de la sustancia a medir. Estas diluciones se conocen como soluciones testigo. Las
concentraciones utilizadas como testigo deben estar dentro del rango válido para la técnica que se va
a utilizar (donde se cumple la ley de Beer). Es decir, por encima del mínimo de concentración
cuantificable y por debajo del límite de linealidad. La relación lineal entre concentración y la
absorbancia no se suele mantener a altas concentraciones y el límite de linealidad marca la
concentración máxima para la cual la curva de calibración sería fiable.

Límite de linealidad
Absorbancia (A)

Concentración

La curva de calibración se construye midiendo la absorbancia de cada una de las diluciones

testigo (previamente elaboradas). En el eje de ordenadas se asigna el valor de la señal medida y en el
eje de abscisas la concentración del testigo. Para cada testigo le corresponderá una determinada
absorbancia. De esta forma podemos realizar un gráfico de Absorbancia (eje y) en función de la
concentración del testigo (eje x). Teniendo una muestra de concentración desconocida (Muestra x), se
puede medir la absorbancia y estimar la concentración por interpolación sobre la curva de calibración,
como se ejemplifica a continuación:

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Si la absorbancia de la muestra estuviera por encima del límite de linealidad (es decir, si fuera
mayor que la absorbancia del último punto de la recta), se debe realizar nuevamente el ensayo con
una cantidad de muestra menor y así poder calcular la concentración de la sustancia en estudio.

Resumiendo:

Para calcular la concentración de una determinada sustancia en una muestra se debe realizar
previamente una curva de calibración. Para ello se utilizan distintas soluciones de concentración
conocida de esa misma sustancia (soluciones testigo) y se lee en el espectrofotómetro la absorbancia
correspondiente a cada una. Luego, se realiza el gráfico de absorbancia en función de la concentración
de la sustancia. Finalmente, se puede calcular la concentración de la muestra X, interpolando el valor
de absorbancia leído para dicha muestra en la región lineal de la gráfica (donde se cumple la ley de
Beer).

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USO DE MICROPIPETAS

La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeños

volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas.
Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales,
denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente. El uso
de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato. Para ello, se emplean
puntas desechables de plástico (tips). En el laboratorio se emplearán micropipetas de tipo p1000, las
cuales pipetean entre 100 y 1000 μl.

Técnica de pipeteo
1. Seleccionar en la pipeta el volumen que se desea pipetear.
2. Colocar el tip correspondiente en la pipeta (el tip no debe quedar flojo y no debe haber ningún tipo
de residuos entre el tip y el cuerpo de la pipeta).
3. Presionar el botón superior suavemente hasta que ofrezca resistencia (primer tope).
4. Sumergir el tip en la solución que se necesita pipetear.
5. Mantener la pipeta en forma vertical mientras toma la solución, soltando el botón superior con
suavidad.
6. Descartar la solución del tip en el tubo correspondiente presionando suavemente el botón superior
hasta el segundo tope.
7. Usar diferentes tips para pipetear diferentes soluciones (si no, se contaminan los reactivos).

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DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIONES

El objetivo del presente trabajo práctico es determinar la concentración de una muestra

incógnita de una sustancia que absorbe luz a una determinada longitud de onda: el azul de metileno.
Para ello, realizaremos una curva de calibración con muestras testigo de concentración conocida de
azul de metileno.
Como se puede ver en el gráfico, el azul de metileno absorbe luz a una longitud de onda de
660 nm aproximadamente.

Espectro de absorción del azul de metileno

Dado que la ley de Lambert-Beer postula que la concentración de una sustancia es

directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida por la misma, es posible determinar la
concentración de una muestra incógnita a partir de una curva de calibración, es decir, midiendo la
absorbancia de muestras de concentraciones conocidas del reactivo a cuantificar. Los tubos de las
muestras testigo se procesan junto con el de la muestra incógnita y, una vez realizado el gráfico de
absorbancia en función de la concentración de azul de metileno, se podrá calcular la concentración de
la muestra incógnita.

Protocolo

Cada grupo de trabajo debe procesar las muestras para realizar la curva de calibración, junto con las
muestras incógnitas correspondientes (muestra X e Y), como se indica a continuación:

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H2O Solución madre Muestra Volumen final

TUBO
(µl) (µl) (µl) (µl)
B 2000 - - 2000
T1 1750 250 - 2000
T2 1500 500 - 2000
T3 1250 750 - 2000
T4 1000 1000 - 2000
T5 - 2000 - 2000

MUESTRA X - - 2000 2000

MUESTRA Y - - 2000 2000

B: Blanco;
Solución madre: Solución de azul de metileno 0,8mg%
.

A) Colocar en cada tubo los reactivos correspondientes, utilizando una pipeta automática. Usar
un tip diferente para cada reactivo (para evitar contaminarlos).
B) Mezclar el contenido de los tubos.
C) Ajustar con el BLANCO (B) el cero del fotocolorímetro a 660nm.
D) Leer y anotar la absorbancia de cada tubo a 660nm.
E) Graficar la curva de calibración (absorbancia en función de la concentración), en hoja
milimetrada.
F) Interpolar el valor obtenido de la absorbancia de las muestras incógnitas en dicho gráfico y
determinar sus concentraciones

Sabiendo que la concentración de la solución madre es de 0,8 mg%, calcular la concentración de azul
de metileno de cada uno de los tubos testigo.

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Concentración Absorbancia
TUBO
mg % (660 nm)
B
T1
T2
T3
T4
T5

MUESTRA X ¿?

MUESTRA Y ¿?

Luego de graficar la curva de calibración (absorbancia en función de la concentración) y de

interpolar la absorbancia de las muestras incógnitas en dicho gráfico, los resultados obtenidos fueron:
 Concentración de muestra X: ___________________________
 Concentración de muestra Y: ___________________________

Discutir si encontró alguna dificultad en el procesamiento de alguna de las muestras y qué

solución encontró.

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