PRÁCTICA #6.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LAS PROTEINAS DE

LA LECHE

LUISSA FERNANDA GOMEZ 117004312

EMILY VALENTINA LOMBANA 117004319
YORLEAN ALFONSO SANABRIA 117004334

DOCENTE
ALEJANDRA GALÁN

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
VILLAVICENCIO, META
2021
OBJETIVOS
 Separar las principales proteínas presentes en la leche de vaca.
 Obtener la fracción de caseínas de la leche mediante precipitación isoeléctrica.
 Identificar la presencia de las proteínas del suero empleando un método
colorimétrico.
INTRODUCCIÓN
En esta práctica determinación cuantitativa de las proteínas de leche, realizaremos la
precipitación isoeléctrica de la caseína, Las caseínas son un conjunto heterogéneo de
proteínas, por lo que es difícil fijar una definición. Sin embargo, todas las proteínas
englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común: precipitan
cuando se acidifica la leche a pH 4,6. El método para determinar el contenido de proteínas,
es el método de Biuret, que es más sensible que el Kjeldahl y menos costoso y práctico; por
lo tanto sería recomendable buscar un método alternativo como por ejemplo el Formol de
Walker y que fuera más rápido y tan exacto como el método de Biuret, para poder realizar
los análisis en el campo y tener resultados rápidos y confiables. También se determinara la
concentración de proteínas empleando el sobrenadante obtenido en el proceso ya realizado,
para así realizar la curva de calibración la cual se hace utilizando como patrón una solución
acuosa de proteína que es la albumina, realizado esto se leerá la absorbancia de cada tubo
anteriormente rotulado.
MARCO TEÓRICO
La leche está compuesta de grasa, proteínas, lactosa y agua. Las proteínas de la leche
resultan muy enteras debido a que tienen dentro los 8 aminoácidos fundamentales en
proporciones primordiales. Entre ellas, la caseína es la más exuberante e importante para
fijar el calcio en el organismo. Además, tiene vitaminas del conjunto B bastante relevantes
a lo largo de la fase de incremento de los chicos. Su riqueza en calcio, fósforo y vitamina D
la ha elaborado ideal y convencionalmente aconsejable para el adecuado desarrollo y
mantenimiento de huesos y dientes. Sin embargo, nos aporta lactosa, que es la sacarosa
primordial de la leche de casi todos los mamíferos, y que se comporta como un hidrato de
carbono que crea energía ejerciendo un impacto productivo en la absorción intestinal del
calcio y el magnesio. Tampoco se debe olvidar que la leche tiene una gigantesca proporción
de agua para conservar un óptimo estado de hidratación en el organismo.
Para separar las proteínas de otros componentes de la leche como pueden ser la grasa o la
lactosa, se utilizan procesos como la ultrafiltración, la microfiltración o el descremado. Para
separar las diferentes proteínas entre sí, se siguen otras técnicas de separación como pueden
ser la coagulación, la cromatografía o la precipitación. Por medio de estas técnicas se puede
conseguir una lista casi innumerable de proteínas lácteas funcionales desde las más
conocidas como las caseínas, caseinatos o lactosueros, a las más desconocidas como la beta
lactoglobulina o las lactoalbúminas. Todas y cada una de ellas se utiliza en alguna
aplicación, tanto en la alimentación como en farmacia o cosmética.
Y para identificar la presencia de las proteínas del suero se emplea un método llamado
colorímetro. Un colorímetro es un dispositivo utilizado para probar la concentración de una
solución al medir su absorbancia de una longitud de onda específica de la luz (no debe
confundirse con el colorímetro triestímulo usado para medir los colores en general).

Procedimiento
Precipitación isoeléctrica de la caseína

Determinación cuantitativa de las proteínas del suero Método de Biuret

Resultados
Ph inicial : 6,7
Precipito : 4,931
Hcl: 3,5
Peso de la caseína= 39,1683g - 36,2156g (vidrio) - 1,5137g (papel)

Peso de la caseína = 1,4390 g

Tubo Concentración Absorbancia

(mg/mL)

B - 0
1 0,2 0,029
2 0,4 0,072
3 0,6 0,11
4 0,8 0,14
5 1 0,18
6 x 0,21
7 y 0,3
Tabla 1. Datos obtenidos

Para encontrar la concentración de X y Y se emplea la l y de Lambert-beer

A= E * C * l
A
E=
C∗l
0,14
E=
mg
0,8 ∗1 cm
ml
mL
E=0,175
mgcm

Para x:
A
X=
E∗L
A
X=
E∗L
 0,21
X=
mL
0,175 ∗1 cm
mgcm
mg
X =1,2
mL

Para y:
A
Y=
E∗L
A
Y=
E∗L
0,3
Y=
mL
0,175 ∗1 cm
mgcm
mg
X =1,714
mL

Tubo Concentración Absorbancia

(mg/mL)

B 0 0
1 0,2 0,029
2 0,4 0,072
3 0,6 0,11
4 0,8 0,14
5 1 0,18
6 1,2 0,21
7 1,714 0,3

Tabla 2. Concentración y absorbancia.

 Absorbancia vs concentración
0.33
0.3
0.27
0.24
0.21
Absorbancia

0.18
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Concentracion

Grafica 1. Absorbancia vs concentración.

Análisis de resultados
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la
leche por acidificación y forma una masa blanca más o menos granulosa, el cual se separa
del lactosuero dando lugar a una cuajada frágil y desmineralizada, en donde el calcio no
juega ningún papel, ya que es arrastrado por el suero, esta precipitación se da mediante el
uso de ácidos fuertes (HCl), el punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6, (en el
laboratorio vimos cómo empezó a precipitar desde un pH de 4.8), a este pH la caseína se
encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones
intermoleculares, por lo que precipita.
El producto final es el caseinato sódico o cálcico, después de neutralizar la caseína con
hidróxido sódico o cálcico.
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas
por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su
solubilidad y facilitar su agregación.
La leche está compuesta por varios nutrientes que incluyen agua, vitaminas, carbohidratos
y dos proteínas: 80 % caseína y 20 % suero. El suero es la parte líquida translúcida de la
leche que quedó después de que hicimos el proceso de filtración.
Ahora, para la determinación cuantitativa de las proteínas del suero se midió utilizando el
método del Biuret, que se basa en la formación de un compuesto coloreado o cromóforo, de
color azul-púrpura, debido a la formación de un complejo entre el ión cobre y los enlaces
peptídicos a pH alcalino. Se requiere un mínimo de dos enlaces peptídicos para la
formación del complejo coloreado, que se mide a 550 nm. Es un método poco sensible pero
muy preciso, ya que la abundancia de grupos peptídicos (por unidad de masa de proteína)
es prácticamente la misma en cualquier proteína.
En el espectrofotómetro es importante el uso de un blanco o control para darle validez al
resultado del experimento, para la curva de calibración según la ley de Lambert-beer se
obtiene midiendo la absorbancia de la serie de tubos rotulados , para medir esta
concentración se elige la región de máxima absorción del espectro, es decir, la longitud de
onda analítica. El resultado se expresa en la grafica (1) donde la absorbancia esta en
función a la concentración, así obteniendo una línea recta que pasa cerca del origen. Con
los datos obtenidos , el grafico que se obtiene no es tan ideal , pero dentro de ciertos
valores es posible trazar la recta más probable que une una serie de puntos.
 Otros métodos de cuantificación de proteínas:
Método Ventaja Desventaja
Lowry: es un método colorimétrico de Tiene bastante No todas las
valoración cuantitativa de las proteínas. sensibilidad proteínas reaccionan
A la muestra se añade un reactivo que igual. Muestra
forma un complejo coloreado (color muchas
amarillo) con las proteínas, siendo la interferencias como
intensidad de color proporcional a la detergentes no
concentración de proteínas, según la Ley iónicos, sulfato
de Lambert-Beer. amónico etc

Bradford: consiste en la cuantificación Muy sensible, Muestra

de la unión de un colorante, el Azul de rápido y sencillo. interferencias con
Coomassie G-250, a la proteína, detergentes
comparando esta unión con la de
diferentes cantidades de una proteína
estándar, la tinción en solución es de
color rojo, al unirse a proteínas se
convierte en color azul.
BCA: para la detección y cuantificación Es el método más Las muestras que
colorimétrica de proteínas totales. Este sensible Es el que contengan sustancias
método combina la reducción del Cu+2 muestra menos que interaccionan
a Cu+1 en medio alcalino (reacción de interferencias con el cobre, como
Biuret) con la detección selectiva del por ejemplo
catión Cu+1 utilizando el acido amoniaco, azúcar
bicinconínico. El producto de la reductores o lípidos
reacción tiene un color púrpura pueden interferir con
formado por el complejo de BCA con un el ensayo
ion Cu+1.
CBQCA:se trata de un agente Muy sensible La interferencia de
fluorogénico de alta sensibilidad que se aminas
utiliza para la detección de aminas contaminantes en la
primarias en las proteínas muestra No todas las
muestras reaccionan
igual
Absorción (UV): este método mediante No se pierden las Interfieren muchos
la medición de la absorción muestras compuestos que
característica que presenta el triptófano absorben en el UV
y la tirosina a 280 nm , estima la (alcoholes, ácidos
cantidad de proteína presente en la nucleicos, entre
muestra otros.

 clasificación de las proteínas según la solubilidad.

Albúminas: Solubles en agua. Seroalbumina, Ovoalbumina, Lactoalbumina

Globulinas: Solubles en soluciones salinas diluídas. Componente del plasma,

lactoglobulina, seroglobulina, ovoglobulina

Glutelinas: Solubles en soluciones de ácidos y bases diluidos. Trigo, avena, cebada.

Prolaminas: Solubles en soluciones acuosas de etanol. Gliadina de trigo, centeno.

CUESTIONARIO
1. Comprare la composición de proteínas de la leche humana versus leche de
vaca.

Leche de vaca: las grasas constituyen alrededor del 3 al 4 por ciento del contenido
sólido de la leche de vaca, las proteínas aproximadamente el 3,5 por ciento y la
lactosa el 5 por ciento, pero la composición química bruta de la leche de vaca varía
según la raza. Por ejemplo, el contenido de grasa suele ser mayor en el ganado Bos
indicus que en el B. taurus. El contenido de materias grasas de la leche del ganado
B. indicus puede ser de hasta el 5,5 por ciento.
Existen varios tipos de proteínas en la leche (Caseína, Beta-lactoglobulina, Alfa-
lactoalbúmina, Lactoferrina, Lacto peroxidasa, Inmunoglobulinas, Lisozima) que
tienen funciones especializadas, pero todas:
– Protegen al recién nacido y a la glándula mamaria de las infecciones.

– Intervienen en la formación de otros componentes de la leche como la lactosa y

la grasa.

Caseína
La caseína comprende varios tipos de moléculas que son la alfa-caseína, la beta-
caseína, la kappa-caseína y la gamma-caseína. Son partículas sólidas que
permanecen en suspensión. En la leche de vaca es la proteína más abundante,
constituyendo el 80% del total de sus proteínas. En la leche humana constituyen el
40%, y no hay ni alfa ni gamma caseína.
Cuando esta proteína se encuentra en un medio ácido o alcalino (limón, vinagre,
etc.) se produce su desnaturalización, tiene lugar una reacción química que altera su
estructura, y deja de ser soluble en agua, lo que provoca que precipite en forma de
grumos. De ellos se obtiene la ricotta. Cuando a la leche se le añade cuajo o ácido
láctico se forma el queso.

Beta-lactoglobulina
La beta-lactoglobulina es una proteína que no se encuentra en la leche humana, pero
sí en la leche de vaca. Cuando se hierve la leche, esta proteína forma parte de la
capa de nata que aparece en la superficie. Puede pasar a la leche humana a través de
la leche de vaca ingerida en la dieta de la madre.

Alfa-lactoalbúmina
La alfa-lactoalbúmina es una proteína que favorece la unión de la glucosa con la
galactosa para la síntesis la lactosa. Se encuentra tanto en la leche de vaca como en
la humana. Forma parte de la capa de nata que aparece en la superficie de la leche
hervida.

Lactoferrina
La lactoferrina es una proteína de color rojo debido al hierro al que está unida.
Tiene una importante función defensiva antibacteriana y antifúngica, ya que altera
la pared de los microorganismos causando su muerte y además fija el hierro del
medio quitándoselo a éstos, que ya carecen de él para su proliferación. Parece ser
que también actúa protegiendo la glándula mamaria.

Lacto peroxidasa
La lacto peroxidasa es una proteína casi inexistente en la leche humana, pero muy
abundante en la saliva. También es muy abundante en la leche de vaca. Es una
enzima con función defensiva que, en presencia de agua oxigenada, procedente de
los microorganismos o producida por otros enzimas, cataliza la formación de una
serie de sustancias con gran poder antimicrobiano.

Inmunoglobulinas
Las inmunoglobulinas son proteínas que reconocen las estructuras extrañas al
organismo, como las membranas de los microorganismos, y se unen a ellas
permitiendo que sean destruidas por el sistema inmune. Son muy abundantes en el
calostro y menos en la leche.
En los bebés estas inmunoglobulinas no se absorben, sino que permanecen en el
tubo digestivo para protegerlo frente a microorganismos patógenos.

Lisozima
La lisozima es una proteína presente en la leche humana pero ausente de la leche de
vaca. Su función es disolver la pared de los microorganismos patógenos. Actúa
además potenciando la acción de los leucocitos. La lisozima y la lactoferrina se
potencian mutuamente en su acción contra los agentes infecciosos. La lisozima se
encuentra también en la clara del huevo.

Leche materna: Proteínas: el mayor porcentaje corresponde a caseína (40%) y el

60% restante a proteínas del suero: lisozima, lactoalbúmina, lactoferrina que
contribuye a la absorción de hierro en el intestino del niño y lo fija, evitando que sea
usado por las bacterias. Además, como parte del Nitrógeno no proteico se
encuentran aminoácidos libres, entre ellos la taurina potente neurotransmisor, que el
recién nacido no es capaz de sintetizar. Es de destacar la presencia de
inmunoglobulinas. IgA, IgG, IgM. La principal es la IgA secretora cuya función
consiste en proteger las mucosas del recién nacido y es producida por el
denominado ciclo entero mamario; encontrándose en muy altas concentraciones en
el calostro.

Lactoferrina
Uno de los elementos más relevantes de las proteínas de la leche materna es la
lactoferrina, constituyendo cerca de un 10-15% de las mismas. Esta proteína
beneficia la absorción del hierro, tiene actividad antimicrobiana, antiviral y
antiinflamatoria; es un elemento de aumento y proliferación de la mucosa intestinal,
y beneficia la unión de la timidina en el ADN (siendo este último un impacto sin
dependencia del hierro) Además, es inmunomodulante y anti carcinogénica.
La actividad antimicrobiana de la lactoferrina se practica sobre un extenso espectro
de patógenos, integrados hongos, bacterias y virus. La funcionalidad bacteriostática
se debería a la función de la lactoferrina para ligar iones Fe, debido a que la
molécula está primordialmente como apolactoferrina (forma independiente de
 hierro) en las secreciones y tiene la función de secuestrar este metal en los sitios de
infección. Tal cual priva de un nutriente sustancial a las bacterias inhibiendo su
incremento. La capacidad bactericida de la lactoferrina se atribuye a la relación
directa de la molécula o parte de ella, con las áreas bacterianas, lo cual crea un
incremento en la permeabilidad de la membrana y la liberación del contenido
citoplasmático. Este impacto es parecido al producido en hongos y levaduras,
empero en esta situación se necesita de la molécula completa de lactoferrina. En la
situación de virus, la lactoferrina lleva a cabo su acción por competencia,
impidiendo su internalización en la célula eucariota.

2. ¿A qué se debe la solubilidad de las proteínas en agua? ¿Qué factores afectan

la solubilidad de las proteínas?
Las proteínas son solubles en agua una vez que adoptan una conformación globular.
La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al
ionizarse, establecen enlaces débiles (puentes de hidrógeno) con las moléculas de
agua. De esta forma, una vez que una proteína se solubiliza queda recubierta de una
capa de moléculas de agua (capa de solvatación) que impide que se logre juntar a
otras proteínas lo que causaría su precipitación (insolubilización). Esta propiedad es
la que hace viable la hidratación de los tejidos de los organismos vivos.

La solubilidad de una proteína está influenciada por los próximos componentes:

 Su estructura en aminoácidos (una proteína rica en aminoácidos polares es
generalmente más soluble que una rica en aminoácidos hidrofóbicos)
 Su composición tridimensional (las proteínas fibrosas son generalmente
menos solubles que las globulares).
Tenemos la posibilidad de mencionar que los primordiales factores que influyen en
la solubilidad de una proteína son los siguientes:
 La temperatura
 La constante dieléctrica del medio
 El pH del mismo
 La fuerza iónica.

3. Que sustancias en la leche de la mujer actúan como parte fundamental de los

sistemas inmunológico y de protección del recién nacido.
La leche materna protege de forma activa y pasiva al lactante, gracias a su riqueza
en inmunoglobulinas, lactoferrina, lisozima, citoquinas y otros numerosos factores
inmunológicos, como leucocitos maternos, que proporcionan inmunidad activa y
promueven el desarrollo de la inmunocompetencia del bebé
En este sentido, se han descrito importantes hallazgos a través de diversos estudios,
al mostrar el papel protector que ejerce la LM ante diversas enfermedades. Uno de
estos estudios es el efectuado por Riskin y cols, en el que analizaron la leche de
madres cuyos bebés estaban padeciendo algún tipo de infección. La muestra estaba
formada por 31 lactantes, de los cuales 12 tenían infección vírica, 1 gastroenteritis,
 5 infección del tracto respiratorio superior, 5 infección urinaria, 2 neumonía, 1 otitis
aguda, 4 meningitis y 1 celulitis periorbital. Los resultados apoyan la teoría de que
existe una conexión inmunológica dinámica entre las madres y los lactantes que
padecen una infección activa, ya que se observó un aumento del número total de
leucocitos de la sangre, específicamente del número de macrófagos.

4. ¿Cuáles son las proteínas que pertenecen a la caseína, cuales a las proteínas del
suero? Comente a qué clase de proteínas pertenecen en términos de su
estructura.

Conclusiones.
 Se observa que la caseína de la leche se precipita cuando el pH disminuye a 4.6
gracias al HCl
 Utilizamos la prueba biuret para identificar las proteínas de la leche, ya que el
reactivo detecta la presencia de tres o mas enlaces peptídicos, mostrando como
resultado un tono purpura-violeta, este complejo tiene un máximo de absorción de
540 nm.

Fichas de seguridad
Biblbiografia

Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México
Emilio Fernández y Aurora Galván. Métodos para la cuantificación de proteínas.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

Cox, M. y Nelson, D. (2007). Principios de bioquímica (Quinta edición). Barcelona:

Ediciones Omega.