I.

INTRODUCCIÓN

En la microbiología se podría decir que el elemento más importante para el trabajo junto con el
microscopio, es el microorganismo que se desea observar, estudiar o analizar. Por lo que para
tener un acceso fácil y rápido a los microorganismos en cualquier momento, estos deben ser
cultivados. Por lo que podemos hacernos la siguiente pregunta. ¿Cómo le damos las condiciones
adecuadas para que un microorganismo crezca como si estuviera en su habitad o medio
correspondiente? Pues la respuesta es sencilla, con el tiempo se han ido utilizando métodos
artificiales preparados en laboratorios; este material alimenticio en el que crecen los
microorganismos es llamado el medio de cultivo, mientras que el crecimiento de los
microorganismos en colonias se denomina el cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado,
así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se

licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado
por aquellas que crecen en él.

OBJETIVOS:

- Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes características para el cultivo de

microorganismos.

- Conocer los constituyentes habituales de los medios de cultivo como las peptonas,
extractos de carne y levadura, sistemas amortiguadores (soluciones tamponadas), agentes
reductores como cisteína, tioglicolato y otros, agentes selectivos como cristal violeta,
sales biliares, azida sódica y otros que son utilizados en la preparación de los distintos
tipos de medio de cultivo.
II. MATERIALES Y METODOS:

Materiales

- Medios de Cultivo o ingredientes deshidratados

- Agua destilada o desionizada
- Algodón
- Balanza
- Erlenmeyer de 250 y 500 ml
- Espátulas
- Lápiz marcador de vidrio
- Papel aluminio y papel kraft
- Probetas de 100 ml

Procedimiento

a. Caldo Nutritivo (Extracto de carne 0.3% y Peptona 0.5%)

1. Se utilizó un trozo de papel aluminio para pesar cuidadosamente la cantidad de

medio deshidratado suficiente para preparar 100 ml de caldo nutritivo. Se utilizó el
Agar Deshidratado en su forma comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Colocó el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y se agregó
cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.
3. Mezcló la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución.
4. Se envolvió con papel, identificando el nombre del medio, la fecha de preparación y
el nombre de la persona responsable.
5. Esterilizó en autoclave a 121° C (15 lb. De presión) durante 15 minutos.

b. Agar Nutritivo (Extracto de carne 0.3%; Peptona 0.5%; Agar 1.5%)

1. Preparar 100 mL de Caldo Nutritivo (Repita los pasos 1,2, y 3 del procedimiento
anterior).
2. Agregar la cantidad de agar calculada para los 100 ml y disolver en la cocinilla, con
agitación constante, evitando el sobrecalentamiento hasta que el medio luzca
transparente a la luz.
3. Una vez disuelto el medio dejar enfriar ligeramente.
4. Esterilizar en autoclave a 121° C por 15 minutos.

c. Agar MacConkey (Peptona 1.7%; Proteosa-Peptona 0.3%; Lactosa 1%; Sales biliares
0.15%; NaCl 0.5%; Agar 1.5%; Rojo Neutro 0.003%; Cristal Violeta 0.0001%)

d. Agar Manitol Salado (Extracto de carne 0.1%; Proteosa-Peptona 1.0%; NaCl 7.5%;
Manitol 1.0%; Agar 1.5%; Rojo Fenol 0.0025%).

e. Agar Citrato de Simmon's [ (NH4)H2PO4 0.1%; K2HPO4 1.0%; NaCl 0.5%; Citrato de
sódio 1.0%; MgSO4 0.02%, azul de bromo timol 0.008%; Agar 1.2%]
 1. Se pesó cuidadosamente la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar
100 ml de cada uno. Utilizando el Agar Deshidratado en su forma comercial
siguiendo las instrucciones del fabricante. Observando la formulación de cada medio
comprobará que los pesos a realizar son distintos.
2. Se colocó el polvo de cada medio en Erlenmeyer de 250 ml y disolvió en la cocinilla
hasta la completa disolución del agar con agitación constante evitando el
sobrecalentamiento hasta que el medio luzca transparente a la luz.
3. Una vez disuelto el medio se puso a enfriar ligeramente.
4. Se colocó los tapones de algodón para cada Erlenmeyer. Luego de colocarlos, se
cubrió los recipientes con papel kraft e identificó el material con el nombre del
medio, fecha de elaboración y el nombre de la persona responsable de su
preparación.
5. Se esterilizó en autoclave a 121° C por 15 minutos.

III. RESULTADOS

Los medios de cultivo fueron disueltos por calor, usando baño maría. A excepción del caldo
nutritivo, que fue disuelto por agitación. La razón de esto es que el caldo nutritivo es un medio
de cultivo en estado líquido, a diferencia de los demás que son en estado sólido, en otras
palabras tienen agar agar dentro de su composición química, y para evitar formación de
pequeños grumos o cristales en el fondo del frasco, se usó el calor.

Todos los medios de cultivos utilizados son medios sintéticos o definidos, esto quiere decir que
conocemos su exacta composición respectiva, ubicada en la parte trasera del envase. A su vez
esto nos dice cuanto medio de cultivo se debe disolver en 1l. Sin embargo, el trabajo realizado
fue a base de 100ml, por lo que con ayuda de regla de 3 simples, se puedo determinar la
cantidad exacta para ser empleada.
Los medios de cultivo listos para ser esterilizados en la autoclave, para su posterior distribución
en placas Petri. (Agar Simmons, agar macConkey, agar manitol salado, caldo nutritivo(x 2)
respectivamente de izquierda a derecha)

IV. DISCUSIÓN
Se puede observar colores determinados para cada uno de los medios de cultivos, que hacen
fácil su diferenciación, en esta oportunidad solo discutiremos acerca de cada uno de ellos,
explicando que tipo de medio son y para qué tipo de microorganismos son los más indicados.

1. El agar macConkey, una vez disuelto se obtiene un color rojizo oscuro.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo,
aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa
en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento:
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la
mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram
positiva. 

Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la

colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo
neutro).

Medio preparado: rojo púrpura

2. Agar Nutritivo

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de

microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros
materiales de importancia sanitaria.

Fundamento:
Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de
microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene
inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno
para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento
con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos
exigentes.

Medio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente. 

3. Agar manitol salado, una vez disuelto se obtiene un color anaranjado

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de

estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de
muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia
sanitaria. También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de
Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque
algunas especies pueden no desarrollar.

Fundamento:

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los

estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol
acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas
de una zona amarilla brillante. Los estafilococos
coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de
una zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se
repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio
para efectuarles, posteriormente, la prueba de la
coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de

carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable,
el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que
inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

Medio preparado: rojo

4. Caldo nutritivo, una vez disuelto se obtiene un color amarillo tenue, casi transparente
 Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de
microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso está descripto en
muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de
importancia sanitaria.

Fundamento:

Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de

carne que constituye la fuente de carbono y nitrógeno
necesario para el adecuado desarrollo bacteriano.
Puede ser utilizado además, como pre enriquecimiento
en la búsqueda de Salmonella spp. A partir de
alimentos, ya que permite recuperar células dañadas,
diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.

Medio preparado: ámbar claro.

5. Agar Citrato de Simmon's

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias (medio de cultivo diferencial), en

base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento:

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato

de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es
cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de
bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de
cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la
consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa,
a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da
origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de
la producción de citrato permeasa.

Medio preparado: verde.

V. CONCLUSIONES:
Esta práctica permitió un acercamiento a las técnicas para la prepación de medios de cultivo y
su correcta forma manejo, la actividad también permitió un acercamiento entre el estudiante y el
medio de trabajo de laboratorio, para poder incrementar la confianza y habilidades en el uso de
los instrumentos.

Otorgó grandes conocimientos sobre los medios de cultivo, tanto en su definición, tipos y
fundamentos específicos de cada uno de ellos, que fueron muy útiles al momento de preparar
cada medio de cultivo.

Se ha podido apreciar la importancia de los medios de cultivo para la siembra y mantención de

microorganismos, siendo capaz de darle a estos el ambiente adecuado que necesitan para
desarrollarse, para que en un futuro cercano podamos usarlos para nuevos estudios o
investigaciones.

VI. BIBLIOGRAFIA

1. Brock T. Biología de los microorganismos. 10ma ed. Reino Unido: Pearson Pretince
hall; 2004. Pg 102-110.

2. Tortora G. Introducción a la microbiología. 9ª ed. México: Editorial médica

panamericana; 2007. Pg. 168- 174

3. Laboratorios Britania [en línea] [fecha de acceso; 9 de abril del 2017], disponible en:
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/nutritivocaldo.htm

4. Laboratorios Britania [en línea] [fecha de acceso; 9 de abril del 2017], disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htm

5. Laboratorios Britania [en línea] [fecha de acceso; 9 de abril del 2017], disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/manitolsalagar.htm