INFORME No 4: CUANTIFICACIÓN DE ANALITOS POR ESPECTROSCOPIA

UV-VIS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
Aplicar los principios de UV-Vis para la identificación de analitos en una muestra
problema.

MARCO TEÓRICO.
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de
medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la
longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz
absorbida por la misma.
Región V:
Se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región de
energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los
compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos,
sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima
absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la
determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores
-como pH, concentración de sal y el disolvente que alteran la carga de las
moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiación
ultravioleta es una lámpara de deuterio.
Región visible:
Se parece el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes de
onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de
absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución
coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
Transmitancia (T):
De una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que
llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que
incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io
x 100 La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad
incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la
concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.
Absorbancia (A):
Es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad
de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y
transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la
muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 =
0.
Ley de Lambert-Beer :
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud
de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará-;
y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 8. Mapa conceptual del paso a paso para el uso del Espectrofotómetro UV-
Vis.

PROCEDIMIENTO USO DEL

ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS

Calibración
Para vaciar una cubeta Para introducir una cubeta o sacarla
Para conectar o desconectar
Para añadir una alícuota de muestra a una cubeta

Se debe se Se debe
se

Selecciona y luego pulsa

Llenar una cubeta con 3ml de agua

en
y

Sacar la cubeta y vaciarla Pulsar en una de las fl

Ajusta la longitud de onda a 405uM y pulsar el botón A=0

Tabla 9. Curva de calibración y cálculos para determinar la concentración de pNF

en muestras
Datos obtenidos
Cubeta 1 2 3
Volumen de p-nitro Fenol (pNF) 1 3 2
Volumen de agua 2 0 1
Absorbancia 0.390 1.438 0.910
 Cálculos
1 2 3 A C
pNF 1 3 2 0,39 26,67
H2O 2 0 1 0,91 53,33
26,67 80 53,33 1,438 80
Grafica

Curva de calibración
pNF
1.6
1.4
f(x) = 0.02 x − 0.14
1.2 R² = 1
Absorbancia

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
20 30 40 50 60 70 80 90
concentración

Problema
Se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con 2 mℓ de agua. Calcula la
concentración de pNF en la muestra de partida si el ensayo ha proporcionado un
valor A405 = 0.426
0.426=0,0917x – 0.1354
0.426-0.1354= 0.0917x
0.2906=0.0917x
X= 0.0917
0.2906

X= 0.3155

CUESTIONARIO
1. Explique la ley de Beer-Lambert e indique las bajo las cuales se
cumple está ley
La ley de BOUGUER-LAMBERT-BEER también se conoce como ley de Beer-Lambert-
Bouguer y fue descubierta de formas diferentes e independientes en primer lugar
por el matemático y astrónomo francés Pierre Bouguer en 1729, luego por el
filósofo y matemático alemán, Johann Heinrich Lambert en 1760 y por último el
físico y matemático también alemán, August Beer en el año 1852. Se puede decir
que esta ley se trata de un medio o método matemático, el cual es utilizado para
expresar de qué modo la materia absorbe la luz.

A= -εcd

Donde, A = Absorbencia
ε = Coeficiente molar de extinción
d = Recorrido (en cm)
c = Concentración molar

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos,

ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz,
agregación de moléculas, cambios del medio, etc. La medición de absorbancia de la
luz por las moléculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotómetros.

2. ¿Qué aplicaciones tiene la espectroscopia en el campo de alimentos? cite un

ejemplo.

En la industria alimentaria, las aplicaciones de la espectroscopía se pueden agrupar

en diferentes aspectos:
 Detección de fraudes alimentarios
 Calidad de alimentos
 Estudios de trazabilidad
 Seguridad alimentaria
 Análisis de alimentos
Ejemplo:
La validación del método de cuantificación de vitamina A (retinol) en
azúcar morena por espectrofotometría ultravioleta / visible,
empleando un Espectrofotómetro ultravioleta/visible con el propósito
de disminuir la influencia de la heterogeneidad de la distribución de
vitamina A en el azúcar analizado.

CONCLUSIONES
Con la curva de calibración se demuestra la ley de Beer-lambert, se
pudo determinar la concentración de la muestra.
A la hora de medir el valor de la absorbancia de los estándares y la
muestra es necesario tener en cuenta el número de mediciones.
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su
concentración pues a mayor número de moléculas mayor interacción
de la luz con ellas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abril,D.N.,Barcena,R.A(2010) Espectrometría: Espectros de absorción
y cuantificación colorimétrica de biomoléculas(pp.5,7,8)Córdoba:
Departamento de bioquímica y biología molecular: disponible en: 8
(uco.es)
Harvey David. Química Analítica Moderna. Ed. Mc Graw Hill. España
(2002). pp 573.
Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Nieman (2001) Principios de Análisis 
Instrumental. 5ta  Edición, Editorial McGraw‐Hill, México. 1028 pp.