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Compendio de guías
Autor
MSc. Yanet Gutiérrez Gaitán

Universidad Nacional Agraria
Facultad de Agronomía
Departamento de Protección Agrícola y Forestal

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M Ó D U L O PRÁCTICO
Técnicas de laboratorio
C o m p e n d i o de guías
Autor
Managua, Septiembre 2012

Técnicas de Laboratorio
Universidad N a c i o n a l Agraria
Facultad de Agronomía
Créditos
Contenido Técnico: MSc. Yanet Gutiérrez Gaitán
Coordinación: MSc. Víctor Sandino
lng. Ma. Gabriela Zapata
Revisión técnica:
PROMIPAC: MSc. Julio López
Ma. Gabriela Zapata.
UNA: MSc. Víctor Sandino
Arte y Diseño: lng. Harold Argüello
lng. Ma. Gabriela Zapata
Lic. Karol Contreras
Fotografías: UNA
Septiembre 2012
Agradecimiento: La coordinación agradece, la ardua labor realizada por el personal
docente del DPAF-UNA y PROMIPAC en el desarrollo y revisión de este material que
vendrá a ser de mucha utilidad para los docentes y estudiantes de toda índole que estén
relacionados con dicho expertis.
Esta publicación ha sido posible gracias al apoyo del Programa de Manejo Integrado de
Plagas en América Central (PROMIPAC) y al patrocinio de la Cooperación Suiza en
América Central.
® DERECHOS RESERVADOS
2012 Universidad Nacional Agraria (UNA); Programa de Manejo Integrado de Plagas en
América Central (PROMIPAC-ZAMORANO). Se autoriza la reproducción total o parcial de
esta obra con fines educativos y no de lucro; sólo se requiere citar la fuente.
Gutiérrez Y. 2012. Universidad Nacional Agraria MÓDULO PRÁCTICO: Técnicas de
laboratorio. Managua, Nicaragua. 1° Edición, 2012. 6 1 p .
Página 1
INDICE DE CONTENIDO PAGINA
PRESENTACION 4
GUÍA 1 . Organización, estructura y trabajo aséptico de 5
laboratorio
GUIA 2. Preparación de medios de cultivos ó nutritivos 10
GUIA 3. Técnicas de aislamiento de Oomycetes y Hongos 12
fitooatóaenos
GUIA 4.Técnicas de aislamiento de Bacterias fitopatógenas 14
GUIA 5.Técnicas de extracción de Nematodos de suelo y 17
material veaetal
GUIA 6. Evaluación de sanidad de la semilla 20
GUIA ?.Técnicas de inoculación de Bacterias y Hongos 23
fitopatóqenos
GUIA B. Técnica Elisa para la detenninación de presencia 27
de Virus fitooatóaenos
GUIA 9. Técnicas de aislamiento de Hongo 30
Entomopatóqenos
GUIA 10. Calibración de microscopio 33
GUIA 1 1 . Determinación de concentración de esporas o 36
propáoulos mediante el Hemacitómetro
GUIA 12. Organización y principios de trabajo con técnicas 40
moleculares
Página 2
ANEXO INDICE DE ANEXO PAGINA
1 Anexo 1 . Trabajo aséptico de laboratorio 44
2 Anexo 2. Receta de medios de cultivos ó nutritivos 46
3 Anexo 3. Técnicas de aislamiento de Oomycetes y 50
honaos Fitooatóaenos
4 Anexo4. Técnicas de aislamiento de bacterias 54
fitooatóaenas
5 Anexo 5. Técnicas de extracción de nematodos de 55
suelo v material veaetal
6 Anexo 6. Evaluacion de Sanidad de semillas 58
7 Anexo 7. Técnicas ELISA para detección de Virus 59
fitooatóaenos
8 Anexo 8. Organización y principios de trabajo de 59
laboratorio con técnicas moleculares
Página 3
PRESENTACIÓN
La Universidad Nacional Agraria, (UNA), institución de educación superior que
contribuye al desarrollo agrario, mediante la formación de profesionales y el
Programa de Manejo Integrado de Plagas en América Central PROMIPAC, cuyo
objetivo es fortalecer la capacidad de instituciones agropecuarias en
Centroamérica, ambas instituciones en pro de potencializar las capacidades
nacionales y comprometidas con el desarrollo social y productivo del país, hacen
posible la publicación del presente Compendio de Guias de Técnicas de
Laboratorio.
Con el compromiso de fortalecer las capacidades técnicas de futuros profesionales
y sector agropecuario en general, el Compendio de Guías de Técnicas de
Laboratorio, provee de herramientas para el diagnóstico de enfermedades en
plantas a nivel de laboratorio y práctica de invernadero; están orientadas en una
secuencia, que describen protocolos prácticos, sencillos y de esta forma
desarrollar habilidades y destrezas en los estudiantes, además de brindar
contenidos técnicos-científicos aplicados en investigación concerniente a la
fitopatologia y en el ámbito de la fitoprotección.
Docente investigador DPAF-UNA
Página 4
GUÍA 1 . ORGANIZACIÓN, ESTRUCTURA Y TRABAJO ASÉPTICO DE
LABORATORIO
COMPETENCIA
Aplicar técnicas de laboratorio para el diagnóstico de enfermedades en plantas,
cumpliendo con las medidas de asepsia, procedimientos de protocolos y cultivo
puro de agentes fitopatógenos
SUBCOMPETENCIA
Utilizar equipos, instrumentos, cristalería y pnnciptos del trabajo aséptico en
laboratorio de diagnóstico en enfermedades de plantas.
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCIÓN
Según el trabajo que se realiza existen diversos tipos de laboratorios: clínico
diagnóstico; sanitario-epidemiológico; laboratorios para controlar la elaboración de
preparados bacterianos (antibióticos, vitaminas, productos de leche, pan, cerveza
etc.).
En Universidades y Centros Agropecuarias existen laboratorios microbiológicos,
entomológicos, biología molecular, en estos se estudian el papel e importancia de
ciertas especies de microorganismos en la transformación de substancias, en la
formación de la estructura y fertilidad del suelo, en la nutrición de las plantas,
etcétera. En los laboratorios de patología vegetal, se estudian y se identifican los
agentes causales de enfermedades que afectan a las plantas y la diversidad de
especies y si bien en cada laboratorio se lleva a cabo actividades e
investigaciones específicas, los métodos y principios que se utilizan en estos son
similares.
11. OBJETIVOS
• Manipular equipos, instrumentos, reactivos, cristalería más comunes en
el laboratorio
• Diferenciarlos métodos de esterilización, desinfección, quema y flameo
de cristalería, instrumentos y otros equipos
• Diferenciar la organización de trabajo de laboratorio de diagnóstico de
enfermedades en plantas
• Nombrar instrumentos y cristalería y requerimiento de asepsia
(esterilización, desinfección, flameado, quema)
Página 5
111. MATERIALES
Cristalería: Erlenmeyer, tubos de ensayos, pipetas, platos petri, probetas,
agitadores, papel de envolver, platos petri con medio general de bacterias,
algodón, cloro, alcohol 95 %
Equipos: centrífuga, micro pipetas, cámara de flujo laminar, autoclave, horno,
microscopio, balanza mecánica, asas, mechero, bisturí, tijera, pincho espátula,
vidrio reloj, porta objeto, cubre objeto, pinzas, picetas, fósforo
IV. METODOLODOGÍA
4.1. Normas del trabajo en el laboratorio
Los buenos resultados de un análisis en laboratorios dependen fundamentalmente
de las medidas de asepsia con que éstas se realicen, ya que el medio ambiente
contiene una gran cantidad de microorganismos que pueden contaminar los
cultivos puros o medios nutritivos. Con esta finalidad hay que tener presente las
reglas de seguridad personal, para el trabajo en laboratorios:
1. Trabajar en el laboratorio con ropa especial (bata, gorro, mascarilla,
guantes)
2. No comer, beber o fumar durante el trabajo
3. Trabajar guardando la limpieza, organización y silencio
4. El área de trabajo debe estar desinfectada antes y después
5. Lavar las manos con agua y jabón las manos al iniciar y terminar el trabajo
6. En la mesa de trabajo debe estar sólo material necesario
7. Cultivos de microorganismos usados deben ser colocados en lugar
determinado para este fin
8. Rotular los tubos y platos Petri con medio de cultivo (fecha,
microorganismo, investigador)
9. Mantener el microscopio y otros equipos limpios y en buen estado
10. En caso de cualquier accidente (quemadura, derramamiento de
microorganismos, etc), avisar inmediatamente al profesor, para solucionar
el problema
1 1 . Prohibido sacar del laboratorio cualquier material contaminado sin haber
obtenido instrucciones especiales
4.2. Organización del laboratorio
La organización básica de un laboratorio tiene que contener los siguientes cuartos
o secciones de trabajo: lavandero (cuarto de lavado), cuarto de autoclave, cuarto
para preparación de los medios de cultivos , cuarto de pesado, cuarto de cámara
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de flujo laminar, cuarto de centrifugación, cuarto frío, de destilación de agua y
otras dependencias de acuerdo al tipo de investigación que se realice.
4.3. Cristalería que se utiliza ampliamente en laboratorios
Erlenmeyer graduados, tubos de ensayo, probetas (cilindro), Becker (vaso),
pipeta, pipeta Pasteur, micro pipetas, agitadores, platos Petri, porta y cubre
objetos, vidrio reloj
4.4. Esterilización y desinfección
Esterilización es el proceso mediante el cual se matan o eliminan todos los
microorganismos o sus órganos reproductores. Desinfectar es la eliminación o
neutralización de microorganismos para evitar una infección o avance de los
mismos.
Flamear y quemar, la aguja de transferencia y asa son hechas de cromoníquel
entonces pueden ser quemadas en la llama de un mechero al rojo vivo. Después
se les moja en alcohol etílico 96% (para su enfriamiento)
ACTIVIDADES
• Organizarse en grupos de 4 estudiantes
• Realizar lectura de las reglas de trabajo del laboratorio
• Diferenciar la organización de laboratorio de prácticas, con explicación del
instructor; en grupo de trabajo recorre las diferentes instalaciones
• Limpiar su mesa de trabajo con hipoclorito 1 O %
• Preparar la cristalería (tubos de ensayo, pipetas, platos peri erlenmeyer),
para su esterilización
• Observar e indagar el funcionamiento de autoclave, centrífuga, destilador,
cámara de flujo laminar
• Practicar el rayado simple de bacterias, cumpliendo con las medidas de
asepsia, esterilizar y desinfectar , el profesor realizará la demostración
• Completar la Tabla 1 y marque con una X cuáles instrumentos se flamean,
cuáles se esterilizan y cuáles se desinfectan, socializar y entregar al final de
la práctica
• Leer lectura del Anexo 1 y contestar las preguntas de aprendizajes
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Figura 1. Cámara de flujo láminar para el trabajo
Aseptico de laboratorio
V. PREGUNTAS DE APRENDIZAJES
• ¿Por qué es indispensable trabajar en el laboratorio microbiológico con
ropa especial?
• ¿Cuáles son los métodos de esterilización?
• ¿Cuál es la diferencia entre los términos de esterilización, desinfección y
flameo?
• ¿Cuál es la temperatura y tiempo, para esterilizar cristalería en autoclave?
• ¿Para qué sirve el horno en el trabajo de laboratorio?
• ¿Cómo funciona la cámara de flujo laminar?
• ¿En qué trabajos y para que se utiliza la centrífuga?
• ¿Qué sustancias químicas se utilizan para desinfectar mesas y material
vegetal infectado?
• ¿Cómo está organizado el laboratorio donde usted está realizando esta
práctica?
• ¿Por qué es necesario el uso de agua destilada en los trabajos de
laboratorio?
VI. BIBLIOGRAFÍA
AGRIOS, G.N.; 2002 Fitopatología. Academia Press University of Florida USA
FRENCH, E. Y HEBER T. 1982. Métodos de Investigación Fitopatológica. San
José, Costa Rica. IICA. 154-158 pp.
Página 8
APUNTES
Tabla1. Cristalería, instrumentos, equipos y materiales de laboratorio
Nombre/Cristalería Esterilización Desinfección Flameado Quemar Lavado
/instrumento
Página 9
GUIA 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Ó NUTRITIVOS
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Preparar diferentes medios de cultivos para el crecimiento de hongos y bacterias
fitopatógenas y cumple con los pasos establecidos para su correcta preparación
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCIÓN
Para desarrollarse y multiplicarse los microorganismos deben nutrirse, es decir,
deben obtener del medio ambiente todas las sustancias necesarias para la
síntesis de componentes estructurales de la célula y para la obtención de energía.
Por eso los medios nutritivos ó medios de cultivos tienen que contener las
sustancias nutritivas necesarias en cantidades que corresponden a las
necesidades específicas de un microrganismo (m.o.).
Medios de cultivos: Es un substrato o solución que permite el crecimiento de uno
o más organismos.
Cultivo: Es el producto del crecimiento de un organismo o grupo de organismos
establecido con fines experimentales o industriales.
Cultivo puro: Es el cultivo de un sólo organismo y su progenie. Es un cultivo
clonal de un organismo libre de todo contaminante.
11. OBJETIVOS
• Clasificar los medios, para aislamiento de hongos y bacterias fitopatógenas
• Preparar de acuerdo a la secuencia de preparación de algunos medios de
cultivos
• Vertir PDA en platos Petri estériles, cumpliendo las medidas de asepsia
descritas
111. MATERIALES
Platos Petri esterilizado, agua destilada estéril, maskingtape, parafilm, enlermeyer
de 300ml, 250 mi, biker, cuchillos, pana, agitadores, cinta de pH, probeta, balanza,
agar, PDA, papas, dextrosa, agar-agar
Página 10
IV. METODOLOGÍA
ACTIVIDADES
Lea cuidadosamente las instrucciones relativas a la preparación de medios de
cultivos y asepsia anexo 1 y 2 (Recetas de los medios nutritivos). En grupo de 3-
4 estudiantes, preparar cuatro medios diferentes (PDA, AN, YDC, KING-B).
Calcular de acuerdo a la cantidad-volumen en mi. Las recetas están descritas en
cantidades para 1 000 mi.
• Preparar 250 mi de papa, dextrosa, agar (PDA) (cocción de papas)
• Preparar 150 mi de agar nutritivo ( A.N.) medio general para bacterias
• Preparar 150 mi medio de cultivo King - B para Pseudomonas
• Preparar 200 mi medio de cultivo YDC para Erwinia.
• Medir el pH a cada medio de cultivo
• Esterelizar/autoclavar 120 ºC por 15 min
• Responder por escrito las preguntas de aprendizaje, consultar manual
Métodos de investigación fitopatológica
V. PREGUNTAS DE APRENDIZAJE
• ¿Cómo se clasifican los medios de cultivos (nutritivos) según su origen?
• ¿Cuál es la clasificación de los medios de cultivos según su consistencia?
• ¿Cómo se determina el pH del medio de cultivo?
• ¿Cómo se clasifican los medios nutritivos según el uso?
• ¿Cuáles son las características principales de agar y gelatina?
• ¿A qué exigencias tiene que corresponder un medio nutritivo
• ¿Por qué se utiliza el ácido láctico en el medio general de hongos (PDA)
• ¿ Cuál es el pH favora ble para el crecimiento de los hongos?
• ¿Cuál es el pH favora ble para el crecimiento de las bacterias?
• ¿Cómo se pue de sa ber el pH en un medio de cultivo par a el crecimien to de
hongos y bacterias fitopatóqenas?
VI. B I B L I O GR A FI A
FREN C H, E. Y HE BER T. 1 982 . Métodos de Investi gación Fitopatológica. San
José, Costa Rica . IICA.
Página 11
GUIA 3. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE OOMYCETES Y HONGOS
FITOPATÓGENOS
COMPETENCIA
Aplicar técnicas de laboratorio para el diagnóstico de enfermedades en plantas.
SUBCOMPETENCIA
Practicar las diferentes técnicas de aislamiento de Oomycetes y hongos, de
acuerdo al nivel de parasitismo, tejido vegetal y suelo
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCION
Los Oomycetes y los hongos fitopatógenos según sus hábitos alimenticios tienen
diferentes grados de parasitismo (parásitos facultativos ó parásitos obligados), de
ahí la importancia en el diagnóstico, el macro análisis mediante la observación al
microscopio, de la muestra a procesar o diagnosticar el agente patógeno. De esta
primera valoración se determina la técnica a implantarse para el aislamiento de
estos patógenos de plantas.
11. OBJETIVOS
• Aplicar diferentes técnicas de aislamiento de Oomycetes y hongos
fitopatógenos
• Aislar el patógeno, mediante la obtención de un cultivo monospórico
• Calcular en el aislamiento de dilución de suelo el número de colonias de
hongos y bacterias en 1 O g de suelo ó 1 g de suelo
• Preparar medio especifico para pythium con el uso de antibioticos
111. MATERIALES
Medio de cultivo PDA (esterelizados), platos petri, tubo de ensayos estériles, agua
esterilizada, agitadores, bicker 500 mi, gradillas, pipetas 1 mi, algodón, hipoclorito
5%, Alcohol 95%, bisturí 5, esteroscopios, lactofenol 25%, maskingtape,
marcadores, vidrio relejo, pinzas, bicker 50 mi (5), probetas de 100 mi y 10 mi,
suelo, material vegetal infectado.
Página 12
IV. METODOLOGÍA
1. Trabajar grupos conformados anteriormente. Leer la descripción de las
técnicas en anexo 3.
2. Aplicar las medidas de asepsia/acidificar el PDA esterilizado y verter
3. Describir y anotar los síntomas en plantas enfermas, antes de procesar las
muestras
4. Sembrar en PDA el material vegetal infectado, (marchitamiento en café)
utilizando la técnica (inducción al desarrollo vegetativo/micelial). Sembrar en
dos platos con PDA
5. Con el suelo, a¡licar la técnica de aislamiento de hongos del suelo, utilizar la

5
dilución de 1O y 10 para hongos y bacterias dos platos petri para cada
dilución
6. Observar en el estereoscopio el material vegetal infectado en cámara húmeda
y aplicar la técnica de inducción a la esporulación, Sembrar en un plato por
cada muestra
7. Observar y anota resultados obtenidos con ayuda del profesor
8. Realizar un cultivo monospórico (Anexo 3), para la siguiente práctica de
acuerdo a resultados obtenidos
9. Calcular la Unidades formadoras de colonias según fórmula (Anexo 3)
• ¿Para qué tipos de géneros de hongos se utiliza la técnica de inducción a la
esporulación?
• ¿Por qué se acidifica el PDA para aislamiento de hongos fitopatógenos?
• ¿Cuál es la técnica, para el aislamiento de hongos del suelo?
• ¿Por qué es indispensable sembrar en medio de cultivos para aislar hongos
causantes de marchitez y mal del talluelo?
• ¿Para la siguiente práctica escribir resultados y entrega reporte por escrito en
grupo
• ¿Por qué es importante obtener un cultivo puro originado de una sola espora?
(Cultivo monospórico)
VI. BIBLIOGRAFÍA
CASTAÑO-ZAPATA, J . 1 9 8 6 . Prácticas de laboratorio de fitopatología. Escuela
Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras.
GEORGE, G.N.; 1999. Plant Pathology Academic Press University of Florida.
USA.
GILCHIRST-SAAVEDRA, L.; FUENTES -DAVILA, G.; MARTÍNEZ, C.; LÓPEZ·
ATILANO; DUVEILLER, E,; SINGH, R.B; HENRY, M.; GARCÍA, A, s.f.
Guía práctica par la identificación de algunas enfermedades de trigo y Cebada. CYMMYT.
Segunda edición.
SERGUEICHUK, M. 1986 Guía metodológica para clases prácticas de
microbiología. NI. Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN).
Página 13
GUÍA 4.TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS FITO PATÓGENAS
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Practicar las diferentes técnicas de aislamiento de bacterias, de acuerdo al tipo de
tejido vegetal y suelo
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCIÓN
La mayoría de las bacterias fitopatógenas son difíciles de identificar por rasgos
visibles a través del microscopio, por lo que se hace necesario recurrir a ciertas
técnicas como tínción, espectro nutriclonal, inoculaciones, serología, medios
selectivos y otras pruebas específicas.
Los medios selectivos permiten el crecimiento de solo un determinado tipo de
bacterias, ofreciéndole nutrientes específicos y evitando el crecimiento de todas
las demás bacterias por medio de inhibidores.
El espectro nutricional de las bacterias, se establecen con base a estudios previos,
donde se ha determinado cuáles compuestos pueden ser utilizados como alimento
para determinado género y cuáles no. Por lo tanto al cultivar la bacteria en medios
con composiciones químicas conocidas se podrá saber el tipo de crecimiento y
ciertas reacciones químicas, para su identificación.
Las pruebas serológicas se han convertido en una de las técnicas más rápidas
para determinar la identidad de las bacterias. En estas pruebas se utilizan
diferentes sueros con anticuerpos específicos para cada una, los cuales
reaccionan solo en presencia de la bacteria correspondiente. La inoculación de
una bacteria desconocida en algunas especies o variedades, permite su
identificación por cuanto se conoce previamente que esos hospederos específicos
solo se infectan con determinadas bacterias y no con otras.
Las bacterias Gram positivas son las bacterias que se tiñen con cierto colorante
(violeta cristal) y todo tan firmemente que el alcohol no las destiñe con facilidad,
por el contrario, las gram negativas pierden el color por el lavado del alcohol. Son
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gram positivas los géneros Corynebacterium y Estreptomyces y gram negativas
Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas.
Las técnicas para aislar e identificas las bacterias fitopatógenas es muy distinta de
la utilizada para los hongos, ya que por su tamaño, las bacterias no pueden ser
identificadas por medio de observaciones al microscopio, ó a través de montajes
temporales.
11. OBJETIVOS
• Practicar dos técnicas para aislar bacterias fitopatógenas de material vegetal
infectado, para la obtención de un cultivo puro
• Practicar diferentes tipos de rayados bacterianos, a fin de obtener colonias
individuales
111. MATERIALES
Microscopios compuestos, porta - objetos, papel filtro, asa - bacteriológica,
algodón, cloro, medios agar nutritivo, King-B, YDC.
IV. METODOLOGÍA
• Concluir con resultados del laboratorio anterior.
• Verter agar agua y hacer transferencia de las siembras de hongos, previa
selección, para la obtención de un cultivo puro, con la técnica de cultivo
monospórico. (Anexo 3)
¿Cómo confirmar que la muestra a procesar ha sido infectada por una bacteria?
Mediante la observación al microscopio con fondo obscuro. Para esto cortar un
pedazo de hoja de aproximadamente 3 x3 mm, de la zona entre tejido sano y
tejido necrótico. Preparar un portaobjeto con una gota de agua estéril, colocar en
el trozo de hoja y cubrir con un cubre objeto. Usar un campo obscuro en el
microscopio, con el objetivo de baja magnificación, observar el exudado
bacteriano, proveniente de tejido enfermo (flujo continuo de puntitos blancos)
• Verter medios de A.N, YDC y King-B en platos petri esterilizados (3 platos de
cada medio de cultivo)
• Describir los síntomas de las muestras a procesar
• Usar los medios diferenciales para aislar géneros de Erwinia y Ralstonia
• Practicar realizar un rayado bacteriano/ procedentes de la siembra de dilución
• de suelo
• Practicar los métodos de aislamiento de bacterias fitopatógenas(Anexo 4)
• Realizar diferentes tipo de rayado bacterianos
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• Obtener cultivo puro, mediante la obtención de colonias individuales (próximo
laboratorio de acuerdo a resultados obtenidos).
• Hacer subcultivos para obtener un cultivo puro por medio de estriados por
dilución. Una colonia pura se obtiene multiplicando una célula que fue
separada de las otras por medio del estriado de dilución.
¿Cómo se realiza una tinción simple y con qué finalidad se utiliza en la
identificación de las bacterias fitopatógenas?
Explique cómo realizó el método de dilución en serie en el aislamiento de
bacterias fitopatógenas
VI. BIBLIOGRAFÍA
GILCHIRST-SAAVEDRA, L.; FUENTES -DAVILA, G.; MARTÍNEZ, C.; LÓPEZ
ATILANO; DUVEILLER, E,; SINGH, R.B; HENRY, M.; GARCÍA, A, s.f. Guía
práctica par la identificación de algunas enfermedades de trigo y Cebada.
CYMMYT. Segunda edición
SCHAAD, N.W. 1994. Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria. Second Edition. St. Paul, Minnesota: American Phytopathological
Society, página 157
Apuntes
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GUÍA 5.TECNICAS DE EXTRACCIÓN DE NEMATODOS DE SUELO Y
MATERIAL VEGETAL
Dra. Isabel Herrera Sirias
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Practicar diferentes técnicas de extracción, de nematodos fitoparsitos de tejido
vegetal, raíces y suelo
Tiempo:4 horas
!.INTRODUCCIÓN
La separación y conteo de los nematodos en un volumen de suelo, es la operación
indispensable para cualquier estudio de estos microorganismos. Es por ello que
esta actividad resulta esencial para poder evaluar el nivel de infestación que
presentan las muestras en un momento dado.
Desafortunadamente, hasta el presente no existe ningún método que permita
extraer eficientemente todos los tipos de nematodos del suelo y del tejido vegetal.
Para la extracción de nematodos muchas técnicas y modificaciones han sido
estudiadas, tomándose en cuenta cuatro factores:
1. Fácil y segura manipulación
2. Extracción eficiente
3. Ahorro de tiempo
4. Suspensión de los nematodos, libres de partículas orgánicas e inorgánicas.
Para la extracción de nematodos de material vegetal y de suelo se utilizan algunas
características de los nematodos entre ellos: la forma, el movimiento, el peso
específico (1.084 g), geotaxis positiva y coloración diferencial.
Existen alrededor de 10 métodos que pueden utilizarse en la extracción de
nematodos. Para fines de estudio, en esta práctica se utilizará el método de
tamices más filtro de algodón y centrifugación-flotación para el caso de nematodos
de suelo. En el caso de nematodos que se encuentran en el tejido vegetal, se
realizará el método de Licuadora más tamices e Incubación utilizando el
Humificador.
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11. OBJETIVOS
• Aplicar los procedimientos a seguir para la extracción de nematodos de suelo y
de material vegetal.
• Analizar los principios en los que se basan los métodos de extracción
• Diferenciar las ventajas y desventajas de los métodos de extracción de
nematodos estudiado
• Calcular la población de nematodos en 200 g de suelo
• Analizar la organización y equipamiento del laboratorio de Nematología
111. MATERIALES
Suelo, raíces con nematodos, tamices de extracción, platos de extracción, pichel
plástico. tamices: 0.045. 0 . 1 OO. 0.250 y 0.425 mm de diámetro. licuadora. filtros de
algodón. tijeras, papel toalla. beaker. pipeta. piceta, balanza. vasos de vidrio de
100 mi
Figura 2 Instrumentos de trabajo para extracción de nemátodos
IV. METODOLOGÍA
Se conformarán 4 grupos de trabajo, cada grupo aplicará una técnica de
extracción y explicará al resto de los grupos de trabajo. Las técnicas, que se
aplicarán se describen en (Anexo 5)
• Extracción de nematodos del suelo
• Extracción de nematodos de material vegetal
• Extracción de nematodos con el método centrifugación-flotación
• Extracción de nematodos con método de incubación o humificador
En el método de centrifugación-flotación, se procederá hacer lecturas en la
cuadriculas de conteo de nematos y posterior calcular la población de nematodos
en 200 g. de suelo, procesado.
Procedimiento para el conteo de poblaciones de nematodos
1 . Se toman 100 ce de la solución con nematodos
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2. Se observará en el microscopio 2 ce para cada cuantificación de esta
solución en cuadriculas de conteo de nematodos
3. Con los resultados obtenidos en el paso 2 calcular la población en ce.
Ejemplo Si en 2 ce ---- 1 nematodo
100 ce ---- X
Figura 3. Cuadricula de conteo de nematodos
• ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos estudiados?
• ¿Cuáles son los principios en los que se basan estos métodos
• ¿Cuál es el indicativo más importante para saber que el cultivo está siendo
afectado por nematodos
• ¿Qué consideraciones haría usted para asegurar que las muestras tomadas
sean de calidad, empezando desde la obtención de la muestra hasta la
extracción de los nematodos en el laboratorio?
• Considera usted que el etiquetado de las muestras, es poco importante o muy
importante? Razone su respuesta.
• ¿Qué características de la biología de los nematodos hace qué sea necesario
extraer nematodos del suelo y de material vegetal?
VI. BIBLIOGRAFÍA
HERRERA, I; BIJLMAKERS, H. 1993. Manual de Prácticas. Escuela de Sanidad
Vegetal. Universidad Nacional Agraria. 44 pág.
S'JACOB, J.J. ANO BEZOOIJEN, J. 1984. Manual far practica! work in Nematology.
Department of Nematology Agricultura! lniversity. Waningen, The Netherlands. 77
p.
Página 19
GUÍA 6. EVALUACIÓN DE SANIDAD DE LA SEMILLA
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Determinar la sanidad de la semilla, mediante la aplicación de técnicas de
detección de microorganismos en semilla
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCIÓN
Todos los productos agrícolas son invadidos por diversos microorganismos
durante su desarrollo en el campo, siendo los hongos y las bacterias los más
abundantes y la principal causa de enfermedades, ocasionando severas pérdidas
económicas al reducir el potencial fisiológico de los granos.
En particular los granos y semillas son invadidos por diversos hongos en el
campo, entre ellos Fusarium, A/ternaria, Cladosporium, Helminthosporium y
muchos otros que causan enfermedades a las plantas y que son transmitidos de
un ciclo a otro a través de las semillas. Por otra parte, también los granos y las
semillas son invadidos por hongos cuyo hábitat natural no es el campo sino el
almacén, siendo principalmente especies de Aspergillus y Penicil/ium. Algunas
bacterias, pueden conservarse en el interior de la semilla, siendo estas inóculos
primarios de infecciones en el campo.
Una característica diferencial de requerimientos de agua para hongos y bacterias
de campo y almacén; es que las humedades relativas para estos patógenos en el
campo es 90 al 100%, en cambio los patógenos del almacén pueden crecer en
humedades relativas de 65 a 90 %, condiciones muy frecuentes en el
almacenamiento de granos.
Las reglas lnternational Seed Testing Association (ISTA) establecen, que
normalmente la muestra de trabajo para un análisis de sanidad no deberá ser
menos de 400 semillas puras.
11. OBJETIVOS
• Aplicar técnicas de detección y aislamiento de m.o. en semillas
• Demostrar la presencia de m.o.( hongos y bacterias) siembra con el
endosperma de la semilla hacia el medio de cultivo
• Cuantificar el porcentaje de semillas infectadas por hongos y bacterias
• Analizar el rol de los diferentes hongos y bacterias encontrados
• Valorar la calidad fitosanitaria de la semilla
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• Aislar al patógeno en semilla y obtener cultivo puro
111. MATERIALES
Platos Petri esterilizados, hipoclorito de sodio al 1 %, Papel filtro esterilizado,
marcadores, semillas de sorgo maíz y fríjol, agar agua (AA), agua destilada estéril
(ADE), pinzas, vidrio reloj, bisturí papel servilleta,
IV. METODOLOGÍA
Aplicar las siguientes técnicas
4.1.En 25 semillas partir la semilla de frijol por la mitad desinfectarla con
hipoclorito de sodio 1 % o alcohol histológico 98 % durante 2 minutos, seque las
semillas en papel filtro y sembrar 1O mitad de semilla en medio de agar agua
(AA), que haga contacto de la parte interna de la semilla con el medio, que queden
bien distribuidas en todo el medio
4.2. Aplicar la técnica de inducción a la esporulación con el uso de papel filtro,
utilizar 50 semillas desinfectadas y 50 semillas sin desinfectar leer metodología
descrita en el anexo 6. En semillas de maz, sorgo y tomate
4.3 . E v al u ar al segu ndo día des p u é s de a

l siembra, para anotar crecimient o
b acteriano. A los 7 da
í s crecimiento fun g oso, se gú n informa ión
c sol citada
i en
Tabla 3
4 4.. C on ayu da del pro esor f ide nt ificar los g é nero s de hon os
g y bacterias
nc dentes
i i e n el an á i l sis de sanidad de semilla . Recono cer el creci m iento
bacteriano y fungoso .
4.5. V alorar y anotar en (T abla 3) en sus apuntes sobre la c alidad fit osanitaria de
la semilla, se gú n resultados obtenidos en el laboratorio
4. 6 . R ealizar monta es de hongos j y b acterias, se gú n se han reali z ado en pr ác ticas
anteriores, para reconocer los gé neros m s incidentes

á
4. 7 Realiza t rans erenc a de hongo o ba

f i ter a
c i , para la o b tención de culti v o puro
• • • • .. •
l
• • .... • • •
�
'
..,•
, , •
.. • • •
1
..
• .. -»
Figura 4. Método de detección de microorganismos en semillas
Uso de cámara húmeda (Semillas de sorgo)
Página 21
V.PREGUNTAS DE APRENDIZAJE
¿Cuáles fueron los géneros de hongos más incidentes en el análisis fitosanitario
de las semillas de fríjol y tomate?
¿Cuál grupo de microorganismo que predominó en las semillas? Se consideran
microorganismos de campo o de almacén
V. BIBLIOGRAFÍA
INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION (ISTA). 1996. lntemational
Rules for Seed Testing. Rules 1996. Seed Sci. and Technol. 24 Suplement, Roma.
pp 335.
TORRES T. M.; 2002. Control de calidad de semillas. Centro Nacional de
investigación Agropecuaria/ CNIA-INTA. Managua, Nicaragua.
Tabla 3. Evaluación de la sanidad de semilla
Porcentaje Porcentaje Porcentaje

Número de semillas
semillas de semillas de semillas
Semilla / método afectadas
infectadas sanas aerminadas
Honqo Bacteria
Apuntes
Página 22
GUÍA 7.TÉCNICAS DE INOCULACIÓN DE BACTERIAS Y HONGOS
FITOPATÓGENOS
COMPETENCIA
puro de agentes fitopatógenos.
SUBCOMPETENCIA
Demostrar mediante diferentes técnicas de inoculación la patogenicidad de
hongos y bacterias, cumpliendo con los postulados de Koch
Tiempo: 8 horas
l. INTRODUCCIÓN
Patogenicidad es la capacidad de ciertos organismos para incitar el desarrollo de
una enfermedad infecciosa. Para comprobar la capacidad patogénica de los
microorganismos se cumple con cuatro pasos bien definidos llamados postulados
de Koch (Robert Koch, 1843-1810). Estos son:
1. El organismo sospechoso de causar la enfermedad debe encontrarse
asociado, en forma consistente, a especímenes con la sintomatología de la
posible enfermedad
2. El organismo debe aislarse en un medio nutritivo y obtenerse como cultivo
puro, para registrar sus características morfológicas, bioquímicas o
moleculares
3. El organismo debe inocularse en plantas sanas de la misma especie o
variedad donde se observó originalmente el problema y debe producirse los
mismos síntomas observados al iniciar el proceso
4. El organismo debe ser reaislado a partir de la planta inoculada en cultivo
puro y sus características deben corresponder a las observadas en el
segundo postulado
11. OBJETIVOS
• Demostrar la importancia de las heridas en la penetración y establecimiento de
las bacterias fitopatógenas
• Practicar dos métodos de inoculación para hongos del suelo en dos momentos
definidos (siembra y 7 días después de la siembra (dds)
• Obtener el cultivo puro del patógeno inoculado (bacteria y hongo)e ilustrar los
postulados de KOCH
Página 23
111. MATERIALES
Suelo estéril, maceteras, jeringas, agua destilada estéril, cepas de Xanthomonas y
Pseudomonas. (24 a 48 edad) Fusarium o Rhizoctonia, tubos de ensayos
etiquetas, asas, aspersor De Vilbiss., cuchillas, bolsas plásticas, semillas de
tomate y frijol
IV. METODOLOGÍA
Esta práctica se llevará a efecto a nivel de invernadero, en la cual se establecerá
las siembras de los cultivos de frijol y tomate
4.1. Inoculación de bacteria realizando heridas a plantas en hojas con
(Xanthomonas)
En plantas de frijol inocule los trifolios con X. campestris pv. pheseot: haciendo
cortes con una cuchilla previamente sumergida en la suspensión bacterial.
Deposite 1O mi de agua destilada estéril en cada una de las cajas Petri con
cultivos de Xanthomonas campestris pv. phaseo/i. Con la ayuda de una asa
esterilizada en la llama remueva las células bacteriales y mézclelas con el agua
destilada estéril (ADE) de tal manera que el agua se enturbie.
4.2. Inoculación por aspersión en hojas con (Xanthomonas)
En plantas de frijol inocular asperjando la suspensión bacterial con (Xanthomonas)
sobre el follaje con el aspersor De Vilbiss.
4.3. Inoculación de bacteria realizando heridas a plantas en la axila con
(Pseudomonas)
4.3.1. Con plantas de frijol y con la ayuda de un gotero/jeringa deposite una gota
de la suspensión de Pseudomonas solanacearum en la axila de la tercera hoja
/hoja bandera Introduzca la aguja de disección varias veces dentro del tallo a
través de la gota de suspensión bacterial,
4.3.2. Inocular plantas depositando una gota de suspensión de P. solanacearum
en la axila de la tercera hoja.
Finalmente, inocular en hojas plantas con agua destilada estéril haciendo cortes
con la cuchilla y por aspersión. Inocular plantas con agua destilada estéril
introduciendo la aguja dentro del tallo y depositando una gota de agua destilada
estéril, estas servirán como testigos. Este tipo de inoculación con agua destilada
estéril, deberá realizar antes de manipular las cepas bacterianas y estar ubicadas
apartes de las plantas inoculadas con los patógenos
Página 24
Una vez inoculadas las plantas, se deben colocar dentro de la cámara húmeda
durante 24 horas. Siete días después de la inoculación se empiezan a observar
los primeros síntomas. Observar con cuidado los síntomas desarrollados por cada
bacteria y realizar anotaciones.
4.4. Inoculación de hongos causantes de marchitamientos vasculares
4.4.1. En el caso de hongos del suelo como Fusarium sp/ Rhizoctonia, colocar
discos de 5 cm de diámetro, del micelio del hongo (3 discos) a la orilla de la
semilla (tomate) al momento de la siembra.
4.4.2. Hacer una suspensión del crecimiento micelial del hongo con agua estéril
remover. Luego escarbar en a la orilla de la siembra de la semilla en un punto y
vaciar el contenido de la suspensión. Al momento de la siembra.
4.4.3. Inocular plantas con ADE, escarbar en a la orilla de la siembra de la semilla
en un punto y vaciar el contenido de la suspensión. Al momento de la siembra.
Plantas testigos
4.4.4. Siete días después de la siembra inocular Fusarium en plantas de frijol
usando el método de vaciado del patógeno al suelo
Actividades
En grupo de estudiantes organizarse, para realizar la siembra en los siguientes
(tratamientos/inoculaciones)
1. Establecimiento de la siembra de frijol y tomate. Cada tratamiento antes
descrito estará compuesto por 5 plantas con sus respectivas plantas
testigos
2. Realizar inoculaciones de hongos del suelo al momento de la siembra con
disco y vaciado de la suspensión del micelio del hongo
3. Siete días después de la siembra realizar la inoculación para los hongos de
suelo
4. Dos semanas después de la siembra (dds), realizar las diferentes variantes
de inoculaciones con las bacterias de Xanthomonas y Pseudomonas
5. Regar por la mañana o por la tarde diario las plantas. En los primeros días
valora la siembra, la germinación
6. Se aplicará fertilizante de completo al momento de la siembra.
7. A los 8 días después de la siembra (dds), se registraran datos de síntomas
observados en plantas inoculadas con patógenos de suelo
8. En caso de presentarse insectos se realizará aplicaciones de insecticidas
dentro y en las rondas del invernadero
Página 25
9. Treinta días después de la siembra (dds)se finaliza la observación de los
datos
1 O. En los tratamientos donde se presentaron síntomas, proceder a aplicar las
técnicas de aislamiento comunes para hongos y bacterias, a fin de
confirmar y obtener el mismo patógeno que se aisló. Postulados de KOCH
1 1 . A n a l i z a resultados con el profesor
12. R e c o g e rtodo el material utilizado en la práctica y dejar limpio y en orden
1 3 . Entrega un reporte escrito con todos los componentes de un reporte formal
(Introducción, objetivo, metodología, resultados y discusión, conclusiones y
bibliografía)
• ¿Cuál fue la mejor técnica de inoculación de bacterias? Explique su respuesta
• ¿Cuál fue la mejor técnica de inoculación de hongos de suelo?
• ¿Cuáles fueron los síntomas en inoculaciones con patógenos de suelo? Cómo
verificamos la acción patogénica de estos hongos. Fusarium y Rhizoctonia
VI.BIBLIOGRAFÍA
AGRIOS, G . N . ; 2002 Fitopatología. Academia Press University of Florida USA
CASTAÑO-ZAPATA, J. 1986. Prácticas de laboratorio de fitopatología. Escuela
Agrícola Panamericana, Zamorano Hondura.
FRENCH, E. Y HEBER T. 1982. Métodos de Investigación Fitopatológica. San
José, Costa Rica. IICA. 154-158 pp
Apuntes
Página 26
GUÍA 8. TÉCNICA ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE
VIRUS FITOPATÓGENOS
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Aplicar técnica serológica-ELISA para determinar presencia de virus fitopatogenos
l. INTRODUCCIÓN
Los virus que atacan a las plantas se diferencian de los demás fitopatógenos por
su tamaño y forma, su constitución química (ácido nucleico y proteína) y
estructura física, método de infección, propagación, translocación dentro del
hospedero, diseminación y sintomatología.
Por su tamaño tan pequeño (medido en nanómetros), los métodos para la
detección de virus en plantas se basan principalmente en la transmisión los virus
de una planta enferma a una sana por medio de la savia, injertos, plantas
parásitas o insectos, hongos y ácaros. Sin embargo la prueba definitiva de la
presencia de un virus solo se logra después de su purificación, la visualización de
su imagen en microscopio electrónico y/o pruebas serológicas y ácido nucleico.
La técnica ELISA (Enzyme Linked lmmunosorbent assay) (Figura 1) es un método
muy confiable y poco costoso para detectar los virus. Los anticuerpos específicos
de las diferentes variantes se pueden comparar y son de fácil utilización. Aunque
es ideal tener un espectrofotómetro para la lectura de la densidad óptica del
producto de ELISA, la diferenciación de muestras negativas y positivas se puede
hacer sin este equipo. La técnica ELISA es rápida y tiene la ventaja de diferenciar
entre las variantes del virus sin depender de que haya una buena expresión de los
síntomas (Anexo 7)
11. OBJETIVOS
• Demostrar mediante el uso de métodos serológicos la presencia de virus
fitopatógenos
• Aplicar ta técnica serológica específica para virus fitopatogena cumpliendo
con los procedimientos de protocolo descrito
• Preprar soluciones de acuerdo a protocolo descrito y número de muestras a
preparar
111. MATERIALES
Plantas enfermas, kid ELISA, reactivos específicos de acuerdo al método a
utilizarse
Página 27
IV. METODOLOGÍA
El procedimiento se realizará en una placa de múltiples pocillos sobre la que se
fijan los anticuerpos de interés. Al añadir la muestra que contiene el antígeno
complementario se produce una unión que se puede detectar mediante la adición
de un segundo anticuerpo contra el mismo antígeno, éste marcado con una
enzima que al añadirle un substrato se hidroliza dando una reacción de color. La
intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de antígeno
presente en la muestra analizada (Figura 3).0rganizarse en grupos de 4
estudiantes
Colecta plantas enfermas de tomate con síntomas de virus
Seguir los pasos descritos en protocolo del método ELISA Directo
1 2
Figura s. Placa multipocillo "Técnica ELISA" Figura 6. "Placa multipocillo ELISA"
Con reacción de color
Pocillo Añadido de Añadido de Añadido de
tapizado muestra anticuerpo sustrato par a la
unido a enzima enzima
..
3
Figura 7 .Principios de "Técnica ELISA"
Se aplicará las técnicas de EUSA, de lnmuno impresión de impresión de tejidos y
Elisa sándwich, cumpliendo con los protocolos para tal fin.
ingehio.cl
2
notícíasccc.com
1
blo s.crcamoselfuturo.com
Página 28
ºº
Figura 8. Principios de detección de virus "Esquema Elisa"4
• ¿Cuál es la diferencia entre el método ELISA Directo e Indirecto?
• ¿Cuál es el principio de la Técnica ELISA?
VI. BIBLIOGRAFÍA
ROSALES, M . I . ; Diagnóstico de Enfermedades en plantas. Uso de herramientas
moleculares. Unidad de Biotecnología INIA-CRI La Platina. Fundación para la
innovación agraria (FIA) y el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA)
4
apsnet.org
Página 29
GUÍA 9. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Obtener cultivos puros de hongos entomopatógenos, aplicando técnicas básicas
de aislamiento de microorganismos
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCIÓN
Los hongos entomoptógenos tienen la habilidad de sobrevivir en materia orgánica,
suelo, plantas e insectos que atacan. Existen más de 700 especies reunidas
aproximadamente en 100 géneros. El género de hongo Beauveria ha sido muy
estudiado como un controlador biológico de muchas plagas insectiles. El hongo
entra a través de la cutícula del insecto, principalmente por las partes frágiles
mediante la acción de procesos físicos y químicos producidos durante la
germinación y penetración. Otra vía de entrada es a través del tracto digestivo
pero, generalmente los conidios no pueden germinar en el intestino.
La multiplicación del hongo en el interior del hospedero conduce a la producción
de hitas y toxinas que provoca la enfennedad y muerte del insecto.
Los insectos muertos por Beauveria y otro género de hongo entomopatógeno
presentan et hongo encima del cuerpo, el cual tiene aspecto algodonoso de color
blanco principalmente en las partes más suave del cuerpo del insecto. Estos
insectos se pueden colectar en campo, para luego reproducirlos y utilizarlos en
grandes cantidades.
11. OBJETIVOS
• Aplicar las técnicas básicas para el aislamiento de hongos entomopatógenos
• Obtener un cultivo puro de diferentes hongos entomopatógenos
111. MATERIALES
Platos con PDA. azas, bisturí, alcohol, mechero, papel filtro, insectos colectados
infectados, tubo de ensayos, papel parafina, pinzas
Página 30
IV. METODOLOGÍA
La fuente de inoculo de insectos infectados puede ser
1 . Insecto infectado naturalmente en el campo
2. Inoculación artificial al insecto en el laboratorio (se coloca el insecto en
cámara humedad para hacer esporular el hongo)
4.1. Aislamiento por dilución seriada
Consiste en colocar las fuentes de inoculo (insecto infectado) en un tubo de
ensayo que contiene 1O mi de agua destilada estéril con 0.01 % de tween 80,
luego se agita durante 1 minuto. A partir de la dilución (solución madre se
2, 3, 4 5. 6
preparan diluciones en serie (10-1, 10 · 10 · 10 ·· 10 · 10 ' ). La segunda
dilución se obtiene transfiriendo con una pipeta estéril de 1 mi de la solución
madre a un tubo que contiene 9 mi de agua destilada estéril, luego se agita
fuertemente y así sucesivamente se repite el proceso hasta lograr obtener las seis
diluciones en serie.
En las diluciones se procede a sembrar en plato Petri con medio nutritivo, se
recomienda realizar de 3 a 4 repeticiones de siembra por cada dilución tomando
0.1 mi por gota sembrada.
4.2. Aislamiento directo del hongo en el insecto
Este tipo de aislamiento puede ser de 2 formas
Raspando partículas del hongo de un insecto infectado con una asa bacteriológica
y tocando en un medio nutritivo
Agarrando con una pinza seca y estéril el insecto esporulando y agitando con
movimiento sobre la superficie del medio de cultivo
Actividades
1 . Salida al campo (REGEN-UNA). Buscar/Recolectar larvas infectadas. En
cultivos agrícolas (Esta tarea realizarla por la mañana.). Trabajar en grupo
(preferiblemente un día antes y colocar en cámara húmeda en un plato
Petri)
2. Visitar al laboratorio de hongos entomapatógenos (charla corta/interactiva y
recorrido de las instalaciones)
3. Practicar métodos de aislamiento de hongos entomopatógenos
4. Obtener un cultivo puro
¿Cuál es la técnica de aislamiento más eficiente y por qué?
¿Cuáles son las diferencias en la estructura y organización del laboratorio de
hongos entomopatógenos?
Página 31
VI. BIBLIOGRAFÍA
MONZÓN, A.; ZAMORA, M. 2004. Producción y uso de Beauveria bassiana para
el control de plagas. Universidad Nacional Agraria. Facultad de Agronomía.
Apuntes
Página 32
GUÍA 10. CALIBRACIÓN DE MICROSCOPIO
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Determinar el valor micrometrado a fin de medir la longuitud de las esporas y
relacionar con las características morfológicas de la especie en estudio
Tiempo: 4 horas
l. INTRODUCCIÓN
La unidad de medida en microscopia es de 0.001 mm (= 1 micra) y se conoce con
el nombre de micra (µ).
Cuando examinamos un hongo, una célula bacteriana, un nematodo fitoparásito,
un insecto etc., para determinar a qué especie pertenece es de importancia
determinar el tamaño de sus estructuras: esporas, cuerpos fructíferos,
conidióloros, longitud y ancho de la estructura en estudio etc. Para ellos nos
servimos de un micrométrico ocular, que consiste una lámina redonda
transparente que se coloca en el ocular del microscopio, con una escala graduada,
para realizar las mediciones.
Debido a que los aumentos varían de un microscopio a otro, las escalas de los
micrómetros oculares no representan medidas convencionales, sino simples
unidades. Para determinar la distancia lineal que representa cada unidad o sea el
valor micrométrico, deben efectuarse calibraciones para cada aumento de un
microscopio. Se emplea para tal fin un micrómetro objetivo o micrométrico de
platina que es similar a un porta objeto y tiene grabada una escala que representa
medidas exactas y convencionales.
Generalmente se emplea un micrómetro objetivo cuya escala comprende de 100 ó
200 divisiones de 0.01 mm.
11. OBJETIVOS
• Calibrar el microscopio a fin de realizar mediciones en el microscopio
• M edir dos especies diferentes de hongos
• Indagar acerca de a medición de la especie en estudio

l
Página 33
111. MATERIALES
Microscopio, micrómetro objetivo, micrómetro ocular, porta objeto, cubre objeto,
asas, cultivo de hongo, papel toalla, pizetas, lactofenol azul, servilletas para
limpieza de lentes
IV. METODOLOGÍA
Para obtener el valor micrométrico del microscopio, examinamos el micrómetro
objetivo, el cual colocamos en la platina del microscopio, luego utilizando el
micrómetro ocular procedemos a determinar el valor numérico. Es necesario usar
primero el objetivo de bajo poder para ambas escalas sean visibles. El micrómetro
ocular se gira hasta que las líneas de la escala sobre el disco aparecen y quedan
paralelas a las líneas o divisiones del micrómetro objetivo. Luego observamos
cuántas divisiones del micrómetro objetivo son cubiertas por una o varias del
micrómetro ocular. Establecido este dato, se determina la fórmula o valor
micrométrico.
Por ejemplo, si la división 1 O del ocular, cubre cuatro unidades del objetivo, una
unidad o división del ocular representará: 4 X 0.01 mm I 1 O = 0.004 mm = 4
micras. Cada división 1 O del micrómetro ocular vale por tanto 4 micras para la
combinación óptica con que se trabaja. Por consiguiente, el valor micrométrico
(VM) en micras se obtiene así:
Valor mtcrométncoeisivisiori del micrómetro ob¡etivo en micras X 1000
División del micrométrico ocular
Se debe calcular el valor micrométrico para el objetivo que se va a utilizar
Una vez hallado este valor, se retira micrométrico de la platina, y en su lugar se
coloca la preparación en la cual queremos verificar las mediciones.
Para usar el micrométrico ocular, enfocarlo sobre un objeto a ser medido (esporas
de hongos) mover el porta objeto hasta que el espécimen se alinee exactamente
con el extremo de la escala del ocular. Contar cuantas unidades está ocupando el
espécimen y multiplicarlo por el valor ya calculado.
Por ejemplo si el espécimen ocupa 6 unidades con el valor numérico hallado en el
ejemplo anterior tendremos: 6 x 4= 24 micras. Este valor será la dimensión del
objeto.
Al trabajar con un objetivo de mayor aumento y medimos el mismo espécimen de
nuevo. Encontramos que éste será más grande. Esto no puede ser verdad.
Obviamente la escala para cada lente de objetivo es diferente. Debemos repetir e
Página 34
procedimiento de calibración o sea obtener el valor micrométrico para cada
objetivo del microscopio
Actividades
Calibración del microscopio
Hallar el valor micrométrico
Realizar mediciones de 50 esporas diferentes. Sacar promedio y encontrar el
tamaño de longitud de la espora a medir.
Consultar bibliografía de la medición del género de hongo en estudio
pi ji j I j ! j ¡¡.j.��
o
D
o
Figura 9. a. "Micrometro ocular
5
b.Micrometro objetivo"
• ¿Por qué es necesario encontrar el valor micrométrico, para objetivo del
microscopio?
• ¿Por qué es importante medir la longitud y ancho de una estructura de un
patógeno o insecto?
• Coincide la medición de la especie en estudio, con la reportada en la literatura,
explique su respuesta
VI. BIBLIOGRAFÍA
CASTAÑO, J. Z. 1986. Prácticas de laboratorio de fitopatología. Departamento
De Protección Vegetal. Proyecto Al O/Honduras Publicación MIPH-EAP
Apuntes
5
rismacontrol.es
Página 35
GUÍA 1 1 . DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ESPORAS O
PROPÁGULOS MEDIANTE EL
HEMACITÓMETRO
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Cuantificar la cantidad de esporas por mi, cumpliendo con el protocolo descrito y
normas de uso y manejo del Hemacitómetro
Tiempo: 4 horas
!.INTRODUCCIÓN
Para realizar pruebas de inoculación cuantificadas es necesario conocer el
número de unidades de infección en el inóculo. Una técnica es contar el número
de esporas en el Hemacitómetro.
El Hemacitómetro es una pieza de vidrio en forma de H con dos cámaras de
conteo. El fondo de cada una de las cámaras tiene un rayado de 9 mm

2
dividido en 9 cuadrados principales de 1 mm por cada lado. El mm del
centro está dividido en 25 grupos de 16 cuadrados pequeños cada grupo
está separado por líneas triples. Las superficie reticular se encuentra a
0 . 1 m debajo del cubreobjetos, por lo tanto, el volumen del líquido sobre 1

2 3
mm es 0.1 mm .
El cubre objeto es grueso para impedir que se hunda el centro en su parte no
sostenida, lo cual reduciría el volumen de las cámaras. Para su uso se coloca el
cubre objeto limpio sobre la cámara de conteo de tal manera que llegue a estar en
contacto con los altorrelieves de la cámara. Con la ayuda de una pipeta deposite
una gota de la suspensión de esporas en el margen del cubre objeto y el área
reticular del portaobjetos. Permitir que se asienten las esporas durante 1 O 2
minutos y observe la distribución de las esporas. Estas deben estar de manera
uniforme distribuidas en todos los cuadrados de la cámara.
2
Las esporas pequeñas se cuentan en el mm central, el cual está compuesto de
2
25 grupos de 16 cuadrados pequeños. Cada uno de estos grupos mide 0.04 mm
Contar el número de esporas en los 4 grupos de las esquinas central. Sumar el
total de esporas en los 5 grupos y calcular el número de esporas /mi de la
siguiente manera
3
0.2 mm X0.2 mm X 0 . 1 mm= 0.004 mm
Página 36
X= E/5 X1/0.004
X= X 50 en donde, X= Número de esporas /mi

2
E= Esporas en los 5 cuadrados de 0.04 mm
3
1 mi (cc9=1000 mm
X=EX 50X 100
X= E X 50 000 em donde, X= Número de esporas /mi

2
E = Esporas en los 5 cuadrados de 0.04 mm
Las esporas grandes se cuentan en 5 cuadrados principales de 1 mm de lado; Los
cuatro de las esquinas y el central. La constante a multiplicar es 2000.
6
Figura 1 O. Contador de esporas "Hemacitómetro de Neubauer"
11.0BJETIVOS
• Usar el hemacitómetro, para cuantificar la concentración de esporas grandes y
pequeñas en mi
• Aplicar las reglas de conteo de esporas, según protocolo descrito
• Determinar concentración de esporas mi
• Calcular concentraciones de esporas
6
html.rmcondelva o.com
Página 37
111.MATERIALES
Cultivo pura con esporas de Fusarium, pizeta, tubo de ensayo, gradillas, pipetas
Pasteur, pañuelos para lentes de microscopio, papel toalla, lactefonol 25 %, porta
objeto, cubre objeto, agua destilada estéril
IV.METODOLOGÍA
1 . Preparar en agua una suspensron de los propágalos a contar, de mayor
concentración que la deseada. Si los propágalos tienden a permanecer
unidos o aglomerados agregar un detergente Tween 80 a razón de 250
ppm; mezclar y agitar. El volumen total original en mi entra en el cálculo
final
2. Tomar una alícuota pequeña y agregue un tinte vital algodón azul o
lactofenol para facilitar la observación de células poco refractivas.
3. Limpiar las superticies de la cámara entre cada observación; enjuague con
agua de una piceta y seque por contacto con papel o tela absorbente y por
último con papel de lente
4. Colocar el cubre objeto especial sobre los rieles paralelos a ambos lados de
la cámara, frotando ligeramente para conseguir buen contacto
5. Con una pipeta delgada que no gotee tomar una muestra de la suspensión
y aplicar a la ranura al centro del margen de una de las cámaras donde
será rápidamente absorbida por fuerza capilar. Quitar exceso que rebose
en los bordes
6. Vacié la pipeta y repita el proceso anterior para la cámara opuesta; monte
al microscopio y ubique el rayado d e una de las cámaras con el objetivo de
m enor au m ento, girando luego al revolver para mayores aumentos.
7 . S egún sea os
l propágalos g randes o pe q ue ñ os, realice contadas
respectivamente en cinco cuadros principales (CP) y mu lti pl í quela suma de
estos p or 2000, para obtener el número por mi . L o p ropágulos que estén
sobre las líneas de l os má rgenes de los cuadrados deben contarse sólo en
dos de éstos, los de los lados izquierdo y superior
8. R epetir las contadas obre el segundo rayado en la otra cámara. E l contaje
total d ebe exceder 200 para ue el error de variabilidad no exceda el

q 15 %.
S i es nferior se
i d eben realizar más observaciones o preparar una mayor
concentración. Pr omediar as
l observaciones para determinar la
concentración de as
l suspensión de los propágalos (propágalos / mi)
preparada
9 . calcular el v olumen final necesario para evar la suspensión de propágulos

ll
a la concentración deseada :
Página 38
Propágalos/ml/propágulos/ml deseado X volumen total original (mi)= Volumen
final (mi)
Una vez obtenida la concentración correspondiente a la suspensión inicial.
Calcular una dilución determinada. Se aplica la siguiente fórmula
C,V,=C,V,
Dónde
C , = Concentración inicial (conocida en el conteo)
V 1 = Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inóculo)
C2= Concentración final deseada (según el estudio a realizar)
V,= Volumen final (desconocido)
Despejando
V2= C1V1
c,
Si el volumen inicial era de 100 mi y se desea una concentración de 30 000
conidio /mi, entonces
V,- Concentración calculada x 1 0 0 mi= Volumen final (mi)
30 0000
Con los datos obtengan
Calcular la concentración del inoculo inicial
Calcular la cantidad de líquido que se debe agregar a la suspensión de esporas
preparada, para obtener una concentración de 30 000 esporas por mi.
Actividades
Organizarse en grupos de dos estudiantes
Prepara la suspensión de esporas
Identifica los componentes del Hemacitómetro
Realizar conteos
Calcular concentraciones de esporas
V.PREGUNTAS DE APRENDIZAJE
¿Por qué es necesario conocer la concentración de esporas, para trabajos de
inoculación o formulaciones de productos biológicos?
VI.BIBLIOGRAFÍA
FRENCH, E. Y HEBER T. 1 9 8 2 . Métodos de Investigación Fitopatológica. San
José, Costa Rica. IICA.
GILCHIRST·SAAVEDRA, L.; FUENTES -DAVILA, G.; MARTÍNEZ, C . ; LÓPEZ
ATILANO; DU V E I LLER , E, ; S I N G H , R.B ; H ENRY, M.; G ARCÍA, A, s.f. Guía
práctica par a identificación de algunas enfermedades de trigo

l y cebada.
CYMMYT. Segunda edición
Página 39
GUÍA 12. ORGANIZACIÓN Y PRINCIPIOS DE TRABAJO DE LABORATORIO
CON TECNICAS MOLECULARES
COMPETENCIA
SUBCOMPETENCIA
Aplicar algunos principios de trabajo y organización en el uso técnicas
moleculares, para la detección de fitopatógenos
Tiempo: 4 horas
1.INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de fitopatógenos por medio de la identificación de sus ácidos
nucleicos es un concepto que se ha desarrollado en las últimas décadas, cada vez
nuevas técnicas son actualizadas y reportadas en revistas científicas como las
técnicas eficientes y acertadas en el diagnóstico de enfermedades.
Las pruebas para diagnóstico convencional de patógenos de plantas se basan en
características morfológicas y morfométricas; las cuales requieren de aislamiento y
crecimiento en cultivos puros para la identificación y experiencia taxonómica y
entrenamiento para identificar a nivel de especies.
Los avances en biología molecular han brindado nuevas vías para la detección e
identificación de patógenos de plantas. No obstante estas técnicas no excluye la
importancia de la aplicación de las técnicas convencionales.
La reacción en cadena de la polimerasa puede ser utilizada para detectar
diminutas cantidades de ADN de un fitopatógeno que esté presente en suelo,
tejido, savia, etc. Esta técnica permite multiplicar geométricamente regiones
específicas del ADN blanco por medio de ciclos sucesivos de síntesis que ocurren
"in vitre". Los componentes de reacción de PCR son el ADN en blanco,
nucleótidos, una enzima llamada ADN, polimerasa y partidores (iniciadores o
cebadores, primers). Los partidores son pequeñas cadenas de nucleótidos que
definen la secuencia de ADN que será amplificada. Proceso ilustrado en Figura 1 1
La PCR ha sido aplicada inicialmente en la detección e identificación de
fitoplasmas, virus, viroides, bacterias fastidiosas. Pero también en hongos,
bacterias y nematodos. En la identificación a nivel de especies, en las que las
diferencias entre ellas son mínimas y difíciles de caracterizar morfológicamente.
En general la aplicación de esta técnica al diagnóstico de enfermedades en
plantas se ha centrado en organismos que no son fácilmente detectados por
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medio de otros métodos o en aquellos casos en que la obtención de resultados es
lenta.
Entre las ventajas que presenta esa técnica se destacan su sensibilidad ( 1 0 0 a
1 000 más sensible que ELISA), la rapidez en la obtención de resultados y el
potencial para detectar varios patógenos simultáneamente. Las desventajas que
presenta son el alto costo de sus reactivos y equipos y de un entrenamiento
adecuado para su ejecución debido a la posibilidad de contaminación y la
consecuente obtención de falsos positivos.
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7
Figura 1 1 "Reacción en cadena de Polimerasa (PCR)"
Para lograr la duplicación de un tramo de ADN, cada ciclo de la técnica PCR
incluye tres etapas: 1) Desnaturalización, durante la cual se separan las dos
hebras constituyentes del ADN; 2) apareamiento de los "iniciadores" o primers del
tramo a replicar; 3) extensión de las cadenas de primers gracias a la acción de
una enzima ADN polimerasa. La repetición de los ciclos permite multiplicar
geométricamente los tramos de ADN elegidos.
11. OBJETIVOS
Diferenciar la organización de trabajo de laboratorio de diagnóstico de
enfermedades en plantas con técnicas moleculares
Usar y manejar de forma adecuada de micropipetas
Preparar Gel de Agarosa
Calcular volúmenes de algunas soluciones
Demostrar la extracción de ADN, en plantas infectadas con virus u hongo
Fitopatogenas
Valorar la calidad del ADN
7 . . .
si uratna.com
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111. MATERIALES
Micropipetas, gel de agarosa, plantas infectadas, protocolo de extracción de
ADN
IV. METODOLOGÍA
Esta práctica se realizará el laboratorio de Biología Molecular de la UNA
Antes de la sesión práctica, indagar a través de sitios web información
referente a los siguientes tópicos
PCR
http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=i1 o4jYepdxs
Electroforesis en gel. No vamos a hacerlo exactamente, pero entender el
principio.
http://www.youtube.com/watch?v=sbCusDyYoiO&NR=1
Extracción de ADN. Aunque habrán diferencias entre este método y el aplicarse,
ustedes puede comenzar a aprender a aprender y pensar el principio.
http://www.youtube.com/watch?v= 7jnHtKYIOng
• Discusión y análisis previo de la indagación e información previa la práctica
con el facilitador
• Reflexión y análisis de la organización del laboratorio de Biología Molecular
• Anotar los principales equipos de trabajo
• Usar las micropipetas
• Calcular volúmenes y preparar algunas soluciones
• Preparar un gel de agarosa
• Extracción de ADN, según protocolo de la muestra a procesar
• Haga un listado de los principales equipos utilizados en las técnicas
moleculares
• ¿Qué es la Biología Molecular?
• Cuáles son las secciones o cuartos de trabajo con técnicas moleculares
• Cómo funciona un termociclador PCR-convencional
• Para qué se prepara el gel de agarosa y porque se su usa solución buffer
Página 42
VI. BIBLIOGRAFÍA
ROSALES. M.I.; Diagnóstico de Enfermedades en plantas. Uso de herramientas
moleculares. Unidad de Biotecnología INIA-CRI La Platina. Fundación para la
innovación agraria (FIA) y el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA)
GÓMEZ-ALPIZAR, L.; FLORES, L.; BRENES, A.; PÉREZ, G.; DURAN, l. 2010
Diagnóstico Molecular de Patógenos de Plantas. Centro de Investigaciones
Agronómicas. San José, Costa Rica
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ANEXOS
Anexo 1 . Trabajo aséptico de laboratorio
1.1 . Métodos y técnicas para la esterilización y desinfección
La esterilización la definimos como la eliminación por muerte o separacron de
todo organismo viviente de un material. También puede significar el hacer
infecundo a un organismo. Desinfectar, es la eliminación o neutralización de
microorganismos para evitar una infección o avance de los mismos.
Métodos físicos
1. Térmico
• Calor seco, consiste en calentamiento del material en ausencia de agua. Exige
temperaturas mayores que la calefacción húmeda Se utilizan materiales
resistentes al calor como por ejemplo la cristalería en hornos.
• Calor húmedo, calentamiento con presencia de agua. En la calefacción
húmeda se pueden utilizar los métodos: ebullición, la pasteurización,
tindalización y la autoclave. El método de autoclave es el más usado y
confiable para esterilizar medios de cultivos. El autoclave es idéntico a una olla
de presión.
Tanto en la calefacción seca como en la húmeda existe una relación directa entre
la temperatura y tiempo de exposición. Mayor temperatura, menor tiempo de
exposición. El tiempo de exposición se calcula desde el momento que el material a
esterilizar alcanzó la temperatura correspondiente. (Tabla. 1 ).
Tabla 1 . Tiempos y temperatura de esterilización
Temperatura Tiempo de Tiempo de
esterilización esterilización de
calor húmedo calor seco
100° e 2 h
110° e 2.5 h
115° e 51 min
121 e e 1 5 min 12h
140° e --- 3h
Flamear y quemar
La aguja de transferencia y asa son hechas de cromoníquel, entonces pueden ser
quemadas en la llama de un mechero al rojo vivo. Después se moja en alcohol
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etílico al 96% (para su enfriamiento), se enciende el alcohol en la llama y se deja
quemar.
Materiales de acero, como por ejemplo soporte de aguja de transferencia, pinzas,
bisturí, pinchos, tijeras no pueden ser quemados al rojo vivo sino flameado (mojar
con alcohol etílico 96%, encender, y dejar quemar). Materiales inflamables como
por ejemplo papel filtro y madera, se flamean ligeramente pasándolos algunas
veces por la llama de un mechero.
Métodos químicos:
• Uso de gases y vapores (óxido de propileno C3HsO, vapor de formaldehído
HCHO).
• Uso de líquidos y soluciones químicas. En general son usados como
desinfectantes. Tienen como desventaja que permanecen en el medio
esterilizado por no ser volátiles. Sin embargo, para la desinfección de
superficie tienen amplia aplicación. Las superficies a desinfectar pueden ser
por ejemplo mesa de trabajo, utensilios de laboratorio, material vegetal.
Entre los desinfectantes se pueden mencionar:
./ Alcoholes: Sobre todo el alcohol etílico. (70% ó 95%) .
../ Cloro: Es liberado como gas en agua de compuestos de hipoclorito de sodio,
potasio o calcio. Para la desinfección de material vegetal es ideal hipoclorito de
sodio al 1 ó 2%
./ Formalina: Al 4% se usa para la desinfección de mesas de trabajo, cuartos de
transferencia, semillas, partes vegetales leñosas. Es muy corrosivo y acción
lenta .
./ Agua oxigenada H202: Se usa para la desinfección de semillas. Por ejemplo
30 minutos H202 al 30%.
1.2. El trabajo aséptico en la sala de prácticas
Para los laboratorios, los alumnos no disponemos de cuartos estériles con
suficiente capacidad para todos, entonces tenemos que tomar en cuenta ciertas
reglas para que podamos trabajar bien en la sala de prácticas de Fitopatología.
1. Cumplir siempre en la limpieza: lavarse las manos, limpiar las mesas, no dejar
objetos innecesarios en la mesa, desinfectar las mesas, tener cuidado con
material fungoso que está esporulando, eliminar directamente cualquier basura
de las mesas.
2. Evitar corrientes de aire innecesarios. No hacer movimientos innecesarios
durante trabajos asépticos, no caminar innecesariamente, cerrar las ventanas y
apagar los aires acondicionados.
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3. El trabajo estéril se hace rápido, por corto tiempo podrán estar abiertos los
platos estériles, para verter medios o siembras o verter en matraces, etc.
Entre mas corto el período en que están expuestos la cristalería estéril menos
probabilidad de contaminarse.
4. Un objeto estéril una vez en contacto con un objeto no estéril (por ejemplo: una
mesa) ya no es estéril. Por ejemplo el tapón de algodón, aguja de
transferencia, pipeta, etc. tiene que ser esterilizados de nuevo.
Anexo 2. Recetas de medios de cultivos
Los medios nutritivos se clasifican según el origen, consistencia y uso
Medios naturales: (leche, frutas, suero de la sangre).
Artificiales: (Recetas de cocciones o infusiones de origen
Origen Sintéticos: (Sustancias puramente químico, sales,
carbohidrátos y vitaminas
Los medios naturales se usan: Material vivo del hospedero (planta), para los
parásitos obligados, que no pueden ser cultivados sobre medios artificiales, sino
solamente sobre material vivo del hospedero. Sobre hojas cortadas, pedazos de
frutas (papá, zanahoria) esterilizados, madera, tallo, semillas.
Medios líquidos: Consiste en el agua y sustancias solubles
ej. Caldos se usa en el estudio de propiedades fisiológicas
químicas de los microOrganismos
Consistencia
Semi sólidos: Baja concentración de solidificante (O. 5% - 5%
agar gelatina), se utiliza para mejorar la motilidad del cultivo
investigado
Medios sólidos: Se e
l a ñade solidifica n te de a
g ar - ag ar de
1 O, 15, 20% y se utiliza para el aislamiento de cultivos puros

d e m i c roorg a nis mos y estudio de c ara cter sticas
í
morfológicas.
Página 46
Generales: Papa dextrosa agar, agar nutritivo (PDA, AN),
para crecimiento de hongos y bacterias
Específicos: Para ciertos grupos de m.o. (m.o descomponen
Uso células).
Selectivos: Desarrollo de una sola especie o grupo de m.o.
para estudiar algunas propiedades, diferenciales m.o.
Medios de diagnósticos o diferenciales: Se usan en estudios
bioquímicos, aislamiento de cultivos puros e identificación.
2.1. Determinación del pH
El pH del medio también tiene efecto sobre la selectividad del medio, como
también en el desarrollo de los m.o. En general los hongos prefieren un pH más
bajo (pH= 5.5 a 6.5) que las bacterias (pH= 7).
Para el aislamiento de hongos de material vegetal se usa en general medios de
cultivo acidificado. Una o dos gotas de ácido láctico al 25% añadido a 1 O mi de
agar derretido antes de verter el plato ó 100 gotas de ácido láctico a1000 mi de
PDA, una vez esterilizado antes de verter. El uso de antibiótico, para inhibir
crecimiento b acteriano.
E l pH representa o indica neutralidad H+
El pH arriba de 7.0 indica que la solución es más alcalina (tiene m enor cantidad de
h idrogeniones que el agua).
El pH debajo de 7.0 indica que la solución es más ácida q ue el agua.
E l pH del agua destilada es ideal, para medios de cultivos 5.5-6.5
¿Có mo determinar el p H?
• Papel o cinta para medir el pH (papel pH).
• Po tenciómetro qu e mide la diferencia de potencial de H idrogeniones H+ entre
la solución examinada y una solución estandarizada voltios).

(
• C alorímetro - se u tilizan distintos indicadores en solución en las ue el calor

q
de la solución corresponde a un p H definido.
• P ara realizar ajustes de pH a medios de cultivos, se utilizan soluciones NaOH
1 N y HCI 1 N; se mide primero el pH del medio a ntes de esterilizarlo y luego
se ajusta agregando gota a gota. Se usa ácido clorhídrico, para b ajar el pH
(acidificar) y N aOH, para alcalinizar
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2.2. ¿Qué sustancia se usa como solidificante?
a. Agar - agar, polisacárido complejo que se obtiene de algas marinas a
garofitas (Algas rojas) 70 - 80% de polisacárido, agua y sustancias
minerales.
b. Gelatina, naturaleza proteica, se obtiene de los huesos, puede
descomponerse por enzimas proteolíticas y por eso no se utiliza
ampliamente con solidificante
2.3. ¿Cuáles son las exigencias de un Medio de Cultivo?
Poseer sustancias nutritivas necesarias (fuente de nitrógeno, carbono, oxigeno,
hidrogeno, sales inorgánicas, factores de crecimiento).
Estar húmedo, para que los m.o. puedan asimilar sustancias nutritivas solubles,
estériles, transparente, pH determinado.
2.4. ¿Cómo verter medio en platos petri?
Generalmente se vierte entre 1 O y 1 5 mi por plato Petri (tamaño normal). Primero
se derrite el medio al baño maría y después se deja enfriar hasta 45 · 50º C.
cuando se vierte un medio muy caliente se condensa demasiada agua en la tapa
del plato lo que puede causar problemas a la hora de observar el plato bajo el
microscopio estereoscópico.
Una condensación ligera se puede eliminarse con algodón. Después se desinfecta
la tapa con algodón remojada en alcohol y se flamea. Lo más adecuado es verter
el medio cuando los platos estériles están ubicados en la orilla de una mesa
desinfectada. Así le queda suficiente espacio para maniobrar con el matraz y al
verter, la abertura entre la tapa y el plato se mantiene bastante reducida. Antes de
verter el medio se elimina la tapa del matraz con el dedo auricular y anular de la
mano izquierda cerca de la llama del mechero.
Ahora se flamea el cuello del matraz procurando que éste no se caliente
demasiado. Luego se desplaza al matraz en la dirección lateral hacia los platos
(nunca efectuar movimientos verticales con el matraz). Los platos se abren
levantando un poco la tapa inclinándola para atrás. Hay que verificar si el medio se
distribuyó por todo el fondo del plato (si no es así, con la mano izquierda se mueve
o inclina un poco el plato). Si sobra un poco de medio de cultivo en el matraz, se
vuelve a tapar pasando el tapón y cuello del matraz por la llama.
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2.5. Recetas para algunos medios de cultivos más comunes
2.5.1. Agar agua
Útil cuando se desea un crecimiento espaciado del micelio.
Agua 1000 ce; Agar 10-20 g
Preparación: agréguele el agar al agua, caliéntelo hasta derretirlo. Distribúyalo y
esterilícelo.
2.5.2. Papa - Dextrosa - Agar (PDA)
Útil para el crecimiento de la mayoría de los hongos cultivables y para el
aislamiento de éstos cuando no hay problema de contaminación bacteriana.
Trozos de papa pelada: 250 g
Azúcar (sacarosa, dextrosa, glucosa): 1 O g
Agua: 1000 ce
Agar: 1 8 g
Acido láctico: 25% 100 gotas (Para eliminar bacterias)
Preparar el PDA, instantáneo, según prospecto
Preparación: Pele y parta la papa en trozos, hiérvala en 500 ce de agua destilada
por 30 minutos mientras derrite el agar en otros 500 ce. Filtre el caldo de papa con
un tamiz y gasa. Junte las dos preparaciones, agréguele y disuelva el azúcar, y
sustituya al agua hasta completar los 1 000 ce y esterilizarlo.
2.5.3. Agar nutritivo
Es apropiado para el aislamiento de la mayoría de las bacterias patogénicas de
plantas. Las bacterias generalmente prefieren un medio neutro o ligeramente
alcalino.
Extracto de carne: 3.0 g
Peptona: 5.0 g
Glucosa: 2.5 g
Agar: 15.0 g
Agua: 1000 mi
Medios instantáneos: Son los medios que se pueden adquirir en el comercio en
forma deshidratada (polvo, grano o pastillas). Las marcas mas conocidas con
DIFCO (EEUU) y Oxoid (Inglaterra). En general, solamente falta añadir la cantidad
de agua dictada y esterilizarlo
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2.5.4. Medio Kin B para Pseudomonas
H20 dest - 1000 mi
Proteosa peptona - 20 g.
Glicerina - 1 0 mi
K2H PO, - 1 . 5 g.
Mg SO, 7H20 - 1 . 5 g.
Agar - 1 5 g.
Ph 7.4
2.5.5. YDC (Erwinia)
Parte I
Ca Co3 - 20 g.
Extracto de levadura - 1 0 g.
Agar - 1 5 g.
Agua destilada - 900 mi
Parte II
Dextrosa - 20 g.
Agua destilada - 100 mi
Pseudomonas �
AgarF
(basis)
Anexo 3. Técnicas de aislamientos de Oomycetes y hongos fitopatógenos
3.1 . Inducción de la esporulación y/o fructificación
Para aislar hongos de crecimiento lento (hojas, tallos) Cercospora,
Septoria,Phoma y otros. La mayoría de los hongos que atacan las partes aéreas
de las plantas esporulan abundantemente si el tejido del hospederon (planta), se
mantiene en alta humedad relativa. La esporulación ocurre en la mayoría de los
hongos en 2 - 3 días y la formación de cuerpos fructíferos entre 1 a 2 semanas
Esta técnica es conveniente, para manchas foliares producidas por hongos que
forman cuerpos fructíferas en la cual se procede primeramente a poner en cámara
húmeda y a las 24 o 48 horas, con la ayuda de un microscopio estereoscópico se
toman las esporas o cuerpos fructíferos mediante una aguja fina, y se depositan
haciendo un estriado sobre la superiicie de agar, o bien se añaden una o dos
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gotas de agua estéril en la superficie del agar (preferible acidificado) de modo que
el estriado se hace a partir de las gotas. Otra forma es tomar con una aguja los
cuerpos fructíferos cerrados conteniendo esporas, se pueden transferir a un
portaobjeto (estéril) o (flameado) en 3 o 4 gotas de agua estéril se presionan y las
esporas que salen se colectan con una aguja y se depositan sobre agar.
3.2. Inducción al desarrollo vegetativo/miceliar
Para aislar hongos causantes de marchitez! pudriciones radiculares y mal del
talluelo.
Se lava el tejido infectado en agua, para separarlo de la materia orgánica extraña.
El siguiente paso es la desinfección superficial del tejido, mediante diversos
compuestos/ químicos, de los cuales el más usado es el hipoclorito de sodio al
1 %, alcohol histológico al 95 %. Si el patógeno por aislar se encuentra
solamente en los tejidos celulares externos del hospedante, se debe eliminar este
paso. La selección de la porción de tejido enfermo, de la cual se va a hacer el
aislamiento, es también muy importante para la obtención del patógeno primario
libre de contaminación. Es mejor aislar del margen del tejido infectado,
especialmente en el caso de tejidos jóvenes que son fácilmente invadidos por
microorganismos secundarios. En caso de que se trate de organismos que
invaden determinados tejidos, pueden eliminarse éstos, asépticamente, dejando
sólo el tejido infectado. Cuando se desea aislar hongos se puede evitar la
contaminación bacteriana añadiendo al medio del cultivo (PDA), antibiótico como
estreptomicina en concentraciones de 100 - 500 p.m.
Si no se desea usar antibióticos, se puede acidificar el PDA con unas gotas de
ácido láctico para bajar el ph a 4.0 o 5.0. Este ph usualmente inhibe el desarrollo
de las bacterias pero no el de la mayoría de los hongos. En el PDA acidificado se
utiliza 100 gotas de ácido láctico en 1 OOOml de PDA.
3.3. Aislamiento mediante trampas o cebos
Para aislar hongos del suelo y aire
Los estudios de poblaciones en el aire, suelo y agua proporcionan información
acerca de cómo los hongos patógenos sobreviven cuando el hospedero no está
presente, como se mueven de un lugar a otro y cómo se reproducen en la
ausencia de estos. El aislamiento de los hongos presentes en el aire se lleva a
cabo mediante el uso de portaobjetos cubiertos con sustancias pegajosas tales
como vaselina. Las esporas se pueden atrapar a diferentes alturas, sobre los
campos afectados.
El aislamiento de hongos en el agua, por ejemplo de canales de rrnqacion,
generalmente requiere el uso de cebos. Las especies de Phytophthora que
ocasionan las pudriciones radicales de diversos cultivos, pueden atraparse
Página 51
poniendo frutos intactos de manzana, pera o limones, para la especie P.
citrophthora, en el agua de riego. Estos hongos atacan la superficie del fruto y
ocasionan una mancha café en el tejido inmediato interior, de donde el hongo
puede ser aislado usando medios selectivos.
Mediante esta técnica se ha demostrado que P. cinnamomi, se disemina de un
campo a otro en el agua de riego. Para aislar hongos del suelo se emplea
también, un tubo plástico con agujeros laterales lleno con diferentes medios. Estos
tubos enterrados en el suelo, permiten al hongo desarrollarse desde el suelo, los
tubos se sacan y se aísla el hongo de las áreas cercanas a los agujeros. Esta
técnica es sumamente valiosa para el estudio de oomycetes y hongos cuyos
micelios avanzan por el suelo.
El empleo del hospedero como trampas para aislar hongos patógenos habitantes
del suelo, así por ejemplo se puede plantar hospederos susceptibles y mantenerlo
en condiciones ambientales favorables para la infección. Una vez que hay
infección en las raíces o en el hipocótilo se saca la planta y el patógeno puede ser
aislado fácilmente por ejemplo emplear tallos de frijol para aislar Rhizoctonia
sola ni.
3.4. Aislamiento por dilución de esporas
Para hongos del suelo y parásitos obligados.
Las técnicas de dilución favorecen el aislamiento de organismos que producen
grandes cantidades de esporas, como los penicilios, los aspergilos, las levaduras y
muchos Actinomycetes. Esta técnica de dilución es una de las más antiguas para
el estudio de los hongos del suelo. Se procede en la forma siguiente: a una
cantidad conocida de suelo se añade agua estéril y a continuación se hace una
serie de diluciones. Alícuotas de la suspensión de la serie de diluciones se
depositan sobre la superficie de diversos medios de cultivo.
En el caso de que se desee saber solamente la cantidad total de la mayor parte de
los tipos de hongos presentes en el suelo se puede usar un medio como PDA. Sin
embargo si se quiere estudiar solo ciertas especies o grupos deben usarse medios
selectivos. Así por ejemplo: S nyder et al han usado un medio que contiene sales
m inerales, rosa de bengala, sales de Na y estreptomicina para el aislamiento
selectivo de Fusarium so/ani f. sp phaseolis. P ara otros hongos, otros compuestos
q uímicos son empleados para inhi bi r selectivamente acterias

b y hongos, por lo
cual el medio llega a ser sumamente complejo.
Página 52
3.5. Inoculación del hospedero
Se emplea para parásitos obligados y casos difíciles, cuando el material enfermo
está sumamente contaminado, la inoculación directa del hospedero puede ser el
método más rápido para aislar al patógeno.
3.6. Método de dilución del suelo
1 . Remover el suelo pesar 1 O g poner en 90 mi H20 estéril. Se deja su reposo 5
min (dilución 1 : 1 0 " ).
2
2. 1 mi de la dilución 10- se transfiere asépticamente al tubo con 9 mi de agua
3
estéril ( 1 0 - ). Se mezcla bien el inoculo golpeando el tubo con el dedo indice.
1·
3. De manera analógica s transfiere al tercer tubo hasta la dilución 1O -
3 5
4. De cada dilución 10 - y 10 - sembrar 0.2 mi con medio PDA y AN se
distribuye por toda la superficie con espátula Drigalski.
5. Incuba a temperatura 25 a 28ºC
El número de los microorganismos en 1 g del suelo se determina por la cantidad
de colonias que crecen en la placa ejemplo: hemos sembrado 0.2 mi de la dilución

3
1 o- han crecido 5 colonias. Entonces en 1 g de suelo va encontrarse.
UFC: Número de colonias x dilución = Total UFC•g de suelo
0.2
Número de colonias: Total de colonias formadas en cada plato petri.

3 5
Dilución: Cifra correspondiente a la dilución dada (1 O · y 1 O · ¡
0.2: mi de dilución sembrada en cada plato petri.
3.7. Cultivo monospórico
Una vez aislado el patógeno causante de una enfermedad, se requiere de grupos
de individuos que representen la población del patógeno. Para esto deben
obtenerse cultivos puros generados de una sola espora.
Se hace una suspensión de baja concentración de conidios en agua estéril de la
especie en estudio a partir del cultivo inicial. En 0.5 mi de dicha suspensión verter
en una caja Petri con medio agar agua y dispersarla con una varilla de vidrio
estéril observar la germinación de las conidias bajo el estereoscopio a intervalos
de tiempo (24,48 y 72 horas). Cuando estos inicien su germinación, con una aguja
Página 53
previamente esterilizada a la flama, ubicar los conidos que germinan en forma
aislada y tomar el pedacito del agar donde se encuentran estos y transferir uno por
los conidios a cajas Petri individuales. Usar el medio selectivo recomendado para
el crecimiento del patógeno en estudio. Observar el crecimiento de cada colonia
obtenida y descartar aquellas que muestren un crecimiento concéntrico doble o
triple, ya que este patrón indica más de una espora durante la transferencia al
cultivo selectivo.
3.8. Medio de harinas de maíz mas antibióticos (PARC)
Harina de maíz 60 g
Agar 12 g
Agua 1 000 mi
1 O mg/L Pimaricina (20 de 50% i.a.)
1 O mg/L Rifampicina (100% i.a.)
250 mg/L Ampicilina (100% i.a.)
Anexo 4. Técnicas de aislamiento de bacterias
4 . 1 . Dilución en Serie
Corte trozos pequeños de tejido enfermo de aproximadamente 5 mm de largo,
sumérjalos durante dos minutos en cloro o hipoclorito de sodio al 0.5%, enjuague
en agua destilada estéril por un minuto y deposite 1O trocitos en un tubo de
ensayo que contenga 5 mi de agua estéril; tape el tubo y manténgalo en reposo
durante 15 minutos. Prepare 3 tubos de ensayo conteniendo cada uno 9 mi de
agua destilada estéril (ADE). Enumérelos.
Mediante una pipeta estéril deposite 1 mi del primer tubo (trocitos tejido vegetal),
al segundo tubo, agite nuevamente, y de este, pase 1 mi al tercer tubo para
obtener finalmente diluciones de 1 :1 O, 1 : 1 0 0 y 1:1000, respectivamente. Agregue
por separado 0.5 mi de cada dilución por caja Petri esterilizada. Agregue
aproximadamente 20 mi de AN a cada caja y agite suavemente para distribuir las
bacterias a través del medio. Coloque las cajas sobre una mesa limpia del
laboratorio. Las colonias aparecerán 48-72 horas más tarde, siendo la
concentración de éstas proporcional a la dilución empleada. Se considera que
cada colonia proviene de una célula bacteria!. Xanthomonas produce en AN
colonias de color amarillo.
Las colonias provenientes de tejido vegetal enfenno con bacterias fitopatógenas
de tomate o chile atacados por Pseudomonas solanacearum se deben transferir a
cajas petri con medio KB. Sobre éste medio Pseudomonas produce un pigmento
Página 54
fluorescente de color verdoso-amarillento, el cual es fácil de observar bajo la luz
ultravioleta.
4.2. Rayado bacteriano
Como el método anterior, corte trozos pequeños de aproximadamente 5 mm de
tejidos afectados por Xanthomonas campestri, colóqueles durante 2 minutos en
hipoclorito de sodio al 0.5%, enjuáguelos en ADE. Deje reposar por unos 10-15
minutos (observe el flujo de bacterias de color lechoso) y con una asa estéril
transfiera una suspensión de bacterias a cajas Petri con nutriente-glucosa-agar
(NGA). Se transfiere haciendo rayados paralelos de lado a lado de la caja sobre la
superficie del medio.

Coloque las cajas a temperatura ambiente. Las colonias aparecerán 48-72 horas
más tarde. Xanthomonas produce colonias de color amarillo.
4.3. Prueba de patogenicidad
Esta es la prueba más importante para definir si el cultivo puro obtenido
corresponde a una especie de bacteria patogénica. Usar plantas jóvenes de ta
variedad del cultivo en el que se haya observado la lesión. inyectar una
suspensión concentrada de bacterias, derivada de un cultivo puro joven. Se filtra
la suspensión bacteriana en la hoja. Incubar las plantas una semana en una
cámara húmeda. Si se reproducen lesiones extendidas similares a los síntomas
observados en el campo, es seguro que es patogénica, pero hay que aislar
nuevamente la bacteria, para verificar los postulados de Koch.
Anexo 5. Técnicas de extracción de nematodos
5 . 1 . Extracción de nematodos del suelo
5 . 1 . 1 . Tamices más filtro de algodón
Esta técnica constituye una modificación de la técnica de extracción de Embudos
de Baerman. Es usado para colectar nematodos activos y está basada
principalmente en el movimiento de los nematodos. A continuación se explica el
procedimiento a seguir:
1. Se toma 1 kilo de suelo que corresponde a la muestra obtenida en el
campo, se homogeniza y tamiza para descartar terrones y residuos
vegetales.
2. Del suelo tamizado se toman 200 g de suelo, los cuales se ponen en un
pichel con 1 litro de agua y se agita hasta desbaratar el suelo.
3. La suspensión se deja reposar por 30 segundos y el sobrenadante se
decanta cuidadosamente sobre los cuatro tamices, los cuales han sido
Página 55
colocados en orden ascendente de la siguiente manera: 0.045, 0 . 1 0 0 , 0.250
y 0.425 mm de diámetro.
4. El suelo que queda asentado en el pichel se le vuelve a echar agua, un litro,
repitiendo la operación anterior una vez más.
5. Con un poco de agua, proveniente de una manguera, se lavan los residuos
que han quedado en los tamices de mayor diámetro (0.425 y 0.250 mm),
los que posterior a esto se descartan.
6. El suelo que quedó en los tamices de menor diámetro (0.045 y 0.100), es
lavado con una pizeta y depositado directamente en el tamiz de extracción
al que previamente se le ha colocado el papel filtro.
7. Finalmente el tamiz de extracción es colocado en un plato de extracción el
cual contiene 100 ce de agua. El tamiz de extracción se dejará reposar por
24 horas.
8. Pasadas las 24 horas se toma del plato de extracción la solución con
nematodos, la cual se deposita en un beaker, y se procede observar la
muestra en el microscopio, para la identificación y conteo de los
nematodos.
4.1 .2. Centrifugación-Flotación
Esta técnica se basa en el peso específico de los nematodos, la cual se detalla el
procedimiento
1. Seguir los pasos del 1 al 5 descrito en el método de Tamices más filtro de
algodón.
2. El suelo que quedó en los tamices de menor diámetro (0.045 y 0.100), es
lavado con una piceta y depositado directamente en el tubo de la
centrífuga.
3. El vaso de la centrifuga es pesado para conocer su peso y a partir de este
peso se debe procurar (es mandatorio) que todos los vasos con las
muestras de suelo pesen lo mismo para no afectar el balance de la
centrífuga.
4. Una vez asegurado que todos los vasos pesen lo mismo se centrifugan a
2000 revoluciones por minuto (rpm) por 5 minutos. En este punto se
observarán una fase sólida (el suelo con los nematodos) y una líquida (el
agua) la cual debe ser decantada
5. Al tubo con el suelo se le agrega la solución azucarada con una densidad
especifica la densidad que poseen los nematodos. Se homogeniza bien la
solución y se procede a pesar nuevamente el tubo. Todos los vasos de la
centrífuga deben pesar lo mismo.
6. Centrifugar los vasos a 2000 rpm por 2 minutos.
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7. Igual que en el paso 4 se observarán las mismas dos fases. Esta vez la
fase líquida se verterá sobre el tamiz de 0.045 mm de diámetro, se lavará
con cuidado y con abundante agua.
8. Con la piceta se lavará el tamiz y la solución con los nematodos será
vertida en un beaker.
9. Observar la solución obtenida en el microscopio inmediatamente.
5 . 2 . Extracción de Nematodos de Material Vegetal
5 . 2 . 1 . Licuadora más tamices más filtros de algodón.
Paralelamente al grupo de nematodos ectoparásitos (nematodos que se alimentan
externamente de las raíces), existe el grupo de nematodos endoparásitos
(nematodos que viven y se alimentan dentro del tejido vegetal). Para la extracción
de este grupo de nematodos se utiliza la técnica de maceración de raíces
mediante la utilización de una licuadora.
El principio de este método es igual que el anterior, la movilidad de los nematodos.
A continuación se describen los pasos a seguir:
1. El material vegetal infectado por nematodos (raíces, tallos, hojas, granos,
etc), se lava en el chorro de la llave de agua, con el propósito de eliminar
suelo y otras partículas.
2. Una vez lavadas se secan con papel toalla y se cortan en trocitos de
aproximadamente uno o dos centímetros de largo, en el caso de raíces,
hojas y tallos.
3. El material a procesar debe ser pesado, todas las muestras deben tener el
mismo peso. (p.e: 3,5, 1 O g).
4. Colocar el material vegetal en la licuadora a la que previamente se le han
puesto 100 ce de agua y se licúa por 30 segundos. El tiempo de licuado va
a depender del tipo de raíces y género de nematodos.
5. Decantar la solución obtenida sobre los tamices (0.045, 0 . 1 0 0 , 0250 y 0.425
mm), lavar los tamices de mayor diámetro y recoger en un beaker los
residuos de los tamices de menor diámetro de poro.
6. Depositar la solución obtenida en el tamiz de extracción con el papel filtro y
colocarlo en el plato de extracción con 100 mi de agua. Dejarlo reposar por
24 horas.
7. Observar la solución obtenida en el microscopio para la identificación y
conteo de los nematodos.
Página 57
5.2.2. Método de Incubación o Humificador
Esta técnica se utiliza para nematodos endoparásitos, tales como Meloidogyne sp.
con el fin de incubar los huevos en estado embrionario y el juvenil 1 así como los
estados juveniles 2 que se encuentran aún en el matriz gelatinosa. Las raíces
serán colocadas en los recipientes y permanecerán en el humificador por 72
horas. Cada 24 horas se harán observaciones en el microscopio para el conteo de
las poblaciones. Las raíces deben ser lavadas cuidadosamente, secadas y luego
se deben pesar.
Anexo 6. Evaluación de sanidad de la semilla
1. Técnica de siembra de inducción a la esporulación (Prueba de agar)
Utilice 5 platos con agar agua (AA) al 2%. Tome 50 semillas por cultivo, trátelas
con hipoclorito de sodio durante 2 minutos, séquelas en papel filtro y
posteriormente siembre 1O semillas por plato de tal manera que queden bien
distribuidas e incube a 20-25 grados centígrados durante 4 a 8 días. Haga
observaciones frecuentes tomando registro de germinación y número de semillas
que presentan hongos, bacterias o ambos. Las bacterias se transfieren a los
tubos de ensayo con NGA-CaC03 y los hongos a tubos de ensayo con V-8 agar
ácido láctico para identificación posterior y pruebas de patogenicidad.
2. Prueba en papel filtro
Esta prueba es una modificación de la prueba de germinación ya que la semilla se
coloca sobre la superlicie de discos de papel filtro humedecido. Los discos de
papel se saturan con agua estéril y el exceso s elimina. Como en el método
anterior tome 50 semillas por cultivo; trátelas con hipoclorito de sodio durante 2
minutos y luego coloque 10 semillas por plato Petri. Ya que con éste método el
crecimiento de plántulas con frecuencia dificulta la observación de hongos, y la
determinación del porcentaje de infección es imposible, adicione unas 5 gotas de
2,4-D al 0.2% por cada plato con el fin de prevenir la germinación de la semilla.
Las cajas así tratadas se sellan con tiras de papel parafilm y se ponen a incubar a
20-25 grados centígrados con un ciclo de luz ultravioleta (LU) de 12 horas diarias
durante 4-8 días, como en el método anterior, tome registros del número de
semillas que presentan hongos o bacterias, o ambos. ldentlfíquelos
Anexo 7. Técnicas ELISAS, para detección de Virus fitopatógeno
El uso del test ELISA, es usada para detectar la presencia de antígenos o
anticuerpos a las paredes de una placa de plástico (poliestireno), a la que
posteriormente se le agregará extractos de savia de la planta problema. Si el
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antígeno está presente en la muestra, estos serán inmovilizados a las paredes de
la placa. Un segundo anticuerpo unido covalentemente a una enzima que
reconoce el antígeno inmovilizado es agregado posteriormente. La presencia en
cada pocillo de la placa del complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo +enzima es
revelado por el cambio de color que ocurre al aplicar un sustrato cromogénico que
es utilizado por la enzima conjugada al segundo anticuerpo. El cambio de color y
por lo tanto la presencia del antígeno, es cuantificado por medio de la medición de
absorbancia que es efectuado por un lector de placa ELISA. Existen variantes:
7.1. ELISA Directo
La forma más simple. Detecta un antígeno que se ha unido a una fase sólida
(placa poliestireno). Un anticuerpo conjugado con una enzima es incubado con el
antígeno capturado y después de lavar el exceso del conjugado se agrega el
substrato cromogénico. El viraje a un color determinado indicará un interacción
específica antígeno-anticuerpo.
7.2. ELISA Indirecto
El antígeno es primero absorbido a la placa, entonces actúa un anticuerpo
secundario y posteriormente el anticuerpo conjugado a la enzima. Para que se
desarrolle color, el anticuerpo primario que es específico para el antígeno debe
estar presente en el complejo final.
7.3. ELISA Sándwich
En este caso un anticuerpo es absorbido a la placa con el objetivo de capturar el
antígeno. Un segundo anticuerpo conjugado, es utilizado después de agregar la
muestra con el antígeno de interés. De esta forma se obtiene el viraje del color del
substrato que indica la presencia del antígeno en la muestra. Esta forma es
considerada la más específica y sensible de las metodologías de ELISA.
7.4. lnmuno impresión de tejidos
Se utiliza en reacciones específicas antígeno-anticuerpo es similar a la placa
ELISA, con la excepción que en este caso la matriz sólida es una pieza especial,
membrana. Con esta técnicas, la localización del patógeno o agente causal de la
enfermedad puede ser determinad dentro del tejido del hospedero. El tejido de la
planta es presionado contra una membrana (nitrocelulosa o nylon) a la que
después se le unirán los anticuerpos que se unen específicamente al patógeno.
Un cambio de color indicará un resultado positivo y mostrará la localización del
patógeno en el tejido del hospedero
Página 59
7.5. Test de flujo lateral
En esta prueba un anticuerpo, específico para el antígeno blanco (patógeno) es
inmovilizado en una fase sólida (membrana de nitrocelulosa). Un segundo
anticuerpo conjugado a otro coloidal, que también reconoce al antígeno blanco, es
depositado sobre esta membrana. Cuando la muestra que contiene el antígeno es
aplicada a la membrana, esta migra a través del conjugado solubilizándolo y
formando un complejo que se mueve a través de la membrana. Este complejo es
atrapado al alcanzar el anticuerpo que está inmovilizado en la matriz, formándose
un sándwich, entre los dos anticuerpos y el antígeno. Además, se desarrolla un
color que refleja la concentración del antígeno en la muestra. La mayoría de los
test de flujo lateral también contienen una línea control que asegura la ejecución y
funcionamiento correcto de la prueba.
7.6. Protocolo ELISA
1. Realizar macerado del material vegetativo
2. Adicionar 100 µI de control(+) muestras y buffer a cada pozo
correspondiente e incubar pro 2 horas
3. Lavar con PBST (1 X) 4-8 veces y secar
4. Adicionar 100 µI de la enzima conjugada e incubar por 2horas
5. Lavar con PBST (1 X) 4-8 veces y secar
6. Adicionar 100 µI de PNP e incubar por 30 a 60 min en cámara húmeda
7. Adicionar 50 µI de solución stop
8. Realizar lectura del protocolo (visual o fotométrica)
7.7. Preparación de soluciones
1 . Preparación PBST 1 X
(20) (?) = (1 X) (100ml)
X = 5 mi PBS
95 mi de H,O
2. Diluir 3.33 Buffer de extracción en 10 mi PBST
3. Dilución muestra
900 µI Buffer
100 µI solución macerada
Página 60
Anexo 8 Organización y principios de trabajo de laboratorio con técnicas
moleculares
8.1. Uso correcto de micropipetas
• Seleccionar la micropipeta correcta de acuerdo al trabajo
• Ajustar el volumen
• Colocar una punta en la micropipeta sin tocar la punta
• Presiones el émbolo hasta el primer punto de resistencia
• Colocar la punta debajo de la superficie del líquido
• Lentamente libere el émbolo
• Colocar la punta cerca del fondo del tubo
• Lentamente presione el émbolo para que pase el primer punto de la
resistencia hasta el segundo punto de resistencia
• Libere el émbolo DESPUES de que la punta es removida del tubo
• Elimina la punta en el contenedor de descarte
8.2. Preparación de geles de agarosa
• Pesar la cantidad apropiada de agarosa de acuerdo a la concentración y
volumen requerido
• Calentarlo en microondas hasta disolver aproximadamente 2 min
• Añada el volumen requerido de bromuro de ethidíum (1 %) o Gel Red,
agitar
• Dispensar el gel en una cámara de electroforesis de acuerdo con el número
de muestras que colocará
• Sumerja el peine y alinearlo
• Permitir que el Ges se solidifique y retirar el peine
• Colocar en la base de la cámara y llenarla con la solución buffer
Tabla 2. Preparación de Cantidad de agarosa de acuerdo a la capacidad de
La cámara
Capacidad de Cantidad de Cantidad de Cantidad de
cámara agarosa para 1 agarosa para agarosa para

% ,,.;, 1.6 % ;,,, 2.6 % ial
150ml 1,5 2,4 3,9
100ml 1 1,6 2,4
50ml 0.5 0.8 1,6
Página 61
8.3.Preparación de soluciones
1.Buffer de Extracción para 100 mi 7. NaOAc 3 M (pH 5.2) 100 mi
100 mi Tris.HCI (1 M) pH 8.0 1 3 g NaOAc en 10
2,5 mi EDTA (0,5 M) Autoclavar
5 mi NaCI (5M)
2. Buffer de Extracción CTAB 8. CTAB 10 % 50 mi
Para 1 0 0 m l 5 g CTAB
2 g de CTAB (C,,H42N8r)
5 mi EDTA (0,5 M)
28 mi NaCI (5M)
3. Buffer TE (Tris-EDTA) pH 7,4 9. SDS 1 0 % 1 0 0 m l
500 mi 10 g SDS
0.605 g Trizma Based (1 OmM=
0 , 1 8 5 g EDTA ( 1 m M )
Autoclavar
4. EDTA 0,5 pH 8.0 500 mi 1 O. Buffer TBE 5 X IL
93,0 g EDTA Tris-Base 54 g
Ácido Bórico 27,5 g
5. Tris-HCL 1 M pH 8,0 100 mi EDTA 3,72 g
12, 1 1 g de Trizma Base pH 8, 13-8,23
Autoclavar
6. NaCI 5 M 100 mi
29,2 g NaCI
Autoclavar
Página 62

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Compendio de guías

MSc. Yanet Gutiérrez Gaitán

Departamento de Protección Agrícola y Forestal

MSc. Yanet Gutiérrez Gaitán

Managua, Septiembre 2012

Departamento de Protección Agrícola y Forestal

Contenido Técnico: MSc. Yanet Gutiérrez Gaitán

Coordinación: MSc. Víctor Sandino

lng. Ma. Gabriela Zapata

PROMIPAC: MSc. Julio López

Ma. Gabriela Zapata.

UNA: MSc. Víctor Sandino

Arte y Diseño: lng. Harold Argüello

lng. Ma. Gabriela Zapata

Lic. Karol Contreras

Agradecimiento: La coordinación agradece, la ardua labor realizada por el personal

docente del DPAF-UNA y PROMIPAC en el desarrollo y revisión de este material que

relacionados con dicho expertis.

Plagas en América Central (PROMIPAC) y al patrocinio de la Cooperación Suiza en

2012 Universidad Nacional Agraria (UNA); Programa de Manejo Integrado de Plagas en

América Central (PROMIPAC-ZAMORANO). Se autoriza la reproducción total o parcial de

Gutiérrez Y. 2012. Universidad Nacional Agraria MÓDULO PRÁCTICO: Técnicas de

laboratorio. Managua, Nicaragua. 1° Edición, 2012. 6 1 p .

INDICE DE CONTENIDO PAGINA

GUÍA 1 . Organización, estructura y trabajo aséptico de 5

GUIA 2. Preparación de medios de cultivos ó nutritivos 10

GUIA 3. Técnicas de aislamiento de Oomycetes y Hongos 12

GUIA 4.Técnicas de aislamiento de Bacterias fitopatógenas 14

GUIA 5.Técnicas de extracción de Nematodos de suelo y 17

GUIA 6. Evaluación de sanidad de la semilla 20

GUIA ?.Técnicas de inoculación de Bacterias y Hongos 23

GUIA B. Técnica Elisa para la detenninación de presencia 27

GUIA 9. Técnicas de aislamiento de Hongo 30

GUIA 10. Calibración de microscopio 33

GUIA 1 1 . Determinación de concentración de esporas o 36

propáoulos mediante el Hemacitómetro

GUIA 12. Organización y principios de trabajo con técnicas 40

ANEXO INDICE DE ANEXO PAGINA

1 Anexo 1 . Trabajo aséptico de laboratorio 44

2 Anexo 2. Receta de medios de cultivos ó nutritivos 46

3 Anexo 3. Técnicas de aislamiento de Oomycetes y 50

4 Anexo4. Técnicas de aislamiento de bacterias 54

5 Anexo 5. Técnicas de extracción de nematodos de 55

suelo v material veaetal

6 Anexo 6. Evaluacion de Sanidad de semillas 58

7 Anexo 7. Técnicas ELISA para detección de Virus 59

8 Anexo 8. Organización y principios de trabajo de 59

laboratorio con técnicas moleculares

La Universidad Nacional Agraria, (UNA), institución de educación superior que

contribuye al desarrollo agrario, mediante la formación de profesionales y el

Programa de Manejo Integrado de Plagas en América Central PROMIPAC, cuyo

objetivo es fortalecer la capacidad de instituciones agropecuarias en

Centroamérica, ambas instituciones en pro de potencializar las capacidades

nacionales y comprometidas con el desarrollo social y productivo del país, hacen

posible la publicación del presente Compendio de Guias de Técnicas de

Con el compromiso de fortalecer las capacidades técnicas de futuros profesionales

y sector agropecuario en general, el Compendio de Guías de Técnicas de

Laboratorio, provee de herramientas para el diagnóstico de enfermedades en

plantas a nivel de laboratorio y práctica de invernadero; están orientadas en una

secuencia, que describen protocolos prácticos, sencillos y de esta forma

Según el trabajo que se realiza existen diversos tipos de laboratorios: clínico