Fitomanual 2020-1

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO CIENCIAS AGRÍCOLAS
SECCIÓN AGROECOSISTEMAS
FITOPATOLOGÍA
Manual de Prácticas
ASIGNATURA: Fitopatología
CLAVE: 1614
CLAVE CARRERA: 204
AUTORES
M. en C. Yazmín Cuervo Usán
Dra. Rosa Navarrete Maya
Biol. Marcos Espadas Reséndiz
M. en C. Gloria Zita Padilla
FECHA DE REVISIÓN: Agosto de 2018
Pág. 1 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

ÍNDICE.
Introducción 3
Objetivos 4
Reglamento interno de los laboratorios de ciencias agrícolas 5
Relación de prácticas 8
Evaluación del curso 8
Relación de Anexos 9
Material necesario para las prácticas 10
Manejo de residuos peligrosos 10
PRÁCTICA 1. Métodos de Colecta 11
PRÁCTICA 2. Elaboración de medios de cultivo y técnicas de 17
aislamiento de microorganismos
PRÁCTICA 3. Identificación de bacterias fitopatógenas 24
PRÁCTICA 4. Identificación de hongos fitopatógenos 28
PRÁCTICA 5. Identificación de nematodos fitopatógenos 33
PRÁCTICA 6. Identificación de síntomas en plantas enfermas 37
PRÁCTICA 7. Control biológico 52
ANEXOS 55
Anexo I. Proyecto Semestral 56
Anexo II. Elaboración de medios de cultivo 58
Anexo III. Purificación de partículas virales 65
Anexo IV. Microcultivo 67

INTRODUCCIÓN.
La Fitopatología, como una ciencia de fines prácticos, podría considerarse
relativamente joven. Si bien es cierto que desde la época antigua todas las culturas se
interesaron en el conocimiento de las enfermedades de las plantas y su control
(aplacando la ira de los dioses con sus sacrificios y ofrendas). Es solo hasta mediados
del siglo XIX cuando su estudio se intensifica, primero con el descubrimiento de los
agentes causales de las enfermedades y el desarrollo de la metodología para su
estudio, y posteriormente, ensayando medidas preventivas al iniciarse la producción
masiva de alimentos.
Actualmente esta ciencia ha adquirido una importancia relevante, porque su eficiente

conocimiento y aplicación redundan en una mayor producción alimenticia, tan
importante para mantener el nivel y estabilidad de vida de un pueblo.
Siendo la Fitopatología la ciencia que estudia las enfermedades de las plantas, sus
agentes causales, su interacción con los hospederos, así como su sintomatología y
medios de control, es notorio el papel que desempeña dentro de esta ciencia el trabajo
de gabinete, es decir, el análisis de laboratorio, ya que es en este lugar donde se
establece el conocimiento de cada uno de los enunciados anteriores.
El objetivo del laboratorio es el adiestramiento en las principales técnicas de colecta,

cultivo, identificación e inoculación de los organismos causales de las enfermedades
de las plantas. El presente manual tiene la intención de brindar a los alumnos la mínima
información necesaria para el trabajo práctico de la Fitopatología, tratando siempre de
establecer la relación hospedero-patógeno, al aportarles el conocimiento básico para
que en un futuro puedan realizar el diagnóstico en un cultivo enfermo o dañado, y
tengan noción de los métodos y técnicas de control que podrían emplear para lograr
una mejor producción.

OBJETIVO GENERAL DEL CURSO.
Que los alumnos sean capaces de reconocer los principales agentes causales de
enfermedades en las plantas (abióticos y bióticos), saber manejar adecuadamente la
terminología y metodologías fitopatológicas, discriminar entre los mecanismos de
control más efectivos para una enfermedad determinada y describir el ciclo de las
enfermedades.
OBJETIVOS DEL CURSO EXPERIMENTAL.
Preparar a los alumnos en los principales métodos de colecta, elaboración de medios

de cultivo, técnicas de asilamiento, identificación e inoculación de los organismos
causales de las enfermedades de las plantas, para poder diagnosticar una enfermedad
vegetal y recomendar los métodos de control que se emplean para lograr una mejor
producción.
Adquirir la destreza en el manejo de las principales técnicas del diagnóstico

fitosanitario y discriminar entre ellas para aplicarlas a determinado grupo fitopatógeno,
para su reconocimiento y diagnóstico (hongos, bacterias, nemátodos, virus)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
SECRETARÍA DE PLANEACIÓN
DEPARTAMENTO DE CERTIFICACIÓN
REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIOS DEL

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CAPÍTULO PRIMERO. DISPOSICIONES GENERALES
Artículo 1. El presente reglamento tiene por objeto establecer las normas relativas a la organización y
funcionamiento de los laboratorios pertenecientes al Departamento de Ciencias Agrícolas.
Artículo 2. Para los efectos del presente reglamento, se entenderá por usuarios:
I. Los alumnos de la carrera de Ingeniería Agrícola que oficialmente se encuentren inscritos y

cursando alguna asignatura que requiera la realización de prácticas en los laboratorios, algún
trabajo de investigación o servicio social.
II. Los académicos de la facultad que estén impartiendo alguna de las asignaturas adscritas a
alguno de los laboratorios o que requieran el uso de ese espacio, previa autorización del
responsable del laboratorio.
III. Los estudiantes que al haber concluido con sus estudios y que se encuentren desarrollando
alguna de las opciones señaladas en el Reglamento de Evaluaciones de la Facultad de
Estudios Superiores Cuautitlán para obtener su titulación, previa solicitud al responsable del
área en la que se esté desarrollando la opción por titulación y que demuestre que se necesita el
laboratorio para su trabajo.
IV. Personal administrativo adscrito al laboratorio.
Artículo 3. Las disposiciones de este reglamento son de orden general y se aplicarán sin perjuicio de las
particularidades que cada laboratorio tenga, de acuerdo a las actividades propias de cada asignatura
práctica que se imparta en ellos.
CAPÍTULO SEGUNDO. DE LA ESTRUCTURA
Artículo 4. La administración, vigilancia y operación de equipo especializado depende directamente del

departamento de Ciencias Agrícolas a través del responsable del laboratorio, el cual se auxiliará para
ejercer sus funciones, del personal administrativo adscrito al laboratorio.
Artículo 5. El responsable de laboratorio tiene como funciones las siguientes:
I. Dirigir el laboratorio de acuerdo a su reglamento.

II. Velar por el buen funcionamiento del equipo a su cargo.
III. Coordinar las actividades académicas del laboratorio.
IV. Coordinar las actividades del laboratorista y del auxiliar de laboratorio.
V. Las demás funciones que le sean asignadas por el Jefe de Departamento de Ciencias Agrícolas
Artículo 6. El jefe de laboratorio tiene como funciones las siguientes:
I. Supervisar y controlar el funcionamiento del laboratorio

II. Elaborar y presentar informes periódicos del laboratorio.
III. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisión mixta de
tabuladores

Artículo 7. Son funciones del laboratorista.
I. Mantener el material y equipo en condiciones de higiene y limpieza.

II. Llevar el inventario de material, equipo y reactivos del laboratorio, reportando al responsable de
laboratorio cualquier inexistencia.
III. Reportar fallas en equipo y en el suministro eléctrico, de agua, gas y vacío.
IV. Suministrar el material a los usuarios del laboratorio.
V. Cumplir el horario que se le asigne para atender a las necesidades que se tengan en el
laboratorio.
VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisión mixta de
tabuladores
Artículo 8. Son funciones del auxiliar de laboratorio:
I. Asear, lavar, esterilizar, secar y guardar el material, instrumental, equipo y mobiliario.

II. Apoyar en el levantamiento del inventario del laboratorio.
III. Proporcionar, recuperar y controlar el material, substancias, equipo e instrumental del
laboratorio, reportando faltantes, desperfectos y anomalías al responsable del laboratorio.
IV. Asear, lavar y mantener ordenada el área del laboratorio.
V. Trasladar mobiliario y equipo de laboratorio, instrumental y substancias a los lugares que le sean
indicados.
VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisión mixta de
tabuladores
CAPÍTULO TERCERO. DE LAS RESTRICCIONES
Artículo 9. Queda prohibido dentro de los laboratorios:
I. Ingresar y consumir cualquier tipo de alimento o bebida

II. Fumar
III. Usar teléfono celular o localizador
IV. Cometer desorden, bullicio o cualquier acto de indisciplina que vaya en contra de la Legislación
Universitaria
V. Realizar acciones que pongan en peligro la integridad física de los demás usuarios del
laboratorio.
VI. Utilizar y manipular cualquier instrumento, equipo o reactivo sin autorización del profesor
responsable de la práctica o del responsable del laboratorio.
VII. El ingreso a toda persona ajena que interfiera con el desarrollo de las actividades que se realizan
en éstos.
VIII. El almacenaje de cualquier material ajeno a las labores propias del laboratorio.
Artículo 10. Se deberá respetar el horario asignado para el desarrollo de cada práctica. Los usuarios que
estén desarrollando trabajos de investigación, servicio social u otros, no podrán realizar trabajos durante
el horario asignado a las prácticas de las materias que se impartan en alguno de los laboratorios.
CAPITULO CUARTO. DEL USO Y LOS USUARIOS DEL LABORATORIO
Artículo 11. Todos los usuarios de los laboratorios tienen los mismos derechos y obligaciones.
Artículo 12. El usuario tiene la obligación de conocer las normas del presente reglamento, para ejercer
sus derechos y cumplir con las obligaciones y responsabilidades derivadas del uso del laboratorio.
Artículo 13. Los alumnos para poder obtener calificación aprobatoria en el curso de enseñanza
experimental deberán haber asistido durante el semestre como mínimo el 80%.

Artículo 14. Los usuarios del laboratorio tendrán derecho a utilizar el material y equipo necesario para la
realización de sus prácticas curriculares.
Artículo 15. Los usuarios tienen el derecho de ser atendidos con eficiencia para el desarrollo de las
prácticas programadas.
Artículo 16. Los profesores que tengan programado realizar prácticas de laboratorio deberán elaborar
una lista de los requerimientos al inicio del semestre para que el responsable o laboratorista proporcione
el material solicitado en tiempo y forma.
Artículo 17. Para el uso de los equipos de laboratorio debe revisarse el manual de uso de cada equipo y
registrar el tiempo de uso en la bitácora.
Artículo 18. Para el uso del equipo de laboratorio, el usuario deberá llenar el formato correspondiente y
dejar credencial de la universidad. En caso de deterioro o daño causado al material o equipo se deberá
llenar el formato correspondiente de adeudo y quedará como garantía la credencial de la UNAM vigente.
Artículo 19. Los materiales y equipos deberán ser entregados a los laboratoristas en las mismas
condiciones en que los recibieron. En los casos en que el manual indique algún procedimiento previo,
éste deberá seguirse.
Artículo 20. El usuario conservará y mantendrá el orden y limpieza de las instalaciones y equipo del
laboratorio.
Artículo 21. El usuario deberá reportar cualquier falla del equipo ante el profesor titular del grupo o
responsable del laboratorio o laboratorista, inmediatamente para deslindar responsabilidades
Artículo 22. Esta prohibido a los alumnos el paso al interior de los anexos.
Artículo 23. Cuando el manual de prácticas lo indique los usuarios deberán usar: bata, lentes de
protección, guantes, o ropa especial.
Artículo 24. El tiempo de tolerancia para llegar y entrar al laboratorio será de un máximo de 15 min.
Artículo 25. Al término de la práctica, cerciorarse que las llaves de gas, vacío y agua queden cerradas; y
que el equipo eléctrico quede desconectado.
Artículo 26. A los residuos generados durante la realización del trabajo experimental, deberá de dársele
el manejo indicado en el manual de prácticas.
Artículo 27. En caso de accidente, se debe avisar inmediatamente al profesor o a los laboratoristas.
CAPÍTULO QUINTO. DE LAS SANCIONES
Artículo 28. Toda persona ajena que ingrese sin la autorización correspondiente, se hará responsable de
los daños que se ocasionen a los experimentos o prácticas que se realizan y se fincará responsabilidad
de acuerdo a la legislación universitaria vigente.
Artículo 29. El material consumible que sea extraviado o deteriorado por el usuario deberá ser repuesto
por él.
Artículo 30. Cualquier uso indebido del laboratorio, equipo u otros recursos dará lugar, según la gravedad
y circunstancias del caso, a cualquiera de las sanciones que aplican en la legislación universitaria.

RELACIÓN DE PRÁCTICAS.
Número y Nombre de la
Número TÍTULO Unidad Temática en el
Programa de la Asignatura
1 Métodos de Colecta 1 Introducción
2 Elaboración de medios de cultivo y 1 Introducción
técnicas de aislamiento de 2 Generalidades de
microorganismos microorganismos
3 Identificación de bacterias fitopatógenas 2 Generalidades de
microorganismos
4 Identificación de hongos fitopatógenos 2 Generalidades de
microorganismos
5 Identificación de nematodos 2 Generalidades de
fitopatógenos microorganismos
6 Identificación de síntomas de las 3 Principios de la Fitopatología
plantas enfermas
7 Control biológico 4 Métodos de control de las
enfermedades de las plantas
5 Enfermedades de importancia
EVALUACIÓN DEL CURSO
Teoría – 50 %
Práctica – 50 %
PUNTOS A EVALUAR PORCENTAJE

PROPUESTO
1. Asistencia 80 % mínimo
2. Prácticas 20 %
3. Proyecto semestral 20 %
4. Examen 10 %
Total 50 %

RELACIÓN DE ANEXOS.
Anexo I. Proyecto Semestral

Anexo II. Elaboración de medios de cultivo
Anexo III. Purificación de partículas virales
Anexo IV. Microcultivo
Anexo V. Medida de estructuras de agentes fitopatógenos con microscopio óptico
Anexo VI. Cuantificación de la concentración de inóculo

MATERIAL NECESARIO PARA LAS PRÁCTICAS.
POR EQUIPO POR GRUPO

1 m de franela 1 caja de portaobjetos
1 m de manta de cielo 1 caja de cubreobjetos
0.5 l de blanqueador de ropa 1 bolsa de detergente
1 marcador indeleble 1 rollo de papel aluminio
cerillos 1 paquete de algodón
1 rollo de maskin-tape 1 rollo de papel adherente
1 charola de plástico tipo panera 10 goteros con frasco de
etiquetas engomadas color ámbar
.
En las prácticas 2, 3, 4 y 5, cuando los aislamientos de microorganismos (bacterias,
hongos y nematodos) se desechan, se convierten en residuos biológicos peligrosos.
Por lo tanto, es muy importante darle el manejo adecuado que contrarreste su
peligrosidad. Todos los recipientes que contengan estos cultivos (principalmente cajas
de Petri), deberán envolverse en papel periódico en paquetes de tres cajas cada uno.
Una vez envueltos se esterilizarán en autoclave para destruir a los microorganismos. El
medio de cultivo sobrante y las cajas de Petri desechables deberán ponerse en bolsas
especiales para incinerarse en el horno de Veterinaria. Así mismo, los restos que
contengan nematodos deberán seguir el mismo procedimiento.

Práctica 1. MÉTODOS DE COLECTA.
INTRODUCCIÓN.
El diagnóstico de las enfermedades de las plantas se refiere a la determinación del

agente causal de una enfermedad, y es una de las bases indispensables para lograr un
control eficaz. Sólo cuando se conoce el agente causal puede consultarse la literatura
especializada que revela la experiencia de otros fitopatólogos y puede servir para
planear las medidas de control.
Ciertas enfermedades pueden ser reconocidas fácilmente, es decir, a simple vista,

basándose en la experiencia y en las particularidades de los patógenos que los hacen
inconfundibles, pero hay muchas otras que se confunden, y entonces el diagnóstico se
complica, teniendo que realizar las siguientes actividades: colecta, aislamiento,
identificación del patógeno, inoculación, reaislamiento y confirmar la
identificación.
La colecta inicia con una observación de alteraciones en nuestro cultivo, y será mas
precisa si el que la realiza ha examinado personalmente la enfermedad en el campo.
Un observador cuidadoso puede obtener datos valiosos que faciliten todo el proceso.
Por ejemplo la distribución local de una enfermedad varía de acuerdo a las
circunstancias, es decir, pueden estar atacadas todas las plantas por igual, algunas
más que otras, plantas sanas alternadas con plantas enfermas, áreas bien definidas de
plantas enfermas, en hileras en los bordes de la plantación, en las partes más bajas o
distribuidas al azar. Es importante notar la presencia de focos de infección inicial, a
partir de los cuales se extiende la enfermedad, ya que esa información da idea del
patrón de diseminación y de la fuente de inóculo primario. En el desarrollo de la
Fitopatología práctica es de suma importancia la colecta del material enfermo, ya que
de esto dependerá el que se puedan realizar las técnicas conducentes a una
identificación acertada del patógeno en cuestión.
OBJETIVO.
Manejar las técnicas más comunes de colecta y preservación de material de estudio

fitopatológico.
ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA.
Entregar resuelto el siguiente cuestionario

1. ¿Qué es el diagnóstico de las enfermedades?
2. ¿Por qué es indispensable llevar a cabo un diagnóstico?
3. ¿En cuáles casos es fácil diagnosticar una enfermedad?

4. ¿Qué actividades se deben realizar cuando el diagnóstico se complica?
5. ¿Qué es una colecta fitopatológica?
6. ¿Por qué y cuándo se debe realizar una colecta?
7. ¿Qué observaciones se deben hacer en el campo?
8. ¿Cuál es el objetivo de esta práctica?
9. ¿Qué material se necesita para realizar una colecta?
10. ¿Cómo se detectan los problemas fitopatológicos?
11. ¿De qué dependen las partes vegetales que es necesario colectar?
12. ¿Qué se debe colectar en un cultivo anual?
13. ¿Qué se debe colectar en un cultivo perenne?
14. ¿Qué se debe hacer si el tejido es carnoso?
15. ¿Qué se debe hacer si la planta presenta nodulaciones en la raíz?
16. ¿Qué se debe anotar en la libreta de campo con respecto al material colectado?
17. ¿Qué usos se le puede dar al material colectado?
18. ¿Qué se debe hacer si el material colectado se va a utilizar para realizar
aislamientos?
19. ¿Qué se debe hacer si el material colectado se destinará al herbario fitopatológico?
20. ¿Qué es una solución fijadora?
EQUIPOS, REACTVOS Y MATERIALES

Pala recta Lupa de campo Libreta de campo
Tijeras de podas Bolsas de papel secante Ligas
Serrucho Prensa botánica Engrapadora
Cámara fotográfica Periódico y cartón Frascos
Etiquetas Papel secante Soluciones fijadoras
Papel secante Navaja de campo Hielera portátil
Navaja de campo
Preparación de soluciones preservadoras.
F.A.A
Formol al 40% 10 ml
Ácido acético glacial 10 ml
Alcohol al 50% 100 ml
SOLUCION DE HESLER
Agua destilada 1000 ml
Cloruro de Zinc 50 ml
Formalina 25 ml
Glicerina 25 ml

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
Se discutirá el cuestionario antes de salir a efectuar la colecta.
Los problemas fitopatológicos se pueden presentar en hojas, raíces. tallos, etc, y

se detectan cuando las plantas crecen anormalmente, se secan o se mueren,
disminución de la cosecha, alteraciones en el crecimiento, decoloraciones,
sobrepigmentaciones, manchas, rayados, pudriciones, marchitamientos, etc. Es
conveniente disponer del mayor número de elementos vegetales colectados que
permitan lograr la identificación del agente causal.
Las partes vegetales que deben colectarse dependen del tipo de cultivo que se
trate:
Cultivo anual. Se deberán colectar varias plantas completas que presenten

síntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la enfermedad,
pero que no estén en est ado de descomposición o totalmente muertas,
pues así no son útiles para su estudio en el laboratorio. Si el cultivo ya esta
muy desarrollado, se deben colectar solo porciones de los órganos
atacados. Es conveniente colectar también una planta sana que sirva de
comparación.
Cultivo perenne. Se colectan partes representativas, como raíz, tallo hojas,

flores y frutos; igualmente con síntomas iniciales y en diferentes etapas de
desarrollo de la enfermedad, y partes sanas para la comparación. Tampoco
se deben colectar partes que estén completamente muertas o en estado de
descomposición.
Para partes vegetales carnosas, como frutos y bulbos, se deben colectar en

frascos con soluciones fijadoras. En el caso de que la planta presente
nodulaciones en la raíz, es muy probable que se trate de infestaciones de
nematodos, por lo que se deben tomar muestras del suelo que hayan estado en
contacto con la raíz. En el caso de que las plantas sean pequeñas, se debe sacar
la planta entera y, sin sacudir el suelo de las raíces, se debe meter en una bolsa
de plástico junto con aproximadamente 250 gr. de suelo, y cerrarla con una liga
para evitar que los nematodos mueran. Las bolsas no deben exponerse al sol.
Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, se acompañen de la

mayor cantidad de datos posibles, que se anotarán en la libreta de campo.
El material colectado puede emplearse para realizar aislamientos del agente

causal, en cuyo caso se puede prensar o conservarse en refrigeración, o bien,
como material de herbario, empleándose el prensado o la preservación en
fijadores* como el alcohol al 70 %, el F.A.A. o la solución de Hesler.

El material de herbario se debe montar en cartulinas blancas de 25 x 45 cm,
siguiendo las técnicas de herbario acostumbradas. Todo material preservado debe
llevar su etiqueta correspondiente.
Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan acompañados

con los siguientes datos:
DATOS DE COLECTA
1. Datos generales
Muestra No. Variedad
Localídad Edad del cultivo
Fecha Cultivos anteriores
Cultivo (hospedero) Predio
2. Apariencia general del cultivo
Marchitez Tizones
Amarillamiento Desarrollo anormal
Manchas foliares Otros
Áreas muertas
3. Parte atacada de la planta
Raíz Brotes o tallos
Hojas Flores
Frutos
4. Distribución de la enfermedad
Periférica Paralela
Manchones Al azar
5. Condiciones prevalecientes durante la aparición de los primeros asíntomas del
desarrollo de la enfermedad
Precipitación Humedad relativa
Vientos Heladas
Granizo Otros
6. Labores culturales
Frecuencia del Fertilización
riego
Incorporación de Aclareos
Materia orgánica Otros
Podas
7. Químicos aplicados al cultivo
Fertilizantes Insecticidas
Herbicidas Fungicidas
Defoliantes Otros
8. Características del suelo

Drenaje Textura
pH Otros
9. Posibles deficiencias o excesos nutricionales
N Mg
P Mn
K Bo
Zn Otros
Ésta información se puede complementar con algunos datos que se toman en el

laboratorio, los cuales pueden ayudar al diagnóstico de la enfermedad y a la
identificación del agente causal.
DATOS DE LABORATORIO
Características de las lesiones
Presencia de esporas, micelio, cuerpos fructíferos o cualquier estructura
Exudaciones, indicando el color, la consistencia, etc.
Presencia de insectos o ácaros
Evidencia de daños mecánicos
El material colectado puede emplearse para:
a) Realizar aislamientos del agente causal. En este caso se puede prensar o

preservarse en refrigeración.
b) Como material de herbario, empleándose el prensado, o bien la

preservación en fijadores* como alcohol al 70%, F.A.A. o solución de
Hesler. En el primer caso los ejemplares deben ser montados en cartulinas
blancas de 25 x 45 cm., siguiendo las técnicas de herbario acostumbradas.
Todo el material preservado debe llevar su etiqueta correspondiente.
ELABORACIÓN DEL REPORTE.

Por equipo
Llevar a cabo la descripción detallada de la actividad de campo, ilustrada con
fotografías
BIBLIOGRAFIA.
1. Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatología General. Herrero

Hnos. México. 59 p

2. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC
Press. Florida, USA. 355 pp
3. González, L.C. 1977. Introducción a la Fitopatología. I.I.C.A. San Jose de

Costa Rica. 148 p.
4. López A.G. 1978. Técnicas de uso común en el manejo de Hongos

fitopatógenos. Tesis. E.N.A. Méx.
5. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis.

Marcel Dekker Inc. New York. 518 pp.
6. Roberts, G. y C. Boothroyd. 1972. Fundamentos de Patología Vegetal. Acribia.

Zaragoza. 392 p.
7. Tuite, J. 1964. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria. Burges Pobl.
Co. Minneapolis. 239 p.
8. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,

Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

Práctica 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
INTRODUCCIÓN.
En el diagnóstico de las enfermedades vegetales, el trabajo de laboratorio es de

suma importancia, ya que es ahí donde se efectúa la identificación del agente
causal, lo que posibilita la aplicación de los métodos de control más adecuados.
El proceso de identificación de un patógeno requiere el aislamiento del mismo,

para lo que es necesario elaborar de medios de cultivo que permitan el desarrollo
de dicho patógeno.
Una identificación científica en Fitopatología, debe realizarse según los

Postulados de Koch, que revisten una importancia dentro de a Fitopatología, y
deben seguirse siempre que se está frente a una enfermedad de la que se
desconozca o se dude del agente causal.
Los Postulados de Koch son los siguientes:
1. El organismo o agente causal debe estar constantemente asociados con la

enfermedad.
2. El organismo debe ser aislado y cultivado en cultivo puro (identificación).
3. Al inocular una planta susceptible sana, debe desarrollarse la enfermedad
original.
4. El organismo patógeno debe ser aislado de la planta infectada bajo
condiciones experimentales (reidentificación), y debe ser igual al original.
AISLAMIENTO.
En la naturaleza abundan los microorganismos que se desarrollan estrechamente

relacionados entre sí, de manera que encontramos bacterias, hongos y otros
organismos de muy diversos tipos, tanto de vida libre como parásitos. Para poder
estudiarlos y conocerlos se deben cultivar en medios adecuados aislándolos del
suelo o de partes vegetales enfermas. A partir de la primera muestra que se
coloca en un medio de cultivo, se obtiene un cultivo mixto del que se deben
tomar nuevas muestras para realizar otros cultivos, seleccionando las diferentes
colonias, hasta lograr que en el medio se desarrolle un solo tipo de organismo,
consiguiendo de esta forma un cultivo puro.
Para realizar aislamientos a partir del suelo, existen diversas técnicas como la de
placa directa y el de dilución en serie. En el caso de que el patógeno se encuentre
en las partes vegetales, se puede proceder a realizar aislamientos directos, utilizar
cámaras húmedas, colocar partes vegetales en el medio de cultivo, emplear
trampas, etc.

MEDIOS DE CULTIVO.
Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el
aislamiento, determinación, desarrollo, reproducción e identificación de aquellos
organismos productores de enfermedades de las plantas, que se comportan como
parásitos facultativos. Para lograr el desarrollo y reproducción de las diferentes
especies fitopatógenas, los medios de cultivo deben reunir características
especiales, tomando en cuenta los factores que se mencionan a continuación:
Nutrientes. En el medio de cultivo deberán estar presentes elementos

nutricionales tales como fuentes de carbono, nitrógeno, macroelementos (P,
K, Mg, Ca), microelementos (Fe, Zn, Mn, Cu, Mo), vitaminas, etc.
Humedad. Deberá proporcionarse una humedad relativa favorable a los
fitopatógenos que se desee cultivar. Generalmente requieren del 50 % o
más.
Temperatura. Los valores óptimos de ésta son muy variables para cada
especie, pero la mayoría de ellas pueden crecer en un rango de 20 a 25 ºC.
Este es un factor determinante para el desarrollo y la reproducción.
pH. También en este caso los valores óptimos son muy variables, pero en
general los hongos fitopatógenos se desarrollan y reproducen mejor en pH
ligeramente ácidos, mientras que las bacterias prefieren los ligeramente
alcalinos.
Luz. Este factor en algunos casos afecta la reproducción de los hongos
fitopatógenos, pero en general no influye.
Asepsia. Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo
de cualquier contaminación por otros microorganismos.
Clasificación de los medios de cultivo.
Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo a su composición o a su

consistencia, quedando de la siguiente manera:
Composición.
Medios de cultivo sintéticos. Son aquellos medios de cultivo en los que

se conoce exactamente la composición de cada uno de sus
componentes, por ejemplo: agar y Czapek.
Medios de cultivo complejos o semisintéticos. En estos la
composición de alguno de sus componentes no se conoce de manera
exacta, o bien, se componen de sustancias naturales y sustancias
sintéticas, por ejemplo PDA (papa-dextrosa-agar).
Medios de cultivo naturales. Se forman a partir de material vegetal
natural, por ejemplo: hojas, tallos, vainas, tubérculos, raíces, etc.

Consistencia.
Medios sólidos. Contienen esencialmente agar, gelatina, albúmina, etc.,

materiales que al enfriarse solidifican. Son muy empleados para el
aislamiento y la reproducción de hongos y bacterias.
Medios semisólidos. Contienen bajas proporciones de agar y gelatina
mezclados o separados; al enfriarse permanecen en estado coloidal. Se
emplean para mantener cultivos por largo tiempo.
Medios líquidos. Son preparados sin agar, gelatina, u otras sustancias
solidificantes, por lo que permanecen líquidos aún al enfriarse. Se
emplean cuando se necesita incrementar el inóculo de hongos o
bacterias.
Los medios de cultivo de uso frecuente son los siguientes:
1. PDA (papa-dextrosa-agar)
2. AN (agar nutritivo)
3. HFA (harina de frijol-agar)
4. V8 (jugo V8 agar}.
5. AVA (avena-agar).
6. TSA (jugo de tomate-sal-agar)
7. MM (medio de Martin).
8. VFA Vainas de frijol-agar)
9. AA (agua-agar)
10. HMA (harina de maíz-agar)
11. JFA (jugo de frijol-agar)
12. JTA jugo de tomate-agar)
13. MSA (malta-sal-agar)
14. BA (Bonner Addoat).
15. BK (medio B de King)
OBJETIVO.
Adiestrar a los alumnos en la preparación de medios de cultivo y en las técnicas
de aislamiento de agentes fitopatógenos más utilizados.
Entregar resuelto el siguiente cuestionario
1. ¿Cuáles son los postulados de Koch?

2. ¿Qué relación tienen los postulados de Koch con el diagnóstico de las
enfermedades de las plantas?
3. ¿Cuáles son las actividades que se llevarán a cabo en esta práctica?
4. ¿Cuáles son los factores a considerar en los medios de cultivo?

5. Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y a su
composición.
6. ¿Cuáles son los diferentes tipos de asilamientos que se van a realizar?
7. ¿Cuántos tipos de cultivos se pueden obtener en un asilamiento?
EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES.
Asa microbiológica Mechero Balanza granataria

Pinzas de disección Soporte con anillo Papa, jugo de tomate, etc.
Agujas de disección Tela de asbesto Partes vegetales enfermas
10 cajas de Petri
ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR,

DESINFECTA LA MESA CON CLORO
Las actividades que se llevarán a cabo en esta práctica son 3:
1. Preparación de los medios de cultivo

2. Vaciado del medio de cultivo a las cajas de Petri
3. Aislamiento de los agentes causales.
1. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Cada equipo elaborará el medio de cultivo que le indique el Profesor, de acuerdo a

las necesidades de su Proyecto Semestral.
2. VACIADO DEL MEDIO DE CULTIVO A CAJAS DE PETRI.
Para llenar las cajas de Petri con el medio de cultivo de una manera aséptica se
deben realizar los siguientes pasos:
1. Limpiar la mesa con una solución de agua y cloro 5:1

2. Colocar y encender el mechero o lámpara de alcohol
3. Poner las cajas y recipientes con el medio sobre la mesa
4. Tomar el recipiente con el medio de cultivo y destapando con la mano
izquierda, pasar la boca del recipiente sobre la llama del mechero.
Conservar el tapón en la misma mano con que se sostiene el recipiente del
medio
5. Tomar con la mano derecha una caja de Petri y levantar la tapa lo suficiente
para verter el medio de cultivo. Vaciar en cada una de 10 a 12 ml
6. Colocar la tapa de la caja de Petri suavemente, y tapar el recipiente del

medio de cultivo
7. Distribuir uniformemente el medio con movimientos de rotación
8. Colocar las cajas en una superficie horizontal, y dejar solidificar.
9. Una vez solidificado el medio, realizar pruebas de esterilidad por incubación
a 35 ºC durante 48 hrs
3. AISLAMIENTO.
Todos los aislamientos deben hacerse en un ambiente aséptico, es decir, a la

flama del mechero, para evitar contaminaciones. Existen varias técnicas de
aislamiento. El aislamiento que se va a llevar a cabo es el que utiliza las partes
vegetales enfermas, con sus tres variantes.
Aislamiento a partir de partes vegetales enfermas.
Aislamiento directo. Cuando se observan las fructificaciones o el micelio

en el ejemplar enfermo, hacer lo siguiente:
1. Se toma una muestra de este material con una aguja de disección estéril
y se coloca directamente sobre el medio de cultivo.
2. Se incuba a 24 ºC y se observan resultados después de 4 a 5 días.
Partes vegetales en medio de cultivo. Cuando solamente se observan los

síntomas, se debe colocar la parte que muestra el daño.
1. La porción vegetal que muestra los síntomas se desinfecta con una de
agua destilada estéril y cloro (NaOCl) y 5:1, agitando durante un minuto.
2. Se elimina el exceso en papel absorbente estéril colocando el vegetal en
cajas de Petri con medio de cultivo.
3. Las cajas de Petri se sellan con parafilm
Cámara húmeda. Cuando las partes vegetales afectadas presentan

micelio, pero no hay fructificaciones, o cuando no se aprecia el crecimiento
del patógeno, se recurre al uso de la cámara húmeda.
1. Se toma una porción del tejido enfermo y se desinfecta en una solución
de cloro (NaOCl) y agua destilada estéril 5:1, agitando durante un
minuto.
2. Se elimina el exceso en papel absorbente estéril colocando el vegetal en
cajas de Petri con un papel filtro en su interior, previamente
esterilizadas.
3. Se humedece con agua destilada estéril y se tapa la caja, sellándola con
parafilm

Aislamiento del suelo.
Técnica de dilución en serie.

1. Se pesa 1g de suelo y se agrega a un tubo de ensaye con 10 ml de
agua destilada estéril
2. Se agita manualmente durante 1 minuto aproximadamente
3. Se toma una alícuota de 1 ml con una pipeta y se agrega a otro tubo de
ensaye que contenga 9 ml de agua destilada estéril y se agita
nuevamente durante 1 minuto
4. Se repite la operación hasta llegar a la dilución 10-4
5. De cada dilución se toma una alícuota de 1 ml, la cual se siembra en las
placas con medio de cultivo PDA y se distribuye uniformemente
6. Se sella cada caja con parafilm y se incuban en posición invertida a una
temperatura de ± 26°C durante 7 días

Por equipo
La entrega del reporte consistirá en la resolución del siguiente cuestionario:
1. ¿A qué tipo de medios de cultivo (natural, semisintético o sintético) pertenecen

los utilizados en esta práctica? Expliquen su respuesta.
2. ¿Cuál es la importancia de la asepsia en un laboratorio de Fitopatología?
3. ¿Qué es la esterilización y cuáles son los métodos más frecuentes para
esterilizar materiales fitopatológicos?
4. Describan ampliamente los tipos de colonias que surgieron en los aislamientos
a partir del suelo y partes vegetales enfermas. Ilustren con fotografías.
5. ¿Cómo realizarían un cultivo de Puccinia graminis tritici y del virus del mosaico
amarillo del frijol, a partir de vegetales enfermos?
MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS.

Las instrucciones se encuentran en la página 7.
BIBLIOGRAFÍA.
1. Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier Acad. Press. Amsterdan.
992 pp.
2. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Op. cit.
3. Echandi, 1975. Op. cit.

4. French, E.R. y Her. 1980. Métodos de Investigación Fitopatológica. IICA. San
José de Costa Rica. 289 p.
5. Gaviño, G. C., C. Juárez y H. Figueroa. 1975. Op. cit.
6. López A.G. 1978. Op. cit.
7. Narayanasamy, P., 2001, Op. cit.
8. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant
pothogenic fungi. C A B International. Oxford. 267 pp.
9. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,

Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,
Washinton, D.C., 413 pp.

Práctica 3.
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FITOPATÓGENAS
INTRODUCCIÓN.
En el proceso de diagnóstico de las enfermedades de las plantas, la identificación

del agente causal ocupa un lugar preponderante. Las técnicas de identificación
particularizan en los agentes bióticos que causan enfermedades, en decir, en los
microorganismos fitopatógenos, entre los que encontraremos virus, fitoplasmas,
espiroplasmas, bacterias, hongos y nemátodos. Los virus son tan pequeños y
requieren de técnicas tan elaboradas para su observación que es imposible
llevarla a cabo en un laboratorio como este. En cambio, es completamente factible
observar a las bacterias (y organismos semejantes a ellas), a los hongos y a los
nemátodos.
Las bacterias son microorganismos pertenecientes al Reino Procaryotae. Se

encuentran ampliamente distribuidas en la Naturaleza. Su forma puede ser
esférica, de bacilo o de espiral. Se encuentran constituidas con las siguientes
estructuras: cápsula de secreción, pared celular, membrana celular y citoplasma,
este último conteniendo gránulos de grasa, vacuolas, pigmentos y material
genético disperso, es decir, carecen de membrana nuclear (procariontes). Algunas
bacterias tienen flagelos y pueden desplazarse en medios líquidos. La pared
celular determina la forma de las bacterias y es selectiva, pudiendo contener
aminoácidos aromáticos, proteínas, ácidos teicoicos y diferentes azúcares.
Dependiendo de la cantidad de éstos, las bacterias pueden teñirse de rojo o de
violeta al seguir la técnica de tinción de Gram. Se conocen aproximadamente 1600
especies de bacterias. La mayoría son saprófitas obligadas y como tales
benefician al hombre porque ayudan descomponiendo grandes cantidades de
materia orgánica y deshechos animales y vegetales.
OBJETIVO.
Identificar las características morfológicas que distinguen a las bacterias en

preparaciones temporales y permanentes

Investigación acerca de la tinción de Gram y su importancia en la identificación de
las bacterias.

Portaobjetos Cristal violeta Sulfato de cobre Aceite de
Cubreobjetos Safranina Alcohol etílico inmersión
Agujas de disección Agua destilada Lugol Microscopio
Cultivos de bacterias Asa de siembra Mechero compuesto

1. Elaboración de preparaciones temporales y permanentes de bacterias.

2. Tinción de bacterias por el método de Gram.
3. Tinción de productos de excreción y cápsula de bacterias.
4. Tinción de flagelos de bacterias.
ANTES DE EMPEZAR A TRABAJAR,

DESINFECTA LA MESA CON CLORO
1. Técnica para realizar preparaciones temporales

1. Trabaja cerca de la flama. Flamea el asa o la aguja de disección hasta obtener
el rojo vivo, para evitar contaminaciones. Permite que se enfríe.
2. Con el asa o aguja toma una pequeña muestra de bacterias del cultivo, colócala
en un portaobjetos limpio con una gota de agua destilada
3. Coloca el cubreobjetos inclinado, evitando que se formen burbujas. Cuando el
fluido se extiende por el borde, se deja caer suavemente.
4. Observa la preparación al microscopio utilizando diferente objetivos. Siempre
debes empezar con el aumento de 10X y avanzar progresivamente. Recuerda
que con el objetivo de 100X debes agregar una gota de aceite de inmersión
sobre la preparación, antes de colocar el lente.
5. Si observas bacterias, puedes teñir la preparación, utilizando alguna de las
técnicas sugeridas.
2. Tinción de GRAM
1. En una gota de agua coloca una pequeña masa de bacterias
esparciéndolas a lo largo del portaobjetos. El cultivo debe ser de
preferencia de 24 horas.
2. Fija la preparación al aire o directamente a la flama.
3. Cubre la preparación con cristal violeta durante 1 min. y decanta.
4. Cubre la preparación con lugol durante 1 min. Y lava con agua corriente.
5. Decolora con alcohol etílico por 30 seg. agitando para una decoloración
homogénea. Lava con agua corriente.
6. Cubre con safranina durante 1 min. y lava con agua corriente.
7. Absorbe el agua con papel.
8. Observa al microscopio. Si las bacterias tiñen de rojo son Gram (-), y si
tiñen de violeta son Gram (+). Esquematiza lo observado.

3. Tinción de flagelos de bacterias
1. Se prepara un frotis y se seca al aire.
2. Se añade el mordiente filtrado y se deja de 1 a 5 min.
3. Se lava con agua cuidadosamente.
4. Se cubre con cristal violeta se deja actuar 2 min.
5. Se repite el lavado de la misma forma.
6. Se seca la preparación al aire.
7. Se observa al microscopio con el objetivo de inmersión.
4. Tinción de productos de excreción y cápsula de bacterias.

1. Coloque en un portaobjetos una gota de tinta china bacteriológica, agregue
una pequeña muestra de bacterias, coloque el cubreobjetos y observe.
2. Haga un frotis, séquelo al aire, agregue cristal violeta durante 2 min. Lave
con sulfato de cobre al 2 % Séquelo con papel absorbente. Las cápsulas
aparecen en color azul y violeta y los cuerpos bacterianos en azul obscuro.

Por equipo.
Completa el siguiente cuadro:
Ilustra con fotografías los resultados de tus observaciones en el microscopio
Tinción de Gram
Tinción de flagelos
Tinción de productos
de excreción

MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS.
Las instrucciones se encuentran en la página 7.
BIBLIOGRAFIA.
1. Agrios, G. N. 2005. Op. cit.
3. French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Op. cit.
4. Narayanasamy, P., 2001, Op. cit.
5. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Op. cit.

Práctica 4.
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS FITOPATÓGENOS
INTRODUCCIÓN.
Los hongos y los organismos semejantes a los hongos, comprenden al grupo más
numeroso de microorganismos fitopatógenos (8000 especies) y son los causantes
de la mayoría de las pérdidas económicas agrícolas, debido al gran número de
enfermedades que ocasionan. Se considera que todas las plantas son atacadas al
menos por un hongo, y muchas son afectadas por un gran número de estos
organismos.
El hábitat de los hongos es muy amplio, ya que se encuentran en el suelo, en el

agua y en las plantas y animales. Pueden desarrollarse en condiciones climáticas
muy variadas, en todo tipo de ecosistemas.
Los organismos semejantes a los hongos pertenecen a los reinos Protozoa y

Chromista, y los hongos al reino Fungi. Son microscópicos y macroscópicos, uni y
pluricelulares. Presentan pared celular y carecen de clorofila.
Están constituidos por células redondas u ovales solitarias o en plasmodios, o más

frecuentemente por estructuras alargadas y ramificadas llamadas hifas, cuyo
conjunto se denomina micelio. Cada hifa está constituida por una pared celular
que protege a la membrana celular y al contenido protoplasmático, en donde se
encuentran dispersos sus núcleos verdaderos, así como las mitocondrias,
ribosomas, retículo endoplásmico y gránulos de sustancias de reserva. Si las hifas
están separadas en celdas, se dice que el micelio es septado, y si el protoplasma
es continuo en las hifas el micelio es cenocítico. En algunos hongos el micelio
llega a formar pseudotejidos. Prosénquima y pseudoparénquima .
Entre las estructuras de reproducción asexual están: los oídios, clamidosporas,

esporangios y conidios, estos últimos solitario o agrupados en sinemas,
esporodoquios, acérvulos o picnidios. Las esporas sexuales son: cigosporas,
oosporas, ascas -libres o en apotecios, peritecios y cleistotecios- y basidios, que
nacen directamente de una espora de resistencia o en basidiocarpo, o dentro de
basidiocarpos.
OBJETIVO.
Identificar las características morfológicas que distinguen a los hongos en
preparaciones temporales y permanentes

Portaobjetos Agua destilada Agujas de disección Lugol

Cubreobjetos Azul de metileno Cultivos de hongos Rojo congo
Microscopio Microscopio de Mechero
compuesto Disección

Por equipo
Investigación acerca de las estructuras morfológicas de los hongos que posibilitan
su identificación.
1. Elaboración de preparaciones temporales y permanentes de hongos,

utilizando diferentes técnicas de tinción.
2. Observación de las preparaciones elaboradas.
3. Fotografías de lo observado, indicando los nombres de las estructuras.
1. PREPARACIONES TEMPORALES.
1. Flamea el asa o aguja de disección en el mechero y deja enfriar
2. Coloca una gota de agua en un portaobjetos, y agrega una masa de micelio y
esporas de un cultivo de hongos.
3. Observa al microscopio.
4. Si hay micelio y esporas, agrega una pequeña gota del colorante para una
mejor observación de las estructuras.
5. Coloca el cubreobjetos y observa nuevamente al microscopio. Fotografía lo
observado, indicando los nombres de las estructuras.
2. PREPARACIONES PERMANENTES
1. Flamea el asa o aguja de disección en el mechero y deja enfriar
2. Coloca una gota de lugol en un portaobjetos, y agrega una masa de micelio y
esporas de un cultivo de hongos.
3. Observa al microscopio.
4. Si hay micelio y esporas, agrega una pequeña gota del colorante para una
mejor observación de las estructuras.
5. Coloca el cubreobjetos y observa nuevamente al microscopio. Esquematiza lo
observado.
6. Sella tu preparación con barniz transparente y etiquétala.

Por equipo
Cada equipo deberá entregar las siguientes cuadros resueltos.
Ilustra con fotografías los resultados de tus observaciones de las colonias de

hongos en la caja de Petri, con su descripción
Hongo 1
Hongo 2
Hongo 3
Hongo 4
Hongo 5
Hongo 6

Ilustra con fotografías los resultados de tus observaciones de los hongos en tus
preparaciones
Hongo 1
Hongo 2
Hongo 3
Hongo 4
Hongo 5
BIBLIOGRAFIA.
2. Barnett, H, H. L. and Hunter B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi.

MacMillan Publishing Co. New York 218 pp. 4th. Ed.
3. Cummins, G. B. and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. APS

Press 225 pp. 3th. Ed.

5. French, E.R.; Herbert, T.T. Op. cit.
6. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of ascomycetes. Volume 1. APS Press.

St. Paul, MN. 263 p.
7. León Gallegos, H. M. y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de México.

v SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp.
8. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. 2002. Hongos microscópicos saprobios y

parásitos:
v Métodos de laboratorio. UAM IB UNAM. México. 90pp.
9. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventory
v and monitoring methods, Elsevier Acad. Press. New York. 777 p.
10. Narayanasamy, P., 2001. Op. cit.
pothogenic
v fungi. C A B International. Wallinford, UK. 267 p.
12. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004. Op. cit.
13. Vánky, K. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. 238 pp. 2 th. ed.

Práctica 5.
IDENTIFICACIÓN DE NEMATODOS FITOPATÓGENOS
INTRODUCCIÓN.
Los nematodos son organismos que pertenecen al reino Animalia, y son

probablemente los animales pluricelulares ms abundantes en el mundo, después
de los insectos. Su tamaño fluctúa entre unas cuantas micras hasta 0.5-1 mm.
Los nematodos son gusanos cilíndricos con cuerpo alargado y delgado con
simetría bilateral. Su cutícula es lisa, son no segmentados y carecen de patas u
otros apéndices. Presentan todos los sistemas fisiológicos principales de todos los
animales, como lo son el sistema excretor, el sistema nervioso, el sistema
reproductor y el sistema digestivo.
Durante su ciclo de vida, los nematodos llegan a presentar cinco estados y cuatro
mudas. En algunas especies la primera y segunda etapa larval no puede infectar a
las platas, realizando sus funciones metabólicas a expensas de la energía
almacenada en el huevecillo.
Los nematodos fitopatógenos presentan géneros ectoparásitos, los cuales pasan

toda su vida en el suelo y se alimentan externamente de las raíces de las plantas
hospederas, como es el caso de Cricononemoides, Hemicycliophora y
Cacopaurus. Otros géneros son endoparásitos, produciendo lesiones internas en
los tejidos vegetales. Generalmente se ubican en el parénquima cortical, o bien
llegan hasta el cilindro central de las raíces hospederas, en donde permanecen o
migran hacia otros órganos de las plantas, por ejemplo, Aphelehchoides, Anguina
y Ditylenchus. Otros más pasan parte de su vida como endoparásitos y la otra
parte la pasan en el suelo que se encuentra alrededor de las raíces que parasitan,
por lo que se les conoce como semiendoparásitos, entre los que destacan
Meloidogyne, Heterodera y Tylenchus.
OBJETIVO.
Identificar las características morfológicas que distinguen a los nematodos en
preparaciones temporales (extracción) y permanentes.

Por equipo
Investigación acerca de las técnicas de extracción del suelo de los nematodos.

Plástico de 1 m2 Piseta Centrífuga

Probeta Caolín Agitadores
2 jarras de plástico de 1 lt Muestras de suelo Cajas de Petri pequeñas
Tamices de 100, 200 y 350 Tubos de centrífuga Solución azucarada
mallas Vasos de precipitados (55 gr/100 ml H2O)
1. Extracción de nematodos.
2. Observación de nematodos vivos.
3. Observación de preparaciones permanentes y temporales de
nematodos.
4. Tomar fotografías de lo observado, indicando los nombres de las
estructuras.
EXTRACCIÓN DE NEMATODOS POR EL MÉTODO

DE TAMIZADO-CENTRIFUGADO.
1. Se coloca 200 gramos de suelo en una jarra con agua.
2. Se agita hasta que los terrones se disuelvan.
3. Se pasa el contenido de la jarra a través de un tamiz de 0.2 (en donde se
quedan las partículas grandes, materia orgánica, etc.), y cae en una jarra en
donde se sigue agitando.
4. Se deja reposar un momento para que las partículas grandes de suelo se
asienten, y las partículas más pequeñas queden en suspensión.
5. La parte del sobrenadante se pasa por un tamiz cerrado donde solo pasa agua,
y en él se quedan las partículas más pequeñas (nematodos) junto con una
pequeña cantidad de suelo.
6. Estas partículas se colocan en tubos de ensaye, junto con una solución de
agua-azúcar, para que con el efecto de la diferencia de densidades, los
nematodos floten. Estos tubos se centrifugan 5 minutos a 2500 rpm.
7. Se centrifuga nuevamente, ahora durante 50 segundos a 1500 rpm.
8. El sobrenadante que resulta se pasa por el tamiz, y con agua se eliminan los
restos de la solución de agua-azúcar.
9. Las partículas limpias que quedan en el tamiz se pasan a una caja de Petri, y
se procede a realizar la identificación de nematodos.

Por equipo
Cada equipo deberá entregar el siguientes cuadro resuelto.
Ilustra con fotografías los resultados de tus observaciones de cada una de las
actividades realizadas
Extracción de
nematodos
Observación de
nematodos vivos
Preparaciones
temporales
Preparaciones
permanentes
BIBLIOGRAFIA.
3. French, E.R.; Herbert, T.T. 1980 Op. cit.

4. Manzanilla-López, R. H. and N. Marbán-Mendoza (eds.). 2012. Practical plant
nematology. Colegio de Pasgraduados and Mundiprensa. Biblioteca básicas de
Agricultura. Méico. 881 p.
5. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.

Marcel
a. Dekker Inc., 518 pp.
pathogenic
a. fungi. C A B International, 267 pp.
7. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Op. cit.

Práctica 6.
IDENTIFICACIÓN DE SÍNTOMAS EN PLANTAS ENFERMAS
INTRODUCCIÓN.
La Sintomatología es la rama de la Fitopatología que estudia los síntomas y los

signos que producen los patógenos en las plantas que atacan. Su conocimiento es
indispensable para el diagnóstico de las enfermedades.
Un síntoma es la manifestación visible de una condición patológica en una planta

sensible, y un signo es la estructura o evidencia del patógeno mismo, producida
dentro o fuera de los tejidos del hospedero.
Debido a la gran cantidad de síntomas que existen, se han agrupado bajo diversas
denominaciones, dependiendo de múltiples factores tales como el lugar de
aparición, del efecto del medio ambiente, del número de patógenos involucrados,
etc. Así, tenemos que los síntomas que ocurren en los órganos directamente
atacados por los patógenos se llaman síntomas primarios, en cambio, a los que
aparecen en otro órgano de la planta no atacado directamente por el patógeno,
sino como una secuela de este, se les llama síntomas secundarios. En algunas
ocasiones los hospederos son atacados simultáneamente por más de un
patógeno, provocando síntomas complejos. Otras veces los síntomas no se
expresan totalmente, debido a condiciones ambientales favorables al patógeno,
denominando a estos síntomas enmascarados. Típicamente cada enfermedad
produce varios síntomas característicos, que generalmente aparecen en series
subsecuentes durante el curso de la enfermedad; a este conjunto de síntomas se
le conoce con el nombre de síndrome.
Desde el punto de vista morfofisiológico, los síntomas se agrupan en necrosis

(muerte de células, tejidos, órganos o la planta completa), hipoplasias
(disminución del desarrollo) e hiperplasias (exceso en el desarrollo).
OBJETIVO.
Identificar los diferentes síntomas y signos que ocurren en las enfermedades
vegetales, mediante la observación de material fresco.
Ejemplares vegetales fitopatológicos frescos Microscopio estereoscópico

Ejemplares vegetales fitopatológicos montados Agujas de disección
Cartulinas para herbario Navaja
Etiquetas Cámara fotográfica

Por equipo
Traer 10 ejemplares vegetales enfermos.
1. Identificación de síntomas y de signos en ejemplares vegetales enfermos
utilizando la Clave de identificación de Síntomas y Signos.
2. Los ejemplares a identificar se observan cuidadosamente, utilizando la lupa y
el microscopio cuando sea necesario, siguiendo la Clave de identificación de
Síntomas y Signos.
CLAVE DE IDENTIFICACIÓN DE SÍNTOMAS Y SIGNOS.
SÍNTOMAS
1. NECROSIS. Caracterizadas por la
degeneración y muerte celular.
Si se presentan antes de que ocurra la muerte
celular
1.1. PLESIONECROSIS
Si se manifiestan hasta que las células y los
tejidos mueren
1.2. HOLONECROSIS
1.1. PLESIONECROSIS

El tejido foliar toma coloraciones amarillentas AMARILLAMIENTO
debido a la destrucción de la clorofila
Presencia de tejidos débiles y flácidos debido a MARCHITÉZ

la pérdida de la turgencia celular provocada por
la carencia de agua, casi siempre por el
taponamiento de los vasos conductores a causa
de los patógenos
Manchas traslúcidas, acuosas, como pequeñas HIDROSIS

gotas de agua contenidas dentro de los
espacios intercelulares. Estas acumulaciones
de líquidos provienen de células que han sufrido
daños en sus membranas celulares
1.2. HOLONECROSIS
Si se presentan en tejidos de almacenamiento 1.2.1.
Si se presentan en tejidos verdes 1.2.2.
Si se presentan en tejidos leñosos 1.2.3.
1.2.1. Tejidos de almacenamiento

Los tejidos sufren rápidamente una 1.2.1.1. PUDRICIÓN
descomposición

ç
1.2.1.1. PUDRICIÓN
Si es antecedida por hidrosis y con un PUDRICIÓN BLANDA
reblandecimiento de los tejidos
El agua es eliminada rápidamente de los tejidos, MOMIFICACIÓN

por lo que el órgano atacado se seca, quedando
con un aspecto arrugado, duro y seco
1.2.2. Tejidos verdes

Marchitez y caída de las plantitas de almácigo, AHOGAMIENTO O “DAMPING-
como consecuencia de la muerte (necrosis) de OFF”
las células del cuello del tallo
Necrosis localizada alrededor del borde de la CHAMUSCADO

hoja

Necrosis extendida en toda la lámina foliar TIZÓN
Zonas de tejido necrótico bien definidas, MANCHADO

de diversos colores y tamaños, en
ocasiones rodeadas por un borde púrpura
o de algún otro color
Manchas necróticas muy pequeñas que TIRO DE MUNICIÓN

posteriormente se rasgan y se caen
dejando pequeños orificios

Manchas necróticas muy pequeñas ABIGARRADO
extendidas en todo el órgano
Zonas alargadas de necrosis, a lo largo de RAYADO

venas y tallos
Zonas necróticas alargadas, en las BANDEADO

regiones internervales de la lámina

Repentina desecación, debilitación y QUEMADURA
muerte de toda la hoja debido a la acción
indirecta de la actividad del patógeno
1.2.3. Tejidos leñosos

Necrosis restringida a los tejidos corticales CANCER O CANCRO
del tallo o raíz, generalmente rodeado de
un callo de tejido sano
Exudados de consistencia viscosa o GOMOSIS

gomosa, generalmente en frutos
2. HIPOPLASIAS. Caracterizadas por la

debilidad de órganos o plantas para
desarrollarse completamente

Debilidad para alcanzar un tamaño ENANISMO
normal
Las plantas adquieren tonalidades entre CLOROSIS

verde claro y amarillo, debido a la no
formación de la clorofila
Clorosis en forma circular ANILLOS CLORÓTICOS
Moteado de colores verdes y amarillos, o MOSAICO

verde claro y verde oscuro

Tono amarillento blanquecino, en ETIOLACIÓN
ocasiones acompañado de
enanismo; los tallos muestran un
crecimiento excesivo y se tornan
quebradizos. Aparece en plantas
que se encuentran en la oscuridad
3. HIPERPLASIA. Existe un
desarrollo excesivo en tamaño y
color de algún órgano de la planta o
de la planta completa, o bien por un
desarrollo precoz de los órganos
Desarrollo excesivo de la planta en 3.1. GIGANTISMO

general
Acumulación excesiva de pigmentos 3.2. HIPERCROMÍA
Los órganos se desarrollan fuera de 3.3. METAPLASIA

lugar o con otras formas
3.1. GIGANTISMO
Se da un torcimiento de los brotes o VERRUCOSIS

enrollamiento de las hojas por O ENCHINAMIENTO
crecimiento excesivo de una parte
del órgano

Sobrecrecimiento de tejido COSTRA O ESCARA
epidérmico, en forma de pequeñas
lesiones, ásperas, elevadas,
formadas por células con paredes
suberizadas
Hinchazón localizada que envuelve TUMEFACCIÓN (tumores, nódulos o

a órganos completos agallas)
Desarrollo de órganos adventicios FASCICULACIÓN “ESCOBA DE BRUJA”

alrededor de un punto local

Desarrollo continuado después de PROLIFERACIÓN
que se alcanza el desarrollo normal
3.2. HIPERCROMIA
Coloración púrpura resultante del ANTOCIANESCENCIA

desarrollo excesivo de antocianinas
Coloración cobriza como resultado BRONCEADO

de diversos procesos que acumulan
pigmentos, como puede ser la
deficiencia de potasio

3.2. METAPLASIA
Desarrollo de órganos en posiciones HETEROTROPÍAS

anormales
Desarrollo de pétalos u otros FILODIOS

órganos florales en forma de hojas
SÍGNOS
Exudados bacterianos de tipo ZOOGLEAS

cremoso y de color blanquecino

Se observa el crecimiento de MILDIU O
organismos semejantes a los CENICULLA VELLOSA
hongos, particularmente sus
micelios y esporangios, que dan una
apariencia de fieltro suave,
localizado en el envés de las hojas.
Casi siempre se observa en el haz
una mancha en correspondencia.
Son producidos por Peronosporales
Se observa el crecimiento vegetativo OÍDIO O

del hongo, como un micelio de color CENICILLA POLVOSA
blanquecino o grisáceo, en
pequeños manchones o de forma
continua, que aparentas polvo sobre
las hojas. En algunas ocasiones se
observan conidios y cleistotecios.
Todos son producidos por
Erisiphales
Presencia de pústulas que contienen ROYA

una gran cantidad de esporas de
hongos Uredinales. Son circulares
en dicotiledóneas y alargadas en
monocotiledóneas. Su color varía
entre amarillo, naranja y café
oscuro, dependiendo del tipo de
espora que contengan (uredosporas
o teliosporas)

Se presenta una masa de color CARBÓN
negro, compuesta por teliosporas de
hongos Ustilaginales, la cual puede
estar cubierta por una membrana de
la planta, o bien puede estar
desnuda
Micelio y conidios de hongos de color FUMAGINA

oscuro, producidos por Melioalaceas
o Capnodiaceas. A pesar de que son
saprófitos, llegan a formar
verdaderas costras sobre la
epidermis de las hojas, de los frutos
o de las ramas que disminuyen el
área fotosintética

Por equipo
Elaborar una tabla con las 10 imágenes y todos los datos correspondientes, con la
identificación del síntoma y/o signo.
Ejemplar Descripción del síntoma y/o Imagen fotográfica del ejemplar

número signo
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
BIBLIOGRAFIA.
2. Blancard, Dominique. 1990. Enfermedades del tomate: observar, identificar,

luchar. Mundi-Prensa. España.212 p.
3. Blancard, Dominique. 1991. Enfermedades de cucurbitaceas: observar,

identificar, luchar. Mundi-Prensa. España. 301 p.
4. Brunt, Alan; Crabtree K., Gibbs A. 1990. Viruses of Tropical plants.

Descriptions and List from the VIDE Database. CAB International Australian
Center for Internationa Agricultural Research (ACIAR). U.K. Redwood Press
Ltd. London. 707 pp.
5. Hull, R. 2002. Matthews´ Plant Virology. Fourth Ed. Academic Press. San
Diego,San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo. 1001 p.
6. Kurstak, R.E.F. 1991. Plant virus infections. Elselvier/North-Holland.

Biomedical Press. Amsterdan. 423 p.
7. Matthews, R.E.F. 1991. Plant Virology. Academic Press. New York. London,
Toronto, Sydney, S. Francisco. 897 pp.
8. Matthews, R.E.F. 1992. Diagnosis of Plant Virus Diseases, Ed. C.R.C.

Press. USA. 374 p.
9. Shew H.D. and G.B. Lucas 1991. Compendium of tobacco diseases. St.
Paul Minnesota American Phitopatologhical Society. U.S.A.

Práctica 7.
CONTROL BIOLÓGICO
INTRODUCCIÓN.
En la agricultura convencional moderna, los fungicidas son la principal herramienta

empleada para el control de hongos fitopatógenos. El uso continuado de estos
productos químicos para el control de estos microorganismos ha provocado a
través del tiempo el desarrollo de resistencia a los fungicidas utilizados y la
contaminación en los agroecosistemas productivos, afectando de manera negativa
los servicios ambientales básicos. Por ello, la tendencia actual ha sido racionalizar
el uso de fungicidas y desarrollar nuevas alternativas de control a través del uso
de agentes de control biológico. En la actualidad, se han desarrollado
biopreparados con base en microorganismos antagonistas como Trichoderma spp,
que pueden reducir el impacto de los patógenos vegetales. Este hongo
antagonista permite el control de patologías fungosas en árboles frutales,
forestales y hortalizas, es posible aislarlo localmente y reproducirlo en forma
masiva para su aplicación a nivel de campo
OBJETIVO.
Comprobar el efecto antagonista de Trichoderma spp. con algunos hongos
fitopatógenos.

Por equipo
Investigación bibliográfica de la importancia del antagonismo en el control

biológico

cepas puras de Trichoderm spp. cepas pura de hongos fitopatógenos
cajas de Petri estériles con PDA Bosturí
parafilm Incubadora
Alcohol en matraz Erlenmeyer Cerillos
Alcohol en atomizador Agua destilada estéril
Papel absrovente

1. Preparar la campana de flujo laminar y trabajar en la zona de asepsia
2. Rotular las cajas de Petri en donde se van a llevar a cabo las Pruebas Duales

3. Esterilizar el bisturí y enfriarlo
4. De la cepas puras de cada una de las especies antagónicas se toma un cuadro
de aproximadamente 1 cm2 y se coloca dentro de uno de los extremos de la
caja Petri, opuesto a éste y de forma equidistante se coloca un cuadro del
mismo tamaño pero de la especie fitopatógena correspondiente
5. Incubar a 27 grados centígrados, cuando desaparezca la condensación en el
botoon de la caja de Petri sellar las cajas con papel parafilm
6. Realizar las observaciones hasta que los crecimientos cubran la totalidad de la
superficie de crecimiento de las cajas de Petri.
7. Clasificar el grado de antagonismo de las pruebas duales de acuerdo a la
escala de Bell et al (1982).
Escala de clases para evaluar el grado de antagonismo de una especie
Clase 1 El agente de control biológico crece completamente

sobre la colonia del patógeno y cubre toda la
superficie del medio de cultivo.
Clase 2 El agente de control biológico crece al menos sobre
dos terceras partes de la superficie del medio de
cultivo.
Clase 3 El agente de control biológico y el patógeno cubren
aproximadamente la mitad de la superficie del
medio de cultivo.
Clase 4 El patógeno crece al menos en las dos terceras
partes del medio de cultivo limitando el crecimiento
del agente de control biológico.
Clase 5 El patógeno crece sobre la colonia del agente de
control biológico ocupando toda la superficie del
medio de cultivo.
Fuente: Bell et al, 1982.
Entregar la siguiente tabla de resultados:
ESPECIES ANTAGÓNICAS
CLASE
Especie 1 Especie 2

BIBLIOGRAFIA.
1. Bell, D.K., Well, H.D. and Markham, C.R. 1982. In vitro antagonism of
Trichoderma species against six plant pathogens. Phytopathology 72: 279-382.
2. Chet I. 1987. Trichoderma- application, mode of action, and potential as a

biocontrol agent of soliborne plant pathogenic fungi. In Innovative approaches
to plant disease control (I. Chet,Ed.), pp. 137-159. Wiley, New York. 137-159
pp
3. Harman, G.E.; Howell .Ch; Viterbo, A; Chet. I. and Lorito. M. 2004. Trichoderma
species opportunistic a virulent plant symbionts. Nature reviews microbiology
2:43-56.
4. Sutton, J.C. and Peng, G. 1993. Biocontrolof Botrytis cinerea in Strawberry

leaves. Phytopathology 83:615-621.

ANEXOS.

Anexo I.
PROYECTO SEMESTRAL.
El Proyecto Semestral es un trabajo particular que deberá desarrollar cada equipo

a través del semestre. Este trabajo pretende que el alumno se familiarice con
algún patógeno en particular, siguiendo los postulados de Koch, para lograr la
correcta identificación del agente causal, de tal forma que pueda extrapolar sus
conocimientos para un diagnóstico adecuado de cualquier enfermedad vegetal en
su ejercicio profesional.
En la primera sesión de laboratorio se les proponen algunos temas a escoger,

aunque puede ser el mismo equipo el que lo proponga. En la segunda sesión
todos los equipos deben tener su tema definido. En la tercera sesión deben
entregar su proyecto de trabajo, el cual debe contener los siguientes puntos:
1. INTRODUCCION. (Justificación del trabajo, es decir, el QUE, el POR QUE y el

PARA QUE).
2. OBJETIVOS. (Ante el planteamiento de un problema, se deben proponer
objetivos a cumplir para poder solucionarlo).
3. HIPOTESIS. (Es la probabilidad que se supone como la solución al problema
planteado, y por lo tanto, debe corresponder a los objetivos).
4. METODOLOGIA. (Es la descripción de los pasos a seguir para cumplir los
objetivos).
5. BIBLIOGRAFIA.
Una vez que se terminen las prácticas, todas las sesiones subsecuentes se
dedican exclusivamente al desarrollo del seminario.
Al finalizar el semestre, hay una sesión para la EXPOSICION DE LOS

PROYECTOS SEMESTRALES. Cada equipo tiene 15 minutos para exponer y 5
minutos para preguntas.
El mismo día de la exposición, se entrega un reporte final que contenga los

siguientes puntos:
1. INTRODUCCION.
2. OBJETIVOS.
3. HIPOTESIS.
4. REVISION BIBLIOGRAFICA. Esta debe incluir:
4.1 Historia y distribución geográfica del patógeno.
4.2 Importancia económica
4.3 Etiología
4.3.1 Clasificación
4.3.2 Morfología.
4.3.3 Patogénesis

4.4 Sintomatología
4.5 Epidemiología
4.6 Control
5. METODOLOGIA
6. RESULTADOS.
7. DISCUSION. (Es la parte más importante del trabajo, pues es donde se hace el
análisis de los resultados, interrelacionándolos con los objetivos e hipótesis
planteados, fundamentándose en la información obtenida en la revisión
bibliográfica).
8. CONCLUSIONES. (Conocimiento obtenido a través de todo el trabajo
experimental).
9. BIBLIOGRAFIA.
El reporte debe ser en Word Arial 12, impreso y en electrónico y con buena
presentación. A la entrega de este reporte, debe de anexarse:
La copia de por lo menos 3 artículos recientes referentes al tema del seminario.
Material didáctico de apoyo, en referencia al seminario (diapositivas, láminas,

preparaciones, material de herbario).

Anexo II.
ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
1.- PDA (papa-dextrosa-agar)
Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento, crecimiento y reproducción de
varios hongos y de bacterias como Xanthomonas y Agrobacterium.
Ingredientes:
Papa 200gr Dextrosa 20gr.

Agar 15 gr Agua destilada aforar a 1000 ml
Procedimiento:
Partir 200 gr. de papa sin cáscara y cubrirlo con agua destilada.
Se deja hervir durante 15 min. Concluido éste tiempo se cuela la infusión o
caldo de papa a través de manta de cielo.
Se disuelve el agar en 500 ml. de agua destilada, calentando ligeramente,
se le agrega la dextrosa y se disuelve.
Se añade la solución de agar dextrosa al caldo de papa mezclando bien y
se afora con agua destilada a 1000 ml. y se esteriliza.
2.- AA (agua-agar)
Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de hongos del suelo como
Phytium y algunos Actinomicetos.
Ingredientes:
Agar 15gr.
Agua destilada aforar a 1000 ml
Procedimiento:
Se disuelve el agar en el agua destilada, calentando ligeramente, se afora a 1000

ml y se esteriliza.
3. AN ( agar nutritivo o extracto de carne-agar)
Este medio de cultivo nos sirve para cultivar bacterias como Erwinia,
Pseudomonas y Corynebacterium.
Ingredientes:
Extracto de carne de res 3gr

agua destilada aforar a 1000ml.

Peptona 15gr
Agar 5 gr
Procedimiento:
Disolver el agar en 500 ml. de agua destilada calentando ligeramente, luego

agregar la peptona y el extracto de carne y disolver, por último aforar con agua
destilada a 1000 ml.
4.- HMA (harina de maíz-agar)
Este medio de cultivo sirve para aislar hongos de los géneros Pythium y
Phytophthora.
Ingredientes:
Harina de maíz 20gr agar 20gr

Peptona 20gr dextrosa 20 gr
Agua destilada aforar a 1000 ml.
Procedimiento:
En 500 ml. de agua destilada a 70º C se agrega la harina de maíz y se calienta por
1 hr. a 60º C se filtra la infusión a través de manta de cielo. La solución filtrada se
clarifica centrifugando por 20 min. a 3000 RPM. Decantar y juntar el líquido sin
sólidos producto de la centrifugación. Disolver el agar, la dextrosa y la peptona en
300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Añadir el líquido centrifugado a
la solución de agar-dextrosa-peptona y aforar con agua destilada a 1000 ml.
Esterilizar.
5.- HFA (harina de frijol- agar)
Este medio de cultivo se utiliza para cultivar algunas especies del género
Phytophthora.
Ingredientes:
Harina de frijol 30gr

Agar 20gr
Agua destilada aforar a1000ml.
Procedimiento:
En 500 ml. de agua destilada se agregan los 30 gr. de harina de frijol, se calienta
la solución a 60-70 ºC. Se filtra la infusión a través de manta de cielo. La solución
filtrada se clarifica centrifugando durante 20 min a 300 RPM. Se decanta y se
junta el líquido sin sólidos, producto de la centrifugación.

Disolver el agar en 300 ml de agua destilada calentando ligeramente. Añadir el
líquido centrifugado a la solución de agar mezclándolo bien. Finalmente aforar
con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar.
6.- JFA ( jugo de frijol - agar)
Este medio de cultivo se emplea para cultivar Colletotrichum lindemuthianum.
Ingredientes:
Jugo de frijol 215 ml (proveniente de vainas prensadas o molidas)

Agar 10 gr
Agua destilada aforar a 1000ml.
Procedimiento:
Obtener el jugo de frijol prensado o moliendo las vainas verdes.

Disolver el agar en 285 ml. de agua destilada, calentando ligeramente. Añadir la
solución de agar al jugo de frijol y esterilizar.
7.- V8A (jugo V8- agar )
Este medio se prepara de dos formas, según la especie de hongo que desee
cultivar.
Para aislar a Phytophthora infestans y Phythium.
Ingredientes:
Jugo V8 centrifugado* 20 ml
CaCo3 4.5 gr
Agar 15 gr
B) Para aislar a Phytophthora parasitica y Ph. palmivora.
Ingredientes:
Jugo V8 centrifugado* 100 ml

CaCo3 2 gr
Agar 15 gr
*En ambas fórmulas se puede sustituir el jugo V8 por jugo de tomate simple.

Procedimiento:
Agregar el CaCo3 al jugo V8 o de tomate. Agitar hasta disolverlo. Dejar reposar la

solución durante 10 min. Centrifugar para clarificar durante 20 min a 3000 RPM.
Se decanta y se junta el líquido sin sólidos, resultante de la centrifugación, hasta
completar la cantidad requerida.
Para la fórmula A) disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente.

Añadir a la solución de agar el jugo V8 o de tomate centrifugado y aforar con agua
destilada a 1000 ml.
Para la fórmula B) utilizar 900 ml. de agua destilada para disolver el agar,
mezclando esta solución con el jugo V8 o de tomate centrifugado.
8.- JTA ( jugo de tomate-agar)
Este medio de cultivo se utiliza para aislar a Phytophthora capsici.
Ingredientes:
Jugo tomate natural 60 ml

CaCo3 0.6 gr
Agar 14 gr
Procedimiento:
Se muelen los tomates y se cuelan a través de una manta de cielo. El jugo se

mezcla con el CaCo3, se agita bien y se deja reposar durante 10 min. Para
clarificar, se centrífuga durante 20 min a 3000 RPM. Se decanta y se junta todo el
líquido centrifugado hasta completar la cantidad requerida. Se disuelve el agar en
otro poco de agua destilada (800ml. ) y se añade la solución centrifugada,
mezclando bien. Se esteriliza.
9.- AvA (avena-agar)
Este medio de cultivo se utiliza para aislar especies de los géneros Phytophthora
y Pythium.
Ingredientes:
Avena 60 gr
Agar 12 gr
Extracto de levadura 2 gr

Procedimiento:
En 600 ml de agua remojar 60 gr de avena durante 24 hr. Después hervir durante

30 min. Filtrar la infusión a través de una manta de cielo. Para clarificar la solución
colada, centrifugar durante 20 min. a 300 RPM. Decantar y juntar el líquido sin
sólidos producto de la centrifugación. Disolver el agar en 400 ml de agua destilada
calentado ligeramente. Disolver el extracto de levadura en la solución de agar.
Añadir a esta solución la infusión de avena centrifugada, mezclar bien y aforar
con agua destilada a 1000 ml Esterilizar.
10. MSA (malta -sal-agar).
Este medio de cultivo se utiliza para aislar principalmente a los hongos que
atacan granos almacenados.
Ingredientes:
NaCl 7.5 gr
Extracto de malta 20 gr
Agar 7.5 gr
Procedimiento:
En 400 ml de agua disolver el agar calentando ligeramente. Disolver el extracto de

malta en la solución de agar. En 500 ml de agua destilada disolver la sal
calentando ligeramente. Añadir la solución de extracto de malta-agar, la solución
de sal, mezclando bien. Aforar con agua destilada a 1000 ml. Esterilizar por NO
MAS de 15 min.
11. TSA (JUGO DE TOMATE-SAL-AGAR).
Este medio de cultivo se utiliza para aislar hongos de granos almacenados.
Ingredientes:
Jugo de tomate de lata 90 ml

NaCl 100 gr
Agar 15 gr
Procedimiento:
En 500 ml de agua destilada se disuelve el jugo de tomate-agar (medio

deshidratado) y el agar, calentando ligeramente. Si se mezcla con el agar y 200 ml
de agua, se centrifuga durante 20 min. a 3000 RPM, y se mezcla bien calentado
ligeramente. En 400 ml de agua se disuelve la sal calentando ligeramente. Se

añade a esta solución la de jugo de tomate-agar mezclando bien y se afora a 1000
ml. Esterilizar.
12. BA (Bonner- Addicott).
Este medio de cultivo sirve para aislar y desarrollar a Phymatotrichum omnivorum.
Ingredientes:
KNO3 (nitrato de potasio 0.808 gr

MgSO4 o7H2C (sulfato de magnesio) 0.0369 gr
Ca(NO3)H2O (nitrato de calcio) 0.236 gr
KH2PO4 Fosfato diácido de potasio 0.0108 gr
KCl (cloruro de potasio) 0.6486 gr
FeCl3 (tartato férrico) 0.0010 gr
Glucosa 20.00 gr
Agar 25.00 gr
Procedimiento:
En 500 ml de agua destilada disolver el agar y la glucosa calentando ligeramente.

En 500 ml de agua destilada disolver todos los demás componentes uno por uno.
Añadir a la solución de glucosa-agar la solución del resto de los componentes,
mezclando bien. Ajustar el pH a 7.0-7.5, midiendo con papel pH y agregando HCl
si se necesita acidificar o NaCl si se trata de alcalinizar.
13. MM (medio de Martin).
Este medio de cultivo se utiliza para aislar a los hongos del suelo.
Ingredientes:
Dextrosa……………10 gr. Estreptomicina…………………………………...1 gr.

Peptona…………….. 5 gr. MgSO4.7H2O(sulfato de magnesio hidratado)…..0.5gr.
KH2PO4…………….1 gr. Rosa de Bengala…………………………………3.5 ml.
Agar………………..20gr. Agua destilada…………………………aforar a 1000 ml.
Procedimiento:
Para preparar la solución de Rosa de Bengala se disuelve 1 gr de colorante en

100 ml de agua; de esta solución se toman los 3.5 ml para agregarlos a 1000 ml
de medio de cultivo.
En 500 ml de agua destilada se disuelve el agar, calentando ligeramente, y en los

restantes 500 ml se disuelven uno a uno los demás componentes. Después se
mezclan bien las dos soluciones.

La estreptomicina se prepara separadamente, momentos antes de vaciar el medio
en las cajas de Petri. Se disuelve 1 gr de estreptomicina en 150 ml de agua
destilada estéril. Se agrega 0.05 ml de estreptomicina en solución a cada caja de
Petri (esto es para inhibir el crecimiento de las bacterias)
14. BK (B de King).
Este medio de cultivo sirve para aislar diferentes géneros de bacterias.
Ingredientes:
Peptona 20 gr
K2HPO4 1.5 gr
MgSO4 1.5 gr
Agar 15 gr
Glicerina 10 ml
Procedimiento:
Se disuelve el agar en 500 ml de agua calentando ligeramente y después se le

añade la glicerina. En otros 300 ml de agua se disuelven los demás componentes
agregándole a esta solución la de agar- glicerina. Se mezcla bien y se esteriliza.
15. VFA (vainas de frijol-agar).
Este medio de cultivo sirve para aislar a Colletotrichum lindemuthianum.
Ingredientes:
Vainas de frijol 250 g.

Agar 15 gr
Procedimiento:
En 500 ml de agua destilada se añaden las vainas cortadas en trozos muy

pequeños. Se calienta a 60º C durante 30 min. Se filtran a través de una manta de
cielo y papel filtro. Se disuelve el agar en 300 ml de agua destilada calentando
ligeramente, se le añade la infusión filtrada, mezclando bien y se afora a 1000 ml.
Esterilizar.

Anexo III.
PURIFICACIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES
REACTIVOS
Fosfato potásico
Sulfito de sodio
Cloroformo
Tetracloruro de carbono
Glicol-polietileno (PEG)
SOLUCIONES
Solución 1: Fosfato potásico 0.5M (1:2 p/v), pH=7.5, con 0.5% sulfito de sodio.
Solución 2: Glicol-polietileno al 6% (PEG).
Solución 3: Fosfato de potasio 0.25 M, pH=7.5
Solución 4: glicol-polietileno al 20.0% (PEG).
METODOLOGÍA
1. Pesar un gramo del tejido cosechado
2. Lavarlo bajo el chorro de agua corriente
3. Someterlo a un lavado con Tween 20 sobre agitador magnético por 3
minutos
4. Lavarlo con una solución de cloro al 10% por 4 minutos en agitador
magnético
5. Enjuagar con agua destilada estéril (150 ml en vaso de precipitado) sobre
agitador magnético por un minuto.
6. Dar un enjuague final con agua destilada estéril (150 ml en vaso de
precipitado) sobre agitador magnético por un minuto.
7. Secar en papel filtro.
8. Colocar en bolsa para macerar
9. Agregar 2 ml de la solución 1
10. Macerar
11. Agregar 1 ml de la solución al macerado
12. Macerar
13. Decantar en un tubo tipo Ependorf, en caso necesario agregar 1 ml de
solución 1 para facilitar la decantación.
14. El macerado se homogeniza durante un minuto.
15. Enseguida se agregan al homogenizado Cloroformo y Tetracloruro de
carbono (0.5:1 v/p de cada uno).
16. Homogeneizar dos minutos más.
17. Centrifugar a 5000 rpm durante cinco minutos.
18. El sobrenadante que resulta se trata con la solución 2 y se agita en frío (4º
C) durante dos horas.
19. Se centrífuga a 8 500 rpm durante diez minutos.

20. El precipitado obtenido se resuspende en la solución 3 y se incuba durante
seis horas.
21. Después se centrífuga a 10,000 rpm durante diez minutos.
22. Al sobrenadante se añade la solución 4 (2 ml PEG/5 ml sobrenadante).
23. Se incuba durante una hora en frío (4º C).
24. El precipitado se centrífuga a 12,000 rpm durante diez minutos.
25. Después se resuspende en la solución 3 (0.5 ml de solución por cada 100 g
de tejido).
26. Después de doce horas, se centrífuga a 10,000 rpm durante diez minutos.
27. Se usa el sobrenadante para el diagnóstico.

Anexo IV.
MICROCULTIVO
INTRODUCCIÓN.
Una vez que se tiene el resultado de las diferentes técnicas de aislamiento como
lo es la obtención de la cepa pura, el siguiente paso para cumplir a cabalidad con
el segundo postulado de Koch, es la identificación del agente causal y una
herramienta más para cumplir con este objetivo, en caso que este agente causal
sea un hongos como en la mayoría de las enfermedades que limitan la producción
agrícola: es la técnica de microcultivo; con esta técnica se obtienen las distintas
fases del ciclo de vida de los hongos, que va de germinación de la espora,
formación del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciación de las estructuras
reproductivas asexuales y sexuales. Se debe dar un manejo de tiempos en el
desarrollo de los hongos para poder observar las estructuras desde el inicio de su
formación.
Por ejemplo esta técnica resulta sumamente útil para aquellos hongos en los que
es difícil observar la formación de los conidios sobre los conidióforos y la forma y
estructura de éstos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se
desprenden y/o se rompen. Mediante este método se puede observar bajo el
microscopio, su crecimiento y esporulación en todos sus detalles y así tener
elementos morfológicos de estructuras somáticas y reproductivas completas para
así poder hacer la identificación con mayor confiabilidad y conocer a los hongos
como agentes causales de enfermedades en los cultivos de importancia agrícola
(Dhingra, and Sinclair, 1985; Trigiano, Windham,. and Windham, 2004)
OBJETIVO.
Conocer la técnica de microcultivo para la caracterización de estructuras
somáticas y reproductivas para identificar morfológicamente a los hongos
fitopatógenos.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Recipiente con alcohol al 96%. Puntas.

Pinzas de disección. Agua estéril.
Aguja de disección. Papel parafilm
Bisturí.
Caja de Petri estériles con PDA.
Caja con cepa pura.
Caja de Petri con portaobjeto,
cubreobjeto y triangulo de vidrio
(estéril).
Pipeta.

1. Con un bisturí estéril se cuadricula el medio de cultivo de la caja de Petri con
PDA en cuadros de aproximadamente 1 cm2. este paso se realiza en el interior
de una campana de flujo laminar preparada para trabajar bajo condiciones
asépticas
2. Dentro de la cámara de flujo laminar, con la ayuda de un bisturí estéril, uno de
los cuadros de PDA se transfiere al portaobjetos que esta en la cámara de
microcultivo ;este portaobjetos debe de estar sobre el triangulo de vidrio
3. Con la aguja de disección estéril o con una asa bacteriológica estéril se lleva el
inóculo a las orillas superiores e inferiores del cuadro de PDA
4. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de PDA inoculado, procurando que
quede bien centrado.
5. Se agregan 2ml de agua estéril, en el fondo de la cámara de microcultivo para
mantener la humedad, sin mojar el área de crecimiento del hongo. Los pasos 1-5
se llevan a cabo en el interior de una campana de flujo laminar o en mesas de
trabajo en condiciones asépticas
6. Se sella el dispositivo de microcultivo con papel parafilm y se rotula.
7. El crecimiento del hongo se detiene cada 24,
8. se repiten los pasos del 1 al 7 para mas microcultivos, y detener su desarrollo a
la 48, 72 y 96 hrs. respectivamente
BIBLIOGRAFÍA
Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press.
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Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscópicos saprobios y parásitos: Métodos

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Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel

Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.

Anexo V
MEDIDA DE ESTRUCTURAS DE AGENTES
FITOPATÓGENOS CON MICROSCOPIO ÓPTICO
INTRODUCCIÓN.
Para identificar a un agente fitopatógeno y cumplir cabalmente con el segundo

postulado de Koch de además de los datos correspondientes al aspecto de los
síntomas que hayan causado en su hospedante, o de las colonias que hayan formado
sobre las placas en medios de cultivo, de los datos morfológicos que hayan resultado
de la técnica de microcultivo es necesario saber las medidas de las estructuras
somáticas y reproductivas que se observan en el microscopio óptico para tener una
identificación confiable del agente causal. Por ejemplo si se habla de hongos
fitopatógenos las estructuras que se miden para identificarlos son: picnidios, acérvulos,
esporodoquios, sinemas, peritecios, apotecios, clestotecios entre otras. La The
American Phytopathological Society en todas sus obras de enfermedades de los
cultivos agrícolas, las claves que usa para la identificación de los diferentes grupos de
hongos fitopatógenos están en función del tamaño de las estructuras somáticas y de
reproducción de este grupo de fitopatógenos. La identificación del agente causal es
básica para precisar el diagnóstico y así poder establecer el mejor método de control
para estas limitantes biológicas en la producción agrícola.
OBJETIVO.
Que el alumno aprenda a calibrar y medir células, estructuras somáticas y
reproductivas de importancia taxonómica de agentes fitopatógenos con el microscopio.
óptico para su identificación morfológica
MATERIAL.
Un microscopio óptico.
Un micrómetro ocular.
Un portaobjetos micrométrico.
Preparaciones permanentes y/o temporales de estructuras fitopatógenos.
METODOLOGÍA.
Calibración de los lentes objetivos.

1.- Se coloca en el ocular del microscopio óptico el micrómetro ocular –aunque a
menudo se trabaja con el ocular micrométrico permanente puesto en el microscopio.
Hay que evitar que quede invertida la escala (Ver Fig 1).

Fig 1.- A.- Colocación de la reglilla ocular, y B.- Escala de la reglilla ocular micrométrica
2.- Sobre la platina del microscopio se pone el micrómetro del objeto similar portaobjeto
como si fuese una preparación.
Fig 2.- Escala de la reglilla portaobjeto
3.- Moviendo la platina se hace coincidir el margen de una raya del ocular micrométrico
con una del portaobjetos micrométrico. Puesto que las rayas del portaobjetos aparecen
tanto más gruesas cuanto mayor son los aumentos, la superposición de las líneas ha
de ser siempre al comienzo del margen exterior de éstas.
3.- Moviendo la platina se observa a través de microscopio con ambas reglillas

colocadas se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber cuantas
líneas del micrómetro ocular concuerdan con cuantas lineas del micrómetro del objeto
se hace coincidir el margen de una raya del micrómetro ocular con una del micrómetro
del objeto. Ver figura 3
Fig 3.- Vista simultánea del ocular y de la reglilla micrométrica
4.- Cuando se observa a través del microscopio con ambas reglillas micrométricas
colocadas, se les puede ver superpuestas en el campo visual, y se puede saber
cuántas líneas del micrómetro ocular concuerdan con cuántas líneas del micrómetro del
objeto. En el campo visual, la reglilla ocular se encuentra graduada del 0 al 10 a un
lado la reglilla del objeto con 100 divisiones; como cada línea del micrómetro del objeto
corresponde a 10 micras, se hacen coincidir ambas reglillas en el cero, en el otro
extremo de las reglillas se observa cual de las 100 líneas de la reglilla ocular coinciden
con otra de la reglilla del portaobjetos. Y se hacen los cálculos correspondientes.

• Ejemplos 1: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 1) y se
observa que en el otro extremo de las reglillas el 100 de la reglilla ocular coincide
con el 97 de los trazos de la reglilla del objeto, es decir 0.97 mm; por lo tanto, una
línea del micrómetro ocular es equivalente a 0.009 mm = 9 µm y este valor es el que
utilizamos para definir el tamaño de cada estructura que se mide, es obvio que esta
calibración es para este microscopio, con ese ocular y objetivos respectivamente.
Esta operación se deberá repetir cuando se cambie de microscopio o de objetivos
para evitar errores.
• Ejemplo 2: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen 2) y se

observa que siete divisiones del ocular micrométrico coinciden con dos divisiones
del portaobjetos micrométrico. Puesto que cada división de éste equivale a 10 µm,
el valor de cada división del ocular se obtiene mediante una simple regla de tres: 7
divisiones del ocular = 20 µm; una división del ocular = 20/7 = 2.8 µm (Ver Fig 4).
Fig 4.- Vista simultánea del ocular y de la reglilla micrométrica, donde coinciden la
primera línea de las dos reglillas y la línea 2 de la reglilla portaobjetos con la siete de la
ocular
b).- Medición de ejemplares y estructuras de micromicetes.

1.- Una vez que se ha cuantificado el valor de cada línea en la reglilla del ocular ( 9 y
2.8 µm en los ejemplos), se puede retirar el portaobjetos micrómetro y en su lugar se
puede colocar un portaobjetos normal con el espécimen a medir y se deja colocado el
micrómetro ocular, de manera que se puede colocar una célula o estructura celular
cualquiera, en este caso, se hace coincidir una raya de la escala con los márgenes de
la estructura fúngica elegida, y se cuenta el número de divisiones de la escala
comprendidas en la longitud y en el ancho de dicha estructura.
• Ejemplo 3: Si la estructura del hongo se extiende a lo largo de 16 líneas y cada una

de ellas vale 9 micras, según se explicó antes, por tanto el tamaño total de esta
célula es de 16 x 9, es decir 144 micras.
2.- Si se llega a cambiar el objetivo por otro menor aumento se debe repetir la
operación para encontrar nuevos valores en la reglilla, esta medición se puede realizar
en un microscopio mono o binocular, pero en este último caso se tiene que mantener
inalterada la distancia interpupilar, puesto que el cambio altera la distancia mecánica y
el valor del micrómetro depende de ella.

BIBLIOGRAFIA
Barrera, E. H y R. Cárdenas 1997 El microscopio óptico FES- Iztacala-UNAM P y V

editores. Estado de México. 86pp.
Barthelemy, E. R. Dawson, R. J., y A. E. Lee. 1984. Técnicas para el Laboratorio de

Biología. 2ª. Edición. CECSA editor. México, D. F. México. 148 pp.
Mateu, B. 1972. Atlas de Microscopia. 4ª. Edición. Jover Ediciones. Barcelona, España.
96 pp.
Muntañola, M. 1999. Guía de los hongos microscópicos. 1ª. Edición. Omega editores.
Barcelona, España. 167 pp.
____________. 1996. El Microscopio Óptico. FES Zaragoza UNAM. México, D. F.

México.

Anexo VI.
CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE INÓCULO
INTRODUCCIÓN
Cuando se trata inocular hospedadores para cumplir con los postulados de Koch y así
efectuar el diagnóstico fitosanitario, evaluar la resistencia de las plantas a
enfermedades, efectuar estudios específicos (epidemiológicos) del patógeno, o para
desarrollar un micoherbicida, es necesario recurrir a la inoculación artificial, ya sea en
invernadero o en campo. Para esto se utiliza inóculo a una concentración específica (es
decir, un número determinado de esporas por mililitro), según el patógeno y hospedero
en estudio, con la finalidad de obtener una buena infección que permita observar las
diferencias entre los materiales evaluados. Conocer el número de esporas por mililitro,
para el caso de micoherbicidas, además de que se requiere en las pruebas de
patogenecidad, en las pruebas seguridad y en estudios epidemiológicos; el
conocimiento de la concentración de esporas por ml. es básico para el manejo del
producto comercial y la aplicación del micoherbicidas en campo.
Para determinar la concentración se usa una cámara Neubauer o hemacitómetro, con

el cual se hacen conteos de esporas en campos de dimensiones conocidas, que darán
el número de esporas por ml de la suspensión inicial. De esta forma, por medio de
diluciones se obtiene el inóculo en la concentración deseada.
OBJETIVO.
Conocer y manejar la cámara Neubauer para realizar el cálculo de la concentración de
inóculo, que permitan entender las concentraciones comerciales y la aplicación de
micoherbicidas
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivos puros de hongos aislados de malezas enfermas, tubos falcón de 15 ml. 100
ml. de agua destilada estéril, agitadores de vidrio esteriles, Vortex, centrifuga, Tween
20,pipetas, colorantes, (solo en caso necesario), Camara de Neubauer, microscopio
compuesto, matraz erlenmeyer de 250ml.
1.-Prepare en agua destilada estéril una suspensión de propágulos a contar de mayor

concentración que la deseada (solución madre).
a) Colocar un volumen conocido de agua destilada estéril o solución fisiológica en
los cultivos de hongos en las cajas de Petri y raspar los cultivos
b) Decantar el raspado en tubos de centrifuga, someterlos 1 minuto en vortex y
centrifugar de 3 a 5 minutos a una velocidad de 6000 revoluciones, separar el
sobrenadante del precipitado. Si los propágulos tienden a permanecer unidos o
aglomerados agregue “Tween 20”a razón de 60 ppm mezclando sin agitar
2.- Si los propágulos son hialinos y pequeños, tome una alícuota pequeña y agregue un

tinte vital azul de algodón, fucsina acida que indique las células vivas, el tinte facilita la
observación de las células poco refractivas. Use el tinte en forma concentrada, o si no
tome en cuenta el factor de dilución que interviene.
3.- Coloque el cubreobjetos especial sobre los rieles paralelos a ambos lados de la
cámara, frotando ligeramente para conseguir un buen contacto, con una pipeta delgada
(que no gotee) tome una muestra de la suspensión y aplíquela a la ranura al centro del
margen de la cámara donde será rápidamente absorbida por la fuerza capilar, quítela a
tiempo para que no entre un exceso que se rebose en los bordes, lo que introduciría un
factor de error.
4.- Monte al microscopio y ubique el rallado de la cámara con el objetivo de menor
aumento, girando luego el revolver para mayores aumentos (no se debe usar el de
inmersión). Deje el tiempo necesario para que los propágulos se asienten en el fondo
de la cámara (dos minutos).
5.- El fondo de la cámara tiene un rayado “Nueubauer” (Fig.I) de 9mm2 (3 mm por lado)
dividido en 9 cuadrados principales (CP) de 1 mm por lado. El campo de conteo que se
debe utilizar depende del tamaño de los conidios del hongo con el que se esté
trabajando. Si éstos son grandes, lo más conveniente es contar en los cuatro cuadros
de las esquinas (A, B, C, D) más el cuadro del centro (E) (Fig.1). El conteo se repite por
lo menos seis veces y se saca un promedio.(Tabla 1). Éste se multiplica por una
constante. De ese producto se obtendrá la concentración en conidios/ml.

Tabla No. 1
Como el volumen sobre cada C.P. es 0.1mm3, para calcular la concentración por cc
(10000 veces mayor), se procede en la forma siguiente:
SUMA de 5 C.P.x 2000= número/cc
Cuando los propagulos son pequeños se usa el C.P. central que esta dividido en 25
cuadros secundarios (C.S.) de 0.2 mm por lado, cada uno de los cuales está dividido
en 16 cuadrados menores de 0.05mm por lado. Entonces la concentración se calcula
así:
NUMERO en el C.P. CENTRAL x 10000 = número/ cc.
Esta concentración corresponde a la de la suspensión inicial. Cuando se desea calcular

una dilución determinada, se aplica la fórmula siguiente:
C1 V1 = C2 V2
Donde:
C1 = Concentración inicial (conocida en el conteo)
V1 = Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inóculo)
C2 = Concentración final deseada (según el estudio a realizar)
V2 = Volumen final (desconocido)
3.- Limpie las superficies de la cámara entre cada observación enjuague con agua
destilada estéril y seque por contacto con papel con papel o tela absorbente y por
ultimo con papel seda. Se puede utilizar un jabon suave o alcohol
BIBLIOGRAFÍA.
Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press.
355 pp
French, E.R. y Her. 1980. Métodos de Investigación Fitopatológica. IICA. Costa

Rica.287pp

Douglas Bollete, C., Charles Quimby, P., Connick,Jr.,W., Daigle,D.,and
Fulgham,F.1991. Progress in the production, formulation, and application of
mycoherbicides.pp209-222. In TeBeest,D. Microbial control of weeds. Chapman and
Hall.
Duveiller, R.P. Singh, M. Henry e I. García A. 2005. Guía práctica para la identificación
de algunas enfermedades de trigo y cebada. Segunda edición. México, D.F.:
CIMMYT 69pp
Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis. Marcel
Dekker Inc., 518 pp.
Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology, Concepts
and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washinton, D.C.,
413 pp.

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

FECHA DE REVISIÓN: Agosto de 2018

Pág. 1 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

Pág. 2 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

Actualmente esta ciencia ha adquirido una importancia relevante, porque su eficiente

El objetivo del laboratorio es el adiestramiento en las principales técnicas de colecta,

Pág. 3 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

OBJETIVOS DEL CURSO EXPERIMENTAL.

Preparar a los alumnos en los principales métodos de colecta, elaboración de medios

Adquirir la destreza en el manejo de las principales técnicas del diagnóstico

Pág. 4 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIOS DEL

CAPÍTULO PRIMERO. DISPOSICIONES GENERALES

I. Los alumnos de la carrera de Ingeniería Agrícola que oficialmente se encuentren inscritos y

CAPÍTULO SEGUNDO. DE LA ESTRUCTURA

Artículo 4. La administración, vigilancia y operación de equipo especializado depende directamente del

Artículo 5. El responsable de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Dirigir el laboratorio de acuerdo a su reglamento.

Artículo 6. El jefe de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Supervisar y controlar el funcionamiento del laboratorio

Pág. 5 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

I. Mantener el material y equipo en condiciones de higiene y limpieza.

Artículo 8. Son funciones del auxiliar de laboratorio:

I. Asear, lavar, esterilizar, secar y guardar el material, instrumental, equipo y mobiliario.

CAPÍTULO TERCERO. DE LAS RESTRICCIONES

Artículo 9. Queda prohibido dentro de los laboratorios:

I. Ingresar y consumir cualquier tipo de alimento o bebida

CAPITULO CUARTO. DEL USO Y LOS USUARIOS DEL LABORATORIO

Pág. 6 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

CAPÍTULO QUINTO. DE LAS SANCIONES

Pág. 7 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

EVALUACIÓN DEL CURSO

PUNTOS A EVALUAR PORCENTAJE

Pág. 8 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

Anexo I. Proyecto Semestral

Pág. 9 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

POR EQUIPO POR GRUPO

Pág. 10 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

El diagnóstico de las enfermedades de las plantas se refiere a la determinación del

Ciertas enfermedades pueden ser reconocidas fácilmente, es decir, a simple vista,

Manejar las técnicas más comunes de colecta y preservación de material de estudio

ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA.

Entregar resuelto el siguiente cuestionario

Pág. 11 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

EQUIPOS, REACTVOS Y MATERIALES

Preparación de soluciones preservadoras.

Pág. 12 de 68 Manual de Prácticas de Fitopatología

Los problemas fitopatológicos se pueden presentar en hojas, raíces. tallos, etc, y

Cultivo anual. Se deberán colectar varias plantas completas que presenten

Cultivo perenne. Se colectan partes representativas, como raíz, tallo hojas,

Para partes vegetales carnosas, como frutos y bulbos, se deben colectar en

Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, se acompañen de la

El material colectado puede emplearse para realizar aislamientos del agente

Pág. 13 de 76 Manual de Prácticas de Fitopatología

Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan acompañados

Pág. 14 de 76 Manual de Prácticas de Fitopatología

Ésta información se puede complementar con algunos datos que se toman en el

El material colectado puede emplearse para: