Proyecto MGA 0571 Límites Microbianos (31-Dic-2019)

"2019, Año del Caudillo del Sur, Emiliano Zapata"
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Con fundamento en el numeral 4.11.1 de la Norma Oficial Mexicana NOM-001-SSA1-2010, se publica el presente proyecto a efecto de que los interesados, a partir
del 1º de noviembre y hasta el 31 de diciembre de 2019, lo analicen, evalúen y envíen sus observaciones o comentarios en idioma español y con el sustento técnico
suficiente ante la CPFEUM, sito en Río Rhin número 57, colonia Cuauhtémoc, código postal 06500, Ciudad de México. Fax: 5207 6890
Correo electrónico: [email protected].
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MGA 0571. LÍMITES MICROBIANOS
Estas pruebas tienen como objetivo evaluar la calidad
microbiológica de productos farmacéuticos (materias
primas, productos intermedios y terminados), mediante
la cuenta de organismos mesofílicos aerobios, hongos
filamentosos y levaduras; así como la investigación de
microorganismos específicos. Los métodos
microbiológicos alternativos pueden utilizarse siempre
que se demuestre su equivalencia con el método
farmacopeico. En los productos no estériles que
carecen de especificación, aplicar el Apéndice VII
Análisis microbiológico de productos farmacéuticos no
estériles, con carácter obligatorio.
RECOMENDACIONES GENERALES. Las
muestras deben trabajarse bajo condiciones asépticas.
Se debe evitar afectar a los microorganismos
contaminantes de los productos de prueba. El tiempo
transcurrido desde la preparación de la primera
dilución hasta su incorporación con el medio de cultivo
no debe exceder de 1h.
Sí el producto de prueba tiene actividad
antimicrobiana, se debe eliminar o neutralizar hasta
CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2019-4 Página 1 de 33 MÉTODOS GENERALES DE ANÁLISIS

donde sea posible. Sí se usan sustancias tensoactivas
para preparar la muestra, se debe demostrar la ausencia
de toxicidad para los microorganismos y su
compatibilidad con los neutralizantes utilizados
(Prueba de Aptitud del método).
SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO
RECOMENDADOS. Las soluciones y los medios de
cultivo que se indican son satisfactorios para las
pruebas descritas en este capítulo, se pueden utilizar
otros medios de cultivo si se demuestra que presentan
características similares de promoción o inhibición del
crecimiento de los microorganismos de referencia
indicados para cada una de las pruebas.
Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2
Solución concentrada
Fosfato monobásico de potasio 34.0 g
Agua purificada cbp 1 000 mL
En un matraz volumétrico de 1 000 mL, disolver el
fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 ± 0.2
con una solución de hidróxido de sodio 1.0 N
(aproximadamente 175 mL) llevar a volumen, mezclar,
envasar y esterilizar. Almacenar en refrigeración.
Solución de uso. Diluir 1.25 mL de la solución
concentrada en 1 000 mL de agua purificada. Envasar
en volúmenes de 90 y 9 mL y esterilizar en autoclave
usando procesos validados.
Solución amortiguadora de cloruro de sodio-peptona
pH 7.0
Fosfato monobásico de potas
3.6 g
io
Fosfato dibásico de sodio 7.2 g, (equivalentes al
dihidratado fosfato 0.067 M)
Cloruro de sodio 4.3 g
Peptona (carne o caseína) 1.0 g

Agua purificada 1 000 mL
Esterilizar en autoclave usando procesos validados.
Caldo soya tripticaseína
Digerido pancreático de caseína 17.0 g
Digerido papaínico de soya 3.0 g
Fosfato dibásico de potasio 2.5 g
Glucosa monohidratada 2.5 g
Ajustar el pH de modo que después de la esterilización
sea 7.3 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar en autoclave usando
procesos validados.
Agar soya tripticaseína
Digerido papaínico de soya 5.0 g
Agar 15.0 g
procesos validados.
Agar dextrosa Sabouraud
Dextrosa 40.0 g
Mezcla del digerido péptico del tejido
animal y digerido pancreático de 10.0 g
caseína (1:1)
Agar 15.0 g
procesos validados.

Agar papa dextrosa
Infusión de papa 200 g
Dextrosa 20.0 g
Agar 15.0 g
Ajustar pH de modo que después de la esterilización sea
5.6 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar en autoclave usando
procesos validados. Acidificar el medio adicionando
aproximadamente 1.4 mL de solución de ácido tartárico
estéril al 10 % por cada 100 mL de medio de cultivo.
Caldo dextrosa Sabouraud
Dextrosa 20.0 g
Mezcla de digerido péptico del tejido
animal y de digerido pancreático de caseína 10.0 g
(1: 1)
procesos validados.
Caldo-Mossel de enriquecimiento de enterobacterias
Digerido pancreático de gelatina 10.0 g
Bilis de buey deshidratada 20.0 g
Fosfato dibásico de sodio dihidratado 8.0 g
Verde brillante 15 mg
Calentar a 100 °C durante 30 min y enfriar de
inmediato. Ajustar el pH a 7.2 ± 0.2 a 25 °C.
Agar glucosa rojo violeta bilis
Extracto de levadura 3.0 g

Sales biliares 1.5 g
Agar 15.0 g
Rojo neutro 30 mg
Cristal violeta 2 mg
Calentar a ebullición y enfriar. Ajustar el pH a 7.4 ±
0.2 a 25°C.
Nota: no esterilizar en autoclave.
Agar MacConkey
Peptonas (de carne y de caseína) 3.0 g
Lactosa monohidratada 10.0 g
Sales biliares 1.5 g
Agar 13.5 g
Rojo neutro 30.0 mg
Cristal violeta 1 mg
sea 7.1 ± 0.2 a
25 °C. Calentar a ebullición durante 1 min con
agitación constante, esterilizar en autoclave usando
procesos validados.
Caldo Rappaport Vassiliadis de enriquecimiento
para Salmonella
Peptona de soya 4.5 g
Cloruro de del magnesio
29.0 g
hexahidratado

Fosfato dibásico de potasio 0.4 g
Verde de malaquita 0.036 g
Disolver por calentamiento suave. Esterilizar en
autoclave usando procesos validados, (la temperatura
no debe ser mayor de 115 °C). El pH debe ser de
5.2 ± 0.2 a 25 °C después de calentar y de esterilizar.
Agar xilosa lisina desoxicolato
Xilosa 3.5 g
l- Lisina 5.0 g
Lactosa monohidratada 7.5 g
Sacarosa 7.5 g
Rojo de fenol 80 mg
Agar 13.5 g
Desoxicolato de sodio 2.5 g
Tiosulfato de sodio 6.8 g
Citrato férrico de amonio 0.8 g
Ajustar el pH de modo que después de calentar a
ebullición sea de 7.4 ± 0.2 a 25 °C. Enfriar a 50 °C y
distribuir en cajas de Petri.
Agar cetrimida
Cloruro del magnesio 1.4 g
Sulfato dipotásico 10.0 g
Cetrimida 0.3 g

Agar 13.6 g
Glicerol 10.0 mL
Calentar a ebullición durante 1 min con agitación
constante. Ajustar el pH de modo que después de la
esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar en
autoclave usando procesos validados.
Agar sal manitol
Digerido péptico de tejido animal 5.0 g
Extracto de carne 1.0 g
d- Manitol 10.0 g
Agar 15.0 g
Rojo de fenol 0.025 g
Calentar a ebullición durante 1 min con agitación
constante. Ajustar el pH de modo que después de la
esterilización sea de 7.4 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar en
autoclave usando procesos validados.
Medio de enriquecimiento para Clostridios
Extracto de carne 10.0 g
Peptona 10.0 g
Almidón soluble 1.0 g
Clorhidrato de cisteína 0.5 g
Acetato de sodio 3.0 g
Agar 0.5 g

Hidratar el agar, disolver calentando a ebullición
con agitación continua. En caso necesario, ajustar el
pH de modo que después de la esterilización sea de
procesos validados.
Agar Columbia
Digerido péptico de carne 5.0 g
Digerido pancreático de corazón 3.0 g
Extracto de corazón 3.0 g
Almidón de maíz 1.0 g
Agar, según su capacidad de
10.0-15.0 g
gelificación
Hidratar el agar, disolver calentando hasta ebullición
con agitación constante. En caso necesario, ajustar el
pH de modo que después de la esterilización sea de
procesos validados, enfriar a 45-50 °C. En caso de
ser necesario agregar sulfato de gentamicina que
corresponda a 20 mg de gentamicina base y verter en
cajas de Petri estériles.
PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS SELECTIVAS E
INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Considerando las indicaciones de las tablas 0571.1 y
0571.2 analizar cada lote de medio de cultivo listo para
usar y los preparados a partir de ingredientes o de
medio deshidratado.
PRUEBAS DE PROMOCIÓN DE
CRECIMIENTO.
Medios de cultivo líquidos. Inocular un volumen

apropiado del medio de cultivo con no más de 100
UFC del microorganismo de referencia. Incubar los
medios de cuenta de acuerdo a las condiciones
indicadas en la tabla 0571.1 y los medios para
determinación de microorganismos específicos a la
temperatura especificada en la prueba y durante un
tiempo no mayor que el menor indicado en la misma.
Si el crecimiento es comparable con el del medio
control, el medio de prueba cumple.
Medios de cultivo sólidos. Para la prueba utilizar el
método de extensión en superficie o de vaciado en
placa. Inocular el medio de cultivo sólido con no más
de 100 UFC del microorganismo de referencia. Incubar
los medios de cuenta de acuerdo a las condiciones
indicadas en la tabla 0571.1 y los medios para
determinación de microorganismos específicos a la
temperatura especificada en la prueba y durante un
tiempo no mayor que el menor indicado en la misma.
Si El crecimiento no debe diferir en un factor mayor de
2 a partir del valor calculado para un inóculo
estandarizado en un medio de cultivo analizado y
aprobado previamente (lote control). el número de
microorganismos recuperados es comparable en un
factor no mayor de 2 (50 a 200 %) con un medio de
cultivo analizado y aprobado previamente (lote
control), el medio cumple con la prueba de promoción.
DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES
SELECTIVAS Y DIFERENCIALES DE MEDIOS
DE CULTIVO.
Propiedades selectivas. Inocular un volumen
apropiado del medio de cultivo con no más de 100
UFC del microorganismo de referencia en medios
líquidos. Para medios sólidos selectivos utilizar el
método de extensión en superficies inoculando con no
más de 100 UFC del de los microorganismos de
referencia. Incubar a la temperatura especificada
durante un tiempo no menor que el periodo mayor

indicado en la prueba. Los microorganismos de
referencia deben cumplir con las propiedades selectivas
veáse Tabla 0571.2. no deben crecer.
Propiedades diferenciales. Para la prueba utilizar el
método de extensión en superficie. Inocular cada una
de las placas con medio de cultivo con no más de 100
UFC del microorganismo de referencia. Incubar a la
temperatura especificada durante un periodo que se
encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las
colonias deben presentar las características
morfológicas y reacciones indicadoras que presenten
los medios de cultivo previamente aprobados (control).
Para medios de cultivo sólidos, el crecimiento no debe
diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor
calculado para un inóculo estandarizado en un medio
de cultivo analizado y aprobado previamente (lote
control).
Los medios de cultivo líquidos, cumplen la prueba de
promoción si el crecimiento del microorganismo de
prueba es comparable con el crecimiento de un lote de
medio analizado y aprobado previamente (lote
control).
MÉTODOS DE CUENTA MICROBIANA
Filtración por membrana
Cuenta en placa (vaciado y extensión)
Número más probable (NMP)
La elección del método se basa en la naturaleza del
producto y las especificaciones establecidas para cada
producto, el método elegido debe permitir analizar la
cantidad de muestra suficiente para evaluar el
cumplimiento de las especificaciones. Cualquiera que
sea el método elegido se debe probar su aptitud.
EVALUACIÓN DE LA APTITUD DEL MÉTODO
DE CUENTA. La aptitud de las pruebas para
recuperar a los microorganismos de referencia en
presencia del producto se debe determinarse y

confirmarse cada vez que se introduzca un cambio en
el método o en el producto. Esta evaluación
corresponde al control positivo de la prueba.
CONTROLES NEGATIVOS. Para verificar las
condiciones de la prueba, usar el diluyente
seleccionado como control negativo en lugar del
producto. En los controles no debe haber crecimiento
de los microorganismos.
PREPARACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
DE REFERENCIA. Mantener a los microorganismos
de referencia mediante el sistema lote semilla véase
Apéndice VI, Conservación, mantenimiento y manejo
de cultivos microbianos: sistema lote semilla, de
manera que los microorganismos no tengan más de 5
pases a partir de la cepa original o un sistema de
conservación que asegure esto (Se debe considerar el
pase indicado en el certificado de la cepa de
referencia).
Para preparar las suspensiones de los microorganismos
de referencia, usar solución amortiguadora de cloruro
de sodio peptona pH 7.0 o solución amortiguadora de
fosfatos pH 7.2; para suspender las esporas de
Aspergillus brasiliensis, añadir 0.05 % de polisorbato
80 a la solución amortiguadora. Las suspensiones
deben utilizarse dentro de un periodo de 2 a 24 h
cuando se almacenan en refrigeración (2 a 8 °C). Un
periodo diferente puede establecerse siempre que se
demuestre la estabilidad de las suspensiones.
Determinar la estabilidad de las suspensiones de
esporas de A. brasiliensis y Bacillus subtilis
conservadas entre 2 y 8 °C.
Cultivar los microorganismos de referencia como se
describe en la tabla 0571.1.
Tabla 0571.1. Preparación y uso de los
microorganismos de referencia para el método de
cuenta.

Prueba de aptitud
Promoción de
del método cuenta
crecimiento
en presencia del
Cuenta
producto
Prepa-
Microor- ración Hongos
Organis Organis-
ganismo de la fila- Hongos
mos mos
cepa mento- filamen-
mesofí- mesofíli-
sos y tosos y
licos cos
levadu- levadu-
aerobios aerobios
ras ras (HL)
(OMA) (OMA)
(HL)
Staphyloco Agar o
ccus Agar o caldo
Agar o
aureus caldo soya
caldo soya
ATCC soya triptica-
tripticaseín
6538 triptica- seína
- a (NMP) -
NCIMB seína ≤ 100 U
≤ 100 UFC
9518 30 a FC
30 a 35 °C
CIP 4.83 35 °C 30 a
≤ 3 días
NBRC 18 a 24 h 35 °C
13276 ≤ 3 días
Pseudomo
Agar o
nas
Agar o caldo Agar o
aeruginosa
caldo soya caldo soya
ATCC
soya tripticas tripticaseín
9027
tripticase eína a (NMP)
NCIMB -
ína ≤ 100 U ≤ 100 UF
8626
30 a FC C
CIP
35 °C 30 a 30 a 35 °C
82.118
18 a 24 h 35 °C ≤ 3 días
NBRC
≤ 3 días
13275
Agar o
Bacillus
Agar o caldo Agar o
subtilis
caldo soya caldo soya
ATCC
soya tripticas tripticaseín
6633
tripticase eína a (NMP)
NCIMB -
ína ≤ 100 U ≤ 100 UF
8054
30 a FC C
CIP 52.62
35 °C 30 a 30 a 35 °C
NBRC
18 a 24 h 35 °C ≤ 3 días
3134
≤ 3 días
Candida Agar o Agar Agar Agar soya Agar
albicans caldo soya dextrosa tripticaseín dextrosa

ATCC dextrosa tripticas Saboura a Sabourau
10231 Sabourau eína ud ≤ 100 UF d
NCPF d ≤ 100 U ≤ 100 U C ≤ 100 UF
3179 20 a FC FC 30 a 35 °C C
CIP 48.72 25 °C 30 a 20 a ≤ 5 días 20 a
NBRC 2 a 3 días 35 °C 25 °C NMP: no 25 °C
1594 ≤ 5 días ≤ 5 días aplica ≤ 5 días
Agar
dextrosa
Aspergillu
Sabourau
s
d o Agar Agar Agar Agar soya Agar
brasiliensi
papa soya dextrosa tripticaseín dextrosa
s
dextrosa tripticas Saboura a Sabourau
ATCC
20 a eína ud ≤ 100 UF d-
16404
25 °C, 5 ≤ 100 U ≤ 100 U C ≤ 100 UF
IMI
a 7 días o FC FC 30 a 35 °C C
149007
hasta 30 a 20 a ≤ 5 días 20 a
CIP
lograr 35 °C 25 °C NMP: no 25 °C
1431.83
una ≤ 5 días ≤ 5 días aplica ≤ 5 días
NBRC
buena
9455
esporulac
ión
NCIMB The National Collection
ATCC American Type Culture
of Industrial and Marine
Collection
Bacteria Limited
CIP Collection de 1´Institut NCPF National Collection of
Pasteur Pathogenic Fungi
IMI Commonwealth NBRC National Board for
Mycological Institute Respiratory Core
Tabla 0571.2. Características de crecimiento de los

microorganismos de referencia en los medios de
cultivo para determinación de microorganismos
específicos
Microorga- Efectos Microorga-
nismos de Medio sobre el nismo de
prueba crecimiento referencia
Caldo- E. coli
Bacterias Promoción
Mossel de P. aeruginosa
Gram-
enriquecim
negativas
iento para Inhibición S. aureus

bilis- enterobac-
tolerantes terias
Agar Promoción
glucosa del E. coli
rojo violeta crecimiento P. aeruginosa
bilis + indicador
Promoción
Caldo del E. coli
MacConkey crecimiento
Escherichia Inhibitorio S. aureus
coli Promoción
Agar del
E. coli
MacConkey crecimiento
+ indicador
Salmonella
enterica
subesp.
enterica
serovar
Caldo typhimurium,
Rappaport ATCC 14028
Vassiliadis Promoción o Salmonella
de del
enterica
enriqueci- crecimiento subesp.
Salmonella miento enterica
spp para serovar abony
Salmonella NBRC
100797,
NCTC 6017,
CIP 80.39
Inhibitorio S. aureus
Promoción Salmonella
Agar xilosa,
del enterica
lisina, deso-
crecimiento subesp.
xicolato
+ indicador enterica

serovar
typhimurium,
ATCC 14028
o Salmonella
enterica
subesp.
enterica
serovar abony
NBRC
100797,
NCTC 6017,
CIP 80.39
Indicador E. coli
Promoción
Pseudomona Agar del P. aeruginosa
s aeruginosa cetrimida crecimiento
Inhibitorio E. coli
Promoción
del
Staphylococc Agar sal S. aureus
crecimiento
us aureus manitol + indicador
Inhibitorio E. coli
Medio de
Promoción
enriquecim Cl.
del
iento para sporogenes
Clostridium clostridios crecimiento
sporogenes
Promoción
Agar Cl.
del
Columbia sporogenes
crecimiento
Caldo Promoción
Candida
dextrosa del C. albicans
albicans
Sabouraud crecimiento

Promoción
Agar
del
dextrosa C. albicans
crecimiento
Sabouraud
+ indicador
PRUEBA DE APTITUD DEL MÉTODO
DE CUENTA EN PRESENCIA DEL PRODUCTO.
La validez de las pruebas que constituyen este capítulo,
se basa en su capacidad para poner en evidencia a los
microorganismos presentes en una sustancia o producto
farmacéutico. Por esta razón, antes de establecer en
forma rutinaria su análisis, es necesario demostrar la
aptitud del método para recuperar a los
microorganismos de referencia previamente inoculados
en la muestra bajo las condiciones de prueba.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA. La
preparación de la muestra depende de las
características físicas del producto de prueba. Sin
embargo, si ninguno de los procedimientos descritos en
este capítulo es satisfactorio para el análisis de un
producto determinado, se debe desarrollar un
procedimiento alterno.
Preparar la muestra de acuerdo a sus características
físicas, elegir el método adecuado para obtener una
solución, suspensión o emulsión sin alterar el número y
tipo de microorganismos presentes en el producto.
Productos solubles en agua. Diluir el producto de
prueba (usualmente en una proporción 1 en 10) en
solución amortiguadora de cloruro de sodio peptona
pH 7.0, solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2 o
caldo soya tripticaseína. Si es necesario, ajustar el
pH de 6 a 8. Cuando se requiera preparar más
diluciones, utilizar el mismo diluyente.
Productos no grasos insolubles en agua. Suspender el
producto de prueba (usualmente en una proporción de
1 en 10) en solución amortiguadora de cloruro de sodio
peptona pH 7.0, solución amortiguadora de fosfatos pH
7.2 o caldo soya tripticaseína. Para este tipo de

productos puede agregarse un agente tensoactivo como
el polisorbato 80 en una concentración de 1 g/L. Si es
necesario, ajustar el pH de 6 a 8. Cuando se requiera
preparar más diluciones, utilizar el mismo diluyente.
Líquidos viscosos. Para muestras viscosas que no
puedan medirse con pipeta en la dilución 1:10, efectuar
diluciones 1:50 o 1:100.
Productos grasos. Disolver el producto de prueba en
miristato de isopropilo esterilizado por filtración o
mezclar con la cantidad mínima necesaria de
polisorbato 80 estéril u otro agente tensoactivo no
inhibitorio estéril, calentar si es necesario a no más de
40 °C, en casos excepcionales a no más de 45 °C.
Mezclar cuidadosamente, mantener la muestra en baño
de agua el tiempo necesario para formar una emulsión.
Añadir la cantidad necesaria del diluyente seleccionado
precalentado para obtener una dilución 1 en 10 del
producto, mezclar cuidadosamente. Cuando se
requiera, preparar más diluciones decimales usar el
diluyente seleccionado que contenga polisorbato 80
estéril u otro agente tensoactivo no inhibitorio estéril
en una concentración adecuada.
Líquidos o sólidos en aerosol. Transferir
asépticamente el producto de prueba dentro de una
unidad de filtración con membrana o a un contenedor
estéril. Usar el contenido total o un número definido de
dosis de cada contenedor.
Parches transdérmicos. Sobre una superficie estéril,
remover la cubierta protectora de los parches y
colocarlos con el adhesivo hacia arriba. Cubrir el
adhesivo con gasa estéril para evitar que los parches se
adhieran, y transferirlos a un volumen adecuado del
diluyente seleccionado conteniendo inactivantes
inactivadores como el polisorbato 80 y (o) lecitina.
Agitar la preparación vigorosamente al menos durante
30 min.

INOCULACIÓN Y DILUCIÓN. A la muestra
preparada como se describe en Preparación de la
muestra y al control negativo (diluyente sin producto
de prueba), inocular un volumen de la suspensión
microbiana que contenga no más de 100 UFC. El
volumen del inóculo no debe exceder del 1 % del
volumen del producto diluido.
Para demostrar si la recuperación de los
microorganismos es aceptable, usar el factor de
dilución más bajo (dilución 1:10); de la muestra
preparada para la prueba, cuando esto no sea posible
debido a la actividad antimicrobiana o a la pobre
solubilidad de la muestra se deben desarrollar
protocolos apropiados. Si la muestra inhibe el
crecimiento, adicionar la suspensión microbiana
después de neutralizarla o diluirla.
NEUTRALIZACIÓN O ELIMINACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA. El número de
microorganismos recuperados en la muestra preparada
como se describe en Inoculación y dilución e incubada
siguiendo las indicaciones descritas en Recuperación
de microorganismos en presencia del producto, se
compara con el número de los microorganismos
recuperados en la preparación control.
Si el crecimiento se inhibe (con un factor mayor que
2), modificar el método de cuenta para asegurar la
validez de los resultados. La modificación del método
puede incluir: (1) incrementar el volumen del diluyente
o del medio de cultivo, (2) incorporar al diluyente un
agente neutralizante general o específico, (3) emplear
el método de filtración de membrana, o (4) una
combinación de estos procedimientos.
Los agentes que se usan para neutralizar la actividad
antimicrobiana aparecen en la tabla 0571.3. Estos
neutralizantes pueden añadirse al diluyente
seleccionado o al medio de cultivo, preferentemente
antes de esterilizar, la eficacia y toxicidad de estos

agentes para los microorganismos se debe demostrar
usando un control con neutralizante y sin producto.
Tabla 0571.3. Agentes neutralizantes para sustancias
con actividad antimicrobiana
Sustancias con actividad Neutralizantes
antimicrobiana potenciales
Sulfito ácido de sodio
Glutaraldehído, mercuriales
(bisulfito de sodio)
Fenoles, alcohol, aldehídos,
Dilución
sorbatos
Aldehídos Glicina
Sales cuaternarias de amonio,
parahidroxibenzoatos Lecitina
(parabenos), bis-biguanidas
Sales cuaternarias de amonio,
Polisorbato
yodo, parabenos
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halógenos,
Tiosulfato
aldehídos
EDTA (edetatos) Iones Mg2+ o Ca2+
Si no se logra neutralizar la actividad antimicrobiana
de la muestra, se puede asumir que el producto no es
susceptible de contaminarse con las especies de
microorganismos probadas, pero no con otros
microorganismos. En consecuencia es necesario
efectuar pruebas con una dilución más alta compatible
con el crecimiento microbiano y el criterio de
aceptación especificado.
RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS EN
PRESENCIA DEL PRODUCTO. Realizar pruebas
individuales para cada microorganismo enlistado.
Contar únicamente los microorganismos agregados en
la prueba.

MÉTODOS DE CUENTA MICROBIANA
1. Método de filtración por membrana. Usar
membranas con una porosidad nominal no mayor que
0.45 µm. El tipo de membrana se selecciona en función
de su eficiencia para retener bacterias y la composición
de la muestra de prueba.
Para cada microorganismo enlistado en la tabla 0571.1,
usar una membrana, transferir la cantidad adecuada de
muestra preparada como se describe en Preparación de
la muestra que represente 1 g del producto, o menos si
el número de UFC esperado es elevado, filtrar
inmediatamente y enjuagar la membrana con el
volumen de diluyente determinado en la prueba de
aptitud.
Para determinar la cuenta de organismos mesofilicos
aerobios (OMA), transferir la membrana a la superficie
de una placa de agar soya tripticaseína. Para la cuenta
de hongos y levaduras (HL), transferir la membrana a
la superficie de una placa de agar dextrosa Sabouraud,
incubar las placas como indica la tabla 0571.1 y contar
el número de colonias.
2. Método de cuenta en placa. Efectuar el método por
lo menos por duplicado para cada medio de cultivo y
promediar para informar los resultados.
2.1 Método de vaciado en placa. Para cada
microorganismo enlistado en la tabla 0571.1, usar al
menos 2 cajas de Petri, a cada una añadir 1 mL de la
muestra (preparada como se describe en Preparación
de la muestra y en Inoculación y dilución) adicionar de
15 a 20 mL de agar soya tripticaseína o agar dextrosa
Sabouraud, mantenido a una temperatura no mayor que
45 °C. Incubar las placas como se indica en la
tabla 0571.1. Calcular el promedio de las cuentas y
determinar el número de unidades formadoras de
colonia por mililitro, gramo o por unidad de muestra.
2.2 Método de extensión. En cajas de Petri estériles,
añadir de 15 a 20 mL de agar soya tripticaseína o agar

dextrosa Sabouraud a una temperatura aproximada de
45 °C y permitir solidificar. Secar las placas, en
campana de flujo laminar o en incubadora. Para cada
microorganismo enlistado en la tabla 0571.1, usar al
menos 2 cajas de Petri, extender sobre la superficie del
medio de cultivo 0.1 mL de la muestra preparada como
se describe en “Preparación de la muestra” y
“Neutralización o eliminación de la actividad
antimicrobiana”, incubar y contar el número de
colonias.
3. Método del Número Más probable (NMP). La
precisión y exactitud de este método es menor que el
de filtración o de la cuenta en placa, los resultados no
son confiables particularmente para la cuenta de
hongos. Por esta razón el método del NMP se reserva
para enumerar organismos mesofílicos aerobios cuando
no se puede usar otro método. Sí su uso se justifica
proceder como sigue:
Preparar 3 diluciones decimales seriales del producto
como se describe en “Preparación de la muestra” y en
“Neutralización o eliminación de la actividad
antimicrobiana”. De cada dilución, tomar 3 alícuotas
de 1 g o 1 mL para inocular 3 tubos con 9 o 10 mL de
caldo soya tripticaseína. Si es necesario, añadir al
medio un agente tensoactivo como el polisorbato 80 y
un inactivador antimicrobiano. Incubar los tubos de 30
a 35 °C por no más de 3 días. Leer los tubos por
turbiedad, sí la lectura se dificulta por la naturaleza del
producto, subcultivar en el mismo caldo, incubar
durante 1 a 2 días en las mismas condiciones y leer por
turbiedad. Determinar el número más probable de
microorganismos por gramo o mililitro del producto de
prueba en la tabla 0571.4.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Cuando se verifica la aptitud del método de filtración
por membrana o el método de cuenta en placa, el
promedio de la cuenta de los microorganismos de

referencia en presencia del producto, no debe diferir
por un factor mayor que 2 de los valores del control.
Ejemplo: Si la cuenta control es de 100 UFC el límite
inferior aceptable para la muestra en análisis es
100 / 2 = 50 UFC y el límite superior es de
100 × 2 = 200 UFC.
Cuando se verifica la aptitud del método del NMP los
valores calculados del inóculo deben estar dentro de los
límites de confianza del 95 % de los resultados
obtenidos con el control.
Si este criterio no se cumple para uno o más de los
microorganismos de referencia con los métodos
descritos, utilizar el método y las condiciones de
prueba más cercanas a esos criterios.
TAMAÑO DE LA MUESTRA DE PRUEBA
A menos que se indique otra condición en la
monografía del producto, usar 10 g o 10 mL del
producto de prueba. Para líquidos o sólidos en forma
de aerosol analizar 10 contenedores y para parches
transdérmicos 10 parches.
El tamaño de muestra puede reducirse cuando la
cantidad de muestra o del lote es extremadamente
pequeño (menores de 1 000 mL o 1 000 g), en estas
condiciones, la muestra debe ser del 1 % del tamaño
del lote a menos que se justifiquen cantidades menores.
Para productos donde el número total de unidades del
lote es menor que 200, el tamaño de la muestra puede
reducirse a 2 o 1 unidad si el total de unidades del lote
es menor que 100. Seleccionar al azar la muestra a
partir del material a granel o de los envases disponibles
del producto. Para obtener la cantidad de muestra
requerida, mezclar el contenido de un número
suficiente de envases.
EXAMEN DEL PRODUCTO
Examen del producto por el método de filtración
por membrana
Usar una unidad de filtración que permita transferir la

membrana al medio de cultivo. Preparar las muestras
usando un método cuya aptitud se haya demostrado
previamente, transferir la cantidad apropiada de la
mezcla a dos membranas, filtrar inmediatamente. Lavar
cada membrana como se establece en la prueba de
aptitud. Para las determinaciones de OMA, transferir la
membrana a la superficie de una placa de agar soya
tripticaseína. Para la determinación de HL, transferir la
membrana a la superficie de una placa de agar dextrosa
Sabouraud. Incubar la placa de agar soya tripticaseína
de 30 a 35 °C durante 3 a 5 días y la placa de Agar
dextrosa Sabouraud de 20 a 25 °C durante 5 a 7 días.
Calcular el número de unidades formadoras de colonias
(UFC) por gramo o por mililitro del producto.
Cuando se examinan parches transdérmicos, filtrar el
10 % del volumen de la preparación descrita en
Preparación de la muestra a través de dos membranas
estériles. Transferir una membrana a agar soya
tripticaseína para determinar OMA y la otra membrana
a agar dextrosa Sabouraud para determinar HL.
Análisis Examen del producto por el método de
vaciado en placa
Preparar la muestra usando un método cuya aptitud se
haya demostrado previamente como se describe en
Aptitud del método. Preparar para cada medio de
cultivo al menos 2 cajas de Petri para cada dilución.
Incubar las placas de agar soya tripticaseína a 30
a 35 °C de 3 a 5 días y las placas de agar dextrosa
Sabouraud por 20 a 25 °C durante 5 a 7 días.
Seleccionar las placas correspondientes a la dilución en
la que el número de colonias no rebase las 250 UFC
para OMA y 50 para HL. Calcular el promedio de la
cuenta en cada medio de cultivo y determinar número
de unidades formadoras de colonias por gramo o por
mililitro de producto.

Análisis Examen del producto por el método de
extensión
Preparar la muestra usando un método cuya aptitud se
haya demostrado previamente como se describe en
Aptitud del método. Preparar al menos dos cajas de
Petri para cada medio y cada dilución. Incubar y
calcular el número de UFC como se describe en el
método de vaciado en placa.
Análisis Examen del producto por el método
número más probable
Preparar y diluir la muestra usando un método cuya
aptitud se haya demostrado previamente como se
describe en Aptitud del método. Incubar los tubos de 30
a 35 °C por 3 a 5 días. Subcultivar si es necesario.
Registrar el número de tubos que muestren crecimiento
en cada dilución. Determinar el número más probable
de microorganismos por gramo o mililitro del producto
de acuerdo a la tabla 0571.4.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
La cuenta de OMA es el número de UFC determinado
en agar soya tripticaseína. Si se presentan colonias de
hongos en este medio, incluirlas en la cuenta. La
cuenta de hongos filamentosos y levaduras (HL) es el
número de UFC presentes en agar dextrosa Sabouraud;
si se presentan colonias de bacterias en este medio,
incluirlas en la cuenta. Cuando la cuenta de HL excede
el criterio de aceptación debido al crecimiento
bacteriano, usar agar dextrosa Sabouraud con
antibióticos. Si la cuenta se efectúa por el método del
NMP el valor calculado corresponde a la cuenta de
OMA.
DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS
ESPECÍFICOS.
Estas pruebas permiten investigar la presencia de
microorganismos específicos y determinar si una
sustancia o preparado farmacéutico cumple con las
especificaciones microbiológicas establecidas.

Para efectuar las pruebas seguir las instrucciones
indicadas, se pueden utilizar procedimientos alternos,
incluyendo los automatizados, siempre y cuando se
demuestre su equivalencia con los métodos
farmacopeicos.
La aptitud de las pruebas para detectar
microorganismos en presencia del producto debe
establecerse y confirmarse cuando se introducen
cambios en las pruebas o en el producto.
Preparar el producto de prueba como se describe en
Preparación de la muestra.
Tabla 0571.4. Número más probable de
microorganismos.
Combinaciones de
tubos con
Número más
crecimiento en cada
probable de
dilución
microorganismos Límites de
Número por gramos por gramo o por confianza
o mililitro de mililitro al 95 %
producto por tubo (NMP/g o NMP/
mL)
10-1 10-2 10-3
0.1 0.01 0.001
0 0 0 <3 0 a 9.4
0 0 1 3 0.1 a 9.5
0 1 0 3 0.1 a 10
0 1 1 6.1 1.2 a 17
0 2 0 6.2 1.2 a 17
0 3 0 9.4 3.5 a 35
1 0 0 3.6 0.2 a 17
1 0 1 7.2 1.2 a 17
1 0 2 11 4 a 35
1 1 0 7.4 1.3 a 20
1 1 1 11 4 a 35

1 2 0 11 4 a 35
1 2 1 15 5 a 38
1 3 0 16 5 a 38
2 0 0 9.2 1.5 a 35
2 0 1 14 4 a 35
2 0 2 20 5 a 38
2 1 0 15 4 a 38
2 1 1 20 5 a 38
2 1 2 27 9 a 94
2 2 0 21 5 a 40
2 2 1 28 9 a 94
2 2 2 35 9 a 94
2 3 0 29 9 a 94
2 3 1 36 9 a 94
3 0 0 23 5 a 94
3 0 1 38 9 a 104
3 0 2 64 16 a 181
3 1 0 43 9 a 181
3 1 1 75 17 a 199
3 1 2 120 30 a 360
3 1 3 160 30 a 380
3 2 0 93 18 a 360
3 2 1 150 30 a 380
3 2 2 210 30 a 400
3 2 3 290 90 a 990
3 3 0 240 40 a 990
3 3 1 460 90 a 1 980
3 3 2 1 100 200 a 4 000
3 3 3 > 1 100
PREPARACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
DE REFERENCIA. Usar suspensiones estables
estandarizadas.

Para conservar los microorganismos viables usar la
técnica del sistema lote semilla véase Apéndice VI,
Conservación, mantenimiento y manejo de cultivos
microbianos: sistema lote semilla, de manera que los
microorganismos de prueba no tengan más de 5 pases a
partir del cultivo de referencia original o un sistema de
conservación que asegure esto (Se debe de considerar
el pase indicado en el certificado de la cepa de
referencia).
Microorganismos aerobios
Staphylococcus aureus ATCC 6538 o NCIMB 9518,
CIP 4.83 NBRC 13276;
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626,
CIP 82.118 NBRC 13275;
Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP
53.126 NBRC 3972;
Salmonella enterica spp. enterica serotipo
typhimurium, ATCC 14028 o Salmonella enterica spp.
enterica serotipo abony NBRC 100797, NCTC 6017,
CIP 80.39;
Candida albicans ATCC 10231 NCPF 3179, CIP
48.72 NBRC 1594.
Cultivar individualmente los microorganismos
bacterianos de referencia en agar o caldo soya
tripticaseína de 30 a 35 °C durante 18 a 24 h. y
Candida albicans en agar o caldo dextrosa Sabouraud
de 20 a 25 °C durante 2 a 3 días.
Preparar las suspensiones utilizando solución
amortiguadora de cloruro de sodio-peptona pH 7.0 o
solución amortiguadora de fosfato pH 7.2. Utilizar las
suspensiones dentro de 2 a 24 h de su preparación si se
conservan de 2 a 8 °C. Un periodo diferente puede
establecerse siempre que se demuestre la viabilidad de
las suspensiones.
Microorganismos anaerobios
Clostridium sporogenes ATCC 11437 (NBRC 14293,
12343 NCIMB, el CIP 100651) o ATCC 19404

(NCTC 532 o CIP 79.3) o NBRC 14293.
Cultivar el microorganismo en condiciones anaeróbicas
en el medio de enriquecimiento para clostridios.
Incubar de 30 a 35 °C durante 24 a 48 h. Se pueden
utilizar células vegetativas o esporas. La estabilidad de
la suspensión de esporas de 2 a 8 °C debe
determinarse.
Control negativo
Usar como control negativo el diluyente elegido en
lugar de la preparación de la muestra. En el control
negativo no debe haber crecimiento.
PRUEBAS DE APTITUD DEL MÉTODO
Preparación de la muestra.
Inocular individualmente una suspensión que contenga
no más de 100 UFC de cada uno de los
microorganismos de referencia, incubar en las
condiciones indicadas en Preparación de
microorganismos de referencia; el efecto sobre el
crecimiento para cada microorganismo se debe
presentar de acuerdo a lo descrito en tabla 0571.2. Esta
evaluación corresponde al control positivo de la
prueba.
Si el producto presenta actividad antimicrobiana es
necesario modificar el método de prueba de acuerdo a
la sección Neutralización o eliminación de la actividad
antimicrobiana.
Si la actividad antimicrobiana del producto con
respecto alguno de los microorganismos de referencia
no puede neutralizarse, se asume que el producto no
puede contaminarse con el tipo de microorganismo que
inhibe.
PRUEBAS DE PRODUCTOS
Bacterias Gram negativas bilis tolerantes
Preparación y preincubación de la muestra.
Preparar una dilución 1:10 del producto de prueba (no
menos de 1 g o 1 mL), en caldo soya tripticaseína,

mezclar e incubar de 20 a 25 °C por un periodo de 2 a
5 h para permitir la recuperación de las bacterias
dañadas debido al proceso de fabricación o al sistema
preservativo del producto.
Prueba cualitativa (ausencia). A menos de que en la
monografía se especifique alguna otra condición, usar
un volumen correspondiente a 1 g o 1 mL del producto
(según se indica en Preparación y preincubación de la
muestra) para inocular en caldo Mossel de
enriquecimiento de enterobacterias, incubar de 30 a
35 °C durante 24 a 48 h. Subcultivar en las placas de
agar glucosa rojo violeta bilis e incubar de 30 a 35 °C
durante 18 a 24 h.
El producto cumple la prueba de ausencia si no se
observa crecimiento.
Prueba cuantitativa NMP
Selección y subcultivo. Inocular el volumen de caldo
Mossel de enriquecimiento de enterobacterias
determinado en la prueba de aptitud del método, con
diluciones que contengan 0.1, 0.01 y 0.001 g o
mililitros del producto de prueba. Incubar de 30 a
35 °C durante 24 a 48 h. Subcultivar cada tubo en una
placa de Agar glucosa rojo violeta bilis. Incubar de 30
a 35 °C durante 18 a 24 h.
La presencia de crecimiento constituye un resultado
positivo. Determinar en la tabla 0571.5 el número más
probable de enterobacterias.
Tabla 0571.5. Interpretación de resultados para
calcular el número más probable de enterobacterias.
Resultados de cada cantidad de Número más
producto probable de
bacterias
(NMP) por
0.1 g o 0.01 g o 0.001 g o gramo
0.1 mL 0.01 mL 0.001 mL o el mililitro
del producto

3
+ + + > 10
+ + − < 103 y > 102
+ − − < 102 y > 10
− − − < 10
Escherichia coli
menos de 1 g o 1 mL), en 10 mL o la cantidad de caldo
soya tripticaseína determinada en la prueba de Aptitud
del método, mezclar e incubar de 30 a 35 °C durante 18
a 24 h.
Selección y subcultivo. Agitar la mezcla, transferir
1 mL del cultivo anterior a 100 mL de caldo
MacConkey e incubar de 42 a 44 °C durante 24 a 48 h.
Subcultivar en una placa de agar MacConkey de 30 a
35 °C durante 18 a 72 h.
El crecimiento de colonias bien desarrolladas
fermentadoras de la lactosa indica la posible presencia
de E. coli, que se confirma por medio de pruebas de
identificación.
El producto cumple la prueba, sí no hay crecimiento o
si las pruebas de identificación son negativas.
Salmonella spp
Preparación y preincubación de la muestra. Utilizar
no menos de 10 g o 10 mL para inocular la cantidad de
caldo soya tripticaseína, determinada en la prueba de
Aptitud del método, mezclar e incubar de 30 a 35 °C
durante 18 a 24 h.
Selección y subcultivo. Transferir 0.1 mL del cultivo
anterior, a 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis de
enriquecimiento para Salmonella, mezclar e incubar de
30 a 35 °C durante 18 a 24 h. Subcultivar en placas de
agar xilosa lisina desoxicolato e incubar de 30 a 35 °C
durante 18 a 48 h.
El crecimiento de colonias bien desarrolladas, rojas,

con o sin centro negro indica la posible presencia de
Salmonella spp, que se confirma mediante pruebas de
identificación.
El producto cumple con la prueba si las colonias
descritas no están presentes o y si las pruebas
confirmatorias de la identificación son negativas.
Pseudomonas aeruginosa
menos de 1 g o 1 mL), en 10 mL o la cantidad de caldo
soya tripticaseína determinada en la prueba de Aptitud
del método, mezclar e incubar de 30 a 35 °C durante 18
a 24 h.
Para probar parches transdérmicos, filtrar a través de
una membrana estéril el volumen de muestra que
corresponde a un parche, preparada como se describe
en Preparación de la muestra, inocular la membrana
en 100 mL de caldo soya tripticaseína.
Selección y subcultivo. Resembrar una placa de agar
cetrimida e incubar de 30 a 35 °C durante 18 a 72 h.
El crecimiento de colonias características de color
verde indica la posible presencia de P. aeruginosa, que
se confirma por pruebas de identificación.
El producto cumple los requisitos de la prueba si no se
presenta crecimiento o si las pruebas de identificación
no corresponden.
Staphylococcus aureus
Preparar una dilución 1:10, empleando no menos de
1 g o 1 mL del producto en 10 mL o la cantidad de
caldo soya tripticaseína determinada en la prueba de
Aptitud del método, mezclar e incubar de 30 a 35 °C
durante 18 a 24 h.
Para probar parches transdérmicos, filtrar el volumen
de muestra que corresponde a un parche, preparada
como se describe en Preparación de la muestra,
inocular la membrana en 100 mL de caldo soya

tripticaseína. Incubar de 30 a 35 °C durante 18 a 24 h.
sal manitol e incubar de 30 a 35 °C durante 18 a 72 h.
El crecimiento de colonias amarillas/blancas rodeadas
por una zona amarilla indica la posible presencia de
S. aureus, confirmar con pruebas de identificación.
El producto cumple los requisitos de la prueba si las
colonias descritas no están presentes o si las pruebas
que confirman la identificación son negativas.
Clostridia
Preparación y tratamiento térmico de la muestra.
Preparación de la muestra, tomar dos porciones
iguales de no menos de 1 g o 1 mL del producto,
calentar una porción a 80 °C durante 10 min y enfriar
rápidamente. La otra porción no se calienta.
Selección y subcultivo. Mezclar y transferir 10 mL de
cada una de las porciones a dos envases que contengan
100 mL del medio de enriquecimiento para clostridios.
Incubar bajo condiciones anaeróbicas de 30 a 35 °C
durante 48 h. Después de la incubación, subcultivar
cada tubo en placas de agar Columbia e incubar bajo
condiciones anaeróbicas de 30 a 35 °C durante 48
a 72 h.
La presencia de crecimiento anaeróbico de bacilos con
o sin endosporas, catalasa negativa indica la presencia
de clostridia.
Si no se detecta crecimiento de microorganismos
anaeróbicos en el agar Columbia o las pruebas de
identificación son negativas, el producto cumple los
requisitos de la prueba.
Candida albicans
Preparar una dilución 1:10, empleando no menos de
1 g o 1 mL del producto en 100 mL de Caldo dextrosa
Sabouraud, mezclar e incubar de 30 a 35 °C durante 3 a
5 días.

dextrosa Sabouraud e incubar de 30 a 35 °C durante 24
a 48 h.
El crecimiento de colonias blancas sugiere la presencia
de C. albicans, que se confirma con pruebas de
identificación.
El producto cumple los requisitos de la prueba si no se
presenta crecimiento o si las pruebas de confirmación
son negativas.
*Para una mejor comprensión de su solicitud adjunte bibliografía u otros documentos que sustenten sus comentarios.

Proyecto MGA 0571 Límites Microbianos (31-Dic-2019)

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Tabla 0571.2. Características de crecimiento de los

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