Biología Molecular aplicada al Diagnóstico Médico

Módulo I: Clase 2

Herramientas y tecnologías de la biología

molecular, aplicadas al diagnóstico y al
tratamiento en medicina.

Lic. Ezequiel Zubillaga

[email protected]
16.04.2018
Innovación
Herramientas y tecnologías
 Eficacia + Eficiencia = Efectividad
• Eficacia: Todo aquello que nos sirve para cumplir el
objetivo que se ha planificado.

• Eficiencia: Consiste en utilizar los recursos

adecuadamente.

• Efectividad: Cumplir con los objetivos planteados

utilizando la menor cantidad de recursos posibles.
¿ Por qué se han desarrollado
tantas herramientas para
realizar diagnósticos utilizando
la biología molecular?
Porque introducen un
cambio positivo en la vida de
los pacientes…….
¿ Cómo? H1N1
¿ Cómo? Dengue - Chik
¿ Cómo? HPV
¿ Cómo? Tratamiento – P210
Tecnologías aplicadas al estudio de biomarcadores moleculares
1. Aspectos Pre-analíticos:
1. Toma de muestra
2. Conservación de la muestra
3. Preparación de la muestra para el análisis

2. Aspectos Técnicos:
1. Extracción de Ácidos nucleicos
2. PCR / RT-PCR
3. Real time PCR
4. Secuenciación
5. MLPA
6. Microarray

3. Aspectos analíticos:
1. Controles de calidad
2. Validación técnica
3. Validación clínica

4. Aspectos Post- analíticos:

1. Modelo de informe
2. Interpretación del resultado
 1. Aspectos Pre-análiticos:
Entre un 40 % y un 70 % de los errores cometidos en un laboratorio clínico se
originan en dicha etapa.

En la fase pre-analítica pueden diferenciarse dos etapas; una primera extra-

laboratorio y la segunda dentro del laboratorio.

Los errores que pueden generarse son de significancia distinta y su medida

es difícil ya que algunos de ellos se ponen de manifiesto en la fase analítica y
otros no se evidenciarán.
 1. Aspectos Pre-análiticos:
Consideraciones:

Un almacenamiento de las muestras sin las condiciones adecuadas, puede alterar las
condiciones físico-químicas de las mismas hasta llegar al punto de deteriorarlas.

Algunos errores no afectan clínicamente al paciente, pero otros implican la repetición de la

solicitud analítica, dando como resultado un incremento de los costos y en ocasiones, incluso
un diagnóstico incorrecto o un tratamiento inadecuado que incide en la salud del paciente.

Debe tenerse en cuenta que muchas veces, en la evolución de un paciente o en el

monitoreo de la eficacia terapéutica, son muestras irrepetibles, es decir, que no pueden
volver a tomarse (ejemplo: monitoreo de la carga viral en un paciente en tratamiento
antiviral en Hepatitis C).
En Biología Molecular, los
ácidos nucleicos son el analito.
(ADN – ARN)
Extracción manual de Ácidos Nucleicos:

Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación mediante un procedimiento químico
son:

1. Lisis de las células.

2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN.

3. Purificación. Consta de 3 fases:

a. Precipitación.

b. Lavado del pellet

c. Recuperación.
Extracción semi-automatizada de Ácidos Nucleicos: 1953

El procedimiento puede realizarse por separación física con la ayuda de minicolumnas equipadas
con una membrana de sílica que retiene específicamente los ácidos nucleicos.

Kits comerciales: High Pure Template (Roche), Stool Mini Kit (Quiagen)

Ej: CMV Cualitativo, CMV CV, EBV Cualitativo, EBV CV.

Extracción automatizada de Ácidos nucleicos:
sistema de extracción basado en el uso de partículas magnéticas que permite el
aislamiento rápido y automatizado de ácidos nucleicos.

El ácido nucleico obtenido es altamente puro y puede ser usado en múltiples

aplicaciones, tales como PCR convencional o cuantitativa, secuenciación, análisis
mediante arrays, etc.

Ej: MagNA Pure (Roche)

Cuantificación y estimación de la pureza del ADN obtenido:

El ADN presenta un máximo de absorbancia a 260 nm, mientras que las proteínas
lo tienen a 280 nm, aunque a 260 nm también presentan absorbancia.

Si calculamos la relaciónA260/A280 podemos determinar si el ADN es más o

menos puro:

A260/A280= 1,9-1,7 (ADN puro)

Ej: NanoDrop (Thermo Scientific)

PCR – Reacción en cadena de la polimerasa: 2003

Kary Mullis
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:

Kary Mullis
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:

35 – 60 Ciclos
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:

Fases de la PCR

Una PCR ideal debería ser altamente específica,

sensible y de gran rendimiento.
 1990 - 2003
RT-PCR – Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa:
Seminested – Nested PCR:

Se aumenta la sensibilidad y la especificidad de la PCR.

Electroforesis en gel de agarosa (PCR punto final) :
Los procesos de amplificación y detección
ocurren desfasados.

Fases de la PCR
PCR Multiplex punto final :

MIX A MIX B MIX C

1 2 3 4 P N M 1 2 3 4 P N M 1 2 3 4 P N
Real time PCR:

La real time PCR es cinética:

Los procesos de amplificación y detección ocurren
dentro del mismo vial cerrado.

Fases de la PCR

Existen dos métodos para la detección: 1- Métodos No Específicos.

2- Métodos Específicos.
Real time PCR:

Los métodos no específicos se

basan en el uso de moléculas
intercalantes que tienen afinidad
por el ADN de doble cadena y que
al ser oxidados generan una señal
fluorescente (SYBR).
Real time PCR: métodos no específicos
PCR Multiplex Real Time No Especifico :
Real time PCR:

Los métodos específicos siguen el

principio conocido como FRET para
generar la señal.
Utilizan sondas de secuencia
conocida para realizar la detección.
Real time PCR: métodos específicos - TaqMan
PCR Multiplex Real Time Especifico :
Real time PCR: métodos específicos - Probes
Análisis de mutaciones y polimorfismos utilizando Curvas de Disociación:

1- Se realizan curvas de Fluorescencia vs. Temperatura luego de finalizada la

reacción

2- De estas curvas se determina el Tm (temperatura de fusión de cada producto

generado, que es directamente dependiente de la secuencia del mismo)

3- Tan solo la diferencia en una base entre dos secuencias genera una
diferencia en la Tm, lo cual Nos permite diferenciarlos
¿Como se cuantifica en
la PCR Tiempo Real?

A través de STD o por medio de

un gen de expresión
constitutiva.
Cuantificación Absoluta

vs

Cuantificación Relativa
Secuenciación por método enzimático:

El método de Sanger (1977) se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminación específica.
Secuenciación por método enzimático automatizado:

Secuenciación en electroforesis capilar: En la actualidad la reacción de secuenciación se basa en una modificación de la PCR con
dideoxinucleótidos marcados con fluoróforos y se resuelve mediante una electroforesis capilar.
Secuenciación:
Genética forense:
Secuenciación NGS (Next Generation Sequencing):
Secuenciación NGS:
Secuenciación NGS: Exoma
MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification :
MLPA es una Multiplex PCR, que permite que en una misma reacción se pueda detectar copias anormales de secuencias genómicas
diferentes de ARN o ADN.
MicroArrays:

Es una superficie sólida a la cual se une una colección de fragmentos de ADN. Se usan para analizar expresión diferencial de genes. Su
funcionamiento consiste en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica, y su target, que se refleja comúnmente mediante
análisis de imágenes de la intensidad de fluorescencia.
¿Para informar - liberar un
resultado debemos conocer
algo más?
Debemos conocer la composición de un dato de Laboratorio…

Variabilidad
Pre-analítica
Resultado Valor
Variabilidad Biológica
de la verdadero

muestra

Imprecisión
analítica

Bias Analítico
(No veracidad) VARIABILIDAD TOTAL /
ERROR TOTAL
 ¿ De que esta compuesto el Error Total?
Expresión de la
Tipos de Error Característica del Característica del
Desempeño Desempeño

Error
Sesgo Bias % / Error %
Sistemático

Error Exactitud Incertidumbre

Total

Error
Precisión CV % / SD
Aleatorio
 CCE –
Control de Calidad: Materiales de
referencia Seguimiento
Control
de
Estadístico Desempeño
Interno
Controles de Calidad – Control de muestra:
Validación Técnica:

El control interno debe haber amplificado.

El control positivo debe haber amplificado. Su desempeño se debe

ajustar a los parámetros establecidos.

El control negativo no debe presentar amplificación.

Validación Clínica:

En este punto vuelven a ser importantes los aspectos Pre-analíticos, la información aportada por el medico
en la orden es fundamental para la validación clínica.

Es necesario conocer el estado fisiológico del paciente, sexo, edad, medicación y adherencia a la misma y el
diagnostico. Además de útil contar con los test realizados sobre la misma muestra (ej: serología,
citogenética, etc.).

El resultado obtenido debe concordar el estado del paciente al momento del realizar el estudio y para eso es
necesario cruzar toda la información disponible.

En caso de no tener información previa se deben realizar test reflejos para confirmar la validez de nuestro
resultado.

La validación clínica es el paso mas importante en la generación de resultados, ya que engloba los aspectos
pre-analíticos y analíticos, establecer criterios y el uso de test reflejos para la misma es indispensable para
conseguir buenas practicas en el laboratorio de análisis clínicos.
Modelo de informe:

El modelo de informe debe tener las siguientes características:

a. Test realizado:
b. Tipo de muestra:
c. Resultado:
d. Observaciones:

Se debe dar información sobre el método utilizado para la obtención del resultado, y de
ser necesario una aclaración de que los resultados obtenidos deben ser interpretados en
función del estado fisiológico del paciente.

Ej: Tamizaje de HPV:

a. Tipo de muestra: (Hisopo, cepillo, semen)

b. HPV 16: (Detectable / No Detectable)
c. HPV 18: (Detectable / No Detectable)
d. Otros genotipos de alto riesgo: (Detectable / No Detectable)
e. Observaciones:
Modelo de informe:

Detección cualitativa del ADN del virus del papiloma humano.

El estudio es realizado por medio de la plataforma Cobas 4800 (Roche) – Reacción en

cadena de la polimerasa en tiempo real.

Se amplifica la región L1 del genoma de HPV.

El ensayo detecta los siguientes genotipos (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,
68, 66)

Aclaración: “Otros genotipos de alto riesgo” implica la detección de uno o mas de los
siguientes genotipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 66.

Nota: Los resultados obtenidos en este estudio deben interpretarse en conjunto con la
información clinico-ginecologica, histológica, anatomopatológica y colposcopica del
paciente.
Interpretación del resultado:

BRCA 1 y BCRA 2:

Descripción genética:

En la paciente indicada se ha realizado un estudio molecular para el análisis de pequeñas

deleciones/inserciones y mutaciones puntuales en la región codificante y los sitios de splicing (10
pb intrónicas flanqueantes) del gen BRCA1 y del gen BRCA2 mediante secuenciación masiva o
NGS (Next Generation Sequencing).

Metodología:

1- Amplificación mediante PCR de los exones codificantes, así como de las regiones intrónicas
flanqueantes tanto del gen BRCA1 como del gen BRCA2.
2- Preparación de librerías.
3- Secuenciación de las librerías.
4- Análisis bioinformático de las secuencias obtenidas.

Resultados:

En las siguientes tablas se resumen los cambios detectados, con una cobertura mayor a 100x, en
todas las regiones analizadas de los genes BRCA1 y BRCA2. Todos los cambios identificados
han sido contrastados con distintas bases de datos internacionales (BIC, NCBI, LOVD, HGMD):
Interpretación del resultado:

Interpretación:

Mediante el análisis directo de los genes BRCA1 y BRCA2, en la paciente indicada, no se ha

detectado ningún cambio claramente patogénico asociado con la susceptibilidad al cáncer.

El cambio c.2971A>G (p.Asn991Asp) en el gen BRCA2, cuya frecuencia de heterocigotos ha

sido descrita, es considerada variante sin importancia clínica (BIC).

El resto de los cambios detectados son sinónimos (no producen un cambio en la proteína) y/o han
sido descritos en un porcentaje considerable en población control, por lo que se podrían
considerar cambios polimórficos sin ningún significado clínico, aunque esto queda abierto a nuevas
investigaciones sobre la susceptibilidad al cáncer.
Interpretación del resultado:

Conclusión:

La paciente no es portadora de cambios, ni en la secuencia analizada del gen

BRCA1 ni en la secuencia analizada del gen BRCA2, que estén claramente asociados con la
susceptibilidad al cáncer.

Este resultado no permite confirmar ni descartar que exista una predisposición familiar al cáncer de mama.

Recomendaciones:

Este estudio no permite detectar grandes deleciones ni duplicaciones (5-10% de las mutaciones
en BRCA1 y un porcentaje algo menor en BRCA2), por lo que se recomienda su análisis mediante
MLPA, en la paciente arriba indicada

Los resultados del presente estudio han de ser evaluados teniendo en cuenta la clínica de la
paciente.

La paciente debe recibir consejo genético en una consulta especializada.

Muchas gracias…..