Los métodos modernos de producción animal y el aumento del comercio internacional exigen el

desarrollo de medios de diagnóstico y de vigilancia, así como capacidad global y armonización

diagnóstica para potenciar la productividad del ganado y la salud de los animales, y para contribuir
a la unión de tecnologías de detección de agentes patógenos como base de la iniciativa mundial
“Una Sola Salud”.

El riesgo de transferencia de agentes patógenos entre países o continentes ha aumentado de

forma considerable en los últimos años debido a varios factores, como un aumento de los
desplazamientos nacionales e internacionales de personas, animales, alimentos y productos
alimentarios, y distintos bienes, así como al cambio climático, que ha causado nuevos escenarios
epidemiológicos y amenazas. Esta nueva situación destaca el requisito de desarrollo y aplicación
de una amplia gama de métodos de diagnóstico potentes y novedosos que permitan detectar con
rapidez los agentes patógenos que se están propagando, y que ofrezcan especificidad y
sensibilidad diagnósticas.

El objetivo de este capítulo es proporcionar información general y actualizaciones sobre los

métodos biotecnológicos más importantes actualmente utilizados en nuestros laboratorios de
diagnóstico. Se han dedicado dos números de la Revista Científica y Técnica de la OIE a la
biotecnología y al diagnóstico de enfermedades animales, los cuales pueden consultarse en la
página web de la OIE (http://www.oie.int/en/publications-and-documentation/scientific-and-
technical-review-free-access/list-of-issues/; Potential applications of pathogen genomics: Volumen
35, Número 1, 2016; Biotechnology applications in animal health and production: Volumen 24,
Número 1, 2005).

Se ha comprobado que la detección directa y la amplificación de secuencias específicas de ácido nucleico en el

genoma de agentes patógenos tiene ventajas considerables. Las tecnologías basadas en la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) han revolucionado el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Las plataformas de
amplificación del ADN son muy sensibles, específicas, rápidas y robustas. Dichas plataformas también son
rentables y adaptables a la automatización y, por lo tanto, ideales para el cribado de alto rendimiento. El equipo
necesario es muy adaptable a la detección de muchas dianas distintas, aunque la calidad de las muestras es
fundamental para que estas tecnologías funcionen bien.

Un paso importante en el procedimiento diagnóstico molecular es la extracción de mezclas “limpias” de ácido

nucleico que actúen como molde para las reacciones. Aunque es relativamente fácil extraer ADN de cultivos
bacterianos o de sangre, técnicamente es más complicado preparar material adecuado de muestras de campo,
como heces, órganos internos o material de abortos. Si el material a analizar no ha sido purificado de agentes
contaminantes en la muestra clínica, la prueba quedará comprometida y puede dar falsos positivos. Los pasos de
manipulación durante la extracción de ácidos nucleicos son críticos debido a la contaminación cruzada de las
muestras, que comporta falsos positivos. Por ello, la extracción de ácidos nucleicos debe llevarse a cabo
mediante procedimientos de trabajo estrictos, en una sala aislada, independiente de la amplificación del ácido
nucleico.
El aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos consta de tres pasos principales: rotura de las células,
eliminación de proteínas y contaminantes y recuperación de ácidos nucleicos adecuados para el análisis. Existen
numerosos métodos de extracción de ácidos nucleicos, como la extracción manual con fenol-cloroformo y
tiocianato de guanidinio para concentrar el ADN en una fase hidrófila, la elución basada en columna de
centrifugación en la que el ácido nucleico se une a una fase sólida como la sílice y las proteínas se eliminan con
la ayuda de la centrifugación, y la extracción con perlas magnéticas, en la que el ácido nucleico se une a las
partículas magnéticas mientras que las proteínas se eliminan por lavado. Si bien cada método de extracción
tiene un rendimiento distinto y genera una pureza distinta de ácidos nucleicos diana extraídos, una extracción
eficaz y reproducible es una parte esencial de la detección de ácidos nucleicos y, por lo tanto, de la detección de
agentes patógenos. La PCR, u otros métodos descritos a continuación, pueden detectar y ampliar la diana
específica, pero la calidad del material de partida es una parte inherente del proceso de detección.

Existen varios métodos especializados para tipos concretos de muestras y tejidos, la mayoría de los cuales se
comercializa hoy en día, como sistemas manuales o automatizados para estaciones de trabajo robóticas. El
desarrollo y la accesibilidad de las infraestructuras de extracción robóticas no solo minimiza el riesgo de
contaminación, sino que también permite el procesado de grandes cantidades de muestras en condiciones de
reacción constante y muy poca manipulación por parte del operario. En consecuencia, estas infraestructuras han
contribuido a establecer pruebas diagnósticas de alto rendimiento y robustas, que acortan el tiempo necesario de
procesado por muestra, pasando a durar de horas a minutos (Belák et al., 2009; Oberacker et al., 2019). Están
diseñadas para mejorar la fiabilidad de la extracción de ácidos nucleicos de distintas muestras, pero sigue
tratándose de un campo exigente.

Como alternativa a la extracción de ácidos nucleicos, los biotecnólogos se están centrando cada vez más en las
polimerasas que son resistentes a los inhibidores de la PCR, y hoy en día se dispone de varias en el mercado
para la amplificación directa de ácidos nucleicos de muestras patológicas sin necesidad de realizar ningún paso
de extracción (Pavšič et al., 2016).

La PCR se utiliza mucho y es una técnica de diagnóstico muy sensible para la detección de secuencias de ácido
nucleico específicas de agente patógeno en tejidos de hospedadores y en vectores. A lo largo de los últimos 30
años, la PCR ha revolucionado el proceso de diagnóstico, y ha permitido una detección rápida, así como muy
sensible y específica, de una gran variedad de agentes patógenos.

La PCR permite identificar y amplificar una región diana específica y seleccionada de ácido nucleico de una
mezcla compleja de secuencias heterógenas (Saiki et al., 1988). La PCR logra la amplificación in-vitro
explotando los mecanismos de replicación natural del ADN, utilizando una sucesión de pasos cíclicos de
incubación a distintas temperaturas. La amplificación facilita la detección de secuencias diana de ácido nucleico
dentro de una muestra, incluso cuando inicialmente solo se cuenta con una pequeña cantidad de dianas.

La PCR se lleva a cabo con ácido nucleico extraído de muestras clínicas. En primer lugar, el ADN de la muestra
heterogénea se desnaturaliza por calor para separar las dos hebras complementarias, creando así una plantilla
monocatenaria. A continuación, se utilizan cebadores específicos para identificar las regiones diana que van a
amplificarse. Los cebadores son moléculas de ADN monocatenarias cortas, sintéticas, complementarias a las
secuencias diana. Si la secuencia diana está presente en la muestra, los cebadores se aparearán con estas
regiones a medida que se enfríe el ciclo de temperatura. Después de la unión, el ciclo entra en una fase de
temperatura intermedia en la que los cebadores unidos permiten la extensión de la secuencia diana mediante la
ADN polimerasa. Una vez que la polimerasa ha sintetizado una nueva hebra complementaria de ADN, el
producto se separa del molde calentándolo a una temperatura más alta y el ciclo se repite.

Estos ciclos se repiten por lo general entre 35 y 50 veces, lo que da como resultado la amplificación de las
secuencias de ADN diana. Cada ciclo tiene el potencial de duplicar el número de dianas del ciclo anterior, lo que
lleva al aumento exponencial del ADN objetivo que da al método su alta sensibilidad. La clave para la
amplificación de las secuencias de ADN diana mediante la PCR es la selección de cebadores apareados que,
cuando se extienden, crearán sitios de hibridación de cebadores recíprocos adicionales para la extensión de
cebadores en ciclos posteriores. Para detectar ARN (por ejemplo, virus de ARN), primero se debe hacer una
copia de ADN complementario (ADNc) del ARN mediante transcripción inversa (RT). A continuación, el ADNc
actúa como molde para la amplificación mediante PCR. Esta técnica se conoce como PCR con transcripción
inversa (RT-PCR).

Una vez amplificada la secuencia diana, se puede detectar. Los productos amplificados se suelen detectar
utilizando métodos que también ayudan a confirmar la identidad de los productos de la PCR, como los
siguientes:
i) Métodos que definen su tamaño característico (como la electroforesis en gel)
ii) Sondas de ADN (ver más abajo)
iii) Fusión de alta resolución (véase la Sección A.2.1)
iv) Sistemas de detección basados en fluorescencia (tecnología en tiempo real)
v) Tecnologías de secuenciación de nucleótidos

Desde la aparición de las técnicas de secuenciación mediante ciclos automatizados, la identificación se realiza
cada vez con mayor frecuencia mediante técnicas de PCR y caracterización de agentes por secuenciación
directa de los productos de la PCR.

Para proporcionar resultados robustos y reproducibles, los protocolos de PCR deben diseñarse y optimizarse con
detalle y validarse por completo. El Capítulo 2.2.3 Desarrollo y optimización de métodos de detección de ácidos
nucleicos proporciona información y orientación completas sobre dichos ensayos.

Para ampliar su utilidad en el diagnóstico veterinario y la identificación de agentes patógenos, la PCR se ha

modificado ampliamente a lo largo de los años. La PCR tradicional, que requiere detección en el punto final de la
reacción, clásicamente mediante electroforesis en gel de agar, ha sido reemplazada en gran medida por la
detección mientras ocurre la reacción, es decir, la PCR en tiempo real. Las variaciones más habituales, las
principales ventajas y las limitaciones de las tecnologías de PCR se resumen en la Tabla 1.

PCR: amplifica una región seleccionada de ácido nucleico diana presente en una muestra

Variaciones Detalles Ventajas Inconvenientes

PCR anidada Dos rondas de PCR, la Alta sensibilidad Alto riesgo de contaminación
segunda de las cuales amplifica porque no es un sistema
más un fragmento genómico cerrado y puede producirse
pre-amplificado en la primera. contaminación cruzada o
En general, sustituida por la arrastre durante la
PCR en tiempo real. manipulación de los productos
amplificados

PCR consenso Dirigida a una región genómica Permite identificar agentes Inespecífica, puede requerir
conservada en un grupo de patógenos nuevos pero más caracterización
agentes patógenos estrechamente relacionados

PCR en tiempo Los resultados de la Muy sensible y específica; Coste (sondas; plataforma).
real amplificación se detectan en disminuye el riesgo de Riesgo de falsos negativos con
tiempo real, mediante contaminación porque es un agentes muy mutables: los
fluorescencia de una sonda sistema cerrado y no hay ajustes de la sonda del cebador
específica de región. La manipulación post- pueden diseñarse para que
cuantificación es posible si se amplificación. sean muy específicos de la
utilizan patrones con números diana o universales para
de copias conocidos (de ahí el detectar secuencias
nombre alternativo de PCR conservadas dentro de todo un
cuantitativa) linaje o toda una cepa.

PCR en tiempo Detecta múltiples dianas a la Permite detectar varios agentes La sensibilidad puede estar
real múltiple vez patógenos en un solo ensayo comprometida. Limitada porque
existen varias tinciones
fluorescentes

En el caso de microorganismos de ADN, como parásitos y bacterias, y en el caso de virus de ADN, el

uso de fusión de alta resolución (HRM) permite el genotipado de subtipos de un agente patógeno
basado en diferencias de nucleótidos. La HRM es un método de análisis post-PCR para analizar la
fusión (disociación) de los productos de la PCR en presencia de tinciones de unión a ADN de doble
hebra mejoradas. Como la mayoría de las máquinas de PCR en tiempo real han integrado esta
función, la HRM representa un método de elección rentable, ya que no se requiere una sonda
marcada. Es posible aumentar la especificidad y la precisión del genotipado de la HRM mediante el
uso de sondas sin marcar para interrogar un segmento corto del amplicón obtenido con la PCR, donde
 está presente la mutación diana. Las sondas sin marcar deben bloquearse en el extremo 3' para evitar
la extensión de la polimerasa. Las técnicas de HRM se pueden utilizar en formato singleplex o
multiplex para la detección y diferenciación simultánea de especies del mismo género (Banowary et
al., 2015; Gelaye et al., 2013), detección de resistencia a medicamentos (Loiacono et al., 2017) o
diagnóstico diferencial (Gelaye et al., 2017).

Hasta hace poco, la detección de secuencias diana amplificadas mediante una PCR en tiempo real se
basaba en el uso de diversas sustancias químicas, como tinciones intercaladas, sondas de hidrólisis,
balizas moleculares, transferencia de energía de sonda de cebador (PriProET), cebadores Scorpion,
sondas de hibridación dual y ligación de oligonucleótidos marcados con tinciones (Belák et al., 2009).
La disponibilidad de métodos de detección limitó el número de diferentes dianas (y por lo tanto,
diferentes patógenos) que podrían detectarse simultáneamente en una PCR múltiple. Se han
desarrollado ensayos de PCR de etiquetas masivas para superar esta limitación.

En un ensayo de PCR múltiple con marcador de masa, los diversos cebadores se marcan con
marcadores de pesos moleculares conocidos, pero diferentes entre ellos. Después de la amplificación
de los fragmentos de ADN diana, los marcadores se liberan usando luz UV y posteriormente se miden
usando espectrometría de masas. Este enfoque permite la detección de una gama mucho mayor de
dianas de ADN amplificadas de lo que era posible anteriormente, ya que el ensayo no se limita al
número de tinciones disponibles. Esto permite que un solo ensayo compruebe simultáneamente una
gran gama de enfermedades. La aplicación de la PCR con marcador de masa ya ha sido probada en
el diagnóstico diferencial de enfermedades sindrómicas (agentes patógenos respiratorios,
hemorrágicos, entéricos, síndrome de meningitis/encefalitis) y en la detección de nuevos clados de
agentes patógenos (Lipkin, 2010). Una modificación de este método utiliza la desorción-ionización
láser asistida por matriz (MALDI), que mide directamente los pesos moleculares de los productos de la
PCR y los compara con los de bases de datos conocidas (Angeletti, 2017; Jang & Kim, 2018).

En los últimos años ha habido un renovado interés en la aplicación de la PCR digital (dPCR), en la que
se aíslan copias individuales de ADN y ARN diana y se amplifican individualmente mediante PCR.
Esta técnica se describió por primera vez en la década de 1990 y desde entonces se ha revitalizado
debido al progreso en la química y el desarrollo de equipos. La característica distintiva de la dPCR es
la separación de la mezcla de reacción en miles o millones de particiones, seguida de la detección en
tiempo real o de punto final (PCR convencional) de la amplificación. Las secuencias diana se
distribuyen en particiones de acuerdo con el modelo de distribución de Poisson, lo que permite una
cuantificación precisa y absoluta de la diana a partir de la proporción de particiones positivas frente a
todas las particiones presentes al final de la reacción. Esto omite la necesidad de utilizar materiales de
referencia con concentraciones diana conocidas y aumenta la precisión de la cuantificación a
concentraciones diana bajas en comparación con la PCR en tiempo real. La dPCR también ha
demostrado una mayor resistencia a los inhibidores en muchos tipos diferentes de muestras
(Gutiérrez-Aguirre et al., 2015). Se han publicado varios artículos de investigación sobre la aplicación
de la dPCR a la detección y cuantificación de agentes patógenos de animales, como el virus de la
peste porcina africana o el virus de la pseudorrabia, lo que demuestra una mayor sensibilidad y
linealidad (Ren et al, 2018; Wu et al, 2018).

El desarrollo de máquinas y pruebas de PCR en tiempo real portátiles plantea la posibilidad de que
estas técnicas se utilicen para el diagnóstico rápido (menos de 2 horas) de brotes de enfermedades en
condiciones de campo. Sin embargo, las técnicas de amplificación isotérmica descritas a continuación
pueden ser mejores, ya que requieren equipos menos complejos y costosos.

Las tecnologías de amplificación isotérmica ofrecen la ventaja de omitir el termociclado, lo que permite la
amplificación del ADN a una temperatura constante. En consecuencia, el equipo necesario es menos complejo y,
por tanto, más económico. Se ha desarrollado el principio básico de esta tecnología, dando como resultado
varias metodologías distintas (Gill & Ghaemi, 2008).

El método más utilizado es el método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), que despliega
cuatro o más cebadores que forman un ADN de tallo-bucle mediante síntesis de ADN autocebado y una ADN
polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena. El resultado del proceso de amplificación es la
producción de bucles en los extremos de las hebras complementarias, que se extienden continuamente. El
proceso de amplificación viene indicado por la aparición de turbidez en la mezcla de reacción, la generación de
una señal fluorescente utilizando tintes fluorescentes (Gill & Ghaemi, 2008) o, si los cebadores están biotinilados,
la observación de productos de reacción utilizando dispositivos de flujo lateral (véase la Sección B.3
Inmunocromatografía). El proceso también es menos propenso a la inhibición por contaminantes en comparación
con la PCR; sin embargo, los protocolos basados en esta tecnología pueden ser difíciles y complejos de
desarrollar. La amplificación isotérmica es menos adecuada para ensayos múltiples que la PCR, ya que el
potencial de formación de dímeros de cebadores y/o reacciones competitivas es mayor y el diseño del ensayo es
más difícil en ciertos casos.

El método del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) permite identificar genomas
individuales en base a patrones únicos generados por enzimas de restricción que cortan en regiones específicas
del ADN. El enfoque RFLP se basa en el hecho de que los genomas de cada agente patógeno se definen por
unas secuencias absolutamente específicas, difiriendo incluso los que guardan una estrecha relación. Así, por
ejemplo, el orden lineal de nucleótidos adyacentes que comprende la secuencia de reconocimiento de una
enzima de restricción específica en un genoma puede estar ausente en el genoma de una cepa o
microorganismo aislado estrechamente relacionado. El procedimiento RFLP consiste en digerir el ácido nucleico
de los agentes patógenos (ADN o productos de la PCR) con una o más enzimas de restricción y luego separar
los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa para determinar el número de fragmentos y
sus tamaños relativos. Una enzima de restricción es una endonucleasa que reconoce y escinde el ADN de doble
hebra en secuencias de nucleótidos, cortándola por puntos específicos llamados sitios de restricción (Loza-Rubio
et al., 1999).

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) se puede utilizar para la separación de fragmentos de ADN
grandes (hasta un tamaño de megabase) y puede ser un complemento útil de la técnica RFLP básica. Estas
tecnologías se utilizan mucho en los programas oficiales para la detección y discriminación de agentes
patógenos transmitidos por los alimentos (Escherichia coli O157: H7, Salmonella, Shigella, Listeria o
Campylobacter) en todo el mundo (https://www.cdc.gov/pulsenet/).

Las técnicas RFLP tienen un valor claro para su uso en estudios epidemiológicos, sin embargo, una diferencia
basada en RFLP puede no ser funcionalmente significativa. Aunque el RFLP y el PCR-RFLP son mucho menos
potentes que las tecnologías de secuenciación modernas, son relativamente económicos, fáciles de realizar y
suficientemente descriptivos para las investigaciones epidemiológicas de brotes y la identificación de cepas
individuales de agentes patógenos.

En los últimos tiempos, el coste de la secuenciación se ha reducido y la secuenciación del genoma se ha vuelto
cada vez más importante en la detección y caracterización del ácido nucleico de los agentes patógenos en las
muestras usadas para el diagnóstico. La secuenciación del genoma implica determinar el orden en el que se
encuentran las bases de ácidos nucleicos en un gen. La secuenciación de productos de la PCR que se dirigen a
una región informativa de un gen es particularmente útil para el patotipado de varios microorganismos. Por
ejemplo, el análisis de la secuencia del gen de la hemaglutinina del virus de la influenza A se usa con frecuencia
para localizar el sitio de escisión y, por lo tanto, clasificar el virus como influenza altamente patógena o
levemente patógena. La secuenciación completa del genoma es actualmente el último procedimiento
discriminatorio para la identificación de agentes patógenos. Desde 1977, el método de Sanger (Sanger et al.,
1977) ha dominado la secuenciación del ADN, aunque los avances recientes en la secuenciación de próxima
generación de alto rendimiento están revolucionando este método.

La secuenciación del genoma es un proceso complejo. El principio básico es la secuenciación cíclica de

fragmentos de ADN diana con di-desoxi nucleótidos marcados, que detienen el alargamiento en la unión. Cada
uno de los cuatro di-desoxi nucleótidos está marcado con una tinción fluorescente diferente, lo que permite la
distinción entre di-desoxi nucleótidos individuales. Durante el proceso de la PCR, estos di-desoxi nucleótidos
marcados se unen a los fragmentos de ADN dondequiera que existan sus pares de bases complementarias. Una
vez unidos, impiden que el fragmento de ADN siga elongándose. Este proceso crea una mezcla de fragmentos
de ADN, cada uno de los cuales termina con un nucleótido definido. Luego, la mezcla de reacción se analiza
mediante electroforesis capilar, que separa los fragmentos por longitud y lee la fluorescencia de cada fragmento.
A continuación, se utiliza un software analítico para convertir las señales de fluorescencia específicas en una
secuencia de nucleótidos.

La secuenciación del genoma permite el análisis de los agentes patógenos detectados durante el proceso de
diagnóstico. Dichos análisis incluyen:
i) Identificación de cepas patógenas para facilitar la implementación de políticas y esfuerzos de control
adecuados y, en su caso, la actualización de vacunas y el desarrollo de pruebas diagnósticas específicas
(Beerens et al., 2017; Busquets et al., 2019).

ii) Evaluar la similitud genética de los agentes patógenos aislados con la de otros agentes patógenos de la
misma especie (subtipo), para determinar sus propiedades filogenéticas o para determinar el origen de un
brote/infección. Esto puede resultar valioso en el análisis epidemiológico de brotes.

Es importante destacar que se pueden utilizar métodos de secuenciación convencionales para detectar y
caracterizar cepas de agentes patógenos emergentes. Esto supera una de las principales limitaciones de los
métodos basados en la PCR, que requieren cebadores conocidos para la detección de agentes patógenos. Por
ejemplo, la secuenciación se usa con frecuencia para identificar un nuevo virus dentro de una familia mediante el
uso de cebadores degenerados (una mezcla de cebadores similares pero no idénticos) para amplificar un gen
común a esa familia de virus, seguido de la secuenciación del amplicón obtenido con la PCR. De manera similar,
los cebadores universales que se hibridan con una secuencia conservada pueden usarse para amplificar y
secuenciar genes en todas las especies bacterianas; la aplicación más común es el uso del gen ARNr de la
región 16S para la identificación bacteriana (Cai et al., 2014).

Las ventajas y limitaciones de las diversas técnicas de secuenciación más aplicadas en el diagnóstico se
resumen en la Tabla 2.

Secuenciación: determina la composición nucleotídica de una región específica del ácido nucleico diana
de una muestra

Variaciones Detalles Ventajas Inconvenientes

Secuenciación Se marcan con nucleótidos di-desoxi Muy específica La longitud de la secuencia
de Sanger fragmentos de ADN de un producto de la es limitada y no tiene
Rentable para fragmentos
(también PCR, que pueden detectarse mediante profundidad. En cada
cortos de ADN
denominada fluorescencia reacción de secuenciación
secuenciación Flujo de trabajo y análisis solo se genera una lectura
con di-desoxi) rápidos y sencillos de secuencia

Secuenciación Se fragmentan los genomas y se utilizan No precisa conocimiento El coste

de alto adaptadores y cebadores universales para previo de la diana porque Requiere un gran
rendimiento generar secuencia. la reacción es almacenamiento de datos y
(HTS), también independiente del cebador
La HTS permite los siguientes tipos de un profundo análisis
denominada Permite analizar muestras bioinformático, porque la
pruebas:
secuenciación múltiples, empleando cantidad de datos
de siguiente • Secuenciación de genoma completo
códigos de barras, lo cual generados es enorme
generación • Descubrimiento de agentes patógenos reduce el coste. Se pueden tardar varios días
(NGS) y (secuenciación de novo)
secuenciación en tener los resultados,
paralela masiva • Metagenómica aunque ello se ve
(MPS) compensado por la gran
• Detección de microbioma
cantidad de datos
• Detección de transcriptoma generados (por ejemplo,
genomas completos)
Encontrar personas con la
formación necesaria en
bioinformática y acceder a
bibliotecas de datos puede
ser difícil

Secuenciación de alto rendimiento (HTS) es el término utilizado para describir métodos de

secuenciación altamente paralelos. Estos métodos producen datos a nivel del genoma y brindan
mayores oportunidades de diagnóstico en comparación con la secuenciación convencional (Belák et
al., 2009; Lipkin, 2010). Aunque hay varios instrumentos disponibles, cada uno con sus propios
métodos de secuenciación, las denominadas tecnologías de secuenciación de segunda generación
comparten la misma estrategia general, que consiste en la amplificación clónica de los moldes de ADN
seguida de la secuenciación en reacciones de secuenciación paralelas en masa para producir miles o
millones de lecturas, que varían en longitud de 50 a 700 pares de bases. Estas lecturas se ensamblan
posteriormente en secuencias más largas, conocidas como contigs, utilizando herramientas
bioinformáticas (véase el Capítulo 1.1.7 Normas para la secuenciación de alto rendimiento,
 bioinformática y genómica computacional). La disponibilidad de versiones portátiles de estos
instrumentos con costos reducidos ha hecho que la HTS sea accesible para laboratorios de tamaño
medio, los cuales la utilizan para la identificación y caracterización de agentes patógenos. Estas
nuevas tecnologías no solo han aumentado la velocidad de secuenciación, sino que también han
reducido radicalmente su coste. Como consecuencia, estos métodos de secuenciación se están
convirtiendo en herramientas cada vez más importantes en la detección y definición de agentes
patógenos.

Otra aplicación de la HTS es la secuenciación del genoma completo de agentes infecciosos. La HTS
permite el ensamblaje del genoma completo o del segmento del genoma y revela eventos de
reordenamiento o recombinación y marcadores de virulencia. La HTS se puede utilizar para realizar
una nueva secuenciación profunda de secuencias víricas en muestras individuales para evaluar la
dinámica evolutiva (Granberg et al., 2016). También se pueden realizar estudios filogenéticos y
rastrear la fuente de infecciones utilizando HTS. Sin embargo, la mayoría de las plataformas HTS
producen lecturas cortas y, por lo tanto, tienen limitaciones ampliamente aceptadas en el ensamblaje
de novo de nuevos genomas. En este contexto, una tercera generación de metodología de
secuenciación que produce longitudes de lectura más largas pero un rendimiento más bajo,
proporciona un medio para aumentar la resolución del ensamblaje del genoma, lo que permite una
secuenciación de novo más eficiente de genomas microbianos (Levy & Myers, 2016). En la actualidad,
existen dispositivos portátiles en formato de unidad flash que pueden producir lecturas de 5 a 50 kb
(Granberg et al., 2016). Aunque la tasa de error de estos instrumentos, que va del 5 al 20%, parece
muy alta, el ensamblaje híbrido de lecturas cortas de plataformas de secuenciación de segunda
generación facilita el ensamblaje de novo de nuevos genomas microbianos. Hoy en día, una
tecnología común aplicada por los dispositivos de secuenciación portátiles se basa en los principios de
la secuenciación de nanoporos, que se basa en medir los cambios en las propiedades eléctricas a
medida que la molécula de ADN atraviesa un poro. Estos cambios eléctricos luego se utilizan para
identificar la base de ADN exacta que atraviesa el poro.

la tipificación de secuencia multilocus (MLST) es un método de secuenciación que se utiliza para la

tipificación de agentes patógenos y en estudios epidemiológicos. Empleando este método, se
amplifican fragmentos de varias dianas mediante PCR y después se secuencian. En cada locus, se
asignan alelos únicos a números aleatorios y, en base al perfil alélico, se determina la secuencia. La
mayoría de métodos de MLST dan resultados muy reproducibles debido a la armonización
internacional de las nomenclaturas; existen secuencias y perfiles de alelos en grandes bases de datos
centrales con herramientas de análisis on-line asociadas.

La metagenómica es el conjunto de aplicaciones de HTS independientes del cultivo utilizadas para investigar la
composición genética (microbioma) vírica y microbiana completa de las muestras (Bexfield y Kellam, 2011). Es
un método considerablemente imparcial, ya que los microorganismos no se seleccionan mediante métodos de
cultivo favorables (o se deseleccionan por condiciones desfavorables) y no requieren conocimientos previos. Es
importante tener en cuenta que sin la amplificación dirigida, las tecnologías metagenómicas son menos sensibles
para la detección de agentes patógenos en comparación con los métodos basados en la PCR. Sin embargo, se
están utilizando con mayor frecuencia en los laboratorios de diagnóstico porque, al detectar una amplia gama de
agentes infecciosos simultáneamente, son poderosas herramientas de diagnóstico. Estas tecnologías también
han hecho posible identificar agentes patógenos más rápidamente, incluidos agentes patógenos que pueden ser
difíciles de identificar mediante cultivo in vitro (Hoper et al., 2017).

Desde el punto de vista del diagnóstico, la capacidad de detectar una amplia gama de agentes infecciosos
simultáneamente (Belák et al. 2013) es una ventaja significativa de las tecnologías metagenómicas. Algunos de
los agentes identificados pueden no haber sido descubiertos con anterioridad, y la metagenómica, acompañada
de la bioinformática, ha llevado al descubrimiento de un gran número de agentes infecciosos, incluidos bocavirus
novedosos, virus Torque Teno, astrovirus, rotavirus y kobuvirus en síndromes porcinos y nuevas variantes de
virus en poblaciones de abejas melíferas. Cabe señalar que el poder de la tecnología metagenómica para
identificar todos los microorganismos presentes en una muestra de manera imparcial, puede suponer para el
laboratorio de diagnóstico el desafío de identificar cuál de los muchos microorganismos detectados en una
muestra podría ser el agente causante de la enfermedad.

Estos resultados, y la experiencia reciente obtenida en varios centros de diagnóstico de todo el mundo, indican
que la detección metagenómica de agentes infecciosos se está convirtiendo en una herramienta de diagnóstico
poderosa, independiente del cultivo y útil, tanto en medicina veterinaria como en humana (Granberg et al., 2016;
Wylezich et al., 2018).
Todas las pruebas de inmunodiagnóstico explotan la capacidad intrínseca de los anticuerpos de unirse a un
antígeno (o epítopo/s dentro del antígeno) con una gran especificidad y afinidad. Los anticuerpos a menudo se
denominan monoclonales o policlonales. Los monoclonales (MAb) derivan de un linfocito B único, lo cual significa
que cada anticuerpo producido es idéntico al siguiente y, por lo tanto, se unirá solo a un tipo de epítopo o de
antígeno. Los anticuerpos policlonales (PAb) son básicamente un conjunto de distintos MAb porque derivan de
una población de linfocitos B, de tal forma que cada anticuerpo es distinto del siguiente y, por lo tanto, puede
unirse de forma específica a distintos epítopos del antígeno.

Los MAb los producen clones de linfocitos B inmortalizados denominados hibridomas, que se forman por la
fusión de una célula de mieloma y un linfocito B individual tomado del bazo de un animal inmunizado. Los PAb se
producen en animales que han estado expuestos a un antígeno extraño, como un agente patógeno o una
vacuna, y representan toda la respuesta humoral a un antígeno. Así pues, los sueros que se analicen contendrán
anticuerpos policlonales, mientras que los anticuerpos empleados como reactivos en una prueba pueden ser
policlonales o monoclonales.

Los inmunoensayos se diseñan para detectar antígenos o anticuerpos específicos de agente patógeno en las
muestras problema, como indicadores de infección activa o previa. Los antígenos pueden ser el agente patógeno
en sí, una o más de sus subunidades o proteínas, una proteína recombinante o un polipéptido sintético. Los
anticuerpos serán los del origen del hospedador a los que el ensayo va dirigidos como marcadores de infección
y/o los anticuerpos reactivos empleados para unirse a anticuerpos específicos o a marcadores antigénicos de la
enfermedad. Los anticuerpos reactivos a menudo se describen según su función. Por ejemplo, un anticuerpo
primario se utiliza para unirse directamente a un antígeno; un anticuerpo secundario se unirá al anticuerpo
primario y se utilizará para llevar un marcador para la detección; y un anticuerpo de captura se utilizará para
inmovilizar un antígeno.

En función del formato del inmunoensayo, el anticuerpo o el antígeno se une primero a una fase sólida
(normalmente, la superficie de microperlas, una membrana, o los pocillos de una placa de ensayo de
inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Esto proporciona un punto inmóvil al cual se une o en el cual es
capturada una diana específica de interés. Así pues, en un inmunoensayo diseñado para detectar una respuesta
humoral en una muestra de suero de un animal infectado se podría utilizar un antígeno unido a la fase sólida que
esté unido a un anticuerpo específico de agente patógeno en un suero problema, y este, a su vez, se detectaría
empleado un anticuerpo secundario marcado. Cuando en una muestra problema la diana es un antígeno, se usa
un anticuerpo en fase sólida para capturar el antígeno a través de un epítopo específico y un segundo anticuerpo
(a menudo marcado) dirigido hacia un epítopo alternativo empareda (efecto sándwich) al antígeno y se usa para
la detección. Existen muchas variaciones en estos formatos de ensayo, pero en todos los casos la especificidad
de los anticuerpos respecto de un antígeno dado constituye la base del inmunoensayo. En la literatura existe una
amplia gama de informes útiles, en los que se compararon varios sistemas de diagnóstico y se dieron
recomendaciones para los laboratorios de diagnóstico respecto a la especificidad, la sensibilidad y la utilidad de
los diversos ensayos de inmunodiagnóstico (Kittelberger et al., 2011).

Los ELISA son las técnicas de inmunodiagnóstico predominantes en los laboratorios de diagnóstico veterinario
de todo el mundo. Los ELISA explotan interacciones antígeno-anticuerpo específicas para detectar anticuerpos
específicos contra un agente patógeno, o contra un antígeno específico del agente patógeno. El diseño
convencional del ELISA se ha modificado en gran medida para cumplir con todos los requisitos de diagnóstico.

El principio básico que subyace a todos los ELISA es la unión específica de un antígeno a un
anticuerpo. Cada tipo de ELISA explota esta interacción de un modo distinto.

El ELISA indirecto (I-ELISA) se utiliza para detectar anticuerpos contra un antígeno en una
muestra de suero. En el I-ELISA, el antígeno diana (completo o purificado) se une a la
superficie solida de los pocillos de una placa de ELISA (fase sólida). Para llevar a cabo la
prueba, se deben dar los siguientes pasos:

i) Se añaden a los pocillos muestras de suero a una dilución adecuada especificada. Si en

el suero hay anticuerpos específicos contra el antígeno de recubrimiento, se unirán al
antígeno.
ii) Las placas de ELISA se lavan para eliminar los anticuerpos no unidos.
iii) A continuación, los anticuerpos generados contra las inmunoglobulinas de la especie
animal en estudio se añaden a los pocillos. Estos anticuerpos de la especie en cuestión
(o, a veces, Proteína A o G) se conjugan con una enzima (normalmente, una peroxidasa).
iv) Dado que todos los anticuerpos no unidos de la muestra de suero se eliminan durante el
paso de lavado inicial, los anticuerpos conjugados añadidos en el paso (iii) solo pueden
unirse a los anticuerpos ya unidos a la fase sólida del ELISA durante el paso (i) (es decir,
a los anticuerpos que son específicos del antígeno de interés).
v) Se lleva a cabo un segundo lavado para eliminar los anticuerpos conjugados no unidos.
vi) A continuación, se añade el sustrato de la enzima con un cromógeno adecuado, en
tampón sustrato. Si en el pocillo hay anticuerpos conjugados unidos (es decir, en los
pocillos que contienen los anticuerpos de interés), la presencia de la enzima conjugada
hará virar el color del tampón sustrato.
vii) Este desarrollo de color se mide a una longitud de onda definida utilizando un
espectrofotómetro. Cantidades más altas de anticuerpos en la muestra dan como
resultado aumentos en la densidad óptica
El I-ELISA es muy sensible para la detección de anticuerpos, porque los reactivos se agregan
en exceso (el exceso de reactivo se elimina por lavado) y esto promueve reacciones rápidas y
la amplificación de la señal debido a la acción continua de la enzima que genera el cambio de
color en el paso final del ensayo. El formato se puede hacer aún más sensible agregando más
enzima por molécula de conjugado. Esto se puede hacer biotinilando anticuerpos y luego
agregando enzimas conjugadas con estreptavidina, o usando reactivos de detección que tienen
estructuras a las que se unen muchas más moléculas de enzima, p. ej., poliestreptavidina de
HRP (peroxidasa de rábano picante).

Los ELISA de captura de antígeno (Ag-ELISA) se utilizan para detectar la presencia de

antígenos específicos de agentes patógenos en una muestra y son útiles para el diagnóstico
antes de la enfermedad clínica o durante la misma.

El Ag-ELISA suele seguir un formato de ensayo en sándwich. Los MAb o PAb específicos de
los antígenos de interés se unen a la superficie sólida de los pocillos de una placa ELISA. A
continuación, se añade la muestra al pocillo y los anticuerpos unidos capturan los antígenos
diana. Los antígenos capturados se detectan posteriormente mediante la adición de un
segundo MAb o PAb marcado con enzima. Luego, los pocillos se lavan para eliminar todo
anticuerpo conjugado no unido antes de agregar los sustratos de enzima y los tampones. En
cuanto a los I-ELISA, esto dará como resultado un cambio de color detectable en los pocillos
positivos. Tenga en cuenta que si el anticuerpo de detección no está marcado, entonces se usa
un anticuerpo conjugado con enzima (que se dirige al anticuerpo de detección).

Las características deseadas de los anticuerpos de captura son una fuerte unión al agente
patógeno, el reconocimiento de un epítopo conservado altamente específico del agente diana y
la capacidad de unirse a una placa ELISA sin pérdida de reactividad. El anticuerpo de
detección debe reconocer un epítopo distinto al reconocido por el anticuerpo de captura que
está unido a la placa ELISA. Puede ser difícil identificar MAb de reactividad intratipo completa y
se pueden preferir antisueros policlonales para aumentar la probabilidad de reacción contra
todas las variantes antigénicas.

Los Ag-ELISA se han desarrollado para detectar muchos agentes infecciosos, p. ej. el virus de
la diarrea vírica bovina (VDVB, véase Mignon et al., 1991), el virus de la peste bovina y el de la
peste de los pequeños rumiantes (VPPR) (Libeau et al., 1994). Los métodos de captura de
antígenos relacionados que utilizan perlas inmunomagnéticas recubiertas de anticuerpos son
ahora métodos importantes y bien aceptados para detectar ciertas infecciones bacterianas,
incluidas Listeria, Salmonella y E. coli. El principio de esta tecnología se basa en la separación
inmunomagnética, es decir, el uso de pequeñas partículas superparamagnéticas o perlas
recubiertas con anticuerpos contra antígenos de superficie bacteriana. Las propiedades
magnéticas de las perlas permiten que queden retenidas mientras las perlas se lavan y se
pasan a diferentes tampones de una manera análoga a los métodos descritos anteriormente
para ELISA. Los antígenos tales como bacterias intactas o sus determinantes antigénicos
solubles pueden detectarse después de la extracción magnética de la muestra problema
utilizando un segundo anticuerpo en formato sándwich. Los ensayos de captura de antígeno
que utilizan perlas inmunomagnéticas pueden mejorar la cinética de la reacción antígeno-
 anticuerpo a medida que las perlas se mezclan dentro de la muestra, lo que reduce el tiempo
de incubación.

El ELISA de bloqueo (B-ELISA), utilizado para la detección de anticuerpos séricos, comparte

algunas similitudes con el Ag-ELISA. Los anticuerpos específicos del antígeno diana se unen a
la fase sólida de la placa ELISA. El antígeno, antes de añadirlo a la placa recubierta de
anticuerpo, se incuba con las muestras. Si las muestras contienen anticuerpos contra ese
antígeno, se unirán (bloquearán) al antígeno. Cuando se agrega a los pocillos, el antígeno
bloqueado no podrá unirse a los anticuerpos de recubrimiento. En consecuencia, cuando se
agrega el anticuerpo de detección a los pocillos, no reconocerá ningún antígeno unido (sin
desarrollo de color). Por el contrario, si la muestra deriva de un caso negativo, se producirá una
unión y habrá desarrollo de color.

El ELISA de competición (C-ELISA) es una variante de ELISA que se utiliza para detectar o
cuantificar anticuerpos o antígenos mediante un método competitivo. El principio de un ensayo
competitivo para la detección de anticuerpos es la competencia entre los anticuerpos que
pueden estar presentes en el suero problema y el anticuerpo de detección (que en este caso se
une directamente al antígeno). La unión específica del anticuerpo de detección se detecta
usando un conjugado antiespecie apropiado o se puede marcar el propio anticuerpo. La
reducción del color esperado obtenido se debe a la unión de los anticuerpos presentes en el
suero problema que son específicos del antígeno, que por lo tanto compite con el anticuerpo de
detección específico por los sitios de unión al antígeno. El C-ELISA ofrece ventajas
significativas respecto al I-ELISA; por ejemplo, dado que las muestras de muchas especies
pueden analizarse sin la necesidad de conjugados marcados con enzimas específicas para
cada especie en estudio, los análisis pueden realizarse usando antígenos menos purificados y
pueden ser más rápidos de realizar ya que requieren menos tiempo de incubación. En algunos
casos, los C-ELISA pueden tener una sensibilidad analítica menor que los ELISA indirectos.
Cuando el C-ELISA se basa en la competencia entre los anticuerpos del suero problema y un
MAb (anticuerpo de detección) para unirse a un solo epítopo del antígeno, pueden darse falsos
negativos cuando la respuesta humoral del hospedador al agente patógeno va dirigida a unos
epítopos del antígeno que difieren del epítopo diana del MAb.

La inmunoelectrotransferencia se lleva a cabo en laboratorios de diagnóstico para identificar y/o caracterizar

agentes infecciosos en base a la especificidad de antígeno o empleando antígenos conocidos para detectar una
respuesta serológica específica. La inmunoelectrotransferencia combina la alta resolución de la electroforesis en
gel con la especificidad de la inmunodetección y ofrece un medio de identificación de proteínas
inmunodominantes reconocidas por anticuerpos de los animales infectados o por anticuerpos dirigidos contra el
agente diana. Como ejemplo de detección de antígeno, la inmunoelectrotransferencia se ha empleado a gran
escala como método principal de criado para la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y para el scrapie; se ha
empleado en millones de muestras de tronco encefálico de Europa y de otros lugares para la detección de
proteínas priónicas (Schaller et al., 1999). Actualmente, está sustituida en gran medida por una prueba de
cribado basada en Ag-ELISA o en métodos basados en dispositivos de flujo lateral, pero sigue constituyendo una
importante prueba confirmativa y es fundamental para la diferenciación de cepas causantes de encefalopatías
espongiformes transmisibles en EEB típicas y atípicas y en scrapie.

Los falsos positivos y falsos negativos de otras pruebas de diagnóstico a menudo pueden resolverse por
inmunoelectrotransferencia (Molina Caballero et al., 1993). La inmunoelectrotransferencia también se puede
utilizar para determinar la especificidad de MAb individuales. También pueden transferirse polipéptidos
purificados individuales (o proteínas recombinantes) a las membranas de difluoruro de nitrocelulosa o
polivinilideno mediante inmunoelectrotransferencia para examinar la reactividad de los sueros problema a
proteínas concretas. Este perfil característico de la reactividad se puede usar para ayudar a distinguir entre
animales vacunados e infectados, como la inmunoelectrotransferencia ligada a enzimas (EITB), una
transferencia Western para la fiebre aftosa (FA) que se usa mucho en Sudamérica (Bergmann et al., 1993).

El factor que más afecta al éxito de la inmunoelectrotransferencia es la naturaleza de los epítopos reconocidos
por los anticuerpos. La mayoría de las técnicas de gel de alta resolución implican algún tipo de desnaturalización
del antígeno, que destruye los determinantes conformacionales y permite la detección de epítopos lineales o no
conformacionales. La mayoría de los antisueros policlonales contienen anticuerpos para tanto para los epítopos
lineales como para los conformacionales, pero los MAb reconocen epítopos individuales; por lo tanto, si se
dirigen a epítopos conformacionales, no reaccionarán con proteína desnaturalizada.
La inmunocromatografía constituye un método cómodo para la detección de antígenos, anticuerpos (o cualquier
molécula marcada cuyo ligando haya sido depositado en la membrana cromatográfica [recubrimiento]; p. ej.,
productos de LAMP biotinilados [véase el apartado A.3 Amplificación isotérmica]) en varios minutos y sin
aparatos especiales (Fowler et al., 2014; Hanon et al., 2016; Waters et al., 2014).

La muestra se aplica (normalmente con tampón) a un extremo de una membrana en la que hay una almohadilla
que contiene microperlas conjugadas a anticuerpo o a antígeno (perlas de látex o de oro coloidal). El antígeno o
el anticuerpo (según el formato) de la muestra forma un inmunocomplejo con las microperlas marcadas. El
complejo se desplaza por la membrana debido a la acción capilar, hasta que contacta con el anticuerpo, antígeno
o ligando correspondiente inmovilizado en la membrana, donde forma un inmunocomplejo y genera un producto
coloreado que puede visualizarse a simple vista o leerse con un lector manual portátil. Los dispositivos de flujo
lateral (LFD) aportan un gran potencial para el desarrollo de pruebas de diagnóstico portátiles y que podrán
realizarse a pie de explotación. Las microperlas que incorporan fluoróforos pueden emplearse para desarrollar
LFD con mayor sensibilidad analítica cuando se aplican con detectores portátiles específicos (Liang et al., 2017).
Es posible que la fluídica de bajo coste y basada en papel también tenga una importante función en el futuro,
sobre todo en el contexto de las pruebas que se realizan a pie de explotación (p. ej., Yang et al., 2018).

Los virus indicadores pueden derivar de virus manipulados genéticamente que están totalmente atenuados y que
tienen un gen de marcador que codifica, por ejemplo, proteína fluorescente verde, o las luciferasas de Renilla o
de luciérnaga. Como alternativa, las glicoproteínas de envoltura del virus que se deben estudiar se expresan en
una partícula de replicación deficiente de una especie vírica heteróloga que lleva un gen marcador, como por
ejemplo, glicoproteínas de lisavirus expresadas en partículas retrovíricas (pseudotipos víricos). Estos métodos
innovadores, que reducen el riesgo biológico durante el diagnóstico veterinario y aumentan la sensibilidad de las
pruebas de neutralización de virus (VNT), se han desarrollado para una gama de agentes patógenos víricos,
como los virus de la rabia (Wright et al., 2008), de la influenza A (Carnell et al., 2015), de la PPR, de la peste
bovina, del moquillo canino (Logan et al., 2016a; 2016b) y de la fiebre del Valle del Rift (Schreur et al., 2017).
Estas tecnologías permiten una rápida cuantificación de anticuerpos neutralizantes, ya que obvian la necesidad
de esperar a que aparezcan placas u otros efectos citopáticos. Posiblemente, pueden ser multiplexados para
desarrollar ensayos de VNT capaces de detectar anticuerpos neutralizantes contra antígenos distintos (Molesti et
al., 2014).

El sistema de inmunoprecipitación con luciferasa (LIP) también se puede utilizar para la detección de anticuerpos
específicos de agentes patógenos. Se describió una aplicación reciente de este método para la detección de
anticuerpos específicos del VPPR (Berguido et al., 2016). En este ensayo, una enzima indicadora, la luciferasa
de Renilla (Ruc), se fusiona con un antígeno de interés y se expresa en células de mamíferos. Posteriormente, la
proteína de fusión de RUC-antígeno es reconocida por anticuerpos específicos del antígeno, y los complejos de
antígeno-anticuerpo se capturan con perlas de proteínas A/G, que reconocen la región Fc del anticuerpo IgG. La
cantidad proporcional de anticuerpo unida al antígeno marcado con Ruc se determina utilizando un luminómetro
para medir la luz producida al agregar la coelenterazina, el sustrato para la enzima Ruc. Este sistema es
independiente de la especie, proporciona una detección muy específica y sensible y requiere un volumen muy
bajo de suero problema.

Las pruebas homogéneas rápidas son aquellas en las que los reactivos se mezclan para formar una solución o
suspensión homogénea dentro de la cual se realizan las reacciones de anticuerpos y antígenos de forma rápida.
Estas pruebas no requieren posteriores separaciones ni lavados y se pueden leer sin más pasos de manejo de
los líquidos. Los ejemplos de tales pruebas son los ensayos de aglutinación por los cuales una muestra de suero
se mezcla con un antígeno de partículas suspendido y donde la presencia de anticuerpo sérico contra el
antígeno hace que el antígeno se aglutine (debido a la naturaleza multivalente de los anticuerpos). Los métodos
más sofisticados incluyen el ensayo de polarización de la fluorescencia (FPA). Esto mide cómo la tasa de giro de
una molécula, por ejemplo, un antígeno, cambia a medida que se vuelve más grande debido a la unión del
anticuerpo. Un ejemplo de este método es el FPA de Brucella utilizando O-Polisacárido conjugado con
fluoresceína (Nielsen et al., 1996). Una limitación de este método es la necesidad de un antígeno altamente
purificado y un antígeno que sea lo suficientemente pequeño como para girar rápidamente cuando no está unido
al anticuerpo. Se requieren dos lecturas, una para medir la fluorescencia de fondo de la muestra y la otra para
medir la fluorescencia de la reacción después de la adición del antígeno. Otros métodos que se utilizan en la
industria farmacéutica para la detección de compuestos de alto rendimiento incluyen métodos competitivos
donde los ligandos complementarios, análogos a antígenos y anticuerpos, están marcados con marcadores que
interactúan entre sí de forma medible en función de la proximidad, con señales que aumentan a medida que se
acercan (indicando que la unión ha tenido lugar). La introducción de reactivos competitivos, como por ejemplo,
un anticuerpo sérico sin marcar, impide que esta reacción conduzca a la consiguiente reducción medible de la
señal (McGiven et al., 2009). En comparación con otros métodos de diagnóstico, las pruebas de FPA muestran
una alta sensibilidad, por ejemplo, para el diagnóstico de la brucelosis bovina (Praud et al., 2016).

Estas tecnologías también se están utilizando para producir polisacáridos conjugados con proteínas (Cuccui y
Wren, 2015), puesto que tanto el código genético para el portador de proteínas, como las proteínas requeridas
para la síntesis de los glicanos o el código para las proteínas necesarias para conjugar los glicanos al portador
se pueden insertar en células bacterianas del hospedador (como E. coli). Aunque está pensada principalmente
para la generación de vacunas, tales glicoproteínas recombinantes también se pueden usar para
serodiagnóstico, como por ejemplo, la detección de anticuerpos anti-Brucella en ganado y cerdos. (Ciocchini et
al., 2014; Cortina et al., 2016). Estos antígenos ofrecen las ventajas tradicionales de las proteínas
recombinantes, como la pureza del producto y evitar la necesidad de cultivar el microorganismo nativo (en este
caso, un agente zoonótico altamente infeccioso), pero también permiten la producción de antígenos de
diagnóstico no proteicos muy importantes, como los glicanos, en una forma (conjugado) que facilita su uso para
el diagnóstico y para las vacunas.

La tecnología del ADN recombinante permite la producción de antígenos para varias aplicaciones diagnósticas,
como ELISA, aglutinación, pruebas de inhibición de la hemaglutinina (HI), pruebas de gel de agar, pruebas de
inmunodifusión (AGI), pruebas de fijación del complemento (CFT), así como otras basadas en microchips y
perlas.

Para la producción de anticuerpos, se utilizan anticuerpos recombinantes como alternativa a la tecnología

tradicional a base de hibridoma en la generación de anticuerpos de alta calidad. Pantalla de fagos, pantalla de
levadura y pantalla ribosómica son algunos de los métodos utilizados para producir anticuerpos en sistemas
procariotas, eucarióticos e in vitro, respectivamente (Sutandy et al., 2013).

Al evitar los sistemas biológicos por completo, la recreación de la estructura antigénica a través de la síntesis
también ofrece muchas ventajas respecto a la extracción de antígeno nativo. Esto implica altos niveles de pureza
y reproducibilidad, capacidad simple de escala y diseño de antígeno a medida.

Una próxima tendencia en la producción de antígenos para uso en ensayos es el desarrollo de antígenos
peptídicos sintéticos. Esta técnica permite que los antígenos sean probados como reactivos de diagnóstico en
base a la secuencia del gen; la expresión de toda la proteína es innecesaria, acortando así el proceso. También
se pueden sintetizar péptidos glicosilados (Bednarska et al., 2017). El costo y los beneficios son tales que para la
producción de proteínas grandes aún predominan los sistemas de producción recombinantes. Sin embargo, para
antígenos no proteicos donde la base genética subyacente para la producción no está clara y, por lo tanto, la
producción recombinante no es posible, la síntesis es una opción muy viable y exitosa para la producción de
antígenos de diagnóstico. Ello se ha puesto de manifiesto en el caso de la brucelosis, puesto que se han
sintetizado los epítopos de la estructura nativa del O-Polisacárido de B. abortus S99 y de B. melitensis 16M y se
ha demostrado que los antígenos sintéticos son altamente efectivos para el serodiagnóstico (Guiard et al., 2013;
McGiven et al., 2015).

El ADN sintético se puede generar a partir de datos de secuencia y luego utilizarse con tecnología recombinante
para generar proteínas e incluso virus completos para una producción rápida de vacunas, como la de la influenza
(Dormitzer et al., 2013).
Un microchip es una disposición bidimensional de sondas biológicas específicas (por ejemplo, ADN, proteínas,
péptidos o glicanos) inmovilizadas en sustratos sólidos, como un portaobjetos, vidrio recubierto de polímero,
plásticos, nitrocelulosa, etc. (Barbulovic-Nad et al., 2006). Un microchip proporciona una alta capacidad de
multiplexación, es decir, se pueden realizar a la vez cientos o miles de detecciones. Se pueden crear microchips
para identificar la causa de una enfermedad sindrómica, por ejemplo, un chip que se dirija a grupos de agentes
patógenos encefalíticos o a agentes relacionados con la especie, por ejemplo, microchips para enfermedades
porcinas. De manera similar, pueden diseñarse microchips de especificidad muy alta para detectar múltiples
objetivos en un agente patógeno dado. El uso de métodos basados en microchips puede presentar algunos
desafíos en el manejo y análisis de los grandes conjuntos de datos que se generan. La instrumentación y los
consumibles también pueden tener costes prohibitivos para algunos laboratorios.

Los microchips de ADN explotan la capacidad de las hebras complementarias de los ácidos nucleicos
para hibridar, lo cual implica los siguientes pasos:

i) Se amplían ácidos nucleicos aislados de las fuentes biológicas y se marcan con una tinción
fluorescente.
ii) Luego, los productos de ADN monocatenarios marcados se agregan a la superficie del microchip
de ADN. Esto se traduce en la hibridación de los ácidos nucleicos de la muestra con las sondas
biológicas complementarias del microchip, creando una estructura molecular bicatenaria marcada
en la superficie del microchip.
iii) Luego, el microchip se enjuaga para eliminar las moléculas diana unidas no específicamente y
evaluarse utilizando un escáner láser.
La tecnología de los microchips de ADN es una herramienta útil con gran variedad de aplicaciones
diagnósticas. Esta tecnología ofrece la posibilidad de detectar e identificar agentes patógenos de
importancia en veterinaria y en salud pública en la muestra problema (Ojha & Kostrynska, 2008).
También se puede utilizar para estudios epidemiológicos y genotipado de agentes patógenos. Con los
avances tecnológicos, los microchips de ADN también han progresado hacia el descubrimiento de
nuevos agentes patógenos emergentes. Por ejemplo, se utilizó un chip que consta de sondas de 70
mer altamente conservadas de todos los genomas víricos de referencia secuenciada para demostrar
que un coronavirus era responsable del síndrome respiratorio agudo grave (SARS).

Los microchips de ADN son particularmente útiles para los ensayos multiplex y se han utilizado para
detectar y determinar todos los subtipos posibles de HA y NA del virus de la influenza aviar (Belák et
al., 2009). La generación más reciente de microchips permite el análisis de la secuencia de ADN, a
menudo proporcionando secuencias de genomas completos en un solo estudio.

Los microchips de proteínas se producen de manera similar a los de ADN al inmovilizar proteínas de
alta densidad en una superficie sólida (Sutandy et al., 2013). Los chips contienen moléculas de
sondeo específicas, tales como antígenos o anticuerpos que pueden reconocerse a través de
marcadores fluorescentes o detectarse por espectrometría de masas (MS) (SELDI-TOF
[Desorción/ionización láser de superficie mejorada- Tiempo de vuelo] o la MALDI-TOF [MATRIX-
Desorción/ionización láser asistida por matriz - Tiempo de vuelo]) (Sutandy et al., 2013; Yu et al.,
2006). El principio de la reacción entre una molécula de captura inmovilizada y un analito diana de
proteína presente en la muestra se basa en el reconocimiento de anticuerpos/antígenos o la
interacción de proteína/proteína. Los chips de proteína se utilizan para la detección de antígeno o
anticuerpo en muestras de sangre, el descubrimiento de biomarcadores de enfermedades y el
descubrimiento de la patogénesis y la respuesta inmunitaria a un agente patógeno por parte de
diferentes hospedadores. Por ejemplo, se usó una microchip de proteína que contenía 1406 proteínas
de Brucella melitensis predichas para detectar sueros de cabras infectadas experimentalmente y de
seres humanos infectados de forma natural y para demostrar las diferencias entre la respuesta
inmunitaria caprina y la humana después de la infección por B. melitensis (Liang et al., 2010 ).
Además, se pueden usar microchips de proteína para la detección de anticuerpos dirigidos contra
agentes patógenos específicos y monitoreando los cambios en la expresión de proteínas celulares.
 Espectrometría de masas con desorción/ionización láser de superficie mejorada- Tiempo de vuelo

Los avances tecnológicos han permitido a la plataforma de microchips lograr una estandarización
suficiente y una validación del método, así como una eficiente impresión de la sonda, manejo de
líquidos y visualización de señal. Algunos desafíos importantes del uso de microchips de proteína en
los diagnósticos de rutina son la necesidad de anticuerpos altamente específicos para evitar falsos
positivos y la necesidad de producir un gran número de anticuerpos con métodos de alto rendimiento
(Sutandy et al., 2013).

Los chips basados en perlas y las matrices de perlas citométricas son variantes de ensayos basados en sondas
que brindan la oportunidad de utilizar múltiples analitos dirigidos a ácidos nucleicos, antígenos o anticuerpos
(Christopher-Hennings et al., 2013). En la técnica, el ácido nucleico, el antígeno o el anticuerpo específicos de
agentes patógenos se vinculan covalentemente a perlas de microesfera. Una ventaja de esta tecnología es su
capacidad multiplex, la cual deriva de las propias perlas que tienen una marca fluorescente (de modo que cada
perla puede llevar una sonda específica). Los pruebas basadas en perlas se están utilizando cada vez más en
pruebas de detección de múltiples agentes patógenos para buscar ácidos nucleicos de varios agentes patógenos
(Boyd et al., 2015) o anticuerpos contra diferentes agentes patógenos en una sola muestra (Sánchez-Matamoros
et al., 2016). Si resulta necesario analizar muchas muestras de suero respecto de un conjunto de enfermedades
(por ejemplo, varios antígenos diferentes), incluida la posibilidad de múltiples antígenos por enfermedad, los
chips basados en perlas múltiples ofrecen un medio eficiente para ello. Ejemplos recientes en los que se explota
la capacidad múltiple de esta tecnología son la aplicación a la genotipificación del virus de la peste porcina
africana (LeBlanc et al., 2013) y una prueba DIVA (diferenciación entre animales vacunados e infectados) para la
detección de la FA (Chen et al., 2016).

Los biosensores utilizan un elemento de biosensibilización inmovilizado (ADN, ARN, antígeno/anticuerpo o

glicanos), también conocido como bioreceptor, para reconocer un biomarcador característico del agente
patógeno. La interacción bioquímica resultante entre el biomarcador y el bioreceptor se convierte en una señal
medible por el transductor y que se muestra (Vidic et al., 2017). La biosensibilización se basa en métodos de
transducción óptica electroquímica y basada en la masa (Alahi y Mukhopadhyay, 2017). Este método se ha
utilizado para la detección de antígenos del virus de la influenza A (Hideshima et al., 2013; Lee et al., 2013) y la
detección de anticuerpos contra Mycoplasma bovis (Fu et al., 2014).

La espectrometría de masas (MS) permite detectar biomarcadores presentes en una muestra en función de la
masa. La infección por un microorganismo se puede detectar comparando el perfil de biomarcadores presentes
en una muestra con los de una base de datos de muestras que se sabe que son positivas respecto al
microorganismo de interés. Esta es la premisa de las modalidades de diagnóstico tipo MALDI-TOF MS. Este
método se usó para Staphylococcus intermedius y para la identificación directa de bacterias en hemocultivos
(Guardabassi et al., 2017). También se han desarrollado algunos métodos para identificar biomarcadores de
proteínas como medio de identificación de virus. MALDI-TOF MS también se puede usar para la secuenciación
de fragmentos de ADN cortos como alternativa a la secuenciación convencional cuando se necesita un cribado
automatizado de alto rendimiento respecto a mutaciones.

Se ha desarrollado una plataforma basada en ionización por electrospray (ESI), que combina la precisión y la
sensibilidad de la MLST con la velocidad y el rendimiento de la MS para la identificación rápida de agentes
patógenos (Kailasa et al., 2019). De manera similar, existen varias aplicaciones que utilizan la MALDI-TOF MS
para el genotipado o para la tipificación y resecuenciación de polimorfismos mononucleotídicos (SNP).

La MS también se usa en la proteómica. El proteoma es el complemento total de las proteínas

expresadas dentro de una célula, un tejido o un organismo. La proteómica es el estudio de las
proteínas, incluido su nivel de expresión, modificación pos-traduccional e interacción con otras
proteínas. Como no todas las proteínas se expresan en todo momento, sino que ello depende de
factores fisiológicos y ambientales, la proteómica puede proporcionar una excelente visión general de
los procesos de la enfermedad a nivel de proteínas. Por ejemplo, el diagnóstico definitivo de infección
crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) aún se basa en la biopsia hepática, pero el análisis
proteómico de muestras de suero muestra que la expresión de al menos siete proteínas séricas es
significativamente distinto en pacientes con VHB crónica. De manera similar, el diagnóstico diferencial
 ante mortem de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) puede ayudarse de la proteómica, ya que
los datos preliminares muestran que siete proteínas del líquido cefalorraquídeo (LCR) se expresan de
modo distinto en pacientes con CJD variante que con CJD esporádico (Choe et al., 2002). En
veterinaria, se han desarrollado estudios proteómicos aplicables a muchas enfermedades animales y
zoonóticas (Katsafadou et al., 2015; PatrMool et al., 2012; Torre-Escudero et al., 2017).

Existen distintas técnicas para la detección directa de proteínas de agentes patógenos, antígenos o ácidos
nucleicos en tejidos o líquidos corporales de los animales. En algunos casos, la misma tecnología se puede
aplicar a la detección de anticuerpos en el suero.

La prueba de la inmunofluorescencia (fluorescent antibody test - FAT) se usa para la detección de

agentes patógenos en tejidos o líquidos corporales de los animales mediante el uso de anticuerpos
específicos contra antígenos específicos. Dado que el método se basa en la unión directa del
anticuerpo marcado a los antígenos del agente infeccioso presente en la muestra, se denomina
inmunofluorescencia directa. Este método se suele utilizar en laboratorios de diagnóstico, por ejemplo,
para la detección del virus de la rabia en el encéfalo de animales muertos y del virus de la peste
porcina clásica en tejidos de cerdos sospechosos.

Se puede usar una modificación de la FAT para la detección de anticuerpos específicos producidos
por el sistema inmunitario contra varios agentes patógenos durante las infecciones. Esencialmente, la
modificación se encuentra en el uso de un anticuerpo secundario específico de los anticuerpos de las
especies estudiadas. Este procedimiento se conoce como inmunofluorescencia indirecta. Es un
método que se suele utilizar en laboratorios de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra
una amplia gama de agentes patógenos, como por ejemplo, el virus de la peste porcina africana
(Cubillos et al., 2013), Coxiella bernetii, bacterias causantes de la fiebre Q (Roest et al., 2013) y
muchos otros agentes infecciosos de interés en veterinaria.

Otra modificación de la inmunofluorescencia directa emplea un anticuerpo primario sin marcar

derivado de una especie específica para que reconozca el antígeno específico del agente patógeno, y
a este anticuerpo se le une posteriormente un anticuerpo secundario anti-inmunoglobulina de la
especie en estudio, que se conjuga a un fluoróforo. Este procedimiento también se denomina
inmunofluorescencia indirecta.

La inmunohistoquímica es una técnica para la detección in situ de antígenos en tejidos fijados

utilizando anticuerpos marcados. Como complemento del aislamiento de microorganismos causantes
presentes en el tejido, la inmunohistoquímica se ha convertido en una herramienta estándar para
identificar agentes patógenos en el tejido y para confirmar los resultados obtenidos mediante otras
tecnologías de diagnóstico. La inmunohistoquímica se suele utilizar para la detección de proteína
priónica anormal (PrPSc) en el tejido encefálico para confirmar el scrapie, la EEB y otras encefalopatías
espongiformes transmisibles, y es más sensible que el examen histopatológico estándar
(Thorgeirsdottir et al., 2002). En los últimos años, se han desarrollado con éxito pruebas de
diagnóstico basadas en la inmunohistoquímica y se han aplicado a la detección del virus de la rabia en
muestras clínicas (Rahmadane et al., 2017). A medida que aumenta el número de anticuerpos contra
antígenos específicos, aumenta el uso de la inmunohistoquímica para la identificación de
microorganismos y otros marcadores específicos de enfermedades autoinmunes y neoplasias.

Debido al uso de fijadores para preparar las muestras, la IHC ofrece varias ventajas respecto a los
métodos de aislamiento de agentes patógenos, que son las siguientes:

i) comodidad en el envío de muestras;

ii) manejo seguro de agentes patógenos zoonóticos;
iii) estudios retrospectivos de muestras conservadas;
iv) rapidez; y
v) detección de microorganismos no viables (Haines y Clark, 1991).
Como la fijación con formalina puede desnaturalizar los epítopos antigénicos (es decir, la estructura
tridimensional reconocida por algunos anticuerpos), el paso limitante en la aplicación de la
 inmunohistoquímica es identificar una combinación adecuada de anticuerpo/antígeno que se unirá al
antígeno en tejidos fijados con formalina. Esto puede superarse utilizando cortes congelados o
empleando técnicas de recuperación de antígenos (por ejemplo, digestión con enzimas proteolíticas, o
microondas) antes de la inmunotinción.

Esta tecnología explota dos fenómenos naturales: el código genético único que contiene un agente
patógeno en su genoma y la capacidad de las secuencias de ácido nucleico monocatenarias (ADN o
ARN) de hibridarse o unirse con secuencias de ácido nucleico monocatenarias complementarias
formando híbridos bicatenarios. En su forma más sencilla, la hibridación in situ (ISH) utiliza sondas de
ADN o ARN monocatenarias que se producen sintéticamente y están diseñadas para complementar
una región corta específica del genoma de un agente patógeno. Las sondas se unen a los
marcadores, que son fácilmente detectables utilizando microscopía y que pueden consistir en
tinciones fluorescentes, nanopartículas fluorescentes o enzimas que producen un producto
cromogénico cuando se tratan con sustrato.

El venta reciente de reactivos de ISH ha hecho que la técnica sea más accesible y es probable que en
el futuro goce de una mayor captación por parte de los laboratorios de diagnóstico. Una aplicación
notable de la ISH es el desarrollo rápido de pruebas para la detección de nuevos agentes patógenos
emergentes. Tan pronto como se disponga de los datos de secuencia generados por secuenciación de
alto rendimiento durante la identificación del agente patógeno (véase el apartado D.vi), se pueden
diseñar sondas y desarrollar pruebas. Por el contrario, se tarda bastante más en generar los reactivos
basados en anticuerpos/antígenos necesarios para el desarrollo de inmunoensayos.

Hay varias tendencias en el desarrollo de tecnología para el diagnóstico, como por ejemplo, la multiplexación de
ensayos o la evaluación de la complejidad en la biología de la infección, la cual que tendrá un impacto en la
forma en que se abordarán los diagnósticos de en el futuro, afectando al entorno de laboratorio, al análisis de
datos y al control de la enfermedad:

i) El desarrollo global de tecnologías que incluyen el uso de chips ha llevado a una fuerte tendencia a la
miniaturización del formato analítico en los ensayos de detección molecular y de proteínas. Los formatos
analíticos miden desde varios milímetros hasta varios centímetros. Paralelamente, se ha desarrollado una
amplia gama de herramientas de diagnóstico sencillas, como dispositivos analíticos de flujo lateral para
mejorar el diagnóstico de muchas enfermedades directamente en el lugar en el que se encuentran los
animales (in situ). Estos cambios permiten un análisis in situ, lo cual facilita un diagnóstico rápido y
asequible de determinadas enfermedades infecciosas. La infraestructura y la preparación adecuadas deben
ser un componente integral de la actualización de la tecnología, incluida la capacitación en el uso e
interpretación de dichos métodos.
ii) La simplificación de las tecnologías, el desarrollo de dispositivos más pequeños, y más simples y
asequibles, también se ve en otros campos de la microbiología de diagnóstico veterinario, como por
ejemplo, en tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. El desarrollo de dispositivos simples y la
mejora de las tecnologías de preparación de muestras facilitarán el análisis directo de las secuencias de las
muestras clínicas no solo en los centros de referencia, sino también in situ en condiciones de campo o en
laboratorios de campo con poco equipamiento. Durante este trabajo, será muy importante centrarse no solo
en el rápido desarrollo técnico de los equipos de secuenciación, sino también en fortalecer el conocimiento
de la bioinformática y en mantener conocimientos generales en material de veterinaria y de epidemiología.
iii) El desarrollo de fuentes alternativas de generación/amplificación de señales, reemplazando la medición
según la luz por la medición según la masa, el efecto piezoeléctrico o la concentración del ligando
conducirán al desarrollo de una nueva plataforma de tecnologías.
iv) Aunque el desarrollo de nuevas tecnologías a menudo puede conducir a resultados más rápidos y a una
mejora de la capacidad, siempre debe tenerse en cuenta el valor real y el papel de la prueba de
confirmación del diagnóstico y de la respuesta de las Autoridades Competentes. En este contexto, la pericia
con la que se cuenta en los laboratorios sigue siendo tan importante como siempre para explicar la
importancia y las limitaciones de los resultados.
v) Cada vez es más habitual que los métodos tradicionales y conocidos que emplean equipo de bajo coste
sean sustituidos por métodos más complejos que requieren una mayor inversión. Estos métodos más
nuevos a menudo requieren una mayor diversidad de experiencia entre el personal de laboratorio y se
asocian a una mayor facturación en plataformas, ya que otros sistemas, relativamente recientes, se vuelven
 redundantes. Esto tiene implicaciones en cuanto a los recursos de laboratorio y a la estructura de las redes
de laboratorio nacionales e internacionales a medida que los laboratorios se vuelven más especializados.
vi) El análisis en profundidad de los agentes patógenos, por ejemplo, a través de la secuenciación de alto
rendimiento, se está convirtiendo cada vez más en una parte esperable en de los laboratorios de referencia.
A medida que las plataformas de diagnóstico van cambiando en cuanto a las formas descritas
anteriormente, se van viendo afectados varios componentes de la cadena de control de la enfermedad.
Deberán desarrollarse tecnologías de comunicación/sistemas de información apropiados para recopilar,
almacenar y analizar sistemáticamente los grandes conjuntos de datos producidos por las nuevas
tecnologías en un tiempo relativamente corto. Por ejemplo, es probable que haya una tendencia creciente
hacia las entradas de resultados en tiempo real a través de plataformas móviles. Estas tendencias
requerirán el desarrollo continuo de bioinformática, tecnología de la información y los sistemas de manejo
de datos.
vii) Cada vez existen más métodos con altos niveles de sensibilidad y especificidad analítica para los
laboratorios, los cuales están permitiendo una rápida identificación y respuesta a las enfermedades
veterinarias infecciosas, mejorando así la efectividad de los métodos de control y de erradicación. Estos
avances proporcionan nuevas oportunidades para la identificación y caracterización de los agentes
infecciosos y mejoran el control de las enfermedades infecciosas de interés en veterinaria.
viii) Los métodos biotecnológicos de nueva aparición abren una amplia gama de posibilidades y retos en el
diagnóstico microbiológico. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente tener en cuenta los nuevos y
potentes métodos e introducir estas nuevas tecnologías en nuestros laboratorios de diagnóstico. Sin
embargo, es importante determinar cuál es la capacidad y el valor de diagnóstico exacto de las nuevas
tecnologías y en qué medida estos métodos pueden reemplazar los métodos de diagnóstico clásicos. En
general, lo más seguro es mantener un complejo multidisciplinario de métodos y capacidades de
diagnóstico en nuestros laboratorios, proporcionando una combinación práctica de tecnologías nuevas y
potentes con otras más clásicas, así como un conocimiento adecuado de los procesos de diagnóstico
veterinario y de la biología y la epidemiología de las infecciones.

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NB: ADOPTADO POR PRIMERA VEZ EN 1996 COMO BIOTECNOLOGÍA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES
INFECCIOSAS Y EL DESARROLLO DE VACUNAS ; ÚLTIMAS ACTUALIZACIONES ADOPTADAS EN 2021.