Revista Politécnica ISSN 1900‐2351 (Impreso), ISSN 2256‐5353 (En línea), Año 12, Número 23, páginas 83‐89, Julio – Diciembre 2016 

VERIFICACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETECCIÓN Y

CUANTIFICACIÓN DE Clostridium perfringens EN AGUA
POTABLE MEDIANTE FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Magda Lucía Rodríguez López1, Marisol Sepúlveda Sánchez2, Clara María Arboleda Baena3, Lina María
Arismendi González4, Judith Betancur Urhán5
1
Bióloga, MSc en Biología, Coordinadora de laboratorio área de microbiología, [email protected]
2
Bióloga, Analista de microbiología, [email protected]
3
Bióloga, [email protected]
4
Bióloga, [email protected]
5
Bióloga, Investigadora asociada, [email protected]
Grupo de Investigación en Gestión y Modelación Ambiental-GAIA, Universidad de Antioquia.

RESUMEN

Clostridium perfringens es considerado un importante indicador de contaminación fecal que puede señalar la
presencia de microorganismos patógenos de detección difícil y costosa, e indicar la eficacia de los procesos
de filtración en la potabilización del agua. El objetivo de este trabajo es verificar la metodología de la Norma
ISO 14189:2013 para la determinación y cuantificación de C. perfringens en agua potable, mediante el
método de Filtración por Membrana en el laboratorio de Microbiología del Grupo de Investigación en Gestión
y Modelación Ambiental (GAIA) de la Universidad de Antioquia. Los datos obtenidos demostraron la aptitud
del Laboratorio para obtener resultados precisos y exactos en comparación con los criterios de aceptación
referentes de la Norma ISO 14189:2013 y los consignados en la Guía Técnica Colombiana, GTC 84 de
2003. En consecuencia, bajo las mismas condiciones de ensayo, el Laboratorio es competente, lo que le
permite entregar resultados confiables y oportunos.

Palabras clave: verificación de método, filtración por membrana, clostridium perfringens, norma ISO
14189:2013

Recibido: 23 de Septiembre de 2015. Aceptado: 28 de Diciembre de 2016

Received: September 23th, 2015. Accepted: December 28th, 2016

VERIFICATION OF THE MEMBRANE FILTRATION METHODOLOGY FOR THE DETECTION AND

QUANTIFICATION OF Clostridium perfringens IN DRINKING WATER

ABSTRACT

Clostridium perfringens is considered an important indicator of fecal contamination that can signal the
presence of pathogenic microorganisms of difficult and costly detection, and the effectiveness of filtration
processes in water purification. This work aimed to verify the methodology of the ISO Standard 14189:2013
for the determination and quantification of C. perfringens in drinking water through the membrane filtration
method at the facilities of the Microbiology Laboratory in the Research Group on Environmental Management
and Modeling (GAIA), University of Antioquia. The data showed the Laboratory is suitable for obtaining
precise and accurate results compared to the referenced acceptance criteria of ISO 14189: 2013 and those of
GTC 84, 2003. Accordingly, under the same test conditions, the laboratory is suitable, allowing it to deliver
reliable and timely results.

Keywords: Method verification, Membrane filtration, Clostridium perfringens, ISO Standard 14189:2013.

Cómo citar este artículo: M. L. Rodriguez-Lopez et al, “Verificación del método para la detección y
cuantificación de clostridium perfringens en agua potable mediante filtración por membrana” Revista
Politécnica, vol. 12, no. 23, pp. 83-89, 2016.

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1. INTRODUCCIÓN colombiana actualmente no incluye a C. perfringens

como indicador de contaminación fecal. Sin
Clostridium perfringens es un bacilo Gram positivo embargo, la Resolución 2115 de 2007 [6] establece
anaerobio, formador de endosporas, que se que basados en el mapa de riesgo, las autoridades
encuentra normalmente en suelos y aguas ambientales, con la colaboración de las autoridades
residuales y hace parte de la microbiota del sanitarias y las personas prestadoras de la
intestino de humanos y animales. Este jurisdicción, deben evaluar la posible presencia de
microorganismo es el agente causal de varias otros microorganismos patógenos en el agua y la
enfermedades humanas, incluyendo gangrena viabilidad de incorporarlos en el mapa de riesgo,
gaseosa y gastroenteritis de origen alimentario [1]. señalando las acciones a seguir.

Aunque Escherichia coli es considerado el principal La normatividad colombiana para la evaluación de

indicador de contaminación fecal, el agua la calidad microbiológica del agua de consumo
potabilizada puede no contener esta bacteria y sin exige que los laboratorios implementen el Sistema
embargo estar contaminada con agentes de Gestión de la Calidad y la Acreditación de
infecciosos más resistentes a las condiciones del Pruebas de Ensayo [7] de metodologías validadas.
ambiente o a los tratamientos convencionales [2]. En consecuencia, los laboratorios deben realizar la
Mediante la formación de esporas, C. perfringens verificación de las metodologías a través de la
puede sobrevivir en ambientes no aptos para su evaluación de parámetros como precisión,
desarrollo después de su deposición, lo cual facilita exactitud, límite de detección e incertidumbre, con
su detección a largo plazo. Debido a su asociación el fin de demostrar que son aptos para
con el tracto digestivo de humanos y animales y la implementarlas bajo sus condiciones particulares
presencia de sus esporas en aguas residuales, C. de operación y que cumplen con los requisitos para
perfringens ha sido identificado como un indicador el uso específico previsto.
de contaminación fecal tardía y lejana, por lo que
puede señalar cuáles fuentes son susceptibles de Con el fin de aplicar métodos que garanticen
contaminación intermitente [3]. Por la extraordinaria resultados confiables, precisos y oportunos, el
resistencia de sus esporas a los procesos de Grupo de Investigación en Gestión Modelación
desinfección y a otras condiciones ambientales Ambiental GAIA, se propuso verificar la
desfavorables, este microorganismo ha sido metodología microbiológica para la detección y
propuesto como índice de la presencia de cuantificación de C. perfringens en agua potable,
protozoos y virus entéricos en aguas de consumo de acuerdo a los criterios técnicos establecidos en
tratadas, siendo considerado particularmente como la norma ISO 14189:2013, en la Guía Técnica
un buen sustituto para rastrear la presencia de Colombiana, GTC 84:2003 y en la NTC-ISO/IEC
ooquistes de Cryptosporidium en sistemas 17025: 2005 [8, 9, 10].
acuáticos [3, 4, 2]. Debido a que las esporas de C.
perfringens son más pequeñas que los quistes u
ooquistes de protozoos, estas pueden ser útiles 2. METODOLOGÍA
como indicadores de la eficacia de los procesos de
filtración [5, 2]. 2.1 Materiales y Equipos

Desde el punto de vista de la calidad microbiológica Para el procedimiento de verificación se tomó agua
del agua de consumo, no existe un límite inferior potable del sistema que surte las instalaciones del
tolerable, por lo tanto, ésta debe estar libre de Grupo de Investigación en Gestión y Modelación
cualquier microorganismo potencialmente Ambiental (GAIA). Se emplearon las cepas
patógeno. Dado que los métodos para determinar certificadas Clostridium perfringens NCTC 8237,
la presencia de este tipo de microorganismos Bacillus subtilis subesp. spizizenii ATCC 6633 y
requieren en general de mucho tiempo y resultan Clostridium bifermentans CECT 550. Para los
costosos, usualmente se emplean ensayos para la cultivos se empleó agar TSC (triptosa-sulfito-
determinación y cuantificación de indicadores en cycloserina) más suplemento selectivo para agar
lugar de los patógenos. TSC y agar Columbia, marca Merck. Los cultivos se
mantuvieron en jarras de anaerobiosis con reactivo
A diferencia de la Directiva 98/83/CE del Consejo Anaerocult A y tirillas Anaerotest, marca Merck. La
de la Unión Europea [6], la normatividad prueba confirmativa se realizó con 1-

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naphthylphosphate disodium salt y Fast Blue B Salt, 2.3 Verificación de la metodología

marca Sigma. Se emplearon filtros de nitrocelulosa
estériles con poro de 0,45 µm y 47 mm de Se seleccionó la dilución de trabajo y se evaluaron
diámetro. los parámetros de verificación: límites de detección
y cuantificación, precisión, exactitud e
La filtración se realizó con bomba de vacío incertidumbre.
conectada a un sistema multicanal de acero
inoxidable y portafiltros estériles. Todo el 2.3.1 Límite de detección
procedimiento se llevó a cabo en una cámara de
flujo laminar vertical marca Esco y para los cultivos El límite de detección se calculó a partir de la
se empleó una incubadora marca Binder. fórmula 1 [9]:

2.2 Desarrollo del método P(+) = 1 – e –m (1)

El procedimiento de verificación se realizó con base
en la metodología establecida en la Norma ISO Donde,
14189:2013 para la enumeración de Clostridium e: Es la base de logaritmo natural
perfringens, empleando el método de Filtración por m: en el número promedio de partículas por porción
Membrana [8] (Figura 1). analítica.

Para el cálculo del límite de detección, usando la

cepa Clostridium perfringens NCTC 8237 se
prepararon diluciones decimales hasta 10-9 y se
identificó el rango donde se pueden obtener
recuentos confiables (de acuerdo a las limitaciones
del método) y se analizaron por triplicado.

2.3.2 Precisión

Fue determinada como repetibilidad y precisión

intermedia. Para su cálculo, los resultados de los
recuentos se linealizaron (Log10).

Para evaluar la repetibilidad, se determinó el

coeficiente de variación (% CV) de los ensayos
para una muestra preparada, a una dilución de
trabajo definida, para dicha muestra se analizaron
12 repeticiones.

(2)

Donde , es la desviación estándar del conjunto de

medidas y es el promedio de los datos.

Para la precisión intermedia, otro analista repitió el

mismo procedimiento de preparación de muestras y
de análisis. A partir de los resultados obtenidos por
el analista responsable de la verificación y el
segundo analista, se evaluó la precisión intermedia
Fig.1. Procedimiento para la detección y del método, mediante el cálculo del CV.
cuantificación de Clostridium perfringens según la
norma ISO 14189:2013. El porcentaje de repetibilidad (% R) y de precisión
intermedia (% PI) se calculó mediante la fórmula 3.

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% R y % PI = (100 - CV) (3) Donde µA1 es la incertidumbre estándar relativa al

componente aleatorio, µB corresponde a la
temperatura de incubación de la prueba presuntiva,
2.3.3. Exactitud. µC corresponde a temperatura de incubación de la
prueba confirmativa y µD corresponde al volumen
La exactitud se evaluó con la cepa de referencia de la muestra.
Clostridium perfringens NCTC 8237, mediante el
análisis de tres diluciones (10-6, 10-7 y 10-8) con 12 La incertidumbre combinada de los resultados
repeticiones cada una. Los ensayos se realizaron experimentales se estima mediante la ecuación 7.
en paralelo en dos matrices diferentes, agua
potable y agua peptonada.
(7)
Como control para verificar la ausencia del
microorganismo indicador, se analizó por triplicado Donde, µ comb es la incertidumbre relativa
el agua potable sin inocular. combinada bajo condiciones de reproducibilidad
intermedia.
El porcentaje de recuperación (% R) para agua
potable se calculó con la fórmula 4. µd op es la incertidumbre operacional relativa
intrínseca al resultado experimental, que está dada
% R = ( muestra inoculada)/( cepa + por la fórmula 8.
muestra) x 100 (4)

Donde es el promedio de la concentración.

2.3.4. Incertidumbre (8)

La incertidumbre del método se estimó de acuerdo
Donde nc es el número total de colonias presuntivas
con los lineamientos de la norma ISO 29201:2012
contadas, nz es el número total de colonias aisladas
[10]. Como factores de aporte significativo a la
para confirmación y nk es el número de colonias
incertidumbre del resultado final se consideraron la
confirmadas.
precisión intermedia, la temperatura de incubación,
el volumen de muestra y los recuentos presuntivos Para estimar la incertidumbre expandida se usó un
y confirmados de unidades formadoras de colonias. factor de cobertura K = 2 con un nivel de confianza
del 95% (ecuación 9).
La incertidumbre estándar relativa al componente
aleatorio se estimó con la fórmula 5:
µE = ( )*(2) (9)
, (5)
Donde µcomb es la incertidumbre relativa combinada,
Donde SR corresponde a la desviación estándar del y µd op es la incertidumbre operacional.
conjunto de datos encontrados por los analistas y n
es el número total de datos procesados.

La incertidumbre relativa combinada se estimó 2.3.5. Tratamiento estadístico de los datos

mediante la raíz cuadrada de la suma de los Se llevó a cabo el análisis descriptivo de estimación
cuadrados de la incertidumbre estándar relativa al de coeficientes de variación, promedios y
componente aleatorio y de las incertidumbres desviaciones estándar. Adicionalmente, para
asociadas al componente sistemático (ecuación 6). evaluar si existen diferencias significativas entre las
medias de los analistas, se realizó un Análisis de
Varianza de un Factor y se determinaron los
valores F y F crítico. Estos análisis se realizaron
(6)

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utilizando las herramientas del programa Microsoft

Excel. Tabla 3. Repetibilidad de los ensayos realizados
por los analistas 1 y 2.

3 RESULTADOS Analista 1 2
Media 7,82 7,80
El recuento de Clostridium perfringens NCTC 8237 Desviación estándar 0,27 0,19
fue posible en las diluciones 10-6 y 10-7. En Coeficiente de variación (%) 3,46 2,47
concentraciones mayores, se presenta
ennegrecimiento del medio, lo cual dificulta las La precisión intermedia calculada para los analistas
lecturas (Tabla 1). 1 y 2 en este ensayo fue del 97,72 % (Tabla 4). El
análisis de varianza de un factor para el recuento
Tabla 1. Resultados de los recuentos UFC/mL de UFC/100mL de Clostridium perfringens en 12
Clostridium perfringens en diluciones evaluadas por repeticiones para cada uno de los analistas arrojó
triplicado. un valor de F menor que el F crítico, lo cual
significa que se acepta la igualdad de medias, es
decir, no existen diferencias significativas entre los
Resultado Resultado Resultado analistas 1 y 2.
DILUCIÓN PROMEDIO
1 2 3
1 x 10
-5
Incontable Incontable Incontable - Tabla 4. Precisión intermedia del ensayo realizado
1 x 10
-6
184 210 220 204,7
por los analistas 1 y 2.
-7
1 x 10 19 22 25 21 Función estadística Resultado
-8
1 x 10 0 0 0 0 Media 7,84
Desviación estándar 0,18
Coeficiente de variación (%) 2,28
Con estos resultados se establecieron las La recuperación de Clostridium perfringens NCTC
concentraciones de trabajo para determinar el límite 8237 fue de 99,61% en la dilución 10-6 y de 92,49%
de detección, la precisión, la exactitud y el en la dilución 10-7 (tabla 5).
porcentaje de recuperación.
Tabla 5. Porcentajes de recuperación de
El límite de detección del método de Filtración por Clostridium perfringens NCTC 8237.
Membrana para Clostridium perfringens se
presenta en la dilución 10-7, ya que a 10-8 la Desviación
Coeficiente
Porcentaje de
Dilución Media de variación
probabilidad de detección es menor al 95% [9] estándar recuperación
(%)
(Tabla 2). 10-6 2,51 0,07 2,94 99,61
10-7 1,50 0,10 6,42 92,49
Tabla 2. Límite de detección del método para la
determinación y cuantificación de Clostridium Aplicando la metodología ISO 14189:2013 para la
perfringens NCTC 8237. determinación y cuantificación de Clostridium
perfringens, la incertidumbre relativa combinada del
laboratorio se estimó como µ comb = 0,0375, la
Clostridium perfringens incertidumbre operacional intrínseca al resultado
Dilución
Promedio P(+) = 1 – e -m experimental fue µd op = 0,1062 y el valor de la
1 x 10-6 204, 7 1
incertidumbre expandida fue µE = 0,2252.
1 x 10-7 21 0,99
1 x 10-8 0 0,00
4. DISCUSIÓN
De acuerdo con los resultados (Tabla 3), los
porcentajes de repetibilidad de los analistas 1 y 2 La verificación de un método analítico permite
fueron de 96,54 % y 97,52 %, respectivamente, evaluar sus características y determinar si estas
para la detección y cuantificación de Clostridium cumplen o no los requisitos previamente
perfringens en agua potable por el método de establecidos, igualmente, permite evaluar la
Filtración por Membrana. capacidad técnica de cada laboratorio de ensayo

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en particular. Por esta razón, verificar metodologías 3. AGRADECIMIENTOS

de análisis microbiológico es prioritario para
garantizar la oferta de servicios oportunos y Los autores agradecen a la Universidad de
confiables. Antioquia y a Colciencias por el soporte financiero
al proyecto código 111556136074: “Validación y
En el desarrollo de esta verificación, las diluciones acreditación de la metodología de filtración por
de trabajo para el cálculo de la repetibilidad y del membrana para la determinación de Legionella sp.
porcentaje de recuperación estuvieron dentro de los y Clostridium sp. en una matriz de agua potable
rangos óptimos y aceptables para recuentos por para el Grupo de Investigación en Gestión y
medio del método de Filtración por Membrana, Modelación Ambiental - GAIA”, en el marco de la
teniendo en cuenta la sobredispersión de los convocatoria 561 de 2012.
microorganismos [11].

La repetibilidad y la precisión intermedia obtenidas 4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

en este ensayo se ajustan a valores guía
reportados en los anexos de la norma ISO [1] Yonogi, S., Matsuda, S., Kawai, T., Yoda, T.,
14189:2013 [8], indicando que el método es Harada, T., Kumeda, Y., Gotoh, K., Hiyoshi, H.,
repetible bajo las mismas condiciones de ensayo. Nakamura, S., Kodama, T. y Iidab, T. BEC, a Novel
De igual forma, los porcentajes de recuperación Enterotoxin of Clostridium perfringens Found in
para determinar la exactitud del método fueron Human Clinical Isolates from Acute Gastroenteritis
superiores al criterio de aceptación de referencia Outbreaks, Infection and Immunity, 82, 2390–2399,
(>72%) [8], indicando que el método de Filtración 2014.
por Membrana para la detección y cuantificación de
Clostridium perfringens en agua potable, aplicado [2] Organización Mundial de la Salud, OMS. Guías
bajo las condiciones del laboratorio GAIA, es para la calidad del agua potable. Primer apéndice a
exacto. la tercera edición. Volumen 1. 2006.

La incertidumbre expandida que se estimó en este [3] Mueller-Spitz, S.R., Stewart, L.B., Val Klump, J.
trabajo es específica para los resultados de la y McLellan, S.L. Freshwater Suspended Sediments
verificación realizada. La estimación de este and Sewage Are Reservoirs for Enterotoxin-Positive
parámetro es particularmente relevante cuando la Clostridium perfringens, Appl. Environ. Microbiol.,
incertidumbre afecta el cumplimiento con los límites 76 5556–5562, 2010.
de una especificación [9].
[4] Clapham, D. y Franklin, N. Cryptosporidium and
Giardia lamblia in private water supplies. Environ.
5. CONCLUSIÓN Health J, 106 164-169, 1998.

La metodología para la detección y cuantificación [5]. Payment, P., Waite, M. y Dufour A. Introducing
de Clostridium perfringens en agua potable parameters for the assessment of drinking water
aplicada en el laboratorio GAIA, arroja resultados quality. En: Assessing Microbial Safety of Drinking
confiables, precisos y exactos de acuerdo con los Water Improving Approaches and Methods:
criterios de aceptación establecidos a través de la Improving Approaches and Methods. (Eds. A.
determinación del límite de detección, precisión y Dufour, M. Snozzi, W. Koster, J. Bartram, E. Ronchi
exactitud. La estimación de la incertidumbre y L. Fewtrell), WHO Drinking Water Quality Series,
permite el cumplimiento de requisitos específicos OECD—WHO, IWA Publishing, 47-77, 2003.
de la norma ISO/IEC 17025 para laboratorios de
ensayo que buscan la acreditación de métodos [6] DIRECTIVA 98/83/CE DEL CONSEJO de 3 de
cuantitativos. noviembre de 1998 relativa a la calidad de las
aguas destinadas al consumo humano.

[7] República de Colombia. Características,

instrumentos básicos y frecuencias del sistema de
control y vigilancia para la calidad del agua para

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consumo humano. Ministerio de la Protección

Social, Ministerio de Ambiente, Vivienda y
Desarrollo Territorial. Resolución 2115 de 22 de
junio de 2007. Bogotá. 2007.

[8] International Standards Organization, ISO.

Calidad del Agua – Enumeración de Clostridium
perfringens, empleando el método de Filtración por
Membrana. Norma 14189:2013.

[9] Norma Técnica Colombiana. Requisitos

generales para la competencia de los laboratorios
de ensayo y calibración. NTC-ISO/IEC 17025.
ICONTEC. Ed 2005. 2005

[10] Guidance on Validation of Microbiological

Methods. Calidad del agua. Guía para la
orientación acerca de la validación de métodos de
análisis microbiológicos. Adopción idéntica (IDT)
por traducción de la ISO/TR 13843:2000 Water
Quality. GTC 84 2003.

[11] International Standards Organization, ISO.

Water quality. The variability of test results and the
uncertainty of measurement of microbiological
enumeration methods. Norma ISO 29201:2012.

[12] Criterios para la validación de los métodos de

ensayos físico-químicos y microbiológicos. En:
Guía para el funcionamiento de los laboratorios de
ensayo de aguas. (Ed. Morillas, P.P.). Asociación
española de abastecimientos de agua y
saneamiento. 2012. Disponible en:
http://www.aeas.es/documentos/guiafuncionamient
olaboratoriosensayoaguas2.pdf [consultado el 8 de
agosto de 2015].

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