UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Facultad de Ciencias

Escuela de Química y Farmacia

Estudio químico de un extracto alcaloídeo de Latua Pubiflora

(Griseb) (Latúa) y evaluación farmacológica de los
compuestos alcaloideos

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de
Químico Farmacéutico
Profesor Patrocinante. Sra. Juana Núñez Donoso – Instituto de Química.
Georgina Elizabeth Ulloa Arauz
Valdivia Chile 2004

Profesor Co-Patrocinante

Sra. Carin Akesson Nygren – Instituto de Farmacia.

Agradecimientos

A la profesora Juana Núñez por compartir conmigo su tiempo y experiencia en el presente

trabajo, por haber permitido que trabaje con ella, por la orientación y apoyo entregado para llevar
a cabo esta Tesis.

A Joel Pardo por su gran e importante ayuda y colaboración en el desarrollo del estudio
farmacológico.
Al profesor Hernán Palma por su colaboración en la realización de lo espectros de masa.

A los profesores: Francisco Marín (Instituto de Bioestadística), Rita Fuchslocher (Instituto de

Producción Animal), Magdalena Romero (Instituto de Botánica), a la profesora Susan Hess
(Instituto de Química) y profesora Carin Akesson (Instituto de Farmacia) por su disposición a
atender mis consultas.

A mis compañeros y amigos que estuvieron dispuestos a compartir su tiempo, ayuda y apoyo,
especialmente: Daniela, Pomes, Karla, Joaquín y Katty.

Finalmente, quiero agradecer a mi familia su compresión, esfuerzo y apoyo en cada momento.

1. RESUMEN

Latua pubiflora (Griseb) (Latúe, palo de los brujos), es un arbusto nativo perteneciente a la
familia de las Solanáceas, que crece en la zona costera, desde Valdivia a Chiloé. Era usada en
ceremonias mapuches por las machis para producir alucinaciones, las que se asocian a la
naturaleza química de los alcaloides que concentra.

Estudios químicos previos en hojas de Latúe, muestran que esta planta acumula alcaloides
derivados del tropano, principalmente atropina y escopolamina. Una investigación reciente revela
la presencia de los alcaloides minoritarios 3α- cinamoiloxitropano y apoatropina.

En el presente trabajo, se preparó un extracto alcaloídeo, el que fue separado en fracciones

mediante cromatografía de columna y cromatografía a escala preparativa, para posteriormente
elucidar estructuralmente a través de cromatografías comparativas y Espectroscopia de Masas,
los alcaloides: atropina, escopolamina, apoatropina, tropina y apoescopolamina. Tropina y
apoescopolamina, son identificados por primera vez en Latua pubiflora. Además se identificó la
cumarina escopoletina aislada de una fracción no alcaloídea del extracto, y elucidada
estructuralmente por espectroscopia UV, Masas y RMN-H1.

Se evaluó el efecto ansiolítico de la fracción 36-37 y fracción 203-206 en dosis de 2.0 mg/Kg. y
6.0 mg/Kg. respectivamente utilizando el test de laberinto elevado en cruz. Como fármaco de
referencia se utilizó Diazepam.

La fracción 36-37 mostró un aumento en forma estadísticamente significativa del tiempo de

permanencia de los ratones, en las ramas abiertas del laberinto, lo que se relaciona con un efecto
ansiolítico. En cambio, la fracción 203-206, no presentó una diferencia estadísticamente
significativo con respecto al grupo control, por lo se descarta que esta fracción presente un efecto
ansiolítico.
SUMMARY
Latua pubiflora (Griseb) (Latúe, palo de los brujos), is a native shrub appertaining to Solanaceas
family, that grows in the coastal zone from Valdivia to Chiloé. It was used in mapuche
ceremonies for the machis to produce hallucinations, attributed to alkaloids.

Previous chemical work on aerial parts of Latúe has shown that this plant accumulates tropane-
derived alkaloids, mainly atropine and scopolamine. Recent investigation revealed the presence
of the minor alkaloids 3α- cinnamoyloxytropane and apoatropine.

In the present investigation we have studied the alkaloid extract; it was fractionated by column
chromatography and preparative TLC. The alkaloids atropine, scopolamine, apoatropine, tropine
and aposcopolamine were structurally elucidated by comparative chromatography and Mass
Spectroscopy. Tropine and aposcopolamine were identified from Latua pubiflora for the first
time. Additionally, the coumarin scopoletine was identified from a non-alkaloid extract. Its
structure was elucidated by spectroscopic techniques (UV, Mass, 1H-NMR).

The anxiolytic effect of the 36-37 fraction was evaluated in a dose of 2.0 mg/Kg and the 203-206
fraction in a dose of 6.0 mg/Kg, through the plus-maze test. Diazepam was used as the reference
drug. The 36-37 fraction shows a significant increase in the time of permanence in the open arms,
related to anxiolytic effect. However, the 203-206 fraction does not show a significant increase,
discarding an anxiolytic effect of this fraction.
2. INTRODUCCION

Desde tiempos remotos las plantas han sido la principal fuente de sustento del hombre. De ellas
ha obtenido los medios para su alimentación y bebidas, abrigo, salud y bienestar general. Según
relata la historia, los vegetales fueron los primeros medicamentos utilizados por el hombre para
aliviar el sufrimiento físico y curar las enfermedades. Así el conocimiento de las plantas se
desarrolló junto con la evolución del progreso social y científico.

En la naturaleza, existen prácticamente medio millar de especies de plantas superiores. Sin

embargo, sólo el 5-10% ha sido investigado respecto a su composición química o actividad
biológica. Los productos naturales presentes en plantas, nos proporcionan una gran variedad de
compuestos químicos, los cuales en muchos casos presentan una estructura única con potencial
farmacológico (Montes y col, 1992).

Dentro de las sustancias naturales con interés terapéutico, sin lugar a dudas, los alcaloides
constituyen un grupo de primer orden. Son compuestos que poseen estructuras moleculares
complejas y actividad farmacológica importante.

Hasta la fecha se conocen más de 4000 alcaloides y se estima que están presentes solamente en
un 10 a 15 % de todas las plantas conocidas. Son abundantes en un reducido número de familias
de plantas, Papaveráceas, Papilionáceas, Rubiáceas, Solanáceas, etc.; y se han aislado alcaloides
de la raíz, semillas, hojas y corteza de unas 40 plantas pertenecientes a estas familias (Gros y col,
1985).

Desde el punto de vista químico, los alcaloides son sustancias orgánicas básicas por la presencia
de nitrógeno amínico. Este nitrógeno puede encontrarse bajo la forma de amina 1ª, 2ª, 3ª o como
compuesto de amonio cuaternario. Los alcaloides son a menudo sólidos, cristalizables, a veces
coloreados, la mayoría de las veces dotados de actividad óptica (Montes y col, 1992). Estos
compuestos se caracterizan por tener la propiedad de formar sales solubles en el agua con ácidos
orgánicos e inorgánicos, mientras que sus bases libres son solubles en los solventes orgánicos.
Esta propiedad es la base de los procesos generales de extracción de los alcaloides (Sharapin y
col, 2000).

Desde tiempos remotos el hombre ha utilizado alcaloides como pociones mágicas, medicamentos
y venenos. Sólo recientemente se han obtenido conocimientos precisos acerca de las estructuras
químicas de muchos de estos interesantes compuestos (Gros y col, 1985).

Uno de los ejemplos de plantas mágicas que tenemos en Chile es Latua pubiflora, usada en las
ceremonias mapuches. Ella está rodeada de un hálito de misterio y superstición, desde antes de la
llegada de los conquistadores.

Esta planta perteneciente a la familia de las Solanáceas (Hoffmann, 1997), fue descrita por
primera vez por el botánico alemán August Grisebach, en el año 1854. Su nombre científico
Latua pubiflora, proviene del nombre mapuche de la planta: “latué, latúe o latuy”, que es una
contracción de los vocablos “Latue-hue”, que literalmente significa: “lo que causa la muerte”.
Con esta definición se reconocen sus propiedades de planta venenosa, y se alude a sus
propiedades tóxicas y al uso que de esta planta hacían las machis en sus ritos. Las machis y
curanderos solían usarla para entrar en trance o para causar “males”, que terminaban con la
locura de la víctima (Ramírez, 1979).

Latua pubiflora, llamada también, Latué o Palo de los brujos, es un arbusto espinoso que crece en
la zona costera, desde Valdivia a Chiloé. Es el único representante del género en Chile (Muñoz,
1992).

Las Solanáceas constituyen una importante familia de plantas herbáceas, a veces arbustos,
propios de los países cálidos y templados. Desde el punto de vista químico, se caracterizan por
proporcionar a la terapéutica principios activos de naturaleza alcaloídea, como moléculas
derivadas del núcleo del tropano (l-hiosciamina, atropina y escopolamina), nicotina y
glucoalcaloides esteroídeos o solaninas (Montes y col, 1992).

Los compuestos químicos responsables de las propiedades narcóticas y tóxicas de Latua

pubiflora, son dos alcaloides muy abundantes en toda la planta, especialmente en las hojas: la
atropina y la escopolamina, que tienen influencia sobre el funcionamiento del SNC (Ramírez,
1979). Esto es congruente con los resultados obtenidos por Reyes, que demostraron que en un
extracto de Latua pubiflora destinado a la obtención general de alcaloides, se obtuvo un extracto
que al análisis cromatográfico (c.c.f.), mostraba la presencia de al menos cinco alcaloides, dos de
los cuales fueron identificados como atropina y escopolamina, los otros alcaloides no se han
aislado aún dado que se encuentran en baja concentración. (Reyes, 2000).

Atropina y escopolamina son los fármacos antimuscarínicos mejor conocidos, ambos son ésteres
del ácido trópico y de una base nitrogenada terciaria: la tropina en el caso de la atropina, y la
escopina en el caso de la escopolamina (Fig. 1). El éster intacto de la tropina y el ácido trópico es
esencial para la acción antimuscarínica de la atropina, porque ni el ácido libre ni la base
manifiestan actividad antimuscarínica importante. La presencia de un grupo hidroxilo libre en la
porción ácida del éster es otro aspecto importante para su actividad (Goodman y col, 1996).

FIGURA 1. Fórmulas estructurales de ácido trópico, atropina y escopolamina.

Los antagonistas de los receptores muscarínicos impiden los efectos de la acetilcolina al bloquear
su fijación a los receptores colinérgicos muscarínicos a nivel de los sitios neuroefectores en
músculo liso, músculo cardíaco y células glandulares, lo mismo que en ganglios periféricos y
sistema nervioso central (Goodman y col, 1996).

Las dosis pequeñas de antimuscarínicos deprimen las secreciones salival y bronquial, y la

sudoración. A dosis mayores se dilata la pupila, se inhibe la acomodación del cristalino para la
visión de cerca y se bloquean los efectos vagales sobre el corazón, de modo que se incrementa la
frecuencia cardíaca. Dosis mayores inhiben el control parasimpático de la vejiga urinaria y el
tubo digestivo y, por tanto, inhiben la micción y disminuyen el tono, así como la motilidad del
intestino. Se requieren dosis aún mayores para suprimir la secreción y motilidad gástricas.

La atropina y escopolamina difieren desde el punto de vista cuantitativo en sus acciones

antimuscarínicas, sobre todo en su habilidad para afectar al SNC. La atropina carece casi de
efecto perceptible sobre el SNC a las dosis que se aplican en clínica, sólo produce excitación
vagal leve, como resultado de estimulación del bulbo raquídeo y de los centros cerebrales
superiores. Con dosis tóxicas de atropina, se vuelve más notable la excitación central, y esto da
como resultado inquietud, irritabilidad, desorientación, alucinaciones o delirio. Con dosis aún
mayores, la estimulación va seguida de depresión, que culmina en colapso circulatorio e
insuficiencia respiratoria después de un periodo de parálisis y coma. En contraste, la
escopolamina tiene efectos centrales muy notables a dosis terapéuticas bajas, generando
depresión del SNC que se manifiesta por somnolencia, amnesia, fatiga e incapacidad de
ensoñación, con reducción de la etapa de sueño de movimientos oculares rápidos. También
produce euforia, excitación, inquietud, alucinaciones o delirio y, por tanto, es motivo de cierto
abuso. Estos efectos excitadores, que semejan a los de las dosis tóxicas de atropina, se producen
con regularidad después de administrar grandes dosis de escopolamina. (Goodman y col, 1996).

En un estudio previo de Latua pubiflora se analizó un extracto alcaloídeo de la planta. Este

extracto, se probó, in vivo, en ratones, utilizando diferentes ensayos, que permitieron asignarle
importantes efectos en dosis de 150 mg/Kg., efecto ansiolítico, sedante e incoordinación motora
(Reyes, 2000).

Posteriormente, en un estudio in vitro realizado en membranas celulares de corteza cerebral de

ratas, utilizando 3H-Flunitrazepam, se demostró la existencia de al menos un componente en el
extracto alcaloídeo de Latua pubiflora capaz de enlazarse al sitio de benzodiazepinas del receptor
GABA-A, con características de agonista parcial (Sánchez y col, 2001).

Los efectos ansiolítico y sedante son congruentes con una acción gabaérgica similar a la
producida por benzodiazepinas, que demostraría la existencia de uno o más componentes
presentes en el extracto alcaloídeo de Latua, capaz de enlazarse al sitio de benzodiazepinas del
receptor GABA-A. Para establecer la interacción de algún compuesto con el receptor GABA- A
benzodiazepínico, se utilizó el antagonista del receptor GABA-A, Flumazenil, el cual revirtió el
efecto ansiolítico del extracto alcaloídeo y del Diazepam (Rojas, 2002).

También se han realizado ensayos con el extracto no alcaloídeo (extracto en solvente neutro, pH
= 7) y se pudo demostrar que en este extracto no hay actividad farmacológica como las ya
mencionadas (Rojas, 2002). Lo que indica que el extracto de mayor interés desde el punto de
vista del contenido de principio activo, es el extracto alcaloídeo, desde el cual es importante
poder aislar la mayor cantidad de alcaloides (minoritarios), ya que la actividad farmacológica de
atropina y escopolamina (alcaloides mayoritarios) son conocidas.

El propósito de esta investigación es separar el extracto alcaloídeo de Latua pubiflora en

fracciones que contengan los distintos alcaloides, especialmente los minoritarios, e idealmente
tenerlos purificados, para que a través de análisis espectroscópicos poder determinar la estructura
química de ellos, puesto que estos son de gran interés farmacológico. Por otra parte, se considera
hacer una evaluación farmacológica de las fracciones alcaloideas separadas, que no contengan
atropina ni escopolamina.

2.1. Antecedentes generales de Latua pubiflora (Griseb) Baill

2.1.1. Clasificación taxonómica

División: Spermatophyta

Subdivisión: Angiospermae

Clase: Magnoliatae (Dicotyledoneae)

Orden: Solanales

Familia: Solanaceae

Género: Latua

Especie: pubiflora

Nombre científico: Latua pubiflora

Nombre vulgar: Latúe, latué, palo de los brujos

FIGURA 2. Latua pubiflora Griseb

2.1.2. Descripción botánica

Arbusto espinoso que mide 3 a 5 metros de altura, de bello aspecto, con ramas largas. Hojas
alternas, enteras; espinas ubicadas en la inserción de las hojas, de color verde claro, con forma
elíptica, aguda, atenuada en el pecíolo, de 5 a 6 cm. de longitud.

Flores solitarias, axilares, pedunculadas. Cáliz corto, ancho, con 5 divisiones. La corola es un
tubo largo también de 5 divisiones y está densamente cubierta de vellos por fuera; estambres, 5;
estigma corto, anchamente bilobulado. Aparecen de octubre en adelante.

El fruto es una baya globosa, verde-amarillenta, de 2 cm. de diámetro, que encierra numerosas
semillas. Es muy venenoso.
Distribución geográfica: crece en la zona costera, desde Valdivia a Chiloé (400 a 430 de latitud
sur). En la provincia de Valdivia prospera entre 500 y 900 metros de altitud. Más al sur desciende
al nivel del mar. Especie chilena. No muy frecuente.

2.2. Formulación de la hipótesis

En Latua pubiflora, el extracto de mayor interés desde el punto de vista de contenido de principio
activo, es el extracto alcaloídeo. A este se le atribuyen acciones psicoactivas sobre el sistema
nervioso central que modifican conductas en ratones. Se le ha asignado además, efectos
ansiolítico, sedante e incoordinación motora.

El efecto sedante se presenta tanto en el extracto alcaloídeo como en el no alcaloideo, no así el

efecto ansiolítico. Por lo que se piensa que podría existir al menos un alcaloide minoritario
responsable del efecto ansiolítico mostrado por el extracto alcaloídeo, ya que escopolamina y
atropina no poseen esta actividad.

2.3. Objetivo General

Separar el extracto alcaloídeo en fracciones que contengan diferentes alcaloides y elucidar la
estructura química de los alcaloides que puedan ser purificadas del extracto alcaloídeo de Latua
pubiflora a través de análisis espectroscópico. Además realizar una evaluación de la potencial
actividad farmacológica de las fracciones que contengan alcaloides minoritarios, libres de
escopolamina y atropina.

2.4. Objetivos Específicos

- Realizar la extracción de alcaloides mediante un solvente orgánico acidificado con HCl 1%.

-Procesar este extracto hasta obtener los alcaloides libres en solución acuosa ácida, luego
basificar esta solución hasta pH =11 y, extraer los alcaloides de la solución acuosa básica con
solventes orgánicos adecuados.

-Fraccionar este extracto, y una vez concentrado obtener los diferentes alcaloides en fracciones
separadas, o idealmente obtenerlos al estado puro, cristalino.
-Las fracciones idealmente puras, se someterán a análisis de espectroscopia de masa, HPLC,
RMN-H1 y espectroscopia UV.

- Evaluación farmacológica de las fracciones que contengan alcaloides libres de escopolamina y

atropina. Utilizando pruebas como laberinto elevado en cruz (efecto ansiolítico) y tiempo de
sueño inducido por pentobarbital (efecto sedante e hipnótico), para poder asignar las propiedades
farmacológicas a cada uno de los alcaloides.
3. MATERIALES Y METODOS

3.1. Reactivos
 Para la preparación del extracto alcaloídeo:

1. Acido clorhídrico: HCl (Merck)

2. Cloroformo: CHCl3 (Merck)

3. Etanol 95o (Merck)

4. Hidróxido de amonio: NH4OH (Merck)

5. Sulfato de sodio: Na2SO4 (Merck)

 Para placas de cromatografía en capa fina (c.c.f.), cromatografía preparativa y eluyentes:

1. Silica gel (Merck)

2. Metanol (Merck)

3. Cloroformo: CHCl3 (Merck)

4. Reactivo de Dragendorff

5. Estándares: atropina y escopolamina (Merck)

 Para fraccionamiento de extracto alcaloídeo:

1. Gel de sílice 60 (Merck)

2. Eter de petróleo (Arquimed)

3. Cloroformo (Merck)
4. Acetato de etilo (Merck)

5. Metanol (Merck)

 Para fraccionamiento de extracto acetato de etilo:

1. Diclorometano (Arquimed)

2. Acetato de etilo (Merck)

3. Cloroformo (Merck)

4. Metanol (Merck)

 Para HPLC:

1. Metanol grado HPLC (Merck)

2. Fosfato diácido de potasio: KH2PO4 (Merck)

3. Agua destilada grado HPLC (Merck)

4. Estándares: atropina y escopolamina (Merck)

 Para espectroscopia ultravioleta:

1. Metanol: MeOH (Merck)

2. Metóxido de sodio: NaOMe (Merck)

3. Acetato de sodio: NaOAc (Merck)

4. Tricloruro de aluminio: AlCl3 (Merck)

5. Acido clorhídrico: HCl (Merck)

6. Acido bórico: H3BO3 (Merck)

 Para evaluación farmacológica:

1. Como depresor del Sistema Nervioso Central: Pentobarbital (NembutalR), laboratorio SIGMA

Nombre IUPAC: 5- etil-5-(1-metil butil)pirimidina-2,4,6-triona

2. Como fármaco ansiolítico de referencia: Diazepam (ValiumR), laboratorio Roche

Nombre IUPAC: 7-cloro-1,3-dihidro-1-metil-5-fenil-2-H-1,4-benzodiazepin-2-ona

3. Como control: Suero Fisiológico, laboratorio Rider

Solución de NaCl al 0,9 %

3.1.1. Preparación de reactivo de Dragendorff

 Parte a:  Parte b:
0.85 grs. de nitrato básico de bismuto 8 grs. De KI + 20 mL H2O
+ 10 mL HAc + 40 mL H2O

Se mezclan volúmenes iguales de a y b y se guardan en un frasco oscuro.

Para pulverizar:

Mezclar 1 mL (mezcla a y b) + 2 mL HAc + 10 mL H2O

3.2. Planta
La especie vegetal, Latua pubiflora, se recolectó durante el mes de diciembre de 1999, en la
cordillera de la costa de la provincia de Valdivia. La identificación taxonómica de la autenticidad
de la especie fue realizada por el botánico, Dr. Carlos Lehnebach del Instituto de Botánica de la
Universidad Austral de Chile. Un ejemplar se encuentra en el Herbario del Instituto de Botánica
de la Universidad Austral de Chile.

3.3. Extracción de alcaloides

Se prepararon dos extractos alcaloideos. La preparación del primer extracto se realizó de la
misma forma como lo hizo Reyes (2000) en su estudio. Se orientó a la obtención general de
alcaloides, para lo cual se utilizó una técnica de extracción sólido-líquido a temperatura ambiente
(Montes y cols, 1992).

Se pesó 0.5 Kg. de hojas y ramas secas y molidas y se dejó macerar por 24 horas en 2 litros de
etanol con ácido clorhídrico al 1%, se filtró en papel filtro Whatman N o1. Este procedimiento se
realizó tres veces para agotar la extracción. Esta solución fue concentrada utilizando para ello un
rotavapor, este equipo permite evaporar el disolvente orgánico volátil que contiene la muestra
vegetal, esto se hace a temperatura menor a 60 oC y luego se lleva a sequedad en una estufa a 50
o
C para eliminar el resto de disolvente. Al extracto se le agregó 1L de agua destilada, se filtró
nuevamente para separar restos de resinas y grasas que precipitan y, se basificó con NH 4OH hasta
pH 11 (pH inicial 1); posteriormente se extrajo con cloroformo, repetidas veces (150mL de sol +
100 mL de CHCl3), hasta agotar la extracción, con este proceso se obtienen los alcaloides libres.
La fase acuosa y clorofórmica se separaron en un embudo de decantación, al extracto
clorofórmico se le agregó sulfato de sodio (aproximadamente 3 grs.), para sacar restos de agua
(se dejó reposar toda la noche, luego se filtró para eliminar restos de sulfato de sodio) y se
concentró en un rotavapor, formándose una solución pastosa. A este extracto lo denominaremos
extracto clorofórmico 1. En tanto, la fase acuosa fue extraída con acetato de etilo, y luego
concentrada en un rotavapor quedando una solución pastosa, obteniéndose así el extracto acetato
de etilo. (Fig. 3)

Para la obtención del segundo extracto se pesó 0.5 Kg. de hojas y ramas secas y molidas y se dejó
macerar por 24 horas en 2 litros de etanol, se filtró en papel filtro Whatman N o1. Este
procedimiento se realizó tres veces para agotar la extracción. Esta solución fue concentrada
utilizando para ello un rotavapor, a una temperatura menor que 600C y luego se lleva a sequedad
en una estufa a 500C para eliminar el resto de disolvente. Al extracto se le agregó 1L de agua
destilada y ácido clorhídrico al 1%, se filtró nuevamente para separar restos de resinas, grasas y
otras impurezas que precipitan y, se basificó con NH4OH hasta pH 11; posteriormente se realizó
una extracción con cloroformo (150mL de sol + 100 mL de CHCl 3), hasta agotar la extracción,
tendiente a obtener alcaloides base. La fase acuosa y clorofórmica se separaron en un embudo de
decantación y al extracto clorofórmico se le agregó sulfato de sodio (aproximadamente 3 grs.),
para sacar restos de agua (se dejó reposar toda la noche, luego se filtró para eliminar restos de
sulfato de sodio) y se concentró en un rotavapor, formándose una solución pastosa. A este
extracto lo denominaremos extracto clorofórmico 2. (Fig. 4)

FIGURA 3. Preparación del extracto clorofórmico 1 de Latua pubiflora.

FIGURA 4. Preparación del extracto clorofórmico 2 de Latua pubiflora.

3.4. Análisis cromatográfico de los extractos clorofórmicos

3.4.1. Cromatografía en capa fina

La identificación de alcaloides presentes en los extractos clorofórmicos 1 y 2 de Latua pubiflora
se realizó por medio de la técnica de cromatografía en capa fina (c.c.f.), que se define como una
técnica de separación de una mezcla de solutos, basada en la diferente velocidad con que se
mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un solvente en
movimiento. Se utilizó como adsorbente cromatoplacas de gel de sílice 60 GF 254, constituyendo
la fase estacionaria. La fase móvil utilizada fue una mezcla de disolventes orgánicos (cloroformo:
metanol (5:1)), que actúan como eluyente sobre la cromatoplaca, permitiendo la partición
diferencial de las moléculas entre el adsorbente y el disolvente llevando consigo la separación.
Las cromatoplacas fueron observadas bajo lámpara de luz UV a 254 y 365 nm y reveladas con
reactivo de Dragendorff. Este reactivo está constituido por yoduro doble de bismuto y potasio, lo
que permite la detección de alcaloides y aminas cuaternarias, debido a que los alcaloides tienen la
capacidad de combinarse con metales pesados tales como: bismuto y yodo, permitiendo así la
formación de sales dobles que se visualizan por la aparición de una coloración anaranjada.

Los alcaloides presentes en los extractos clorofórmicos fueron identificados por c.c.f. utilizando
los estándares atropina y escopolamina. Las características cromatográficas desarrolladas por la
sustancia en estudio frente al reactivo de Dragendorff en la mezcla de disolventes y el cálculo de
la distancia de migración expresada como relación frontal (Rf), fueron comparadas con la
conducta cromatográfica de los patrones atropina y escopolamina, estableciéndose la presencia o
ausencia de los alcaloides conocidos.

Sobre la base de resultados preliminares que se realizaron al extracto clorofórmico y su fase

acuosa a través de c.c.f., se determinó someter a la fase acuosa a una extracción con acetato de
etilo, debido a que mostraba bajo la luz UV la presencia de un compuesto que también está
presente en el extracto clorofórmico

3.5. Fraccionamiento de los extractos

3.5.1. Fraccionamiento del extracto clorofórmico

La técnica utilizada para separar los componentes individuales de los extractos activos, fue
cromatografía de columna. Para la preparación de la columna se montó una columna de vidrio de
3 cm. de diámetro. En el fondo de la columna se colocó un poco de lana de vidrio, y encima de
esta un poco de algodón, de este modo se retiene el material sólido de la columna, mientras que el
líquido eluyente puede circular libremente. Antes de introducir el adsorbente se coloca en el
interior de la columna un poco de disolvente puro y se elimina el aire que puede permanecer
retenido en las paredes, agitando por medio de una varilla larga de vidrio. El adsorbente (gel de
sílice 60, que constituye la fase estacionaria) se introduce en forma de papilla con el eluyente
(éter de petróleo). La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente en
porciones, lo que permite que se pose el adsorbente por la fuerza de gravedad, hasta alcanzar la
altura deseada (20 cm. 7 veces el diámetro de la columna). Es conveniente golpear la columna
durante el llenado con un tubo de goma para favorecer la formación del lecho adsorbente.
Finalmente se abre la llave inferior de la columna para que salga el exceso de disolvente
contenido. La altura del disolvente no debe exceder más de 2 a 5 mm. sobre el sólido. Una vez
realizado esto la columna está lista para introducir la muestra que se desea separar (Abbott y
Andrews, 1970).

Para introducir la muestra se prepara una cabeza de columna, siendo la muestra un compuesto
sólido, ésta debe disolverse en una pequeña cantidad de eluente para luego mezclar con una
mínima cantidad del adsorbente (gel de sílice 60), luego la mezcla se evapora a sequedad y se
coloca en la columna. Se procede a eluir la muestra empleando una serie de disolventes en los

que se va aumentando la polaridad (éter de petróleo → cloroformo → acetato de etilo →

metanol), las fracciones se colectan a la salida de la columna en tubos de ensayo de 20 mL. Se
analizan por medio de c.c.f. observando a la luz UV y revelando con reactivo de Dragendorff,
cada 5 tubos. Aquellas fracciones con características cromatográficas similares se juntan y son
concentradas a pequeño volumen en un rotavapor, para posteriormente lograr la separación del
compuesto activo y su identificación.

La primera columna (A) se prepara con una mezcla de 1.2 grs. de muestra a separar proveniente
del extracto clorofórmico 1 y 2.5 grs. de adsorbente.

La segunda columna (B) se prepara con una mezcla de 2.8 grs. de muestra a separar proveniente
del extracto clorofórmico 2 y 5.0 grs. de adsorbente.

FIGURA 5. Fraccionamiento de la primera columna (A)

FIGURA 6. Fraccionamiento de la segunda columna (B)
3.5.2. Fraccionamiento del extracto acetato de etilo
Para el fraccionamiento de este extracto se preparó una cabeza de columna disolviendo la
solución pastosa, obtenida al evaporar (en rotavapor) el extracto acetato de etilo, en una pequeña
cantidad de eluente y, agregando posteriormente una pequeña cantidad de silica gel, luego se
llevó a sequedad en un rotavapor y se colocó en la columna en forma similar a lo realizado para
el extracto clorofórmico. Se comienza la elución con diclorometano aumentando progresivamente
la polaridad, se continúa con cloroformo, acetato de etilo y metanol.
Se recolectaron 30 fracciones de aproximadamente 10 mL c/u. Se visualizó un compuesto puro,
visible bajo luz UV en las fracciones 11-21 las que se juntaron, y al permitir la evaporación del
solvente a temperatura ambiente, el producto cristalizó.

El compuesto cristalizado fue sometido a análisis de espectroscopia UV, espectrometría de masa

y resonancia magnética nuclear de protón.

3.5.3. Cromatografía en capa fina preparativa

Es una técnica de separación, en que se emplean mayores espesores de adsorbente y tamaños de
placa. La placa se prepara colocando una papilla formada por el adsorbente (30 grs. de gel de
sílice 60) y agua (20 mL) sobre una placa de vidrio de 40 x 20 cm., formando así una capa
uniforme. Una vez seca la placa, la muestra a separar (disuelta en solvente orgánico) se aplica
sobre la base de la placa, formando una línea. En los lados de la placa se aplica una solución de
los compuestos estándar, que sirva de referencia. A continuación se desarrolla la placa empleando
como disolvente una mezcla cloroformo: metanol (5:1). Para el revelado se usa el reactivo de
Dragendorff, que se aplica sólo en la banda lateral para conocer la posición de los compuestos de
interés (que no son atropina ni escopolamina), para luego retirarlos de la placa barriendo el área
de la sustancia con una espátula. Posteriormente, para extraer la sustancia del polvo adsorbente,
se utiliza un disolvente (metanol) en el que se aplica un poco de temperatura y luego se filtra
(Abbott y Andrews, 1970). A continuación se somete la muestra a una purificación, mediante la
disolución de la muestra en metanol (150 mL) y su tratamiento con un agente de adsorción como
carbón activado (punta de espátula) (Sharapin y col, 2000).

3.5.4. Análisis de los compuestos presentes en el extracto clorofórmico por

HPLC
La cromatografía líquida de alta resolución permite, mediante diferencias en el tiempo de
retención en la columna, tener una separación de los compuestos y poder comparar con un
estándar en las mismas condiciones. Esto además permite una estimación de las proporciones en
las cuales se encuentran los componentes dentro del extracto. Se utilizó una columna C8, la que
fue equilibrada con un eluyente que contenía MeOH: 50mM KH2PO4 pH 3,5 (25:75) a un flujo de
1,0 mL/min. Las fracciones a inyectar, fueron filtradas por medio de filtros de jeringa (0,2 m),
para comparar los tiempos de retención se utilizó una solución que contenía los estándares
atropina y escopolamina (ambos en concentración de 0.1 mg/ml) y la detección se hizo a 220 nm,
ya que ésta es la longitud de mayor absorción de los alcaloides y además coincide con el rango de
mayor absorción del extracto alcaloídeo (Rojas, 2002).

3.6. Técnicas espectroscópicas

3.6.1. Espectroscopia de ultravioleta (UV)

Es un método de determinación de estructuras aplicable solamente a sistemas conjugados.
Cuando una molécula conjugada recibe radiación ultravioleta, ocurre una absorción de energía y
un electrón pi es promovido del orbital molecular ocupado de mayor energía (HOMO) al orbital
molecular no ocupado de menor energía (LUMO). La absorción de energía se detecta y se
representa en una grafica de longitud de onda (nm) versus radiación absorbida (McMurry, 1993).

Para analizar el espectro ultravioleta del compuesto se utilizaron los reactivos y procedimientos
descritos por Núñez (comunicación personal). La adición de cada reactivo a una solución
metanólica del compuesto induce desplazamientos estructuralmente significativos en el espectro
ultravioleta, lo que permite revelar el número y la ubicación de sustituyentes unidos a los
carbonos del sistema conjugado. Los desplazamientos son inducidos comúnmente por la adición
de metóxido de sodio (NaOMe), acetato de sodio (NaOAc), acetato de sodio/ácido bórico
(NaOAc/H3BO3), cloruro de aluminio (AlCl3) y cloruro de aluminio/ ácido clorhídrico
(AlCl3/HCl). Los espectros fueron medidos a una longitud de onda entre 220-500 nm y unidades
de absorbancia entre 0- 2, en un Equipo Shimadzu 240 perteneciente al Laboratorio de Productos
Naturales, Instituto de Química UACH.

3.6.2. Espectroscopia de masa (EM)

Es básicamente una técnica que permite determinar la masa de una molécula (peso molecular).
Para ello las moléculas son bombardeadas con electrones y fragmentadas. El análisis de las masas
de los fragmentos resultantes permite conocer el peso molecular (M+), y se obtienen datos
importantes acerca de la estructura molecular (Wade, 1993).
Las fracciones fueron analizadas en un Cromatógrafo de Gases HP 6890 PLUS equipado con un
inyector con temperatura de vaporización programable y acoplado a un Detector de Masa
Selectivo Hewlett- Packard (GC-MSD). La temperatura del inyector fue mantenida a 280 oC en
un modo de pulso. Se uso un programa de temperatura de 60 oC por 4 min. Y luego un incremento
de 10 oC por min. hasta una temperatura de 300 oC; usando una columna capilar HP-5 MS, de 30
m de longitud, diámetro interno de 0.32 mm y un espesor de 0.25 m (Hewlett- Packard). El
Detector Selectivo de Masa fue operado bajo el modo Scan. Instituto de Química, UACH.

3.6.3. Resonancia magnética nuclear (RMN)

Esta técnica permite observar los ambientes químicos de los átomos de hidrógeno (o de los
13
átomos de carbono, C) y proporciona evidencia de la estructura de los grupos alquilo e
indicaciones acerca de los grupos funcionales (Wade, 1993). Equipo Bruker 200 MHz. Pontificia
U. Católica de Chile.

3.7. Estudio farmacológico

3.7.1. Preparación de las fracciones.

Se usaron aquellas fracciones que contenían alcaloides, que no fueran atropina ni escopolamina,
estas fracciones (fracción 36-37 y fracción 203-206) fueron sometidas a liofilización para
eliminar restos de agua, se pesaron en una balanza analítica y se disolvieron en etanol hasta un
volumen de 2 mL.

3.7.2. Determinación de dosis de las fracciones

Para determinar la dosis a administrar de cada fracción se utilizaron 10 ratones a los que se les
administraron las siguientes dosis:

La fracción 36-37 en una concentración de 2.5 mg/mL: 2.0, 5.0, 10 mg/Kg.

La fracción 203-206 en concentración de 6.0 mg/mL : 1.0, 5.0, 6.0, 7.0, 10 mg/Kg.

La confirmación in vitro de la existencia de un componente en el extracto capaz de enlazarse al

sitio de benzodiazepinas del receptor GABA-A, con características de agonista parcial, nos llevó
a determinar la inclusión del test de sueño inducido por pentobarbital como un efecto indicador
in vivo, asociado a la actividad gabaérgica (Sánchez y col, 2001). La medición del efecto sedante,
mediante este test, permite evaluar en poco tiempo y sin requerir equipamiento adicional,
diferentes fracciones que retengan los efectos centrales del extracto; teniendo en cuenta que
existe una clara tendencia a considerar el efecto ansiolítico como el primer paso de una línea
continua de efectos progresivos: ansiolítico- sedante- hipnótico (Florez, 1997).

Se administraron dosis vía intraperitoneal de modo de determinar la dosis efectiva 50 (DE 50), o
sea la dosis que produce el efecto farmacológico esperado en el 50% de los animales (Katzung,
2002).

El test de sueño inducido por pentobarbital es un modelo que permite determinar la acción
hipnótica de una droga o fármaco (evaluada por el periodo de latencia, que corresponde al tiempo
que trascurre entre la inyección del pentobarbital y la pérdida del reflejo de enderezamiento) y el
efecto sedante (demostrado por el tiempo de sueño, que corresponde al lapso transcurrido entre la
pérdida del reflejo de enderezamiento y su recuperación).

De esta manera, se utilizaron las dosis de los extractos que demostraron tener efecto sedante en el
test de sueño inducido por pentobarbital, para la evaluación del efecto ansiolítico.

3.7.3. Animales
Los animales utilizados para el estudio fueron ratones H o M de la especie Mus musculus, cepa
Rockefeller, de dos meses de edad con pesos entre 25 y 40 gr. provenientes del vivero del
Instituto de Inmunologia de la Universidad Austral de Chile, los que fueron trasladados con 24
horas de anticipación al laboratorio del Instituto de Farmacia, y donde se mantuvieron con agua y
alimento ad libitum, temperatura de 21oC y ciclos de luz de 12 horas, para posteriormente realizar
los ensayos entre las 12 y 17 horas, que es el momento del día en que el animal está en máxima
alerta (Paeile y Saavedra, 1990).

3.7.4. Determinación de la actividad ansiolítica

Laberinto elevado en cruz
FIGURA 7. Test de laberinto elevado en cruz

El test de laberinto elevado en cruz es un modelo de evaluación de actividad ansiolítica en

ratones, el cual ha sido ampliamente utilizado en el descubrimiento de nuevos agentes
ansiolíticos y en la investigación de las bases fisiológicas y neuroquímicas de la ansiedad. El test
se basa en la aversión natural de los roedores por espacios abiertos y se realiza en un laberinto
que consta de dos ramas abiertas y dos ramas cerradas, dispuestas en forma de cruz sobre una
plataforma elevada. De esta forma, se asume que cuando el animal está en las ramas abiertas,
experimenta sensaciones de vértigo, agorafobia y xenofobia, las cuales son estímulos naturales
que pueden inducir ansiedad en humanos.

El laberinto es una estructura en forma de cruz, de acrílico, ubicada a 40 cm. De altura sobre una
plataforma de madera y está compuesto por dos ramas de 30 x 5 cm., cerradas por paredes opacas
de 10 cm. De altura y dos ramas abiertas transparentes de 30 x 5 cm., unidas por una plataforma
central opaca de 8 x 8 cm. (Maruyama y col, 1998). El laberinto fue ubicado en una habitación de
paredes negras, iluminada por un tubo fluorescente de 40 w, y enfocado por una cámara de video
en posición vertical para captar las imágenes de los ratones sobre el laberinto. La cámara está
conectada a una videograbadora y simultáneamente proyectada en un monitor situado en una
habitación contigua.
La determinación se realizó dividiendo los animales en cuatro grupos de 10 ratones cada uno, los
cuales fueron inyectados intraperitonealmente, 30 minutos antes de la realización del test, de la
siguiente forma:

1. NaCl 0,9 %, como control en volumen de 12.5 mL/Kg.

2. Diazepam, como fármaco de referencia en dosis de 1.0 mg/Kg.

3. Fracción 36-37 de Latua pubiflora, en dosis 2.0 mg/Kg.

4. Fracción 203-206 de Latua pubiflora, en dosis de 6.0 mg/Kg.

Para llevar a cabo la prueba se coloca el ratón en el centro del laberinto mirando hacia una de las
ramas cerradas y se observa por 5 minutos. Se registra el número de entradas a las ramas abiertas
y cerradas, considerando como entrada cuando las cuatro patas del ratón se encuentran dentro y
como salida, cuando las cuatro patas están fuera. Se consideran como medidas de ansiedad el
tiempo de permanencia en las ramas abiertas y el número de entradas en las ramas abiertas
(Fernández, 1997) y como medida de evaluación de la actividad motora el número total de
entradas, tanto a ramas abiertas como cerradas (Hogg, 1996).

Las diferencias entre grupos experimentales son evaluadas mediante la prueba t de Student, de
modo que nos certifique la significancia al efecto que estamos calculando y que este resultado no
se deba al azar. Se considera un valor estadísticamente significativo cuando p< 0.05. (Schefler,
1981).
4. RESULTADOS

4.1. Análisis cromatográfico en capa fina de los extractos

La c.c.f. permite confirmar o no la presencia de compuestos conocidos, en este caso se utilizó a
los alcaloides atropina y escopolamina como estándares y se compararon con los extractos
clorofórmico 1 y 2. Al analizar ambos extractos, se detectaron al menos 6 alcaloides, dos de los
cuales se encuentran mayoritariamente y corresponden a atropina y escopolamina. Al observar
ambos extractos a la luz UV se observó la presencia de compuestos que presentaban una intensa
fluorescencia celeste o azul.

FIGURA 8. Cromatografía en placa fina de silica gel

1. Estándar de escopolamina
2. Extracto clorofórmico 2 de L. pubiflora

3. Extracto clorofórmico 1 de L. pubiflora

4. Estándar de atropina.

4.2. Fraccionamiento de los extractos

Se realizó el fraccionamiento de los extractos clorofórmico 1 y 2 mediante cromatografía en
columna con solventes de polaridad creciente.

Del fraccionamiento del extracto clorofórmico 1 se obtuvieron 236 fracciones de

aproximadamente 20 mL cada una, se analizó una de cada 5 fracciones, y luego se fueron
juntando y concentrando aquellas de características cromatográficas similares. Al controlar por
c.c.f. el extracto clorofórmico 1, se observó que a partir de la fracción 33 se visualizan los
primeros alcaloides, de estas fracciones las más significativas son las fracciones 36-37, ya que
presentan una mayor cantidad de alcaloide. Desde aquí en adelante comienzan a aparecer los
distintos alcaloides muy juntos entre sí, lo que dificulta una eventual separación. A partir de la
fracción 203 hasta la 206 se visualiza un alcaloide un poco más puro. En las fracciones siguientes
se observa un compuesto alcaloideo que no se diferencia muy bien debido a la aparición de un
compuesto de color lila.

Del fraccionamiento del extracto clorofórmico 2, se obtuvieron 267 fracciones de

aproximadamente 20 mL cada una, siguiendo un procedimiento similar al realizado para el
fraccionamiento del extracto clorofórmico 1, se fue controlando por c.c.f. la composición de las
distintas fracciones obtenidas. Con la mezcla cloroformo: acetato de etilo se observa claramente
la presencia de alcaloides, evidenciados por su coloración naranja en c.c.f. y Reactivo de
Dragendorff, de las cuales las fracciones 91 a la 106 se visualizan más claramente. De ahí en
adelante comienzan a aparecer los distintos alcaloides muy juntos uno del otro. Un alcaloide un
poco más puro se observa desde la fracción 257 a la 260.

Del extracto acetato de etilo, se obtuvieron 30 fracciones de aproximadamente 10 mL cada una,

en que se visualizó un compuesto puro, visible a la luz ultravioleta a partir de la fracción 11 a la
21, las que se juntaron y al evaporar el solvente a temperatura ambiente el producto cristalizó.
4.3. Cromatografía en capa fina preparativa
Se procedió a la purificación de las fracciones 36-37, 203-206 y 91-106, 257-260 provenientes de
los extractos clorofórmicos 1 y 2 respectivamente, utilizando para ello cromatografía en capa fina
a escala preparativa, separándose así cuatro fracciones que contienen compuestos alcaloideos.
Una de las fracciones (banda 2) presenta un Rf distinto al estándar de escopolamina (banda 1), y
otra de las fracciones (banda 3) un Rf similar; las fracciones representadas por las bandas 4 y 5
exhiben un Rf distinto al estándar de atropina (banda 6).

FIGURA 9. Cromatografía en placa fina de silica gel.

1. Estándar de escopolamina

2. Fracción 36-37

3. Fracción 91-106

4. Fracción 203-206
5. Fracción 257-260

6. Estándar de atropina

Posteriormente las fracciones que contenían estos compuestos fueron sometidas a análisis en
HPLC y espectrometría de masa.

4.4. Análisis de los compuestos presentes en el extracto clorofórmico

por HPLC
Se realizaron análisis de HPLC al extracto clorofórmico y a las fracciones 36-37, 203-206 y 91-
106, 257-260 provenientes de los extractos clorofórmico 1 y 2 respectivamente, y se compararon
con una solución que contenía atropina y escopolamina (ambos en una concentración de 0.1
mg/mL). Se presentan picos con tiempos de retención similares a los de atropina y escopolamina.
Además, se puede observar la diferencia que existe entre el cromatograma del extracto
clorofórmico y el de las demás fracciones en relación a la cantidad de compuestos que existe, y la
eficiencia del método de purificación.

FIGURA 10. Cromatograma de extracto clorofórmico 1 de Latua pubiflora

FIGURA 11. HPLC de estándar escopolamina y atropina

FIGURA 12. HPLC de fracción 36-37

FIGURA 13. HPLC fracción 91-106.

FIGURA 14. HPLC fracción 203-206.

FIGURA 15. HPLC fracción 257-260

4.5. Análisis espectroscópico de las fracciones obtenidas del extracto
clorofórmico 1 y 2
Las fracciones 36-37, 91-106, 203-206 y 257-260 fueron analizados mediante un Cromatógrafo
de Gases acoplado a un Espectrómetro de Masas para la identificación estructural de los
compuestos de interés, comparando los patrones de fragmentación con la base de datos del
equipo.

Se identificaron cinco alcaloides, de los cuales atropina y escopolamina, ya habían sido

identificados en estudios químicos previos (Silva y Mancinelli, 1959; Reyes, 2000; Rojas, 2002).

De los alcaloides identificados, el primero de ellos Lp 303*, proveniente de la fracción 91-106,

fue identificado por comparación del espectro de masa con material de referencia, como
escopolamina.

FIGURA 16. Espectro de masa de escopolamina.

El peso molecular de la escopolamina no aparece en el espectro, debido a que el compuesto pudo
haber sido fragmentado antes de llegar a la cámara de ionización de modo que no aparece el ion
molecular [M+]= 303. Sin embargo, los otros fragmentos son absolutamente coincidentes a los
descritos en la literatura (Muñoz y Casale, 2003).

* Esta denominación corresponde a las iniciales de la planta (Latua pubiflora) y el número corresponde al peso
molecular, en c/u de los compuestos que se describen.

Lp 289, aislado de la fracción 203-206 y 257-260, fue identificado como atropina.

FIGURA 17. Espectro de masa de atropina

Lp 271, fue identificado como apoatropina, y fue aislado de la fracción 257-260. La presencia de
este alcaloide en Latua pubiflora ha sido descrita por primera vez por Muñoz y Casale (2003).

A continuación se muestra el espectro de masa de Lp 271.

FIGURA 18. Espectro de masa de Lp 271 (Esp 1) y apoatropina (Esp 2)

Lp 141, proveniente de la fracción 257-260, fue identificado como tropina. Este alcaloide ha sido
descrito en otras especies que poseen alcaloides del tropano (Christen y col, 1993; San-Martin y
col, 1987), pero no en Latua pubiflora.

FIGURA 19. Espectro de masa de Lp 141 (Esp 1) y tropina (Esp 2)

Lp 285, aislado de la fracción 91-106, fue identificado como 2-fenil-2-propeniloxiescopano o
apoescopolamina, este presenta el ión molecular a m/z = 285 que corresponde a la fórmula
molecular C17H19NO3. Por la ausencia de iones a m/z 131, 140 y 148, característicos de la
fragmentación del ácido cinámico, este compuesto corresponde a 2-fenil-2-propeniloxiescopano
y no al cinamoilescopano, esto se puede deducir comparando los datos aparecidos en la literatura
(Muñoz y Casale, 2003).

Este alcaloide, Lp 285, no había sido identificado en Latua pubiflora. Su espectro de masa y
fragmentación se detallan en la figura 20 y 21 respectivamente.

FIGURA 20. Espectro de masa de Lp 285

FIGURA 21. Esquema de fragmentación de Lp 285

Lp 251, procedente de la fracción 257-260, correspondería según el espectro de masa a una

benzodiazepina. A pesar de que la certeza es de un 53 %, esto podría explicar en parte el efecto
ansiolítico observado en el extracto alcaloídeo por Sánchez y col (2001) y Rojas (2002).
FIGURA 22. Espectro de masa de Lp 251

4.6. Análisis espectroscópico de la fracción obtenida del extracto

acetato de etilo
Del producto aislado de la fracción (11-21), Lp 192, obtenida del extracto acetato de etilo se
obtuvieron los siguientes resultados:
Espectroscopia ultravioleta

Según el resultado de los máximos de absorbancia ( max: 343, 296h, 251h, 238 nm.) realizados a
la muestra disuelta en MeOH, nos permite concluir a priori que se trata de una cumarina
(Harborne y Mabry, 1982).

A fin de determinar la presencia y posición de posibles grupos sustituyentes, se realizaron análisis

con diferentes reactivos que inducen desplazamientos de las bandas I y II del espectro en MeOH

-Al agregar NaOMe a la solución metanólica que contiene a la fracción 11-21, se observó un
desplazamiento batocrómico de 49 nm de la banda I (banda de mayor longitud de onda), con
respecto a la banda I en MeOH. Este efecto se atribuye a la presencia de un OH en posición C-7
(Fig.23).

FIGURA 23. Espectro ultravioleta de fracción 11-21 del extracto acetato de etilo en MeOH y en
NaOMe.

-Con AlCl3 y AlCl3/HCl no se observó ningún cambio en la banda I, por lo tanto no existen
grupos OH en posición orto, ni en posición C-5. (Fig.24)
FIGURA 24. Espectro ultravioleta de fracción 11-21 del extracto acetato de etilo en MeOH +
AlCl3 y en MeOH AlCl3 + HCl.

-Con Na+OAc- se observa un cambio batocrómico de 47 nm con respecto al espectro del MeOH,
similar al desplazamiento observado con NaOMe, lo que refuerza la presencia de un OH en el C-
7. Y por último la ausencia de efecto batocrómico, con NaOAc + H 3BO3 revela que no existe
grupos hidroxilo en posición orto. (Fig.25)

FIGURA 25. Espectro ultravioleta de fracción 11-21 del extracto acetato de etilo en MeOH +
NaOAc + H3BO3.
Espectroscopia de masa.

En el espectro de masa de la figura 26, se observa el ión molecular a m/z = 192 que corresponde
con la fórmula C10H8O4. El fragmento a m/z 177 indica la pérdida de un grupo metilo (a partir del
ión molecular), el fragmento a m/z 164 indica la pérdida de un carbonilo, el fragmento a m/z 149
corresponde a la pérdida de un fragmento de metilo (CH3) y carbonilo (C=O) respectivamente.

FIGURA 26. Espectro de masa de Lp 192 (Esp. 1) comparado con el espectro de escopoletina de
referencia (Esp. 2).

Resonancia magnética nuclear

En el espectro RMN-1H, se observa un singlete a 3.96 ppm que integra para tres protones
correspondientes a los hidrógenos del metoxilo (OCH3), a 6.18 ppm un singlete con integración
para un hidrógeno del OH- fenólico. Se observa, también, un par de dobletes a  6.2 y  6.0 cuya
constante de acoplamiento es de 8 Hz (J = 8Hz) que corresponden a los C 4-H y C5-H, siendo este
último el que se desplaza a campo magnético más bajo (Skoog y col, 2001).

FIGURA 27. Espectro de 1H-RMN de fracción 11-21 de extracto acetato de etilo

TABLA 1: Datos de RMN de cumarina de Latua pubiflora.

H-3 H- 4 H- 5 H- 8 -OH -OCH3
7.60 (d) 6.27 (d) 6.92 (s) 6.85 (s) 6.18 (s) 3.96 (s)

A partir de los resultados obtenidos por los análisis anteriormente mencionados podemos afirmar
que efectivamente el compuesto analizado corresponde a escopoletina perteneciente a la
clasificación de cumarinas naturales, en donde los grupos caracterizados corresponden a un grupo
metoxi y un grupo hidroxilo en posición 6 y 7 respectivamente.

FIGURA 28. Fórmula estructural de escopoletina

4.7. Estudio farmacológico

4.7.1. Determinación de dosis de las fracciones

De la fracción 36-37 se tiene 5.0 mg de muestra, la que se disuelve en 2 mL de etanol, por lo
tanto se tiene en una concentración de 2.5 mg/mL. La dosis de muestra con la que se obtienen
resultados similares a los obtenidos por Rojas (2002) para el test de sueño inducido por
pentobarbital fue 2.0 mg/Kg., por lo que esta fue la dosis utilizada para el test de laberinto
elevado en cruz.

Del mismo modo, en la fracción 203-206 se tienen 12.0 mg de muestra la que se lleva a una
concentración de 6.0 mg/mL en etanol, la dosis que se utiliza para el test de laberinto elevado en
cruz es 6.0 mg/Kg.

4.7.2. Determinación de la actividad ansiolítica

En la tabla No 2 se muestra el tiempo de permanencia en ramas abiertas del laberinto, donde se
observan diferencias estadísticamente significativas, según t de Student, con respecto al control
para Diazepam (fármaco de referencia) y la fracción 36-37, no así para la fracción 203-206.

TABLA 2: Tiempo de permanencia en ramas abiertas.

 Muestra Dosis n µ±σ
Control (NaCl 0.9 %) 12.5 mL/Kg. 10 68.1 ± 38.6
Diazepam 1.0 mg/Kg. 10 105.8 ± 23.5 *
Fracción 36-37 2.0 mg/Kg. 10 89.9 ± 35.6 *
Fracción 203-206 6.0 mg/Kg. 10 45.7 ± 22.8

*p< 0.05, diferencia estadísticamente significativa con respecto al control por t de Student

n = número de ratones

µ = promedio de tiempo de permanencia en las ramas abiertas (medido en segundos)

σ= desviación estándar
5. DISCUSION

A partir de Latua (Latua pubiflora), mediante un proceso de extracción alcohol/ácida, se llegó a

la obtención de un extracto alcaloídeo (extracto clorofórmico 1 y 2) y uno no alcaloídeo (extracto
acetato de etilo). Por medio de c.c.f. y comparación con estándares se determinó la presencia de
los alcaloides mayoritarios atropina y escopolamina (confirmado por medio de HPLC) y de al
menos otros cuatro alcaloides en muy baja concentración. Además se observó la presencia de
otros compuestos visibles a la luz UV de coloración celeste intensa.

La separación de los compuestos contenidos en el extracto clorofórmico 1, realizada mediante:

cromatografía de columna y c.c.f. a escala preparativa, entregó dos fracciones: la fracción 36-37
y la fracción 203-206. Del mismo modo a partir del extracto clorofórmico 2 se obtuvieron la
fracción 91-106 y la fracción 257-260. En cuanto al extracto acetato de etilo, de este se obtuvo
por cromatografía de columna la fracción 11-21.

El rendimiento del proceso extractivo de hojas de Latua pubiflora fue bajo, lo que es de esperar
en el caso de los alcaloides, los cuales generalmente se encuentran en una concentración de ppm
(mg/Kg.)(Montes y col, 1992). De la fracción 36-37 se obtuvieron 5.0 mg y de la fracción 203-
206 12.0 mg, ambos fracciones no contenían compuestos puros. A pesar de que la época de
recolección fue la adecuada, puesto que la primavera es el momento en que el contenido de los
principios activos alcanzan su grado máximo en las hojas (Sharapin y col, 2000).

Por medio de Espectrometría de Masas, se logró identificar la presencia de cinco alcaloides, de

ellos atropina (Lp289), aislada de las fracciones 203-206 y 257-260, con un ión molecular [M +]=
289 y escopolamina (Lp303), aislada de la fracción 91-106, fueron identificados primero por
c.c.f. comparando su Rf con el de muestras patrón, luego por HPLC comparando los tiempos de
retención con muestras patrón. La presencia de estos alcaloides es además corroborada por otros
autores (Silva y Mancinelli, 1959; Reyes, 2000; Rojas, 2002; Muñoz y Casale, 2003).
Un tercer alcaloide, apoatropina (Lp271), obtenido de la fracción 257-260, identificado por
espectrometría de masa, presenta un ión molecular [M+]= 271 y fragmentos consistentes con su
estructura, lo que coincide con lo obtenido por Muñoz y Casale (2003). El cuarto alcaloide
identificado corresponde a tropina (Lp141), aislado de la fracción 257-260, con un ión molecular
[M+]= 141. Este alcaloide ha sido descrito en otras especies que poseen alcaloides del tropano
(Christen y col, 1993; San-Martin y col, 1987), pero en Latua pubiflora no había sido
identificado aún.

Y el quinto alcaloide identificado correspondería a apoescopolamina (Lp 285), separado de la

fracción 91-106, con un ión molecular [M+]= 285, este alcaloide es, por primera vez es
identificado Latua pubiflora. Los otros dos alcaloides minoritarios presentes en Latua pubiflora
corresponderían a alcaloides derivados del núcleo del tropano, puesto que géneros afines de
plantas producen los mismos alcaloides o bases estructuralmente relacionadas (Gros y col, 1985).

Lp 251, procedente de la fracción 257-260, correspondería según el espectro de masa a una

benzodiazepina, ya que el compuesto identificado, corresponde a la estructura básica de las
benzodiazepinas. A pesar de que la certeza es de un 53 %, esto podría explicar en parte el efecto
ansiolítico observado en el extracto alcaloídeo por Sánchez y col (2001) y Rojas (2002).

El último compuesto identificado, Lp192, obtenido de la fracción 11-21 del extracto acetato de
etilo, por c.c.f. mostraba a la luz ultravioleta una coloración celeste intensa. La identificación de
este compuesto se realizó mediante espectroscopia UV, espectroscopia de masa y espectroscopia
de resonancia magnética nuclear de protón. Luego de analizar los espectros, por correlaciones
químicas y comparaciones de espectros reportados en la literatura (Harborne y Mabry, 1982), se
determinó la estructura de 7-hidroxi-6-metoxi cumarina o escopoletina. Que corresponde a una
cumarina, un compuesto natural presente en otros géneros de la familia Solanácea (Montes,
1992). Según Hussein y Samuelsson (1991), la escopoletina posee efectos como relajación del
tejido muscular, inhibición de prostaglandinas, antimicrobianas, antinociceptivas e hipotensivas.
Estudios anteriores muestran que, escopoletina no presenta (en ratones) los efectos: sedante y
ansiolítico, por lo tanto de poseer algún efecto sobre el Sistema Nervioso Central, este no
correspondería a los recién mencionados, por lo tanto no se utiliza en el test de laberinto elevado
en cruz (Rojas, 2002).
Para realizar el ensayo biológico en ratones, las fracciones obtenidas fueron analizadas por
HPLC comparando su tiempo de retención con los estándares atropina y escopolamina, de modo
de confirmar que el contenido de estas fracciones no corresponda a ninguno de los alcaloides
mencionados, ya que la actividad farmacológica de atropina y escopolamina es conocida, además
fueron analizadas por un equipo de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas
en que se compararon las fracciones con la base de datos del laboratorio.

Para determinar la dosis efectiva en el test de laberinto elevado en cruz, se uso el test de sueño
inducido por pentobarbital, de modo de observar el efecto sedante, puesto que según la teoría de
ocupación de receptores, es posible asociar una ocupación creciente de los receptores con una
acción progresiva, la que se inicia con el efecto ansiolítico. Cuando la ocupación de los
receptores es baja, avanza hacia el efecto anticonvulsivante y sedante, y culmina con el efecto
miorrelajante cuando la ocupación es máxima (Florez, 1997). Determinándose, de esta forma,
utilizar una dosis de 2.0 mg/Kg. para la fracción 36-37, y para la fracción 203-206 una dosis de
6.0mg/Kg.

El test de laberinto elevado en cruz considera como medida de ansiedad el tiempo de

permanencia en las ramas abiertas. En este test, entre el grupo control y la fracción 203-206 no se
demostró una diferencia estadísticamente significativa, por lo tanto no hay efecto ansiolítico. En
cambio, para el grupo de referencia (Diazepam), y la fracción 36-37 se vio un aumento en forma
estadísticamente significativa del tiempo de permanencia de los ratones en las ramas abiertas del
laberinto, lo que se relaciona con una disminución de la ansiedad que experimenta el ratón al
encontrarse en ramas abiertas y transparentes ubicadas a altura, por lo que se puede decir que
tiene un efecto ansiolítico (Dawson y Tricklebank, 1995).

Un fármaco ansiolítico, por definición es aquel que alivia o suprime el síntoma de ansiedad, sin
producir sedación o sueño. Dentro de los principales sistemas de neurotransmisión implicados en
la génesis y expresión de la sintomatología ansiosa están el complejo receptor GABA- A
benzodiazepínico, el sistema serotonérgico y el sistema noradrenérgico. Según esto, los fármacos
ansiolíticos se clasifican en: aquellos que producen además un efecto sedante- hipnótico
(benzodiazepinas, barbitúricos y meprobamato), los agonistas parciales de los receptores 5-HT 1A
(buspirona, ipsapirona y gepirona), y los que producen además, un bloqueo de algún componente
vegetativo (antihistamínicos, neurolépticos, antidepresivos y bloqueantes β-adrenérgicos
(Florez, 1997).

Los resultados obtenidos en el test de laberinto elevado en cruz, al utilizar la fracción 36-37 en
dosis de 2.0 mg/Kg. presentan relación con lo observado por Reyes (2001), quien estudió un
extracto alcaloídeo de Latua pubiflora, obteniendo un aumento en el tiempo de permanencia en
las ramas abiertas del laberinto elevado en cruz, manifestando que L. pubiflora posee efecto
ansiolítico. Este efecto estaría asociado a una actividad gabaérgica, establecida en un estudio in
vitro, en que el extracto se comporta como un agonista competitivo del receptor benzodiazepínico
al desplazar de su sitio de unión al [H3]-Flunitrazepam (Sánchez y col, 2001), y que más tarde
quedaría demostrado en un estudio in vivo, que existiría al menos un componente en el extracto
alcaloídeo, capaz de unirse al sitio de benzodiazepinas en el receptor GABA- A, con características
de agonista parcial. (Rojas, 2002).

El proceso de extracción empleado permitió obtener una fracción que por c.c.f. contiene
alcaloides que no corresponden a atropina ni escopolamina. Esta fracción (36-37) en dosis de 2.0
mg/Kg., presenta un efecto ansiolítico, demostrado por el test de laberinto elevado en cruz; según
estudios anteriores en este efecto estaría involucrado el complejo receptor GABA- A
benzodiazepínico (Sánchez y col, 2001; Rojas, 2002).

Los resultados de la investigación son fundamentales en cuanto a desarrollar, por un lado, una
conciencia del rol ecológico de las especies en los sistemas naturales y, por otro lado, al uso
racional del recurso. Con la protección y/o conservación de una o más especies, no sólo se esta
protegiendo su valor florístico, sino también la biodiversidad y la fuente directa del producto.

Al considerar en el presente la utilidad de las plantas como posibles agentes de salud, su estudio
representa un desafío para el investigador que trata de interpretar la naturaleza mediante la
aplicación de metodologías modernas de análisis con el fin de buscar nuevos recursos
terapéuticos o emplear mejor los ya conocidos. Sin olvidar lo importante que seria evaluar los
posibles efectos nocivos en el uso de las plantas.
6. CONCLUSION

 El alcaloide mayoritario en hojas de Latua pubiflora es atropina.

 El segundo alcaloide mayoritario es escopolamina.

 Se identificaron los alcaloides minoritarios:

- apoatropina,

- tropina

- apoescopolamina

 Los alcaloides tropina y apoescopolamina, son identificados por primera vez en Latua
pubiflora.

 Los alcaloides minoritarios identificados, provienen de las fracciones 91-106 y 257-260,

ambas obtenidas del extracto clorofórmico 2, lo que indica, que el método de extracción
seguido para este extracto es el más adecuado para estudiar posteriormente los alcaloides
minoritarios de Latua pubiflora.

 Debido a la pequeña cantidad, en peso, obtenida de la fracción 257-260, no se pudo realizar

un estudio farmacológico de esta fracción; por lo que en una siguiente ocasión se debe utilizar
una mayor cantidad de planta, de la que se usó en esta vez, para poder tener una cantidad
suficiente que permita caracterizar farmacológicamente los compuestos aislados.

 Lp 251 aparece como un compuesto que le puede dar un nuevo valor a esta planta, por lo
tanto sería de interés tratar de aislarlo, para luego ser caracterizado por 1H-RMN y 13C-RMN.

 Del extracto acetato de etilo, se aisló e identificó la cumarina escopoletina.

 La fracción 36-37 en una dosis de 2.0 mg/Kg. y la fracción 203-206 a una dosis de 6.0mg/Kg.
son capaces de producir en ratones de la especie Mus musculus, cepa Rockefeller un efecto
sedante, lo que permite su utilización en el test de laberinto elevado en cruz.
 La fracción 36-37 en dosis de 2.0 mg/Kg., presenta un efecto ansiolítico, demostrado por el
test de laberinto elevado en cruz. Esta fracción al ser analizada por Espectroscopia de Masas
no evidenció la presencia de algún alcaloide, por lo que este efecto se puede atribuir a otro
compuesto aún no identificado, presente en la fracción.
7. ABREVIATURAS

c.c.f. : Cromatografía en capa fina

GABA : Acido gammaaminobutírico

HPLC : Cromatografía líquida de alta eficiencia (High Performance Liquid Chromatography)

5-HT1A : 5- hidroxitriptamina o serotonina

Hz : Hercio (seg -1 o ciclos por segundo)

J : Constante de acoplamiento, casi siempre en Hz

Kg. : Kilogramos

[M+] : Ion molecular

mg : Miligramos

MHz : Mega Hercios = 106 Hz

m/z : Relación masa / carga en espectrometría de masas

nm : Nanómetro (10-7)

pH : Medida de la acidez = - log  H+ 

ppm : Partes por millón

Rf : Relación frontal

SNC : Sistema nervioso central

UV : Ultravioleta
RMN-H1 : Resonancia magnética nuclear de protón.

RMN-C13: Resonancia magnética nuclear de protón.

8. GLOSARIO

Acetilcolina, sustancia neurotransmisora ampliamente distribuida en los tejidos corporales, cuya

función principal es mediar la actividad sináptica del sistema nervioso.

Alucinación, percepción sensorial, que puede afectar a cualquiera de los sentidos.

Alucinógeno, sustancia que provoca la excitación del sistema nervioso central, caracterizada por
la alucinación, cambios de humor, distorsión sensorial, despersonalización, aumento del pulso, de
la temperatura y de la presión arterial y dilatación de las pupilas.

Ansiedad, sentimiento de intranquilidad, desasosiego, agitación, incertidumbre y miedo, que

aparece al prever una situación de amenaza o de peligro.

Ansiolítico, es aquel fármaco que alivia o suprime el síntoma de ansiedad, sin producir sedación
o sueño.

Anticolinérgico, fármacos que inhiben los efectos de la acetilcolina

Antimuscarínico, son fármacos que inhiben de forma preferente y competitiva los receptores
colinérgicos muscarínicos.

Cromatografía, es un método analítico empleado ampliamente en la separación, identificación y

determinación de los componentes químicos en mezclas complejas.

Desplazamiento batocrómico, desplazamiento hacia longitudes de onda más largas.

Desplazamiento hipsocrómico, desplazamiento hacia longitudes de onda más cortas.

Eluyente, es un disolvente que se usa para hacer migrar los componentes de una mezcla a través
de una fase estacionaria.

Machis, médicos adivinos pertenecientes al pueblo mapuche

Narcótico, sustancia que produce insensibilidad, altera la percepción del dolor, induce euforia,
cambios de comportamiento y sueño profundo.

Tiempo de retención, es el tiempo que transcurre entre la inyección de una muestra y la

aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica.

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