Reporte Cinetica Enzimatica

PRACTICA NO.
7
CINETICA ENZIMATICA
Jose González1 (200731510), Cristian Gutierrez1 (201604014), Esteban Toño1 (201604170),

Rhydjard Montenegro1 (201604221), Helen Gaitán1 (201616850)
1
Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos
de Guatemala, Carrera de Química Biológica
INTRODUCCIÓN
Las reacciones químicas en los sistemas biológicos ocurren en presencia de catalizadores,
que son proteínas específicas denominadas enzimas, existen factores que pueden alterar la acción
de estas proteínas, tal como: temperatura, pH, concentración de sustrato y efecto inhibidor
(Koolman,2005). La fosfatasa alcalina es una enzima que está presente en los tejidos corporales,
principalmente en el epitelio intestinal y en osteoblastos, por lo que conocer su actividad enzimática
es importante para la detección de enfermedades (Arderiu, 1998). Su actividad se puede determinar
utilizando como sustrato al p-nitrofenilfosfato, que al ser hidrolizado origina p-nitrofenol, compuesto
coloreado que en solución alcalina absorbe luz en la zona visible del espectro (Izquierdo, 2004). Este
sustrato fue empleado en la práctica con el objetivo de conocer la cinética enzimática de la fosfatasa
alcalina, en donde se obtuvieron las absorbancias en una longitud de onda de 405 nm y la velocidad
de reacción, ambas se determinaron en relación con la concentración de sustrato.
METODOLOGÍA Gráfica 1. Curva de calibración de estándar de
La fosfatasa alcalina es una enzima p-nitrofenol.
que cataliza la hidrólisis del enlace éster
fosfórico en un grupo orgánico y un fosforilo a
pH alcalino (Richterich y Colombo, 1983). Se
determinaron lo datos cinéticos de la
fosfatasa alcalina sobre el sustrato p-
nitrofenilfosfato. Se realizó una curva de p-
nitrofenol (producto) para obtener la
ecuación de la recta; a partir de ésta obtener
las diferentes concentraciones de producto y
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en
a su vez analizar el efecto de la concentración
de sustrato en la actividad de la fosfatasa el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12,
alcalina, al aumentar la concentración de USAC.
sustrato aumenta la actividad de la enzima, *µg/mL= microgramos por mL de estándar.
hasta llegar a su máximo valor de velocidad *Rf= coeficiente de regresión lineal.
en el cual todo el enzima ha formado
complejo con su sustrato (Nelsony Cox, 2015).
En la Gráfica 1 se observa la curva de
La curva de calibración se obtuvo por medio
calibración del estándar de p-nitrofenol, la
de la espectrofotometría, este método mide
ecuación con una pendiente m = 0.1371 indica
la cantidad de luz que absorben las sustancias
el valor de linealidad de la recta, así mismo se
a una longitud de onda determinada (Skoog,
determinó estadísticamente el coeficiente de
Holler y Crouch, 2008).
regresión lineal R2 = 0.9989 que indica la
RESULTADOS
correlación entre la absorbancia de la muestra
(Eje Y) y la concentración* del p-nitrofenol
(Eje X).
Gráfica 2. Cinética enzimática de la fosfatasa

alcalina respecto a la velocidad (Vo) de
p-nitrofenol formado en una hora.
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en

el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12,
USAC.
*Constante de Michaelis-Menten.
En la Gráfica 3 se observa la curva de
transformación de Lineweaver-Burk. Se
Fuente: Datos experimentales, obtenidos en calcularon los parámetros cinéticos Vmáx. con
el Laboratorio de Bioquímica, Edificio T-12, un valor de 2.3 [p-nitrofenol] M/Hora y Km =
USAC. 1.1274. Se calculó la ecuación de la recta y el
*Molaridad: mmol/mL de p-nitrofenilfosfato. coeficiente de regresión lineal R2 = 0.8154 que
En la Gráfica 2 se observa la curva de indica la correlación entre el inverso de Vo
velocidad del p-nitrofenol formado por hora (Eje Y) y el inverso de p-nitrofenilfosfato (Eje
con un comportamiento logarítmico (Curva X).
punteada). En el Eje Y se muestra las
velocidades iniciales de reacción respecto al DISCUSIÓN
Eje X que muestra las concentraciones del
Los ensayos enzimáticos miden la
sustrato; la Vo máxima de la reacción se
velocidad con la que una enzima trabaja en un
asocia a una concentración del sustrato de determinado tiempo, por ello se recopiló en
0.0048M, cuyos valores fueron calculados las gráficas 2 y 3 la relación entre el tiempo
algebraicamente. que tarda una determinada cantidad de
sustrato [S] en transformarse en producto [P].
En esta práctica se determinó los datos
Gráfica 3. Representación de Lineweaber-
cinéticos de la fosfatasa alcalina del suero
Burk. Inversos de Vo enzimática Vs. Inversos humano, esta enzima tiene la ventaja de
de concentraciones de p-nitrofenilfosfato. actuar sobre diferentes sustratos, entre ellos
el p-nitrofenilfosfato que cambia de color
cuando son hidrolizados por la enzima,
pudiendo así ser determinado por
espectrofotometría (Plummer, 1998).
La gráfica 1 muestra la relación lineal de la

absorbancia y las concentraciones del p-
nitrofenol, esta curva de calibración se utilizó
para calcular la concentración de p-nitrofenol CONCLUSIONES
a partir de las absorbancias obtenidas,
determinando así que a medida que La enzima fosfatasa alcalina del
incrementa la absorbancia va aumentando la suero humano, puede actuar sobre varios
concentración concluyendo que obedece la sustratos, al actuar sobre el p-
ley de beer-lambert. nitrofenilfosfato cambia de coloración
cuando es hidrolizado por dicha enzima.
En la gráfica 2 se observó cómo al aumentar el
tiempo la concentración del producto (p-
nitrofenol) también aumenta, esto debido a
que la relación es directamente proporcional A medida de que se aumentó la
ya que a medida que la concentración del concentración del p-nitrofenol, se observó
sustrato se agrega mayor cantidad de p- que tiene una relación con la absorbancia ya
nitrofenil fosfato produce provocando así una que también aumentó al momento de
mayor velocidad de producción. vez que la medirla.
reacción deja de seguir la linealidad se Se ha demostrado que si la
produce una meseta la cual se debe al concentración de la enzima se mantiene
decremento de la concentración del sustrato constante la concentración del sustrato
desnaturalizando e incluso inhibiendo incrementa gradualmente, por lo tanto la
(Lehninger, 2015). velocidad de la reacción incrementa hasta
Se ha demostrado experimentalmente que si llegar a un máximo, posteriormente la
la concentración de la enzima es mantenida enzima-sustrato sigue una cinética de
constante y la concentración del sustrato es saturación.
incrementado gradualmente, la velocidad de
la reacción incrementara hasta que alcance un REFERENCIAS
máximo, después de este punto los
incrementos en la concentración enzima- Arderiu, F. (1998). Bioquímica clínica y
sustrato es 1:1 por lo cual la enzima sigue una patología molecular. Barcelona España:
cinética de saturación descrita por la ecuación Reverté
de Michaelis-Menten. El Km es un factor que Bowes, G. & Comb, R. (1988).
indica la afinidad de la enzima por su sustrato Measurement of total alkaline phosphatase
y mientras más pequeño sea su valor hay mas activity in human serum. Clin.Chem.
afinidad de la enzima por el sustrato. En la Izquierdo, F. (2004). Cinética de las
gráfica 3 se observó que la fosfatasa alcalina reacciones químicas. Barcelona: Universidad
no está llevando a cabo su reacción normal de Barcelona E.
catalítica por lo tanto su Km se ve aumentado Koolman, J. (2005). Bioquímica: Texto
por lo que indica que la afinidad entre el y atlas. Buenos Aires Argentina:
complejo enzima es débil. Determinando así Panamericana
una baja pureza de la enzima esta Nelson, D., y Cox, M. (2015).
disminución de afinidad es debida a que el Lehninger: Principios de bioquímica.
paciente presenta una mala alimentacion Barcelona: OMEGA.
debido a que consumen muy poco contenido Plummer, D. (1981). Introducción a la
de zinc y proteínas (Arderiu, 1998). Bioquímica práctica. Colombia: McGraw Hill,
latinoamericana.
Richterich, R. y Colombo, J. (1983). Figura 1. Representación de V en función de
Química clínica: teoría, práctica e [S], para enzima que obedece la cinética de
interpretación. España: Salvat Michaelis-Menten.
Skoog, D., Holler, F. y Crouch, S.
(2008). Principios de Análisis Instrumental.
(6ta Ed.). México: Cengage Learning
ANEXOS
Fuente: Cinetica Enzimatica:

valoracion de fosfata alcalina. (s.f.)
recuperado de :
http://www3.uah.es/bioquimica/San
cho/farmacia/practicas/fosfatasa.pdf

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