BIOTECNOLOGÍA

Guía de Trabajos Prácticos

Ingeniería Química

Universidad Tecnológica Nacional

Facultad Regional Córdoba

Dra. Ing. María José Pascualone

Ing. Natalí Balcaza Pizzi
 Biotecnología – Trabajos Prácticos

Fórmulas útiles para la resolución de problemas

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Ecuación de Michaelis-Menten Vmax . [S]

v=
Km + [S]

Linealización de Lineweaver-Burk 1 Km 1 1
= +
v Vmax [S] Vmax

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite

identificar el Km y Vmax; el punto de corte con el eje de
ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el
de abscisas es el valor de -1/Km.

Inhibición competitiva: el valor de Km aumenta en [I]

Ki =
presencia de inhibidor. Vmax no se ve afectada. Km′
Km − 1

Inhibición no competitiva: sólo se verá afectada Vmax, [I]

Ki =
la cual disminuye a mayor concentración de inhibidor. Vmax
−1
Vmax ′

Donde [S]: concentración del sustrato.

[I]: concentración del inhibidor.
Ki (constante de disociación para el complejo enzima-inhibidor).
Km; Vmax: constante de Michaelis y velocidad máxima de la reacción sin inhibidor.
Km’; Vmax’: constante de Michaelis y velocidad máxima de reacción con inhibidor.

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CULTIVO DE MICROORGANISMOS (BATCH)

t Donde:
n=
td n: número de duplicaciones en el tiempo t.
X t = X o . 2n td: tiempo de duplicación.
Xo; Xt: densidad celular inicial y final.
0,693 µ: velocidad específica de crecimiento.
𝜇=
𝑡𝑑 Yx/s: rendimiento de sustrato en biomasa.
2,303. (log X t − log X o ) = μ. t

∆𝑋
𝑌𝑥/𝑠 =
∆𝑆

BIOREACTORES/CULTIVO CONTINUO

Ks. D Donde:
S= So; S: concentración de sustrato a la entrada y salida.
μmax − D
KS: constante de Monod.
X = Yx/s . (So − S) µmax: velocidad específica de crecimiento máxima.
X: concentración celular a la salida.
Px = D. X Yx/s: rendimiento de sustrato en biomasa.

So Px: productividad celular.

Dc = μmax .
K s + So D: velocidad de dilución (F/V).
Dc: velocidad crítica de dilución.
1
Ks 2 Dm: velocidad de dilución que da la productividad máxima.
Dm = Dc . [1 − ( ) ]
Ks + S

ESTERILIZACIÓN

t = n. D Donde:
t: tiempo de esterilización.
n: número de reducciones decimales.
T −T
( 2 1)
D1 = D2 . 10 z D: tiempo de reducción decimal.
z: parámetro de letalidad térmica.
T: temperatura de esterilización.

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Trabajos Prácticos Áulicos

❖ CINÉTICA ENZIMÁTICA
1) De acuerdo a los siguientes datos, representar las curvas de Michaelis-Menten.

Curva N° Km (mM) Vmax (µmol/seg)

1 1,0 50
2 2,0 50
3 5,0 50

a) ¿Cuál de las enzimas llega más fácilmente a la saturación?

b) ¿Cuál de las enzimas es más rápida a concentraciones saturantes?
c) Calcular el valor de v cuando [S] = 10 mM para cada una de las enzimas.

2) Repetir el ejercicio anterior, con los siguientes valores.

Curva N° Km (mM) Vmax (µmol/seg)

1 1,0 10
2 1,0 8
3 1,0 6

3) Repetir el ejercicio anterior, con los siguientes valores.

Curva N° Km (mM) Vmax (µmol/seg)

1 1,5 20
2 2,8 14
3 3,3 14

4) La hidrólisis de N-glutaril-L-fenilalanina-p-nitroanilida (GPNA) para dar p-nitroanilina y N-glutaril-L-

fenilalanina, está catalizada por la enzima -quimotripsina. En determinadas condiciones de pH y
temperatura, los datos cinéticos obtenidos han sido los siguientes. Asumiendo una cinética de tipo
Michaelis-Menten, calcular gráficamente el valor de Vmax y Km.

[GPNA] (mM) 2,5 5,0 10,0 15,0

v (mmol/L.min) 2,11 3,73 5,90 7,10

5) La fumarasa cataliza la reacción de hidratación que transforma el fumarato en L-malato. Cuando se

utilizó como sustrato el fumarato, una concentración de enzima de 2x106 M y se midió la velocidad
inicial de la reacción de hidratación a pH 5,7 y a 25 °C se obtuvieron los siguientes datos. Calcular Km
y Vmax mediante la representación gráfica de Lineweaver-Burk.

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[fumarato] (mM) 2,0 3,3 5,0 10,0

v (mmol/L.min) 2,5 3,1 3,6 4,2

6) Teniendo en cuenta la reacción anterior, se midió la velocidad inicial de hidratación, expresada como
milimoles por litro de fumarato hidratados por minuto, en función del pH para distintas concentraciones
de sustrato, y se obtuvieron los siguientes datos:

Concentración de sustrato
pH
10 mM 5 mM 2,5 mM 1,25 mM
5 0,92 0,81 0,66 0,48
6 4,00 3,28 2,42 1,60
7 5,40 4,30 3,08 1,96
8 2,67 2,40 1,99 1,53
9 0,21 0,19 0,16 0,12

Por otra parte, la velocidad máxima inicial de la deshidratación del L-malato catalizada por la fumarasa
tiene la siguiente dependencia de pH:

pH 5 6 7 8 9
Vmax (mmol/L.min) 0,068 0,44 3,0 5,68 2,0

a) Calcular el valor de Km y Vmax de la reacción de hidratación para cada valor de pH.

b) Los valores máximos de las velocidades de las reacciones directas e indirectas, ¿alcanzan el
mismo pH?

7) La penicilina es hidrolizada y con ello inactivada por la penicilasa, una enzima presente en bacterias
resistentes a la penicilina. La cantidad de penicilina hidrolizada en un minuto en una disolución de 10 ml
que contiene 10-9 g de penicilasa purificada se midió como función de la concentración de penicilina.
Representar 1/v frente a 1/S a partir de los siguientes datos.
¿Sigue la penicilasa una cinética de Michaelis-Menten? Si es así, determine Vmax y Km.

[penicilina] 10-5 M 10-9 moles hidrolizados/min

0,1 0,11
0,3 0,25
0,5 0,34
1 0,45
3 0,58
5 0,61

8) Se obtuvieron los siguientes datos de velocidad para una reacción catalizada por un enzima en presencia
y ausencia de un inhibidor cuya concentración fue 2 mM. Determinar qué tipo de inhibición se produce,
calcular Km, Vmax, Ki y gráfique los datos por Michaelis-Menten.

[sustrato] (mM) 2 4 8 12 16

v I = 0 mM 1,37 2,13 2,95 3,38 3,65

(µmol/min) I = 2 mM 1,18 1,89 2,72 3,18 3,47

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9) Se estudia la cinética de una enzima en ausencia y presencia de un inhibidor, a una concentración 10

mM. La velocidad inicial viene dada en función de la concentración de sustrato. Los datos obtenidos
se presentan en la sig tabla. Determine Vmax, Km y Ki. ¿Qué tipo de inhibición se produce?

[sustrato] (mM) 1,25 1,67 2,50 5,00 10,00

v Sin inhibidor 1,72 2,04 2,63 3,33 4,17

(µmol/min) Con inhibidor 0,98 1,17 1,47 1,96 2,38

10) El salicilato inhibe la acción catalítica de la glutamato deshidrogenasa. Determinar el tipo de

inhibición mediante el análisis gráfico de los siguientes datos. Suponer que la concentración de
salicilato se mantiene constante y es de 40 mM. Calcule Vmax, Km y Ki.

[sustrato] (mM) 1,5 2,0 3,0 4,0 8,0 16,0

v Sin inhibidor 0,21 0,25 0,28 0,33 0,44 0,40

(mg/min) Con inhibidor 0,08 0,10 0,12 0,13 0,16 0,18

11) A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar el tipo de inhibición, V max,
Km y Ki.

[sustrato] (mM) 2,0 3,0 4,0 10,0 15,0

I = 0 mM 139 179 213 313 370
v (g/h)
I = 6 mM 88 121 149 257 313

❖ CULTIVO DE MICROORGANISMOS (BATCH)

12) Si partimos de 104 UFC/ml en un cultivo que tiene un tiempo de generación de 2 h, ¿cuántas células
cultivables tendremos al cabo de 4, 24 y 48 h de cultivo?

13) ¿Cuál es el tiempo de generación de un cultivo que tiene una velocidad específica de crecimiento µ de
0,01 min-1?

14) Si se quiere conseguir que un cultivo crezca hasta una densidad celular de 108 células/ml en 3 h, y el
tiempo de generación es de 30 min., ¿cuál debe ser la densidad celular al comienzo del cultivo?

15) Se tiene un cultivo de densidad 108 células/ml, con un tiempo de generación de 30 min. Si la densidad
inicial fue de 106 células/ml, ¿qué tiempo de incubación ha sido necesario para alcanzar la densidad final
mencionada?

16) Supongamos un cultivo en fase exponencial que en un momento dado tiene 10.000 células/ml y cuatro
horas más tarde 100.000.000 células/ml. Calcular µ y td (tiempo de duplicación).

17) Los datos de la fase exponencial de crecimiento de tres especies bacterianas que utilizan glucosa como
fuente de carbono son los siguientes. Indique cuál de las tres especies crecerá más rápidamente. Calcule
µ y td.

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Especie A Especie B Especie C

Tiempo (h) log X Tiempo (h) log X Tiempo (h) log X
4 4,64 3 5,30 5 6,22
7 5,15 7 5,86 8 6,67

18) En una comida campestre se contaminó la paella con 46 células de Propionibacterium acnes. Si P.
acnes tiene un tiempo de generación de 90 minutos y una fase de latencia (fase lag) de 1,5 h ¿cuántas
células de esta bacteria estarán presentes en la paella al cabo de 10 h?

19) Un carnicero, portador asintomático de Salmonella, picó carne sin proteger sus manos con guantes. La
carne picada se contaminó con 25 células de Salmonella spp. y con 32 células de S. entérica. Sabiendo
que Salmonella spp. tiene un tiempo de generación de 30 minutos y una fase de latencia de 3 h y que la
µ de S. entérica en la carne es 0,17 h-1 y la duración de su fase de latencia 5 h, calcule el número de
células del género Salmonella que habrá en la carne 10 h después de ser picada.

20) Se produce un vertido de aguas residuales urbanas en una playa. La densidad de E. coli y de
Enterococcus faecalis en las aguas residuales es de 7,8.1010 y 6,2.109 células/100 ml, respectivamente.
El factor de dilución del vertido al incorporarse a la playa es de 1/1000. Dado que la concentración de
nutrientes en la playa es baja, el crecimiento de ambos microorganismos está ralentizado. El tiempo de
generación de E. coli es de 3 horas mientras que la µ de Ent. faecalis es 0,11 h-1. Con los datos que se
indican ¿podría indicar cuál será el número de células por mililitro, de cada una de estas bacterias, en el
agua de la playa 24 horas después del vertido?

21) Se inocula un reactor con Lactobacillus acidophilus en una concentración inicial de 2 g/L. Considerando
que la bacteria tiene un tiempo de duplicación de 64 min y que la fase exponencial no termina, calcule:
μ, el tiempo que tarda el cultivo en alcanzar una concentración de biomasa de 20 g/L y el número de
generaciones (n).

22) Calcular el rendimiento de producción de biomasa por gramo de carbono consumido de un cultivo que
produce 20 g/L de células cuando utiliza como única fuente de carbono una solución de glucosa al 10%
(p/v).

23) Se desean producir 200 kg de biomasa de Saccharomyces cerevisiae. Considerando que el rendimiento
celular de la levadura es de 0,45 y considerando que consume el 100% del sustrato, estime la cantidad
de glucosa que debe adicionar al cultivo.

❖ BIOREACTORES/CULTIVO CONTINUO
24) Una cepa de Pseudomonas aeruginosa, con µmax = 0,693 h-1 y Ks = 5 mg/L, se propaga en un
quimiostato simple, operado con un flujo de alimentación de 0,1 L/h de una solución de glucosa 100 g/L
(sustrato limitante) y con un volumen operativo de 10 L. Se estimó que el rendimiento del nutriente en
células es 0,45 g cél/g glucosa. Determinar: a) la concentración de la biomasa en el efluente; b) la
concentración de glucosa residual, y c) la productividad volumétrica.

25) Un cultivo continuo de una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de amilasa, cuyo µmax = 0,92 h-1,
con Yx/s y Ks para la glucosa de 0,48 g cél/g sustrato y 4 mg/L respectivamente, se opera limitado en
glucosa con una concentración en el flujo de alimentación de 100 g/L, a un caudal de 0,1 L/h, el
volumen del fermentador es de 10 L.

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a) ¿Qué concentración de biomasa tendrá el efluente en el estado estacionario?

b) ¿A qué concentración de glucosa estarán sometidas las células?

26) Estudios realizados en el laboratorio mostraron que, en cultivo continuo, Azotobacter presenta una µmax
= 0,45 h-1 y un Ks de 28 mg/L. Si se opera un biorreactor de 50 L, con una velocidad de dilución de 0,32
h-1; Yx/s = 0,36 g cél/g sustrato y una concentración de sustrato en la alimentación de 5 g/L; determinar:
a) la concentración celular en estado estacionario.
b) la concentración de sustrato limitante en el efluente.

27) Una nueva cepa de levadura está siendo considerada para la producción de biomasa. La prueba se
realizó en un biorreactor de una etapa, obteniéndose los siguientes datos.

D [h-1] S [mg/L] X [mg/L]

0,1 16,7 366
0,2 33,5 407
0,3 59,4 408
0,4 101 404
0,5 169 371
0,6 298 299
0,7 702 59

La concentración de sustrato en la entrada del biorreactor es de 800 mg/L, operándose con exceso de
oxígeno, pH de 5,5 y una temperatura de 35 °C. Usando los datos de la tabla, estime:
a) Valores de µmax y Ks.
b) ¿Cuál es la D que maximiza la productividad celular? Compare valor teórico y gráfico.

28) Los datos de la tabla fueron obtenidos en la oxidación de pesticidas presentes en un agua residual
mediante una mezcla de microorganismos en una operación continua tipo quimiostato. Se considera el
pesticida como el reactivo limitante. Si usted tiene un residuo líquido a tratar de 0,5 m3/s que contiene
500 mg/L de pesticida y requiere reducir la concentración de éste en un 95%.
a) ¿Cuál debería ser la velocidad de dilución y el volumen de la laguna de aireación?
b) ¿Cuál es la masa microbiana [Ton] producida por día de operación? Considere que YX/S de 0,6 g cél/g
sustrato.
D [h-1] S [mg/L]
0,08 15
0,11 25
0,24 50
0,39 100
0,52 140
0,70 180
0,82 240

29) La bacteria Pseudomona sp. tiene una µmax de 0,4 h-1 cuando es cultivada en acetato. El valor de Ks es
1,3 g/L y YX/S es 0,46 g cél/ g acetato. Si se opera el sistema como un quimiostato, con un S0 de 38 g/L,
realice el siguiente análisis:
a) ¿Cuál es la tasa de dilución crítica?
b) ¿Cuál es la concentración de células cuando la D es la mitad de la crítica?

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c) ¿Cuál es la concentración de sustrato cuando la D es un 80% de la crítica?

d) ¿Cuál es la productividad celular a la D en c)?
e) Encuentre Dópt para la productividad celular, ¿qué porcentaje de Dcrítico es éste?

30) Un biorreactor continuo se opera con un volumen de trabajo de 120 L y un flujo de alimentación de 20
L/h. La población bacteriana presenta un tiempo de duplicación mínimo de 3,15 h y un Ks de 1 g/L. El
rendimiento YX/S se ha estimado en 0,28 g cél/g sustrato. Ensayos preliminares hacen recomendable
trabajar a una velocidad de dilución igual al 82% del valor crítico. Determine:
a) µmax.
b) ¿Cuál es la concentración de sustrato en la alimentación?
c) ¿Cuál es la concentración de sustrato en la descarga?
d) ¿Cuál es la concentración celular en estado estacionario?
e) ¿Cómo cambian las respuestas b) y c) si el flujo de alimentación se disminuye a 15 L/h?

❖ AIREACIÓN
31) En un cultivo de Klebsiella pneumoniae, cuyo tiempo medio de duplicación a 30 °C en un medio con
glucosa y sales es 0,9 h, se desea saber a qué concentración celular comenzará a limitarse el crecimiento
por la transferencia de oxígeno. Se ha verificado que se consumen 0,65 g de oxígeno para generar cada
gramo de biomasa. El valor de kLa es de 360 h-1, la solubilidad de oxígeno a saturación en las
condiciones dadas es 95% de la solubilidad en agua destilada y la concentración de oxígeno disuelto que
se considera limitante del estado fisiológico para esta cepa es 10% del valor de saturación.

32) El requerimiento de oxígeno de una población microbiana se caracteriza por los sig. parámetros: µmax =
0,13 h-1; Ko = 0,1 mg O2/L; Yx/o = 0,22 mg PS/mg O2; C* = 0,33 mg/L. La concentración requerida de
células es de 9,5 g/L y la concentración de saturación de oxígeno en el medio de 6,75 mg/L.
a) ¿Cuál es el kLa necesario para que el cultivo no esté limitado?
b) Gracias al agregado de oxígeno puro en aireación la concentración de saturación de oxígeno disuelto
sube a 22,5 mg/L. ¿Cuál será el kLa necesario para obtener la misma cantidad de biomasa? Si en cambio
el kLa se mantiene constante ¿cuál será la biomasa máxima que se podrá obtener?

❖ TRANSFERENCIA DE CALOR
33) Se desarrolla Saccharomyces cerevisiae anaeróbicamente en un cultivo continuo a 30 ºC. Como fuente
de carbono se usa glucosa (36 kg/h) y como fuente de nitrógeno amoníaco (0,4 kg/h). Se produce una
mezcla de glicerol (7,94 kg/h) y etanol (11,9 kg/h) que salen del fermentador junto con 2,81 kg/h de
células y 0,15 kg/h de agua. Además 13,6 kg/h de CO2 abandonan el fermentador en forma de corriente
gaseosa. Calcule la refrigeración necesaria para el proceso.
Datos: Calores de combustión (kJ/mol): Glucosa = -2805; NH3 = -382,6; Glicerol = -1655,4; Etanol = -
1366,8.
Reacción: Glucosa + NH3 → Biomasa + Glicerol + Etanol + CO2 + H2O

34) En un caso de fermentación aeróbica, se utiliza un cultivo sumergido de Aspergillus niger en un

biorreactor batch que opera a 30 ºC. En dos días: se evaporan 100 kg de agua, se consumen 2500 kg de
glucosa, 860 kg de O2 y se producen 1500 kg de ácido cítrico, 500 kg de biomasa y otros productos.
Como fuente de nitrógeno se usa amoníaco. La potencia suministrada para la agitación del caldo es de
15 kW. Calcule la cantidad de calor que debe eliminarse del fermentador para mantener constante la
temperatura del mismo. Dato: ΔH (agua, 30 ºC) = 2430,7 kJ/kg.
Reacción: Glucosa + O2 + NH3 → Biomasa + ácido cítrico + CO2 + H2O

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35) Se investiga la Azotobacter vinelandii para la producción bacteriana de alginato a partir de sacarosa. En
un biorreactor que opera en continuo, que se encuentra a 28 °C y que utiliza amoníaco como fuente de
nitrógeno, el rendimiento de alginato es de 4 g/g de oxígeno consumido. Se plantea producir alginato a
una velocidad de 5 kg/h. Dado que la viscosidad del alginato en solución acuosa es considerable, la
energía necesaria para la mezcla del caldo no puede despreciarse. El biorreactor está equipado con una
turbina de disco de hoja plana; en condiciones adecuadas de velocidad de mezcla y caudal de aire, se
estima que la potencia requerida es de 1,5 kW. Calcular las necesidades de refrigeración.

36) Se prueban diferentes especies bacterianas para la producción a escala comercial de ácido propiónico.
Éste y otros ácidos se sintetizan en cultivos anaerobios utilizando sacarosa como sustrato y amoníaco
como fuente de nitrógeno. Los rendimientos globales obtenidos a partir de la glucosa son los siguientes:
Ácido propiónico 40% (g/g)
Ácido acético 20%
Ácido butírico 5%
Ácido láctico 3,4%
Biomasa 12%

Si se inocula la bacteria a un biorreactor que contiene sacarosa y amoníaco, de manera que se consume
un total de 30 kg de sacarosa durante un período de 10 días. ¿Cuáles son las necesidades de
refrigeración?

❖ ESTERILIZACIÓN
37) Se desea esterilizar un medio de cultivo con el objetivo de lograr 12 reducciones decimales de una
variedad de Clostridium cuyo z = 6,7 °C y D121 = 0,26 min.
a) ¿Es suficiente un tiempo de tratamiento de 10 min a 121 °C?
b) ¿Qué tiempo se necesitaría si el tratamiento se realiza a 115 °C?

38) Se desea esterilizar un alimento envasado con el objetivo de lograr 17 reducciones decimales de una
especie patógena cuyo z = 8,4 °C y D121 = 0,31 min.
a) ¿Es suficiente un tiempo de tratamiento de 5 min a 121 °C?
b) ¿Es suficiente un tiempo de tratamiento de 8 min a 115 °C?
c) ¿Qué cantidad de sobrevivientes quedarán después del tratamiento a 115 °C durante 8 min?

39) Se pretende conseguir la destrucción térmica de las esporas de Clostridium botulinum en un caldo de
cultivo. Para dicho microorganismo se conoce que D105 = 8,60 min y D117 = 0,54 min.
a) ¿Cuál será el valor de z?
b) ¿Qué tiempo de tratamiento a 120 °C se necesita para lograr 12 reducciones decimales?
c) Si el caldo contiene una población inicial de 1012 esporas, ¿cuántos sobrevivientes quedarán después
de la aplicación de un tratamiento a 105 °C durante 1 hora?

40) Calcule el número de reducciones decimales que se obtienen con una esterilización de 4 min a 121 °C
para tres especies de organismos patógenos, sabiendo que:
Especie A: D121 = 0,21 min.
Especie B: D115 = 4,19 min; z = 6,5 °C.
Especie C: D100 = 53 min; z = 14,8 °C.

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Trabajos Prácticos de Laboratorio

❖ EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL

Uno de los objetivos principales de la biotecnología moderna es lograr que una célula realice una tarea
específica y útil, de manera predecible y controlable.
Los científicos que trabajan en el desarrollo de productos biotecnológicos emplean técnicas específicas que
permiten estudiar biomoléculas, en particular ADN, ARN y proteínas, para transferir genes de un organismo a
otro y construir fragmentos de ADN recombinante. Así, es posible no sólo obtener las proteínas recombinantes
de interés sino también mejorar cultivos y animales.
Una vez que se determina que el organismo donante posee un gen que codifica para la característica de
interés, se debe “clonar” el gen. Significa tenerlo puro en el tubo de ensayos, o mejor aún, dentro de un vector
(una molécula mayor de ADN que permite guardar fragmentos de ADN en forma estable y práctica por más
tiempo). La tarea de clonar involucra la técnica de extracción de ADN que consiste en romper las células para
liberar su contenido y separar el ADN liberado del resto de los componentes celulares.
En el presente práctico se extraerá ADN vegetal, luego de un tratamiento con detergente, sal de mesa y
bicarbonato de sodio. El detergente disuelve los lípidos y las proteínas de la membrana celular, rompiendo las
uniones que mantienen la integridad de la misma y se libera el contenido celular. Luego, el detergente forma
complejos con los lípidos y las proteínas, permitiendo que los mismos sean separados del ADN por filtración, y
así se libera el ADN. La sal permite que el ADN precipite en una solución fría de alcohol y que las cadenas de
ADN no se corten. El bicarbonato de sodio actúa como solución buffer.

MATERIALES:
▪ 1 tomate o cebolla o repollo blanco.
▪ agua destilada
▪ sal fina (NaCl)
▪ bicarbonato de sodio (NaHCO3)
▪ detergente
▪ colador de té
▪ alcohol etílico frio

PROCEDIMIENTO:
1. Con licuadora o minipimer procesar el vegetal con 200 ml de agua fría. Colar para retirar restos de pulpa,
piel, semillas.
2. Por otra parte, preparar el tampón de lisis: 250 ml de agua destilada, 2 cditas de NaCl, 6 cditas de NaCO3
y 2 chorros de detergente.
3. Mezclar 10 ml de muestra con 20 ml de tampón de lisis. Agitar vigorosamente durante 2 minutos.
4. Nuevamente colar y colocar 5 ml del filtrado en un tubo de ensayo.
5. Agregar 10 ml de alcohol frío (paso previo por baño de hielo). El ADN no es soluble en alcohol. Cuando
se agrega a la mezcla, los componentes, excepto el ADN, permanecen en la solución mientras el ADN
precipita en la capa de alcohol.

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❖ INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

Las técnicas de inmovilización se aplican tanto a las células como a los microorganismos y las enzimas.
Consiste en la localización de un biocatalizador en una región definida del espacio, para dar lugar a formas
insolubles con retención de la actividad catalítica y/o de la viabilidad y permitiendo su reutilización.
La técnica de inmovilización en alginato de sodio es relativamente simple. Se disuelve el alginato de sodio en
un poco de agua caliente, se mezcla bien y cuando ya está frío se agregan las levaduras. Se deja caer la mezcla
final, gota a gota, en una solución de cloruro de calcio. Con el intercambio de iones calcio (del medio) y sodio
(del alginato) se forma una matriz de alginato de calcio que retiene las levaduras.
A pesar de tener consistencia sólida, dicha matriz permite la circulación de sustancias, de modo que los
agentes biológicos conservan su actividad metabólica. Una vez finalizadas las reacciones químicas esperadas, las
bolitas de alginato y la levadura se recuperan fácilmente.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Balanza Agua destilada
Mechero Bunsen, trípode y malla metálica 1 g de alginato de sodio
2 vasos de precipitados de 100 ml 2,5 g de fermento biológico seco instantáneo
1 probeta de 50 ml 500 ml de solución de cloruro de calcio 2 %
Varilla de vidrio Solución de sacarosa 10 %
Jeringas de 10 ml (sin agujas)
1 vaso de precipitados de 500 ml
1 colador

PROCEDIMIENTO:

1. Disolver el alginato de sodio.

2. Disolver la levadura.

3. Mezclar bien las dos soluciones y distribuirlas en las jeringas.

4. Inmovilización: dejar caer, gota a gota, la mezcla de alginato de sodio y
levaduras en la solución de cloruro de calcio. Agitar suavemente durante el
procedimiento.

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 Biotecnología – Trabajos Prácticos

Conservar las esferas de alginato de calcio con las levaduras inmovilizadas en solución de cloruro de calcio
2%. Esperar 24 horas antes de iniciar la primera fermentación.
5. Para el primer uso de las levaduras inmovilizadas: separar las esferas con un colador y luego de lavarlas con
agua destilada, allí estarán aptas para la fermentación.
6. Recuperación y acondicionamiento: concluida la fermentación, colar nuevamente las esferas y lavarlas con
agua destilada. Conservar las levaduras inmovilizadas en la heladera, en una solución de cloruro de calcio
2%.

❖ FERMENTACIÓN CON LEVADURAS

El uso de microorganismos para la obtención de alimentos es una de las aplicaciones más antiguas de la
biotecnología. Bacterias y levaduras son esenciales para la producción de muchos alimentos tales como el vino,
la cerveza, panificados, productos lácteos, entre otros, que son creados a partir de la fermentación. La levadura
más conocida y utilizada para la mayoría de los procesos fermentativos es Saccharomyces cerevisiae. En esta
actividad se podrá comprobar la producción de un producto gaseoso como resultado de la actividad metabólica
de las levaduras. Teniendo en cuenta que se trata de un proceso anaerobio, se puede concluir que el gas
desprendido es dióxido de carbono.

MATERIALES:
▪ 4 Tubos de ensayo
▪ Agua
▪ Azúcar
▪ Levadura seca en gránulos e inmovilizada
▪ Baño de hielo
▪ Baño de agua tibia (30°C)
▪ Globitos de goma (“bombitas”)

PROCEDIMIENTO:
➢ Tomar 2 tubos de ensayos, añadir en c/u 5 mL de agua, 1 cda. de azúcar y homogeneizar agitando
suavemente. Luego, agregar 1 cdita. de la levadura seca, y tapar bien cada tubo con un globo. Agitar
bien y colocar uno de ellos en un baño de agua tibia, y el otro en un baño de agua fría.
➢ Repetir el mismo procedimiento reemplazando la levadura seca por 2 cditas de las esferas de
levadura inmovilizada.

El objetivo es que se pueda comprobar la producción de gas observando la presencia de burbujas en el tubo y
el globito se infla levemente.

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