7 Cinética Enzimática

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
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FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS
CARRERA: BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: BIOQUÍMICA APLICADA
LABORATORIO N°7
CINÉTICA ENZIMÁTICA
A. OBJETIVOS
a) Obtener los valores de velocidad máxima y constante de Michaelis y Menten a partir de resultados
experimentales
b) Comprender los el mecanismo enzimático mediante el modelo de Michaelis y Menten
c) Transformar la gráfica del modelo de Michaelis y Menten en gráficas lineales
B. FUNDAMENTO TEÓRICO
a) Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia
la
velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Estos
estudios proporcionan
información
directa acerca del mecanismo
de la
reacción catalítica y de la
especificidad
de la enzima.
La velocidad de una reacción
catalizada por un enzima puede
medirse con relativa facilidad, ya que
en muchos casos no es necesario
purificar o aislar la enzima. La medida
se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se
utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición
de los productos o la desaparición de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se
obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida
que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reacción. La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la
curva de avance a tiempo cero.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la
velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Cuando [S]0 es pequeña,
la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción
es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturado por el sustrato, y la velocidad ya no
depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).
b) Modelo cinético de Michaelis y Menten
Michaelis-Menten propusieron un modelo general bioquímico que explica la mayoría de reacciones
enzimáticas. Para iniciar el desarrollo del modelo se plantearon que estas se dan en dos etapas; en la
primera ocurre la formación del complejo enzima-sustrato en una combinación reversible, y en la
segunda
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este complejo se rompe con el fin de formar el producto y, por ende, liberar la
enzima libre. La reacción se muestra a continuación:
El modelo propuesto por Michaelis-Menten solo es válido bajo dos condiciones: cuando la concentración
del sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y cuando el proceso se encuentre en estado
estacionario, es decir, cuando la concentración del complejo enzima-sustrato es constante. La ecuación
de Michaelis-Menten que describe la variación de la velocidad de reacción con respecto a la
concentración del sustrato es:
Observaciones experimentales
• A bajas [S], v 0 incrementa linealmente mientras [S] aumenta.
• A mayores [S], los incrementos de v 0 se hacen menores mientras [S] aumenta. •
Después de una cierta [S], v0 ya no aumenta, alcanzando un máximo Vmax.
c) Cálculo de la Km y de la Vmáx de un enzima

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola La
Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la
concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

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d) Importancia de Km
• Km es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la
mitad de la velocidad máxima. En efecto, si Km = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v =
Vmax/2. • El valor de Km da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad
del enzima por el sustrato (predomina la forma ES), y a mayor KM, menor afinidad (predominan las
formas E y S libres).
• La Km del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo
enzima tienen distinta KM, el que presente mayor KM tiene menor afinidad por el enzima, y la
reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor KM, salvo a
concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = Vmax.
• Los valores de Km de muchas enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus
sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la
velocidad de toda una ruta metabólica.
e) Representaciones lineales de la gráfica de Michaelis y Menten
1. Cinética de Briggs-Haldane
2. Linealización de Lineweaver-Burk
Experimentalmente el valor de Vmax puede no llegar a obtenerse porque la enzima no se haya saturado
completamente. La ecuación de Michaelis-Menten puede expresarse algebraicamente de otras formas
tales que permitan una práctica determinación de los parámetros cinéticos Km y Vmax.
Para determinar gráficamente los valores de Km y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble
recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el
nombre de representación de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cual:
• La pendiente es KM/Vmax
• La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
• La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax
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3. Linealización de Eadie-Hofstee
Es otra técnica similar a la de Lineweaver-Burk para determinar Km y Vmax. El principal problema de
este método es que tanto la variable dependiente como la independiente dependen de v0 y que un error
experimental afectaría a ambos ejes.
4. Linealización de Hanes-Woolf
Se emplea como herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima. En él se
representa la relación concentración de sustrato/velocidad de reacción frente a la concentración de
sustrato [S].
C. PROCEDIMIENTO
a) Regresión no lineal por mínimos cuadrados aplicada a la cinética de Michaelis y Menten 1. Ingresar
al link http://biomodel.uah.es/metab/enzimas/MM-regresion.htm donde se tiene la siguiente interfase:
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2. En formato de datos seleccionar “una [S], una v”
3. En el recuadro de la derecha llenar los datos proporcionados por la docente.
Los datos de concentración de sustrato se anotan primero y se utiliza punto como separador de
decimales (Ej. 2.54).
Una vez anotada la concentración de sustrato, poner coma, añadir un espacio y anotar la velocidad
utilizando punto como separador de decimales
4. Apretar el botón “Mostrar en la gráfica”. De ese modo aparecen los valores de Vmáx y Km
5. Presionar el botón “Cálculo” hasta que los valores de Vmáx y Km dejen de variar 6.
Guardar los resultados de Vmáx y Km
7. Guardar la fotografía del gráfico
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b) Modelo de Michaelis y Menten - Dependencia de la concentración de sustrato
1. Ingresar al link http://biomodel.uah.es/metab/enzimas/MM-sustrato.htm donde se tiene la siguiente
interfase:
2. Llenar los valores de Km y Vmáx en base a los resultados obtenidos en a)

3. Apretar el botón “traza la gráfica”
4. Analizar la gráfica
5. Para comparar dos enzimas, apretar el botón “fijar como referencia” antes de escribir los valores de
Km y Vmáx de la segunda enzima
6. Comparar las gráficas
c) Modelo de Michaelis y Menten - Representaciones lineales
1. Ingresar al link http://biomodel.uah.es/metab/enzimas/graficas.htm donde se tiene la siguiente
interfase:

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2. Llenar los valores de Km y Vmáx en base a los resultados obtenidos en a)
3. Comparar las gráficas
D. TABLA DE DATOS
a) Regresión no lineal por mínimos cuadrados aplicada a la cinética de Michaelis y Menten
Velocidad inicial según concentración de
sustrato
[S] v
10
Vmáx: Gráfica
Km:

Gráfica original Gráfica para comparación

Gráfica directa (Michaelis y Menten) Gráfica de dobles recíprocos (Lineweaver y Burk)
Gráfica de Hanes y Woolf Gráfica de Eadie y Hofstee

E. RESULTADOS
a) Regresión no lineal por mínimos cuadrados aplicada a la cinética de Michaelis y Menten
1. Localizar la Vmáx y Km en la gráfica obtenida
1. Responder las siguientes preguntas:
(1) ¿Cuánto sustrato es necesario para alcanzar el 95% de la velocidad máxima? Justificar la
respuesta localizando el punto en la gráfica
(2) Una isoenzima tiene un Km cuatro veces mayor que el de la enzima estudiada ¿Cómo es su
gráfica? Adjuntar la foto de la gráfica de cinética de ambas isoenzimas
(3) ¿Cuál de las dos isoenzimas es más afín al sustrato? Justificar la respuesta
(4) ¿Cuál de las dos isoenzimas responde a un rango más amplio de concentración de sustrato?
Justificar la respuesta
1. Completar las siguientes tablas:
Datos para Grá Datos para Gráfica
Datos para Gráfica de d de Hanes y Wo de Eadie y Hofstee
recíprocos (Lineweaver y
[S] [S]/v v/[S] v
1/[S]

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2. Obtener Km y Vmáx y explicar la obtención de estos valores en la representación lineal de

Lineweaver y Burk
F. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
a) Los datos de abajo indican las velocidades de la reacción catalizada por la hexoquinasa. Calcular la, KM y
la Vmax de la hexoquinasa a partir de la gráfica de Michaelis-Menten:
[S] Vo (mM/min)
(mM)
0,05 30
0,10 43
0,15 52
0,20 57
0,30 58
b) Al medir la velocidad de una reacción enzimática

1. la enzima debe estar purificado
2. hay que añadir los cofactores
3. la temperatura debe ser lo más alta posible
4. hay que trabajar a pH óptimo
c) Según el modelo de cinética enzimática de Michaelis-Menten
1. la concentración del complejo enzima-sustrato es constante a lo largo de la reacción
2. la concentración del complejo enzima-sustrato es elevada a lo largo de la reacción 3.
cuando la concentración inicial de sustrato es grande, la reacción es de orden 1
4. cuando la concentración inicial de sustrato es pequeña, la reacción es de orden 0
d) Es cierto que:
1. hay enzimas que no siguen el modelo cinético de Michaelis-Menten
2. la velocidad de una reacción enzimática no cambia con el tiempo
3. el valor de la KM de una enzima permite estimar la afinidad entre la enzima y el sustrato 4. según el
modelo cinético de Michaelis-Menten, la concentración del complejo enzima-sustrato es muy elevada
e) ¿Qué propiedad se cumple en una reacción enzimática a bajas concentraciones de substrato?
1. La velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de substrato 2.
Existe una alta probabilidad de unión enzima-sustrato
3. La velocidad de reacción es independiente de la concentración de substrato
4. Ninguna de las anteriores es correcta
f) En la transformación lineal de Lineweaver-Burk se relaciona:
1. la inversa de la velocidad máxima en función de la inversa de la concentración de substrato
2. la inversa de la velocidad máxima en función de la inversa negativa de la KM
3. la inversa negativa de la KM en función de la inversa de la concentración de substrato 4.
la inversa de la velocidad inicial en función de la inversa de la concentración de substrato
G. BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA
a) Murray, R., Bender, D. & Kennelly, P. (2009). Harper. Bioquímica Ilustrada (28 ed). McGraw Hill

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