Acido Glicolico

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia.
PROFESOR PATROCINANTE: Annemarie Nielsen S.

INSTITUTO: Farmacia
FACULTAD: Ciencias
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Alejandro Jerez M.

INSTITUTO: Farmacia
FACULTAD: Ciencias
"IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA POR

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA PARA DETERMINAR Y
CUANTIFICAR ÁCIDO GLICÓLICO EN SECRECIÓN DE CARACOL
(Helix aspersa Müller). ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA ALIMENTACIÓN
Y PERÍODO ESTACIONAL EN SU CONCENTRACIÓN”
Tesis de Grado presentada como

parte de los requisitos para optar
al Titulo de Químico Farmacéutico
PAULINA DEL PILAR LAGOS MEDIAVILLA
VALDIVIA – CHILE
2008
1
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a todas aquellas personitas que de alguna u otra manera participaron
en mi formación y han hecho que hoy sea la persona que soy.
A mi mamá, mujer a quien admiro y respeto mucho por su honestidad y
responsabilidad frente a la vida; a mi papá, hombre de esfuerzo y perseverancia al que
admiro por el sacrificio que hace día a día por la familia y a mi hermano, a quién admiro
por su gran sentido del humor, lealtad, sinceridad y autenticidad.
De manera especial, agradezco a todos mis amigos, a los que marcaron mi
infancia, mi adolescencia y a cada uno de mis queridos hermanos de la gran Familia
EJE Corral, personitas que, sin duda, me enseñaron el valor de la amistad. Con ellos
aprendí que después de una derrota vienen dos conquistas a favor y que las cosas
pasan porque nuestro gran amigo “El Flaco” así las quiere. A mis fieles amigos,
cosacos; Siempre estarán en mi, esos buenos momentos que pasamos sin saber que
un amigo es una luz brillando en la oscuridad…Gracias y jamás olvidaré que fue ahí
donde descubrí mi espíritu de servicio.
A las personitas con las que compartí durante mi estadía en la Universidad…a
mis amiguis, con las que pasé gratos momentos y compartí largas jornadas de estudio:
Marce, Palo, Mary, gracias por haberme dado la posibilidad de conocerlas y de haber
formado tan linda amistad.
A la personita que iluminó mi corazón en el momento menos esperado. A quien
compartió conmigo, día a día, durante el desarrollo de este trabajo e hizo que las largas
jornadas en el laboratorio sean no sólo una muestra de compañerismo sino también de
amor. Fito, te amo con todo mi corazón y gracias por compartir tu vida conmigo.
2
Además, quiero agradecer a los profesores que participaron en este proyecto,
sobre todo porque la relación formada fue más allá de las aulas…
A la profe Carin Akkeson Q.E.P.D, quien iba a patrocinar este trabajo y que
lamentablemente, el destino quiso que no fuera así, pero sé que en el lugar donde esté,
me dio una manito en esos momentos en que todo parecía no resultar.
Profe Anny, gracias por entregarme su confianza y haberme dado la posibilidad
de conocerla; de descubrir el gran corazón que hay detrás de esa mujer de carácter
fuerte y que pocos alumnos hemos tenido la dicha de conocer, de entender sus mañas
y de aprender de sus fortalezas. Gracias por todo el cariño entregado.
Profe Alejandro, gracias por la confianza entregada, por dedicar tiempo a este
trabajo y por su sentido del humor que alegró innumerables momentos. Siempre lo
recordaré por su disposición y humildad. Gracias, de verdad.
Caro, por haberme dado la posibilidad de compartir muchos momentos en donde
descubrí lo parecidas que somos y por confiar en mi, de verdad, gracias.
A Joel Pardo, persona que desinteresadamente ayudó en este proyecto, no sólo
con sus conocimientos sino que también con su alegría diaria que indudablemente hizo
que mi estadía en el laboratorio sea una jornada menos pesada. Gracias por tu apoyo y
la amistad que nació durante este período.
Al profe Guido, quién colaboró en un momento que jamás imaginé, gracias por
su disposición porque sin su ayuda, todo habría sido más difícil.
Al Doctor Dölz, por sus innumerables conversaciones que indudablemente
sirvieron para mi formación personal y profesional.
A don Eduardo, gracias por su disposición y por sus palabras de aliento.

3
INDICE
1 ABREVIATURAS 9
2 RESUMEN 11
ABSTRACT 12
3 INTRODUCCION 13
3.1 CARACOL 13
3.1.1 ANATOMÍA EXTERNA 13
3.1.2 ANATOMÍA INTERNA 15
3.1.3 RITMO BIOLÓGICO 17
3.1.4 NUTRICIÓN 18
3.1.5 SECRECIÓN 20
3.1.6 HISTORIA Y ACTUALIDAD 23
3.2 ÁCIDO GLICÓLICO 25
3.2.1 QUÍMICA DEL ÁCIDO GLICÓLICO 25
3.2.2 SÍNTESIS DEL ÁCIDO GLICÓLICO EN LA NATURALEZA 26
3.2.3 ÁCIDO GLICÓLICO Y COSMÉTICA 26
3.3 CROMATOGRAFÍA 27
3.4 VALIDACION DEL MÉTODO ANALÍTICO 28
3.4.1 LINEALIDAD 28
3.4.2 PRECISIÓN 30
3.4.3 EXACTITUD 31
3.4.4 SELECTIVIDAD O ESPECIFICIDAD 32
3.4.5 SENSIBILIDAD 33
4 HIPÓTESIS DE TRABAJO 35
4
5 OBJETIVOS 35
5.1 OBJETIVOS GENERALES 35

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 35
6 MATERIALES Y MÉTODOS 37
6.1 MUESTRAS 37
6.2 REACTIVOS UTILIZADOS 38
6.3 INSTRUMENTAL Y EQUIPOS 38
6.4 METODOLOGÍA ANALÍTICA 39
6.4.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS. 39
6.4.1.1 Preparación de la fase móvil 40
6.4.2 TRATAMIENTO DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOL 40
6.4.3 VALIDACIÓN 41
6.4.3.1 Preparación de estándares 41
6.4.3.2 Linealidad 42
6.4.3.3 Precisión del sistema instrumental 42
6.4.3.3.1 Repetibilidad 42
6.4.3.3.2 Precisión Intermedia 42
6.4.3.4 Precisión del método 43
6.4.3.4.1 Repetibilidad 43
6.4.3.4.2 Precisión Intermedia 43
6.4.3.5 Exactitud 43
6.4.3.6 Selectividad 44
6.4.3.7 Sensibilidad 44
5
7 RESULTADOS 46
7.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 46

7.1.1 LINEALIDAD 46
7.1.2 PRECISIÓN DEL SISTEMA INSTRUMENTAL 47
7.1.2.1 Repetibilidad de sistema instrumental 47
7.1.3 PRECISIÓN DEL MÉTODO 51
7.1.3.1 Repetibilidad del método 51
7.1.3.2 Precisión Intermedia del método 52
7.1.4 EXACTITUD / PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN 55
7.1.5 SELECTIVIDAD O ESPECIFICIDAD 58
7.1.6 SENSIBILIDAD (LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN) 59
7.1.6.1 Cálculo de los límites de detección y cuantificación. 61
7.2 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOL 62
8 DISCUSIÓN 79
8.1 MÉTODO ANALÍTICO 79

8.2 LINEALIDAD 81
8.3 PRECISIÓN DEL SISTEMA INSTRUMENTAL 82
8.3.1 REPETIBILIDAD 82
8.3.2 PRECISIÓN INTERMEDIA 82
8.4 PRECISIÓN DEL MÉTODO 83
8.4.1 REPETIBILIDAD 83
8.4.2 PRECISIÓN INTERMEDIA 83
8.5 EXACTITUD 84
8.6 SELECTIVIDAD 84
8.7 SENSIBILIDAD 85
8.8 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOL 86
8.8.1 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ÁCIDO GLICÓLICO EN SECRECIÓN DE CARACOL
HELIX ASPERSA MÜLLER. 86
6
8.8.2 DETERMINACIÓN DEL FACTOR K´ 87

8.8.3 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOLES HELIX ASPERSA MÜLLER
SOMETIDOS A DIFERENTES DIETAS Y PERÍODOS DE OBTENCIÓN DE LA SECRECIÓN. 87
8.8.4 DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GLICÓLICO EN SECRECIÓN DE CARACOL HELIX ASPERSA
MÜLLER SEGÚN PERÍODO DE OBTENCIÓN DE LA SECRECIÓN. 88
8.8.5 DETERMINACIÓN DE ÁCIDO GLICÓLICO EN SECRECIÓN DE CARACOL HELIX ASPERSA
MÜLLER SEGÚN ALIMENTACIÓN. 89
8.8.6 ANÁLISIS GENERAL 91
9 CONCLUSIONES 92
10 PROYECCIONES 94
11 REFERENCIAS 95
12 ANEXOS 103
12.1 ANEXO N° 1: FIGURAS 103

12.1.1 FIGURA N° 1: ANATOMÍA EXTERNA DEL CARACOL HELIX ASPERSA MÜLLER. 103
12.1.2 FIGURA N° 2: ANATOMÍA INTERNA DEL CARACOL HELIX ASPERSA MÜLLER. 103
12.1.3 FIGURA N° 3: DESARROLLO DE LA ACTIVIDAD DEL CARACOL DE ACUERDO A LA
TEMPERATURA Y HUMEDAD. 104
12.1.4 FIGURA N° 4: EPIFRAGMA. MEMBRANA MUCOSA, CALCIFICADA SECRETADA POR EL
CARACOL DURANTE EL PERÍODO DE INACTIVIDAD. 104
12.1.5 FIGURA N° 5: ESTRUCTURA QUÍMICA DEL ÁCIDO GLICÓLICO. 105
12.1.6 FIGURA N° 6: ESQUEMA DEL PROCESO DE FOTOSÍNTESIS. A LA IZQUIERDA, LAS
REACCIONES LUMINOSAS DONDE SE PRODUCEN ATP Y NADPH. A LA DERECHA, LAS
REACCIONES DE FIJACIÓN DEL CARBONO QUE DARÁN ORIGEN A LOS CARBOHIDRATOS. 105
12.1.7 FIGURA N° 7: PROCESO DE FOTORRESPIRACIÓN Y FORMACIÓN DE ÁCIDO GLICÓLICO. 106
7
12.2 ANEXO N° 2: TABLAS 107

12.2.1 TABLA N° 1: EQUIVALENCIA DE SECRECIÓN DE CARACOL HELIX ASPERSA MÜLLER,
ANTES Y DESPUÉS DE LIOFILIZAR. 107
12.2.2 TABLA N°2: TRATAMIENTO DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOL HELIX ASPERSA
MÜLLER. 108
12.2.3 TABLA N° 3: CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GLICÓLICO OBTENIDA EN MUESTRAS DE
SECRECIÓN DE CARACOLES ALIMENTADOS CON HARINA DE MAÍZ Y CUYA OBTENCIÓN SE REALIZÓ
DURANTE EL MES DE OCTUBRE. 109

DURANTE EL MES DE DICIEMBRE. 109

DURANTE EL MES DE MARZO. 110

SECRECIÓN DE CARACOLES ALIMENTADOS CON HARINA DE SOYA Y CUYA OBTENCIÓN SE REALIZÓ



SECRECIÓN DE CARACOLES ALIMENTADOS CON VEGETALES Y CUYA OBTENCIÓN SE REALIZÓ


8


12.2.12 TABLA N° 12: VALORES CRÍTICOS DE LA R DE PEARSON PARA UNA PRUEBA UNILATERAL
SEGÚN GRADOS DE LIBERTAD (N-2). 114
12.2.13 TABLA N° 13: VALORES T DE STUDENT Y PROBABILIDAD P ASOCIADA EN FUNCIÓN DE
LOS GRADOS DE LIBERTAD (GL) 115
12.2.14 TABLA N° 14: CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA EL PARÁMETRO DE PRECISIÓN EN
FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL ANALITO DE LA A.O.A.C. 116
12.2.15 TABLA N° 15: CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA EL PARÁMETRO DE EXACTITUD,
RELACIONANDO EL % DE RECUPERACIÓN EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL ANALITO DE
LA A.O.A.C. 117
12.3 ANEXO N°3: CROMATOGRAMAS 118
12.3.1 FIGURA N° 1: CROMATOGRAMA OBTENIDO AL INYECTAR UNA MUESTRA DE SECRECIÓN DE
CARACOL CORRESPONDIENTE AL MES DE OCTUBRE Y ALIMENTACIÓN HARINA DE MAÍZ. 118
CARACOL CORRESPONDIENTE AL MES DE DICIEMBRE Y ALIMENTACIÓN HARINA DE MAÍZ. 118
CARACOL CORRESPONDIENTE AL MES DE MARZO Y ALIMENTACIÓN HARINA DE MAÍZ. 119
CARACOL CORRESPONDIENTE AL MES DE OCTUBRE Y ALIMENTACIÓN HARINA DE SOYA. 119
12.4 ANEXO N° 4: EJEMPLOS DE CÁLCULOS. 123
12.4.1 CÁLCULO PARA DETERMINAR LOS GRAMOS DE SECRECIÓN LIOFILIZADA QUE SE
NECESITAN PESAR PARA PREPARAR 3 ML DE SUSPENSIÓN. 123
12.4.2 CÁLCULO PARA DETERMINAR LOS FACTORES DE DILUCIÓN DE CADA MUESTRA. 123
12.4.3 CÁLCULO PARA DETERMINAR EL % RECUPERACIÓN 124
12.4.4 CÁLCULO PARA DETERMINAR CONCENTRACIÓN ESPERADA DE ÁCIDO GLICÓLICO AL
REALIZAR LA MEZCLA DE MUESTRA Y ESTÁNDAR DE ÁCIDO GLICÓLICO. 124
9
1 ABREVIATURAS
A.O.A.C : Association of Oficial Analytical Chemist.
°C : Grados Celsius.
C.V : Coeficiente de variación.
D.S : Desviación estándar
FDA : Food and Drug Administration.
GLP : Buenas prácticas de laboratorio.
GMP : Buenas prácticas de manufactura.
g / mol : Gramos por mol.
HPLC : High Performance Liquid Chromatography. (Cromatografía Líquida
Alta Eficiencia).
ISP : Instituto de Salud Pública.
K´ : Factor de Capacidad.
kDa : Kilodaltons
mM : Milimolar.
mL : Mililitro.
mL / Min : Mililitro por minuto.
mPa : Milipascales
mV x Min : Milivolt por minuto.
N° : Número.
nm : nanómetro
pKa : Índice que expresa la fortaleza de un ácido débil.
pH : Potencial Hidrógeno, expresa grado de acidez o basicidad de una

10
disolución acuosa.
UV : Ultravioleta
μg/mL : Microgramo por mililitro.
μL : Microlitros.
11
2 RESUMEN
En los últimos años el campo de la tecnología cosmética ha experimentado un
amplio interés por la aparición de la Baba o secreción de Caracol, un producto natural
con propiedades cosméticas y medicinales fascinantes. Se trata de una secreción
producida por los caracoles de tierra que cumple funciones vitales para ellos como los
procesos de reparación y regeneración.
En este trabajo, se desarrolló un método analítico por HPLC-UV para determinar
y cuantificar ácido glicólico en la secreción del caracol Helix aspersa Müller. Además, se
determinó si existen diferencias en la concentración del ácido, según la dieta del caracol
(vegetales verdes, harina de soya y harina de maíz) y el período de obtención de la
secreción (octubre, diciembre y marzo, correspondiente al inicio, mitad y término del
período activo del caracol, respectivamente). Previo al análisis de las muestras, se
validó el método establecido, resultando ser lineal para el rango de concentraciones
trabajadas (20- 100 μg/mL). Además, la sensibilidad, selectividad, precisión y exactitud
hacen que el método sea conveniente para realizar análisis de rutina de muestras de
secreción.
Se determinó que tanto la alimentación, como el período estacional influyen en la
concentración de ácido glicólico en la secreción del caracol Helix aspersa Müller,
obteniéndose concentraciones promedio desde 77,84 μg/mL, correspondiente a
muestras de caracoles alimentados con harina de soya y obtenidas durante el mes de
diciembre, hasta 258,24 μg/mL, correspondiente a muestras de caracoles alimentados
con vegetales y obtenidas durante marzo.

12
ABSTRACT
In recent years, the cosmetics industry has demonstrated widespread interest in
the emergence of the snail secretion, a natural product with fascinating cosmetic and
medicinal properties. This is a secretion produced by snails which has proven vital for
shell repair and regeneration.
In this study, an analytical method of HPLC- UV was developed to identify and
quantify glycolic acid in secretion of the snail Helix aspersa Müller. Furthermore,
possible differences in glycolic acid concentration were determined, according to the
snail’s diet (vegetables, soybean flour and maize flour) and obtaining period of secretion
(October, December and March, corresponding to the start, middle and end of the snail’s
active period, respectively). This method was validated prior to sample analysis,
demonstrating a linear relationship for the concentrations range worked (20- 100
μg/mL). Moreover, sensitivity, selectivity, precision and accuracy make this method
suitable for the routine analysis of secretion samples.
Conclusions revealed that both food and seasonal periods influence on glycolic
acid concentrations in secretion of Helix aspersa Müller. Average concentrations from
77,84μg/mL were obtained, corresponding to snails samples fed with soybean and
obtained during December, to 258, 24 μg/mL, corresponding to snails samples fed with
vegetables and obtained during March.

13
3 INTRODUCCION
3.1 CARACOL
El caracol es un molusco perteneciente a la clase Gasterópodo, es decir, se
arrastra gracias a un aparato motor situado debajo del vientre (Wallach, 2005). La clase
gasterópodos es la más diversa entre los moluscos, comprende desde formas marinas
con muchos caracteres primitivos, hasta formas terrestres altamente evolucionadas
(Hickman et al., 2002).
La especie de caracol silvestre Helix aspersa Müller es nativa del este europeo,
Gran Bretaña y de la costa del Mediterráneo y fue introducida en el sur de los Estados
Unidos, donde se difundió ampliamente. Desde allí se distribuyó al Sur de América
(Cockrum y McCauley, 1967).
3.1.1 Anatomía Externa
o Cabeza: Posee una cabeza carnosa provista de dos pares de tentáculos, un par de
ojos (sobre los tentáculos superiores) y la boca (Storer et al., 1986). Dentro de la
boca hay una estructura peculiar, la rádula, órgano con forma de lengua y que tiene
doble función: raspa el alimento en finas partículas, y sirve de cinta transportadora
para llevarlas en un flujo continuo hacia el tracto digestivo (Hickman et al., 2002).
Cerca de la cabeza, en el lado derecho, se abre el poro genital. El ano y el poro
respiratorio, que es mayor, están en el borde blando del manto, en el borde de la
concha (Storer et al., 1986).

14
o Pie: Órgano musculoso ventral reptador (Meglitsch, 1978) que se une directamente
a la cabeza (Storer et al., 1986). El pie, además de estar adaptado para la
locomoción, lo está también para la fijación a los diferentes sustratos. Se trata de
una estructura en forma de suela, ventral, en la que las ondas de contracción
muscular provocan una locomoción por reptación. El moco segregado se utiliza
frecuentemente como ayuda a la adhesión o para la formación de una pista por la
que el caracol se desliza (Hickman et al., 2002). Este moco es producido por
glándulas del pie, específicamente por una gran glándula pedia ubicada debajo de la
boca (Ruppert y Barnes, 1996).
o Concha: Se halla directamente sobre el pie. Es segregada por el manto, membrana
delgada que además de segregar la concha, rodea las vísceras (Storer et al., 1986).
Típicamente tiene tres capas. El periostraco, que es la capa externa, de aspecto
córneo, constituida por una sustancia orgánica llamada conquiolina. Contribuye a la
protección de las capas subyacentes contra el ataque de organismos perforantes.
La capa media o prismática se compone de prismas de carbonato de calcio
densamente empaquetados y depositados en una matriz proteica. La capa nacarada
de la concha es la más interna, está adosada al manto y es secretada
continuamente por la superficie del mismo (Hickman et al., 2002) (Anexo N° 1,
Figura N° 1).
15
3.1.2 Anatomía interna
Está compuesta por una masa visceral que contiene todos los aparatos
funcionales del caracol y por el manto, cubierta de tegumento que se extiende desde la
masa visceral y que cuelga sobre cada lado del cuerpo; protege las partes blandas y
crea entre ellas y la masa visceral, un espacio denominado cavidad paleal o del manto.
La superficie externa del manto segrega la concha y en esta cavidad se alojan los
sistemas funcionales (Hickman et al., 2002). Todas las partes blandas pueden retraerse
completamente dentro de la concha por la acción del músculo columnelar, que se
extiende interiormente hasta la espira superior de la concha (Storer et al., 1986) (Anexo
N° 1, Figura N° 2).
o Aparato digestivo: Comprende la boca; la faringe muscular, la rádula ventral; un
esófago alargado; un gran buche de paredes finas; un estómago redondeado; un
largo intestino replegado y el ano (Storer et al., 1986).
o Aparato respiratorio: A diferencia de otros gasterópodos, la especie Helix aspersa
Müller pertenece al orden Pulmonados, que se caracteriza por poseer un pulmón, y
no branquias el que está formado por una red de vasos sanguíneos. El aire entra y
sale por un poro respiratorio (Storer et al., 1986) denominado Pneumostoma y se
encuentra cerca del orificio anal.

16
o Aparato circulatorio: este sistema se encarga de colectar la sangre oxigenada de las
paredes del manto y la conduce hacia el corazón (formado por una aurícula y un
ventrículo más grande, ambos en la cavidad pericárdica) y de aquí a través de la
aorta a la cabeza, al pie y a la masa visceral (Cockrum y McCauley, 1967).
o Aparato excretor: Este sistema consta de un solo riñón que emite un uréter anterior,
el cual corre a lo largo de la porción posterior del intestino y se vacía al exterior a
través del nefridiostoma (Cockrum y McCauley, 1967).
o Aparato nervioso: Compuesto, principalmente, por ganglios nerviosos. Los nervios
procedentes de estos se dirigen a todos los órganos (Storer et al., 1986).
o Aparato sensorial: El extremo de cada tentáculo posterior tiene un ojo con cornea,
cristalino y retina. Además, poseen órganos del equilibrio denominados estatocistos
y, probablemente, tiene un órgano olfativo. (Storer et al., 1986).
o Aparato locomotor: El avance de los caracoles es lento y se produce por
desplazamiento hacia delante (Benito, 2004) por medio de ondas de contracción
muscular que recorren el pie (Ruppert y Barnes, 1996), el que se ve favorecido por
la secreción de una sustancia mucosa producida por glándulas ubicadas en él.
(Benito, 2004).
17
o Aparato reproductor: En cada individuo hay un sistema reproductor mixto, masculino
y femenino, en donde la copulación es recíproca. El pene de cada uno se inserta en
la vagina del otro, transfiriendo un espermatóforo; luego se separan los dos
individuos. Depositan una o varias masas de huevos recubiertos por una cubierta
gelatinosa, en lugares húmedos o en agujeros poco profundos (Storer et al., 1986).
3.1.3 Ritmo biológico
La actividad natural de los caracoles de jardín se puede clasificar en dos grandes
etapas: actividad e inactividad. Cuando estos se vuelven inactivos durante el invierno, el
estado que alcanzan se denomina hibernación. Si éste ocurre en el verano, se
denomina estivación. Sin embrago, estos términos no han sido usados correctamente,
lo que ha traído confusión entre los diferentes autores. Además, no está claro si la
estivación y la hibernación ocurren con procesos fisiológicos similares que solamente se
diferencian por el período en que ocurre o si son procesos fisiológicos completamente
diferentes (Anexo N° 1, Figura N° 3).
Sí está claro que, durante el período inactivo, los caracoles secretan una
sustancia mucosa que sella el orificio de su concha para protegerse de condiciones
desfavorables. Esta membrana calcificada se conoce con el nombre de opérculo o
epifragma (Herreid, 1977) (Anexo N° 1, Figura N° 4). Durante el período activo,
preferentemente de noche y en períodos de humedad (Storer et al., 1986) ocurren
cuatro funciones importantes en la vida del caracol: la locomoción, la alimentación, el
crecimiento de las especies jóvenes y la reproducción de los adultos (Aupinel y Bonnet,
1996).
18
Durante el día, se esconden en las oquedades o debajo de los objetos que haya
sobre el suelo, con la cabeza y el pie metidos en la concha (Cockrum y McCauley,
1967).
3.1.4 Nutrición
La especie Helix aspersa Müller se caracteriza por ser una especie herbívora. Su
alimento consiste, principalmente, en plantas verdes, que son humedecidas por las
secreciones de las glándulas salivales y raspadas hasta fragmentarlas en pequeños
trozos mediante la rádula multidentada (Cockrum y McCauley, 1967).
Se describe que caracoles Helix aspersa Müller, pueden tener diferentes
preferencias alimenticias. Por lo tanto, cuando estos están en criaderos, se aconseja ir
acostumbrándolos a una dieta determinada. Algunos de los alimentos que consumen en
los criaderos son: cebada, pepino, zanahoria, repollo, coliflor, apio, cebollines, trébol,
puerro, ortiga, lechuga, avena, cebolla, perejil, duraznos, peras maduras, ciruelas,
cerezas, papa, rábano, rosas, espinaca, cardo, tomates, nabo, trigo, hojas de plantas ,
pasto, además de los diferentes tipos de harinas, como la de trigo, soya y maíz, entre
otras (Bustamante, 2004). Para que la dieta sea aún más completa, los helicicultores
recomiendan agregar cantidades determinadas de calcio para ayudar en el crecimiento
del caracol joven y en la formación o reparación de la concha cuando ésta se daña.
Condición que ya se ha comprobado y resulta necesaria para la crianza de caracoles de
jardín. (Crowell, 1973; Perea et al., 2004).
Se ha demostrado en Helix aspersa máxima que la composición, tanto de la
concha como del músculo, se ve claramente influenciada por la calidad de la dieta

19
(Milinsk et al., 2003). Esto resultaría de gran importancia para aquellos helicicultores
que los crían con fines gastronómicos, ya que con ello podrían determinar qué dieta
logra una mejor calidad del músculo del caracol para así entregar una mejor
composición nutricional al consumidor.
Como ya se detalló, son varios los alimentos que el caracol de jardín puede
consumir, pero en esta oportunidad, se describirán los utilizados para este trabajo que
fueron vegetales verdes (lechuga; Lactuca sativa y repollo; Brassica oleracea capitata),
harina de maíz (Zea maize) y harina de soya (Glycine max) que son los alimentos más
utilizados en el criadero de caracoles de donde se obtuvieron las diferentes muestras
de secreción.
o El maíz es un cereal de la familia de las gramíneas. Su composición consta de
proteínas, extracto etéreo, fibra cruda, cenizas, almidón y azúcares que varían
dependiendo de la parte del grano; pericarpio, endospermo o germen.
(http://www.fao.org/docrep/005/ac854t/AC854T04.htm)
o La soya es una planta de la familia de las leguminosas. Su composición consta de
proteínas, lípidos, carbohidratos y cenizas.
o La lechuga es una hortaliza de la familia asteraceae. Su composición consta de
agua en grandes proporciones, proteínas, vitaminas A, C y E, fibra y minerales.
20
o El repollo es una hortaliza de la familia brasicáceas. Es rico en vitaminas C y A,
calcio, betacarotenos y fibra (http://www.fao.org/docrep/005/ac854t/AC854T29.htm).
3.1.5 Secreción
El mucus es un gel constituido por una red de polímeros que funciona como una
capa protectora de superficies de tegumentos y mucosas, tanto de animales simples
como de mamíferos (Verdugo et al., 1987).
El pie de los gasterópodos está cubierto con una fina capa de este mucus, el
que es usado para una variedad de funciones, incluyendo adhesión, lubricación,
repulsión de posibles predadores y para acoplarse durante la reproducción. Esta
secreción pedia tiene aspecto de gel, que contiene aproximadamente 91 a 98% peso en
peso de agua, dependiendo de la especie, combinado con una pequeña cantidad de
glicoproteínas de alto peso molecular (Denny, 1984), que en Helix aspersa alcanzan
pesos de 82, 97 y 175 kDa (Pawlicki et al, 2003).
Muchos moluscos, tanto especies marinas como terrestres, cuando están
inactivos, utilizan esta secreción de gran capacidad adhesiva, para pegarse a diversas
superficies. Sin embargo, resulta extraño, ya que no se espera que un gel tan diluido,
que comúnmente funciona como lubricante, pueda tener propiedades tan grandes de
adhesión (Pawlicki et al, 2003).
La literatura describe que para la secreción del caracol Helix aspersa Müller
existen dos tipos de secreción. Una de ellas traslúcida de tipo “no adhesivo”, que es la
que deja el caracol cuando se desplaza y una similar, pero más espesa, condensada,
viscosa y elástica, que es la que utiliza para adherirse a diversas superficies. Ambas se
21
diferencian claramente por el tipo de proteínas presentes en ellas (Pawlicki et al, 2003).
Se ha descrito también que la naturaleza de la estimulación del caracol determina
claramente el tipo de secreción que éste libera, la que varía desde una secreción
viscosa y pegajosa producida bajo condiciones normales o por una estimulación ligera
hasta una secreción espumosa y clara que el caracol libera bajo estimulación continua
e incluso, violenta (Campion, 1961).
Existen publicaciones que describen detalladamente la estructura de las
glándulas secretoras, tanto la pedia como también la opercular, quedando muy claro
que la estructura del pie y las glándulas asociadas están adaptadas a sus diferentes
formas de vida y sus requerimientos fisiológicos y ambientales (Shirbhate y Cook,
1987).
En el caso de Helix aspersa Müller, la secreción está compuesta por productos
sintetizados por diferentes tipos de glándulas secretoras. Éstas son todas glándulas
unicelulares que se encuentran en el tejido conectivo y secretan sus productos a través
de poros que pasan entre las células epidérmicas. Son de diversas formas y
usualmente tienen un conducto excretor largo. Se han encontrado ocho tipos diferentes
de glándulas secretoras. Cuatro de ellas secretan diferentes tipos de mucus; proteínas,
calcio, pigmentos y por último, lípidos (Campion, 1961).
El mecanismo molecular que controla el almacenamiento de esta secreción,
dentro de las células glandulares, y su liberación está poco claro. Un estudio realizado
en la babosa Ariolimax columbianus, postula que la liberación de calcio de
compartimentos intragranulares influye directamente en la liberación de secreción de
otras glándulas (Verdugo et al., 1987).

22
Para Helix aspersa se postula que una de las causas de que las células
glandulares liberen esta secreción es que en el sistema circulatorio del caracol ocurren
constantes cambios de presión, que suceden por el movimiento propio del caracol, los
que comprimen los cuerpos celulares glandulares que responden liberando la
secreción. Sin embargo, cuando el animal deja de moverse, las células dejan de
secretar mucus. Por lo tanto, esto sólo explicaría la liberación de secreción durante el
movimiento del caracol. Posteriormente, se postuló que la inervación de las células
glandulares podría tener alguna responsabilidad. Aunque no hay estudios sobre este
tema, el mecanismo de liberación de la secreción podría acercarse más a esta teoría
que a la anteriormente descrita, en donde la liberación de la secreción estaría
controlada por el sistema nervioso, lo que explicaría el aumento de calcio secretado
cuando los caracoles son estresados (Campion, 1961).
La secreción del caracol o también conocida comúnmente como baba de caracol,
se ha transformado en una de las sustancias más apetecidas por los laboratorios
cosméticos y farmacéuticos de los mercados mundiales, debido a las propiedades que
se le han atribuido por la composición de ésta, la que varía en su aspecto y calidad de
acuerdo a la manera de extraerla (Campion, 1961), a las condiciones ambientales en
donde se encuentra (Campion, 1961), a la estacionalidad (Davies et al., 1991; Lira,
2008) y a los hábitos alimenticios a los que están sometidos (Campion, 1961; Lira,
2008). Con esto se aclara que la composición de la secreción de caracoles, tanto de
Helix aspersa Müller, como también de otras especies, varía por los factores antes
mencionados lo que influirá directamente en la calidad de la secreción y, por lo tanto, en

23
las propiedades de algún producto a fabricar con ella, como por ejemplo, las cremas de
uso cosmético.
Por esto resulta interesante determinar si la alimentación y la estacionalidad
influyen en la concentración de los componentes de la secreción de la especie Helix
aspersa Müller, que es la especie que ha cobrado gran importancia en la actualidad, lo
que sería de gran ayuda para una mejor crianza de caracoles, determinándose así, que
alimentación y/o período estacional pudieran favorecer la presencia de algún
componente en particular o el conjunto de ellos, otorgándole así una mejor calidad a los
productos cosméticos que con ella se elaboran.
3.1.6 Historia y actualidad
Revisiones históricas relacionadas al uso terapéutico de los caracoles revelan
que desde la antigüedad hasta hoy, el hombre ha considerado que estos tienen
numerosas propiedades biológicas y terapéuticas. En la época de Hipócrates, ya se
proponía el uso de la secreción del caracol. Celso, Pliny, Galeno y Ambroise Paré
tenían diferentes teorías que justificaban el uso de caracoles en diversos preparados:
crudos; molidos, incluida la concha; hervidos y asados a la parrilla en conjunto con una
copa de vino. En el siglo diecinueve fueron utilizados como jugos, caldos o pastas,
preferentemente para el tratamiento de hernias y para darle brillo y suavidad a la piel.
Más adelante comenzaron a usarse para afecciones tales como tos, bronquitis, catarro,
asma, amigdalitis, faringitis, espasmos intestinales, gastritis y para afecciones de la piel
como el sarampión y erisipelas. Ya en el siglo XX, se confirma la propiedad sedativa de
la secreción de caracol Helix pomatia. Este mucus se extraía y procesaba para obtener
24
una solución aséptica. Además, se conoció el efecto bronco-relajante producido por
esta sustancia que se relaciona con la liberación de prostaglandina E-2 (Bonnemain,
2005).
Sin embargo, es la secreción del caracol Helix aspersa Müller la que ha cobrado
gran importancia en la actualidad, ya que fabricantes de diversos productos cosméticos
le han atribuido diferentes propiedades dermatológicas, ya sea para quitar manchas,
como también para disminuir las líneas de expresión, estrías, celulitis y acné, ya que
sostienen que esta secreción contiene de manera natural diversos componentes, tales
como alantoína, ácido glicólico, antibióticos, proteínas como colágeno y elastina y
vitaminas (Antena 3 Directo Chile; Elicina: Crema de caracol; El mercurio on line;
Instituto Politécnico Nacional de México). No obstante, a pesar de todas las
propiedades que se le han atribuido a la secreción de la especie Helix aspersa Müller,
es sólo información de productos comerciales y sólo se han encontrado antecedentes
de trabajos realizados en la Universidad Austral de Chile que confirman la presencia de
alantoína en esta secreción (Manosalva, 2005; Lira, 2008).
Actualmente, la secreción o baba de caracol, de distintos criaderos, se
comercializa como materia prima en el mercado chileno. Un ejemplo de ello es Pro-
Lham®, distribuido por MAPRIN LTDA, empresa que provee de secreción de caracol a
algunos laboratorios que fabrican productos cosméticos a base de ella, alcanzando,
esta materia prima, valores aproximados de $145.000 el litro.
Se ha descrito que existen factores antimicrobianos, proteínas, glicoproteínas y
carbohidratos en el mucus de otras especies de caracoles de tierra (Iguchi et al, 1982;
Obara, 1992), lo que incentiva a estudiar los componentes de la secreción del caracol
25
de jardín Helix aspersa Müller, que es la especie que se encuentra en nuestro país. Así,
una vez determinados y cuantificados, estos componentes, se podrán atribuir las
verdaderas propiedades a la secreción, ya que son muchos los laboratorios cosméticos
que fabrican cremas con ella, pero ninguno de ellos ha publicado la cantidad de
secreción utilizada en su fabricación, menos aún la concentración de los componentes
que cumplen las funciones atribuidas a tan codiciado producto.
3.2 ÁCIDO GLICÓLICO
Los Alfa- Hidroxiácidos (AHAs), son una familia de ácidos orgánicos que tienen
un grupo hidroxilo en el átomo de carbono alfa (Jiang y Qureshi, 1998) y se encuentran,
preferentemente, en alimentos naturales.
Numerosos son los ácidos que pertenecen a esta familia y se diferencian en el
largo de la molécula. El ácido glicólico es uno de ellos y se encuentra, principalmente,
en la caña de azúcar. Estructuralmente es el más corto, ya que contiene sólo dos
átomos de carbono en su estructura, lo que permite que sea un compuesto de fácil
manejo dermatológico, ya que puede atravesar fácilmente las capas de la piel
(Cotellesa et al., 1995).
3.2.1 Química del ácido glicólico
El ácido glicólico, ácido hidroxiacético o ácido hidroxietanoico, es un
constituyente natural del jugo de la caña de azúcar. Sin embargo, se puede obtener de
la reacción química entre el ácido monocloroacético e hidróxido de sodio o también de
la reducción electrolítica del ácido oxálico. Es un polvo incoloro, levemente

26
higroscópico, soluble en agua, metanol, alcohol, acetona, ácido acético y éter.
Clasificado como ácido débil, de fórmula C2H4O3 y peso molecular de 76,05 g/mol, tiene
un pKa (25°C) igual a 3.83 y su punto de fusión es 80°C (Merck Index, 2001) (Anexo N°
1, Figura N° 5).
3.2.2 Síntesis del ácido glicólico en la naturaleza
Los alfa- Hidroxiácidos (AHAs) son ácidos orgánicos generalmente extraídos de
frutas y de la caña de azúcar. Ellos son metabolitos del ciclo de los carbohidratos y de
otros procesos metabólicos importantes (Nicoletti et al., 1999).
El ácido glicólico se produce en la fotosíntesis, específicamente en un proceso
metabólico denominado fotorrespiración. En este último, los glúcidos formados en la
fotosíntesis son oxidados a CO2 y agua en presencia de luz, perdiéndose energía (Taiz
y Zeiger, 2002) (Anexo N°1, Figuras N° 6 y 7).
3.2.3 Ácido glicólico y cosmética
Los hidroxiácidos se utilizan en dermatología desde hace varios años en
diferentes indicaciones terapéuticas, aunque su uso más extendido es en el
fotoenvejecimiento cutáneo (Briden, 2004). Diversas publicaciones describen el uso
tópico de ácido glicólico sobre la piel. En el tratamiento antiarrugas se han obtenido
muy buenos resultados en diferentes formas de aplicación (Coro-Antich et al., 2000;
Funasaka et al, 2001). Además, se comprobó que este ácido actúa como
dermoabrasivo al emplearlo en estos tratamientos, ya que al ser aplicado sobre la piel
de la cara adelgaza el estrato córneo, engrosa la epidermis y aumenta el contenido de

27
colágeno en la dermis papilar (Coro-Antich et al., 2000). Además, se han obtenido
buenos resultados en el tratamiento de diversas patologías dermatológicas, tales como
acné, en su forma pápulo-pustular y comedónica; hiperqueratosis; ictiosis; psoriasis;
verrugas; envejecimiento y fotoenvejecimiento (Cotellessa et al., 1995).
La FDA establece que aquellos productos cosméticos que contienen ácido
glicólico son seguros si se utilizan en concentraciones iguales o menores al 10% y que
alcanzan un pH no menor a 3,5. Aquellos productos cosméticos que contengan
concentraciones de 20%, 30% y más de ácido glicólico, y que alcanzan un pH no mayor
a 3, solamente se pueden utilizar en centros cosméticos autorizados y deben ser
aplicados por personal especializado.
3.3 CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un método analítico empleado ampliamente en la
separación, identificación y determinación de componentes químicos en mezclas
complejas. El notable aumento en la calidad del material de relleno y el avance en la
instrumentación, llevaron al nacimiento y rápido crecimiento de una nueva modalidad:
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC), en el cual los principales logros son la
rapidez, resolución y reproducibilidad.
Actualmente, la cromatografía de fase ligada es el método dominante y puede
clasificarse en fase normal y fase reversa, de acuerdo a la polaridad relativa de la fase
móvil y de los grupos funcionales químicamente ligados a la matriz. Así, la fase reversa
se caracteriza porque la fase estacionaria es apolar y la fase móvil es polar (Quattrocchi
et al., 1992).
28
3.4 VALIDACION DEL MÉTODO ANALÍTICO
La validación se define como el establecimiento de pruebas documentales que
aportan un alto grado de seguridad de que un proceso planificado se efectuará
uniformemente en conformidad con los resultados previstos especificados (Chaloner-
Larsson et al., 1998).
Los estudios de validación son requisitos para las GMP y GLP, estándares
internacionales de calidad que están dirigidas a disminuir los riesgos, inherentes a toda
producción farmacéutica, que no pueden ser previstos completamente mediante la
evaluación de los productos terminados y a describir los principios que deben regir los
procesos de organización de un laboratorio de control de calidad, respectivamente
(http://www.ispch.cl/ctrl/Inspecion/herramientas.html).
Una vez desarrollado un método de análisis por HPLC, al igual que toda técnica
analítica, ésta deberá validarse para así confirmar y documentar que los resultados
obtenidos por el método utilizado, son confiables (Quattrocchi et al., 1992).
Para la validación de métodos analíticos, se deben determinar como mínimo los
siguientes parámetros: Linealidad, Precisión, Exactitud y Sensibilidad con estándares
de ácido glicólico, de acuerdo a las condiciones de tratamiento de muestras y
cromatográficas establecidas en la literatura (Quattrocchi et al., 1992).
3.4.1 Linealidad
La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad entre la
concentración de analito y su respuesta. Para su determinación se prepara una serie de
al menos cinco diluciones de un estándar, comprendiendo los ámbitos estimados de

29
trabajo con un exceso de al menos 50% sobre el límite superior y un defecto de 50 %
debajo del límite inferior. Estas soluciones se inyectan al menos por duplicado y se
determina la curva de regresión Y= bX+a, donde a corresponde al estimador de la
ordenada y b, la pendiente. Independientemente de la apariencia de la recta, resulta
conveniente evaluar los estimadores de regresión en un intervalo de confianza dado
(por ejemplo, p=0,05):
o Del coeficiente de regresión lineal (r): se determina para evaluar el ajuste al modelo
lineal propuesto, Y=bX+a.
o De la pendiente (b): se determina como parámetro indicativo de la sensibilidad del
método o para evaluar la correlación de diferentes métodos.
o De la ordenada al origen (a): se determina para evaluar la proporcionalidad de la
función analítica, es decir, que la recta pase por el origen y que cualquier desviación
pueda adjudicarse únicamente a un error aleatorio.
El valor r=1 ó -1, indica una recta perfectamente lineal. En la práctica r es
generalmente mayor a 0,99. Además se calcula el coeficiente de determinación r2,
porcentaje de variabilidad de los datos que se explica por la asociaciónentre las dos
variables. Sin embargo, el mejor indicador del modelo lineal no es r sino un test
estadístico, en el cual se calcula un valor de tr con n-2 grados de libertad y se compara
con el valor t tabulado para el nivel de confianza requerido. Si el valor observado de tr
es mayor que t tabla, se rechaza la hipótesis, siendo la correlación lineal significativa con
la probabilidad calculada (Quattrocchi et al., 1992).

30
3.4.2 Precisión
La precisión está relacionada con la dispersión de la medidas alrededor de su
valor medio central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales
cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra
homogénea. La precisión se expresa matemáticamente como la desviación estándar, δ,
estimada analíticamente por s o más comúnmente como la desviación estándar relativa
(RSD) o coeficiente de variación (CV). Ambos estimadores, desviación estándar y
desviación estándar relativa permiten evaluar la incertidumbre en la estimación de la
medida (error aleatorio, correspondiente a la dispersión de datos alrededor de la
media).
Se calcula como:
%C V = (s x 100) / ⎯X
La precisión de un método analítico deberá estudiarse sobre:
o El sistema: evaluando la dispersión de al menos 6 inyecciones del estándar.
o El método: evaluando la dispersión de varias preparaciones de la muestra final
homogénea. La evaluación corresponde a todo el procedimiento, desde la
preparación de la muestra hasta la medición del analito por parte del instrumento.
En este caso, la precisión debe medirse en condiciones de Repetibilidad (mismo
analista, mismo día, mismo instrumento) y Reproducibilidad (diferente analista,

31
diferente día, diferente instrumento). El criterio de aceptación puede ser variable y
estará dictado por los objetivos buscados. (Quattrocchi et al., 1992).
La USP XXIV y la OMS hacen énfasis en el término “precisión intermedia”, que
establece la posibilidad de variar el analista, el equipo o el día del análisis, sin cumplir
con los tres requisitos a la vez como lo exige la condición de “Repetibilidad”.
3.4.3 Exactitud
La exactitud de un método, también conocida como error sistemático o
tendencia, corresponde a la diferencia entre el valor obtenido (media) y el valor
verdadero.
Matemáticamente, suele expresarse como porcentaje de recuperación.
__
Recuperación: R= (X / X) x 100
Donde ⎯X es el valor medio y X el valor verdadero. Si bien este valor de
concentración no se conoce sino que sólo puede estimarse, es posible preparar una
muestra por un procedimiento más exacto que el evaluado y utilizarla como referencia.
La exactitud debe ser tan pequeña como sea posible para que el valor medido se
aproxime al de referencia. Dicho de otro modo, la recuperación del analito debe
acercarse al 100%. Para esta determinación se requiere que el valor medio no difiera
significativamente del aceptado como referencia. También puede utilizarse un ensayo t
de student, efectuando varias determinaciones de al menos tres concentraciones del

32
analito, preparadas al menos por triplicado, comprendidas dentro del rango de
linealidad del sistema. Se calcula un t experimental que se compara con el t de tablas
para n-1 grados de libertad en el nivel de confianza escogido, generalmente p= 0,05.
(Quattrocchi et al., 1992).
T experimental = [100- R] / (%CV √n)
Los valores de t experimental y el tabulado se comparan para el intervalo de
confianza requerido con n-1 grados de libertad y la exactitud o inexactitud se evalúan
para el promedio de recuperaciones de todas las concentraciones. Si t exp <t tabla, no
existe diferencia significativa con el 100% de recuperación y la exactitud es apropiada.
3.4.4 Selectividad o especificidad
Este parámetro se refiere a la propiedad del método de producir una señal
medible debida sólo a la presencia del analito, libre de interferencia de otros
componentes, en la matriz de la muestra.
En muchos casos, la determinación de este parámetro no puede seguir modelos
tan sistemáticos y dependerá del arte e ingenio del analista, pudiéndose tomar como
referencias:
o Tiempo de retención: sirve como primera base para la identificación del pico, pero
esto a veces no resulta suficiente. En el caso de disponer de estándares, la
coinyección de estos y la comparación cuidadosa de los cromatogramas resultantes,
puede servir como primera aproximación.

33
o Modificación de las condiciones cromatográficas: variando la proporción de
solventes, modificadores, pH, etc.
o Caracterización espectral.
o Cambiar a un detector de mayor selectividad.
o Empleo de técnicas enzimáticas para la transformación del analito.
o Reacciones degradativas: (oxidación, reducción, fotólisis) empleadas para
comprobar la disminución o desaparición de la señal del analito (Quattrocchi et al.,
1992).
3.4.5 Sensibilidad
La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima cantidad de
analito que puede producir un resultado significativo.
Los parámetros a definir al evaluar la sensibilidad de un método son los límites
de detección y de cuantificación.
o Límite de Detección: corresponde a la menor concentración de analito que puede
detectarse, pero no necesariamente cuantificarse en una muestra, en las
condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración. Su
determinación puede efectuarse por comparación con la respuesta de un blanco o
placebo, siendo positiva cuando la señal supere la relación señal/ ruido en un factor
de 2 ó 3.
34
o Límite de Cuantificación: corresponde a la menor concentración de analito que
puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones
establecidas y también se expresa en unidades de concentración. En este caso,
generalmente se mide la señal de fondo (relación señal/ruido), efectuando
mediciones repetidas sobre un blanco o placebo, se mide su desviación estándar y
se calcula el límite de cuantificación multiplicando esa desviación estándar por un
factor, generalmente igual a 10.
Los límites de detección y cuantificación también pueden estimarse a partir de la
curva de regresión, siempre que se hayan considerado concentraciones bajas de
analito, por extrapolación a concentración cero (Quattrocchi et al., 1992).
Los límites de detección y cuantificación se calculan de la siguiente manera:
Límite de detección: Ybl + 3 Sbl
Límite de cuantificación: Ybl + 10 Sbl
B: es la pendiente de la curva de calibración.
Ybl: estimado de la respuesta del blanco
Sbl: desviación estándar a concentración cero.

35
4 HIPÓTESIS DE TRABAJO
La secreción de caracol silvestre Helix aspersa Müller contiene ácido glicólico, y
su concentración varía según el tipo de alimentación y el período estacional de
obtención.
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVOS GENERALES
o Implementar y validar un método analítico por Cromatografía Líquida de Alta
Eficiencia para la identificación y cuantificación de ácido glicólico.
o Determinar si existen variaciones en la concentración de ácido glicólico en diferentes
muestras de secreción de caracol Helix aspersa Müller, según tipo de alimentación
del caracol y período estacional de obtención de la secreción.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
o Desarrollar un método de extracción de ácido glicólico desde la secreción de caracol
Helix aspersa Müller.
o Desarrollar e implementar un método analítico por HPLC para identificar y cuantificar
ácido glicólico en la secreción del caracol Helix aspersa Müller.

36
o Validar un método analítico a través de la determinación de los parámetros;
linealidad, exactitud, precisión, selectividad y sensibilidad.
o Determinar la concentración de ácido glicólico en la secreción de caracol Helix
aspersa Müller en tres épocas del año (octubre, diciembre y marzo) las cuales
corresponden al inicio, mitad y término del período activo del caracol y con tres
diferentes tipos de alimentación del caracol (vegetales verdes, específicamente
lechuga y repollo, harina de maíz y harina de soya).

37
6 MATERIALES Y MÉTODOS
Se desarrolló un método analítico para determinar ácido glicólico en muestras de
secreción de caracol Helix aspersa Müller. Éste consta, básicamente, de precipitación
de proteínas, eliminación de impurezas con un solvente orgánico y filtración de la
muestra para inyectarse al equipo cromatográfico.
Posteriormente, el método fue validado considerando los parámetros de
linealidad, precisión, exactitud, selectividad y sensibilidad.
Una vez validado el método, las diferentes muestras de secreción fueron tratadas
y analizadas para determinar la presencia del analito en cuestión. Posteriormente, se
estudió si existen diferencias entre ellas respecto a la concentración de ácido glicólico,
a través del análisis estadístico ANOVA de dos vías y post test de Bonferroni, utilizando
el programa estadístico GraphPad Prism 4.00 para Windows, GraphPad Software, san
Diego, California, USA.
6.1 MUESTRAS
o Secreción pura de caracol Helix aspersa Müller, obtenida de un criadero ubicado en
la localidad de Caulín, Ancud, Región de Los Lagos. (41°49’51.77’’ latitud Sur y
73°31’13.73’’ longitud Oeste). Los caracoles se dividieron en tres grupos para ser
alimentados de manera diferente. Un grupo fue alimentado sólo con vegetales,
lechuga y repollo; otro con harina de maíz y el último, con harina de soya. Cada uno
de estos grupos estuvo formado por 300 caracoles adultos, los que se mantuvieron
en cajas plásticas. Se realizó aseo diario y ayuno un día antes de la obtención de la
secreción para disminuir las probabilidades de contaminación con sus propios

38
desechos, durante este proceso. A cada uno de estos grupos se les extrajo su
secreción de forma manual, directamente desde el pie, en diferentes períodos del
año; octubre de 2005, diciembre de 2005 y marzo de 2006, correspondiente al inicio,
mitad y término del período activo del caracol, obteniéndose un total de 9 tipos de
muestras diferentes.
6.2 REACTIVOS UTILIZADOS
o Estándar ácido glicólico Sigma ®.
o Agua grado HPLC Merck ®.
o Metanol grado HPLC Merck®
o N- Hexano Merck®.
o Ácido tricloroacético (TCA) Merck®
o Fosfato de amonio dihidrogenado Merck®
o Ácido fosfórico 85% Merck®
6.3 INSTRUMENTAL Y EQUIPOS
o Cromatógrafo líquido de alta resolución Jasco
o Detector UV-Visible Jasco con lámpara de deuterio modelo UV- 2075 plus.
o Bomba cuaternaria Jasco modelo PU-2089 plus.
o Balanza analítica digital Denver Instrument Company® modelo AA200.
o Medidor de pH Hanna Instrument® modelo HI9321
o Centrífuga P. Selecta Mixtasel 96.
o Liofilizador VIRTIS 10-145 MR- BA.

39
o Filtros millipore durapore 0,25 um de poro.
o Columna Phenomenex® C- 18, 250 x 4,6 mm 5 micrón.
o Software Jasco ChromPass Chromatography Data System connection V. 1.7.403.1.
o Jeringa 100 μL Hewlett Packard®
o Material de vidrio.
6.4 METODOLOGÍA ANALÍTICA
6.4.1 Condiciones Cromatográficas.
Para implementar el método y las condiciones cromatográficas, se revisó
bibliografía que contiene estudios de determinación de ácido glicólico en frutos (Abreu
et al., 2001), cosméticos (Nicoletti et al., 1999; Couch, L., Howard, P., 2002; Scalia et
al., 1998), sangre y orina (Narayanan et al., 1999), todas por HPLC.
Después de probar cada uno de los métodos anteriormente mencionados y
modificaciones de ellos, se establecieron las siguientes condiciones de análisis:
o Condiciones isocráticas.
o Fase móvil: Buffer fosfato de amonio dihidrogenado. (NH4H2PO4) 5 mM, pH 2,2.
o Velocidad de flujo: 0,5 mL/ min.
o Longitud de onda: 210 nm.
o Tiempo de análisis: 10 minutos.
o Temperatura: Ambiente, 22° C aproximadamente.
o Presión: 8,5 a 9,2 MPa.
o Volumen de inyección: 20 μL.

40
6.4.1.1 Preparación de la fase móvil
Para preparar la fase móvil, se pesaron 0,5752 gramos de fosfato de amonio
dihidrogenado los que se disolvieron en agua grado HPLC para obtener 1 litro de
solución. El pH fue ajustado a 2,2 con ácido fosfórico al 8,5%. Antes de utilizar la fase
móvil, ésta se filtró a través de filtros millipore de 2 micras de tamaño de poro.
6.4.2 Tratamiento de muestras de secreción de caracol
Las muestras de secreción de caracol fueron obtenidas por estimulación directa
del pie de éste, con una espátula metálica, hasta obtener una secreción espesa, muy
viscosa y elástica. Éstas se fraccionaron en envases plásticos, cubiertos con papel
aluminio y congeladas a – 21°C para su mantención. Posteriormente, las muestras se
liofilizaron para disminuir la probabilidad de contaminación y de degradación durante los
días de análisis. Se pesó la cantidad determinada de liofilizado (Anexo N° 2, Tablas N°
1 y N° 2) para preparar la suspensión correspondiente y luego se sometieron al análisis.
Para obtener cromatogramas más limpios, sólo se pesó un cuarto de lo debido,
obteniéndose suspensiones diluidas, a las que posteriormente, se les corrigieron sus
concentraciones multiplicando por su factor de dilución, igual a 4 (Anexo N°4, Ejemplo
N°1).
Para cada determinación se preparó 3 mL de secreción, diluida cuatro veces, a
los que se les agregó ácido tricloroacético (TCA) al 10 % para precipitar las proteínas,
en cantidad suficiente para alcanzar pH 1, ya que no todas las muestras necesitaban
igual cantidad (Anexo N°2, Tabla N° 2). La muestra se mantuvo 15 minutos en el
congelador (-21°C) para ayudar en la precipitación y posteriormente se centrifugó por

41
15 minutos a 3500 revoluciones por minuto. De este proceso se retiró la solución
sobrenadante que se utilizó para el siguiente paso, y el pellet fue descartado.
La solución sobrenadante se inyectó al cromatógrafo, sin embargo, se obtuvo un
cromatograma con muchos picos y algunos de ellos, poco definidos. Por lo tanto, se
realizó una extracción de impurezas de la muestra utilizando solventes orgánicos. Se
mezcló en un embudo de decantación de 100 mL, el sobrenadante, con 9 mL de
Hexano, se agitó por 2 minutos, se descartó la fase orgánica de la mezcla y la fase
acuosa, que contenía el analito en cuestión y que presentaba pH 1, se filtró y se inyectó
en el equipo cromatográfico, obteniéndose claramente un cromatograma mucho más
limpio.
Cabe mencionar que se probaron diferentes agentes deproteinizantes como
Metanol, Acetona, Ácido Perclórico (PCA) y también diferentes soluciones extractivas
Hexano, Diclorometano, Tetracloruro de Carbono, en variadas proporciones, puras y
mezclas de ellas. Sin embargo, fueron las condiciones anteriormente establecidas las
que permitieron obtener cromatogramas con menos interferentes.
6.4.3 Validación
6.4.3.1 Preparación de estándares
Antes de comenzar el proceso de validación, se preparó una solución stock de
ácido glicólico al 0,1 %. Para ello se pesaron 0,0250 gramos de estándar de ácido
glicólico y se aforó en un matraz de 25 mL con fase móvil. De esta solución stock, se
tomaron diferentes alícuotas para preparar estándares a diferentes concentraciones, los
que también fueron diluidos con fase móvil.

42
6.4.3.2 Linealidad
Para determinar este parámetro, se utilizó una curva de calibración de ácido
glicólico, que consideró los siguientes puntos: 20 μg/mL, 40 μg/mL, 60 μg/mL, 80 μg/mL
y 100 μg/mL, donde cada uno de ellos se inyectó por triplicado. Se obtuvo entonces, el
coeficiente de correlación, el de determinación y la ecuación de la recta. Posteriormente
se comprobó la linealidad del método, utilizando un test estadístico.
6.4.3.3 Precisión del sistema instrumental
6.4.3.3.1 Repetibilidad
Para determinar si el sistema instrumental es preciso en condiciones de
repetibilidad se utilizaron estándares de ácido glicólico en tres diferentes
concentraciones, 40 μg/mL, 60 μg/mL y 80 μg/mL, los que fueron inyectados diez veces
cada uno para evaluar su dispersión. Se determinó el promedio, desviación estándar y
coeficiente de variación.
6.4.3.3.2 Precisión Intermedia
Para determinar si el sistema instrumental es preciso en condiciones de precisión
intermedias, es decir, diferente día de análisis, se utilizó un estándar de 80 μg/mL el
que se inyectó por triplicado durante cuatro días consecutivos. Se determinó el
promedio, desviación estándar y coeficiente de variación.

43
6.4.3.4 Precisión del método
6.4.3.4.1 Repetibilidad
Para determinar si el método utilizado es preciso en condiciones de repetibilidad,
se sometieron diferentes concentraciones de estándares al método analítico completo.
Para ello se utilizaron estándares de ácido glicólico en tres diferentes concentraciones,
40 μg/mL, 60 μg/mL y 80 μg/mL. Cada uno de ellos se sometió siete veces al método
analítico completo, durante el mismo día, obteniéndose un total de 21 determinaciones.
Posteriormente se calculó el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de
variación.
6.4.3.4.2 Precisión Intermedia
Para determinar si el método utilizado es preciso en condiciones de precisión
intermedia, se sometieron diferentes concentraciones de estándares al método analítico
completo. Para ello se utilizó estándares de ácido glicólico en tres diferentes
concentraciones, 40 μg/mL, 60 μg/mL y 80 μg/mL. Cada uno de ellos se sometió tres
veces al método analítico completo, durante cuatro días consecutivos, obteniéndose un
total de 12 determinaciones por cada nivel de concentración. Posteriormente se calculó
el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
6.4.3.5 Exactitud
Este parámetro, también conocido como porcentaje de recuperación, se
determinó utilizando estándares de ácido glicólico a diferentes concentraciones, 40

44
μg/mL, 60 μg/mL y 80 μg/mL, los que se sometieron al método analítico completo. Cada
uno de los estándares se inyectó por duplicado antes de someterlos al método analítico
para tener una visión aproximada de las áreas al inicio de la determinación. Cada
estándar se sometió cuatro veces al método analítico. Se calculó el promedio de las
concentraciones obtenidas y se determinó el porcentaje de recuperación según la
fórmula. Además, se realizó el ensayo de t de Student para confirmar el resultado
obtenido.
6.4.3.6 Selectividad
Este parámetro puede determinarse de varias maneras. En esta oportunidad se
analizaron los tiempos de retención de 10 inyecciones de un estándar de ácido glicólico
de 80 μg/mL. Se determinó el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de
variación. Sin embargo, otra de las formas de determinar si el método es selectivo es
agregar, a una muestra de secreción, una cantidad de ácido glicólico de concentración
conocida y ver si se aprecia un aumento en el pick en cuestión de la muestra. Esto se
realizó y se puede apreciar en el análisis de las muestras de secreción.
6.4.3.7 Sensibilidad
Para determinar los límites de detección y cuantificación, se determinó la
pendiente de la curva de calibración. Posteriormente se obtuvo otra curva de
calibración, inyectando cada punto por triplicado, pero en este caso para
concentraciones más bajas de analito, determinándose la ecuación de esta nueva recta
y extrapolando la respuesta a concentración cero, obteniéndose un estimado de la

45
respuesta del blanco, Ybl. Finalmente, se determinó la desviación estándar
correspondiente a cada concentración de la curva fabricada con concentraciones bajas
de analito, se determinó la recta correspondiente a concentración (μg/mL) v/s
desviación estándar y se extrapola como en el caso anterior, la desviación estándar a
concentración cero, obteniéndose el estimado Sbl, correspondiente a la desviación
estándar del blanco.

46
7 RESULTADOS
7.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
7.1.1 Linealidad
Para evaluar si el método utilizado para la determinación de ácido glicólico en las
muestras es lineal en las concentraciones utilizadas, se preparó una curva de
calibración con 5 puntos, a partir de una solución madre de 1000 μg/mL, donde cada
uno de ellos se inyectó por triplicado. (Quattrochi et al., 1992).
Tabla N° 1: Curva de calibración Concentración (μg/mL) v/s Área (mVx Min) para
determinar linealidad del método analítico.
Punto Concentración (μg/mL) Área (mVxMin) Área Promedio (mVxMin)

1 20 0.42
2 20 0.39
3 20 0.40 0.40
4 40 0.82
5 40 0.83
6 40 0.82 0.82
7 60 1.23
8 60 1.23
9 60 1.23 1.23
10 80 1.69
11 80 1.69
12 80 1.69 1.69
13 100 2.08
14 100 2.07
15 100 2.07 2.07
47
La ecuación obtenida de la curva analizada es:
Y= 0,02103X - 0,01815, cuyo coeficiente de correlación r = 0,9994
Grafico N° 1: Curva de calibración Concentración (μg/mL) v/s Área (mV x Min)
Calibration curve: ACIDO_GLICOLICO_2__ - ACIDO_GLICOLICO
2
Area
20 30 40 50 60 70 80 90 100
ug/mL
7.1.2 Precisión del Sistema instrumental
7.1.2.1 Repetibilidad de sistema instrumental
Los resultados cromatográficos obtenidos bajo condiciones de repetibilidad del
sistema instrumental se encuentran resumidos en la siguiente tabla, indicando el
promedio, desviación estándar (D.S) y coeficiente de variación porcentual (%C.V) de
las áreas de los picos (Quattrochi et al., 1992).

48
Tabla N° 2: Valores obtenidos para el parámetro de precisión del sistema instrumental
en condiciones de repetibilidad.
Concentración 40 μg/mL 60 μg/mL 80 μg/mL
Área (mVxMin) 0,85 1,27 1,68

Área (mVxMin) 0,85 1,23 1,66
Área (mVxMin) 0,86 1,29 1,68
Área (mVxMin) 0,88 1,29 1,71
Área (mVxMin) 0,87 1,29 1,71
Área (mVxMin) 0,88 1,26 1,70
Área (mVxMin) 0,86 1,29 1,72
Área (mVxMin) 0,88 1,27 1,70
Área (mVxMin) 0,89 1,29 1,72
Área (mVxMin) 0,87 1,26 1,72
Promedio 0,87 1,27 1,70
D.S 0,0137 0,0201 0,0205
%C.V 1,58 1,58 1,21
49
Figura N° 1: Cromatograma de un estándar de ácido glicólico de concentración 80
μg/mL para la determinación del parámetro de precisión del sistema instrumental en
condiciones de repetibilidad.
7 mV ACIDO_GLICOLICO_2_240.DATA
O
C
I
L
O
6 C
I
L
G
_
O
D
I
C
5 A
0
0,
0
1
2
H
T
S
0
1 2,
0
W
P
S
RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5.1.2.2 Precisión Intermedia del sistema instrumental
Los resultados cromatográficos obtenidos bajo condiciones de precisión
intermedia del sistema se encuentran resumidos en la siguiente tabla, indicando el
promedio, desviación estándar (D.S) y coeficiente de variación porcentual (% C.V) de
las áreas de los picos.

50
Tabla N° 3: Valores obtenidos para el parámetro de precisión del sistema instrumental
en condiciones de precisión intermedia.
Concentración / 80 μg/mL 80 μg/mL 80 μg/mL 80 μg/mL

Período Día 1 Día 2 Día 3 Día 4
Área (mVxMin) 1,65 1,68 1,69 1,72
Área (mVxMin) 1,71 1,66 1,70 1,70
Área (mVxMin) 1,67 1,68 1,72 1,71
Promedio 1,68 1,67 1,70 1,71
D.S 0,0306 0,0115 0,0153 0,0100
% C.V 1,82 0,69 0,90 0,58
μg/mL para la determinación del parámetro de precisión del sistema instrumental en
condiciones de precisión intermedia. Día 4.
mV ACIDO_GLICOLICO_2_250.DATA
7 O
C
I
L
O
C
I
L
G
_
6
O
D
I
C
A
5
3
0
0,
0
1
2
H
T
S
0
1 2,
0
W
P
S
RT [min]
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
51
7.1.3 Precisión del método
7.1.3.1 Repetibilidad del método
Los resultados cromatográficos obtenidos bajo condiciones de repetibilidad del
método se encuentran resumidos en la siguiente tabla, indicando el promedio,
desviación estándar (D.S) y coeficiente de variación porcentual (% C.V) de las áreas.
Tabla N° 4: Valores obtenidos para el parámetro de precisión del método en

condiciones de repetibilidad.
Concentración 40 μg/mL 60 μg/mL 80 μg/mL

Área (mVxMin) 1,01 1,36 1,68
Área (mVxMin) 1,04 1,48 1,66
Área (mVxMin) 1,04 1,47 1,68
Área (mVxMin) 1,01 1,54 1,71
Área (mVxMin) 1,05 1,54 1,71
Área (mVxMin) 1,00 1,46 1,70
Área (mVxMin) 1,01 1,53 1,72
Promedio 1,02 1,48 1,69
D.S 0,0198 0,0640 0,0215
% C.V 1,93 4,31 1,27
52
Figura N° 3: Cromatograma de un Estándar de ácido glicólico de concentración 80
μg/mL para la determinación del parámetro de precisión del método en condiciones de
repetibilidad.
8 O
C
I
L
O
C
I
7 L
G
_
O
D
I
C
6 A
30
0,
0
1
H
T
2
S
0
1 20,
W
P
S
0 RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
7.1.3.2 Precisión Intermedia del método
Los resultados cromatográficos obtenidos bajo condiciones de precisión
intermedia del método se encuentran resumidos en la siguiente tabla, indicando el
promedio, desviación estándar (D.S) y coeficiente de variación porcentual (% C.V) de
las áreas de los picos.

53
condiciones de precisión intermedia para un estándar de 40 μg/mL.

Área (mVxMin) 1,01 1,01 0,99 0,99
Área (mVxMin) 1,04 1,00 0,99 0,99
Área (mVxMin) 1,04 1,01 1,00 1,00
Promedio 1,03 1,01 0,99 0,99
D.S 0,0173 0,0058 0,0058 0,0058
% C.V 1,68 0,57 0,58 0,58

Área (mVxMin) 1,36 1,44 1,46 1,41
Área (mVxMin) 1,48 1,52 1,52 1,41
Área (mVxMin) 1,47 1,51 1,54 1,47
Promedio 1,44 1,49 1,51 1,43
D.S 0,0666 0,0436 0,0416 0,0346
% C.V 4,63 2,93 2,76 2,42
54

Área (mVxMin) 1,96 2,06 2,01 2,02
Área (mVxMin) 1,96 2,04 2,01 2,00
Área (mVxMin) 1,93 2,13 2,06 2,06
Promedio 1,95 2,08 2,03 2,03
D.S 0,0173 0,0473 0,0289 0,0306
% C.V 0,89 2,28 1,42 1,51
μg/mL para la determinación del parámetro de precisión del método en condiciones de
precisión intermedia. Día 1.
O
C
I
L
5 O
C
I
L
G
_
O
D
I
C
4 A
200,
0
1
H
T
S
10
2,
0
W
P
S
0 RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
55
7.1.4 Exactitud / Porcentaje de recuperación
Antes de determinar este parámetro, se inyectó un estándar de cada
concentración para ver el área inicial de estos y a partir de esta información determinar
el % de recuperación.
Tabla N° 8: Concentración inicial de Estándares de ácido glicólico.
Concentración
(μg/mL) 40 60 80
Área (mVxMin) 0,85 1,26 1,71

Área (mVxMin) 0,85 1,24 1,69
Promedio 0,85 1,25 1,70
56
Tabla N° 9: Porcentajes de recuperación obtenidos para los diferentes estándares de
ácido glicólico.
Concentración Área Concentración Prom. % Prom.

(μg/mL) (mVxMin) (μg/mL) (μg/mL) D.S % C.V Recup. %
Recup.
40 0,88 42,34 105,85
40 0,81 38,76 96,90
40 0,84 40,61 101,53
40 0,85 40,88 40,65 1,4700 3,62 102,20 101,63
60 1,24 59,81 99,68
60 1,27 61,20 102,00
60 1,28 61,80 103,00
60 1,28 61,82 61,16 0,9433 1,54 103,03 102,00
80 1,67 80,20 100,25
80 1,72 82,63 103,29
80 1,73 83,01 103,76
80 1,71 82,45 82,07 1,2700 1,55 103,06 102,59
Promedio 2,24 102,07
(Anexo N° 4, ejemplo N° 3)
Además se realizó un ensayo de t de Student. Para esto se utilizó la siguiente
fórmula y se comparó con los valores de la tabla t de Student (Anexo N° 2,Tabla N°
13).
Según la formula;
T experimental = [100- R] / (%CV √n) R: Porcentaje de recuperación promedio
T experimental = [100- 102,07] / (2,24√12) %CV: Coeficiente de variación promedio
T experimental = 0,2703 n: número de estándares sometidos al proceso

57
μg/mL antes de someterlo a la metodología para la determinación del porcentaje de
recuperación.
4
O
C
I
L
O
C
I
L
G
_
O
D
I
3 C
A
0
0,
0
1
H
T
S
1
0
2,
0
W
P
S
RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
μg/mL después de someterlo a la metodología para la determinación del porcentaje de
recuperación.
4
O
C
I
L
O
C
I
L
G
_
O
D
I
C
3 A
0
0,
0
1
H
T
S
1
0
2,
0
W
P
S
RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
58
7.1.5 Selectividad o Especificidad
Los resultados se muestran en la siguiente tabla, donde además se determinó el
promedio de los tiempos de retención obtenidos al inyectar 10 estándares, la desviación
estándar y el coeficiente de varianza porcentual.
Tabla N° 10: Tiempos de retención para la determinación del parámetro de selectividad.
Estándar (μg/mL) Tiempo de Retención (Min)

1 7,533
2 7,533
3 7,483
4 7,483
5 7,475
6 7,475
7 7,475
8 7,467
9 7,467
10 7,458
Promedio 7,485
D.S 0,0264
% C.V 0,3532
59
7.1.6 Sensibilidad (Límite de detección y Límite de cuantificación)
Tabla N° 11: Curva de calibración concentración (μg/mL) v/s área (mVx Min) para
determinar el parámetro de sensibilidad del método analítico.
Concentración Área Área Promedio

Punto (μg/mL) (mVxMin) (mVxMin) D.S
1 5 0.11
2 5 0.14
3 5 0.11 0,12 0,0173
4 10 0.26
5 10 0.25
6 10 0.24 0,25 0,0100
7 15 0,35
8 15 0,34
9 15 0,35 0,35 0,0058
10 20 0,44
11 20 0,46
12 20 0,45 0,45 0,0096
13 25 0,57
14 25 0,57
15 25 0,58 0,57 0,0058
La ecuación obtenida de la curva analizada es:
Y= 0,02210X + 0,01626, cuyo coeficiente de correlación r = 0,9978

60
Grafico N° 2: Curva de calibración concentración (μg/mL) v/s área (mV x Min) para la
determinación de la sensibilidad del método.
Calibration curve: Glicólico_Sensibilidad - Acido Glicólico

0,62
0,6
0,58
0,56
0,54
0,52
0,5
0,48
0,46
0,44
0,42
0,4
0,38
0,36
Area
0,34
0,32
0,3
0,28
0,26
0,24
0,22
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
ug/ml
Además, de la recta correspondiente a concentración (de 5 a 25 μg/mL) v/s D.S se
obtiene:
Y= -0,000468X + 0,01672.
Recordemos que de la curva de calibración se obtuvo (Tabla N° 1):
Y= 0,02103X - 0,01815
61
7.1.6.1 Cálculo de los límites de detección y cuantificación.
Límite de detección: Ybl + ( 3 Sbl)
Límite de cuantificación: Ybl + ( 10 Sbl)
Según lo descrito anteriormente, se tiene que:
b= 0,02103
Ybl = 0,01626
Sbl= 0,01672
Por lo tanto:
Límite de detección: 0,01626+ (3x 0,01672) = 3, 16 μg/mL
0,02103
Límite de cuantificación: 0,01626 + (10x0,01672) = 8,72 μg/ mL
0,02103
62
7.2 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOL
Una vez validado el método, se determinó la presencia de ácido glicólico en
muestras de secreción de caracol Helix aspersa Müller. Al inyectar una muestra de
secreción de caracol, previamente sometida al método analítico, se analizó el
cromatograma obtenido donde se aprecia un pico a los 7,5 minutos aproximadamente,
correspondiente a ácido glicólico. Para asegurar que éste corresponde al ácido en
cuestión, se agregó una cantidad determinada de estándar de ácido glicólico de
concentración conocida a la muestra de secreción. Esta muestra, también liofilizada,
correspondía a otro criadero en donde los caracoles recibieron alimentación variada.
El aumento en el tamaño del pico de la muestra, confirma que éste corresponde
a ácido glicólico.
Figura N° 7 (a): Cromatograma de secreción de caracol Helix aspersa Müller,
correspondiente a otro criadero (Futrono) y de alimentación variada.
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
0
0, O
60
0 C
1 I
50
H L
T O
S C
I
40 L
G
_
30
0 O
20 2, D
I
0 C
10W A
P
0S
RT [min]
-10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
63
Figura N° 8: Acercamiento del cromatograma anterior.
8 O
CI
L
O
7 CI
L
G
_
6 O
DI
C
5 A
-1
-2
-3
RT [min]
-4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Para confirmar la presencia de ácido glicólico se tomó un estándar de
concentración conocida, correspondiente a 1000 μg/mL y se agregó a una muestra de
secreción. Para esta mezcla, se tomaron 900 μL de la muestra de secreción de caracol
y 100 μL del estándar de ácido glicólico, obteniéndose los resultados que se muestran
en la siguiente tabla.
64
Tabla N° 12: Confirmación de la presencia de ácido glicólico en muestras de secreción
de caracol Helix aspersa Müller.
Concentración Microgramos que Tiempo de

(μg/mL) se consideran retención
marcada por para la mezcla (Minutos)
el equipo
Estándar de ácido glicólico 1000 1037,6 103, 76 7,475
μg/mL
Muestra de secreción liofilizada 101,81 91,63 7,467
Mezcla de 900 μL de muestra + 191, 37 195,39 7,442
100 μL de estándar 1000 μg/mL
Al tomar 100 μL del estándar de ácido glicólico de concentración 1037,6 μg/mL y
900 μL de la muestra de secreción de caracol que contiene 101,81 μg/mL de ácido
glicólico, se está considerando que teóricamente 103,7 μg de ácido glicólico
corresponden a los incorporados por el estándar y 91, 63 μg a los de la muestra. Si se
suman estos microgramos de ácido glicólico se obtiene el total de microgramos en los
1000 μL de mezcla, que corresponden a 195, 39 μg. Por lo tanto, al inyectar la mezcla,
se espera obtener una concentración de 195,39 μg/mL, aproximadamente. (Anexo N° 4,
ejemplo N° 4). Al inyectar esta mezcla al equipo cromatográfico, se aprecia
notoriamente un aumento del tamaño del pico de la muestra y la concentración obtenida
fue de 191, 37 μg/mL (Anexo N° 4, ejemplo N° 4).

65
Figura N° 8: Superposición de Cromatogramas de secreción de caracol Helix aspersa
Müller y de estándar de ácido glicólico.
24
22 ACIDO_GLICOLICO_2_258.DATA
O ACIDO_GLICOLICO_2_259.DATA
CI
20 L
O
CI
L
18 G
_
O
DI
C
16 L
C
O
A
CO
I
14 LCI
G
_OL
12 OCI
DIL
CG
10 A_
O
DI
C
8 A
-2
-4
RT [min]
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Cromatograma N° 256 (Negro): Estándar de ácido glicólico 100 μg/mL.
Cromatograma N° 258 (Azul): Muestra de secreción de caracol Helix aspersa Müller.
Cromatograma N° 259 (Rosado): Mezcla de muestra y Estándar.
Se determinó el factor de capacidad (K´) parámetro que se emplea para describir
las velocidades de migración de solutos en columnas.
Se define como:
K´ = (Tr - Tm) / Tm
66
Tr corresponde al tiempo de retención del soluto y Tm al tiempo muerto, es decir,
el tiempo en que aparece la señal de la fase móvil. Idealmente, el valor de K´ para
analitos de una muestra debe estar entre 0,5 y 20 (Quattrocchi et al., 1992).
El tiempo de retención del ácido glicólico es de 7,5 minutos y el tiempo muerto es
de 3,8 minutos, aproximadamente.
Por lo tanto:
K´ = (7,5 – 3,8) / 3,8 = 0,974
Una vez confirmada la presencia de ácido glicólico en la secreción de caracol
Helix aspersa Müller, se determinó si la alimentación y el período de obtención,
producen variaciones en la concentración de ácido glicólico en las diferentes muestras
de la secreción.
Para ello, cada una de las muestras se sometió al proceso analítico establecido,
como se explicó anteriormente. (Anexo N° 2, Tablas N° 1 y N° 2).
Los resultados se presentan a continuación.
El detalle de los resultados obtenidos, para cada tipo de muestra, se puede
apreciar en el anexo N° 2, tablas N° 2 hasta N° 11.
Los cromatogramas de los resultados obtenidos se aprecian en el anexo N° 3.

67
Tabla N° 13: Concentración promedio (μg/mL) de ácido glicólico en muestras de
secreción de caracoles alimentados con maíz según período de obtención.
Concentración promedio (μg/mL) de

Muestra ácido glicólico
Maíz / Octubre 129,57
Maíz / Diciembre 134,52
Maíz / Marzo 160,51
Gráfico N° 3: Concentración de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
Müller alimentados con Maíz.
200 **
* Maíz
Concentración [μg/mL]
P <0,05 *
P <0,01 **
100 P <0,001 ***
0
Octubre Diciembre Marzo
Mes
68
secreción de caracoles alimentados con soya según período de obtención de la
secreción.

Soya / Octubre 187,79
Soya / Diciembre 77,84
Soya / Marzo 149,23
Gráfico N° 4: Concentración de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
Müller alimentados con Soya.
**
*** ***
200
Soya
P <0,05 *
P <0,01 **
100
P <0,001 ***
0
Mes
69
secreción de caracoles alimentados con vegetales según período de obtención de la
secreción.

Vegetales / Octubre 244,45
Vegetales / Diciembre 204,81
Vegetales / Marzo 258,24
Gráfico N°5: Concentración de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
Müller alimentados con Vegetales.
300 ** *** Vegetales

200 P <0,05 *
P <0,01 **
P <0,001 ***
100
0
Mes
70
secreción de caracoles según alimentación y período de obtención de la secreción.

Maíz / Octubre 129,57
Maíz / Diciembre 134,52
Maíz / Marzo 160,51
Soya / Octubre 187,79
Soya / Diciembre 77,84
Soya / Marzo 149,23
Vegetales / Octubre 244,45
Vegetales / Diciembre 204,81
Vegetales / Marzo 258,24
Gráfico N°6: Comparación de la concentración de ácido glicólico en secreción de
caracol Helix aspersa Müller según alimentación del caracol y mes de obtención de la
secreción.
300
200
1: Octubre
2: Diciembre
3: Marzo
100
0
1 2 3 1 2 3 1 2 3
Maíz Soya Vegetales
Alimentación
71
Tabla N° 17: Concentración promedio (μg/mL) de ácido glicólico en secreción de
caracol extraída durante el mes de octubre.

Octubre / Maíz 129,57
Octubre / Soya 187,79
Octubre / Vegetales 244,45
Müller extraída en el mes de octubre.
***
300
*** *** Maíz
Soya
200 Vegetales
P <0,05 *
100
P <0,01 **
P <0,001 ***
0
Alimentación
72
caracol extraída durante el mes de diciembre.

Diciembre / Maíz 134,52
Diciembre / Soya 77,84
Diciembre / Vegetales 149,23
Müller extraída en el mes de diciembre.
***
250
*** *** Maíz
200 Soya
Vegetales
150
100
P <0,05 *
P <0,01 **
50 P <0,001 ***
0
Alimentación
73
caracol extraída durante el mes de marzo.

Marzo/ Maíz 160,51
Marzo / Soya 149,23
Marzo / Vegetales 258,24
Müller extraída en el mes de marzo.
***
300 *** Maíz
Soya
200 Vegetales
P <0,05 *
100 P <0,01 **
P <0,001 ***
0
Alimentación
74
secreción de caracoles según período de obtención y alimentación.

Octubre / Maíz 129,57
Octubre / Soya 187,79
Octubre / Vegetales 244,45
Diciembre / Maíz 134,52
Diciembre / Soya 77,84
Diciembre / Vegetales 204,81
Marzo / Maíz 160,51
Marzo / Soya 149,23
Marzo / Vegetales 258,24
Müller según período de obtención de la secreción y alimentación del caracol.
300
Maíz
Soya
200 Vegetales
100
0
Mes
75
Tabla N° 21: Concentración de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
Müller según período de obtención.
Concentración Concentración Concentración

[μg/mL] de ácido [μg/mL] de ácido [μg/mL] de ácido
glicólico en glicólico en glicólico en
muestras de muestras de muestras de
secreción secreción secreción
recolectadas en recolectadas en recolectadas en
octubre diciembre marzo
Maíz 1 125,28 140,60 154,12
Maíz 2 138,80 132,44 171,12
Maíz 3 124,64 130,52 156,28
Soya 1 184,92 76,56 156,56
Soya 2 195,12 76,16 154,24
Soya 3 183,32 80,80 136,88
Vegetales 1 234,40 198,24 255,16
Vegetales 2 256,48 203,04 264,40
Vegetales 3 242,48 213,16 255,16
Promedio 187,27 139,06 189,32
D.S 50,3199 55,2975 52,4673
% C.V 26,8701 39,7659 27,7129

76
Müller según período de obtención de la secreción.
Concentración [μg/mL] 250
200
150
100
50
0
Mes
77
Tabla N° 22: Concentración de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
Müller según alimentación.
Concentración Concentración Concentración

[μg/mL] de ácido [μg/mL] de ácido [μg/mL] de ácido
glicólico en glicólico en glicólico en
secreción de secreción de secreción de
caracoles caracoles caracoles
alimentados con alimentados con alimentados con
Octubre 1 125,28 184,92 234,40
Octubre 2 138,80 195,12 256,48
Octubre 3 124,64 183,32 242,48
Diciembre 1 140,60 76,56 198,24
Diciembre 2 132,44 76,16 203,04
Diciembre 3 130,52 80,80 213,16
Marzo 1 154,12 156,56 255,16
Marzo 2 171,12 154,24 264,40
Marzo 3 156,28 136,88 255,16
Promedio 141,53 138,28 235,84
D.S 15,8632 48,7310 25,0957
% C.V 11,2081 35,2397 10,6412

78
P <0,05 *
*** P <0,01 **
P <0,001 ***
***
250
200
150
100
50
0
Alimentación
79
8 DISCUSIÓN
8.1 MÉTODO ANALÍTICO
Al ser, el ácido glicólico, un ácido orgánico (débil) de cadena corta, en solución
coexistirá como la suma de sus formas iónica y no iónica (Quattrocchi et al., 1992).
CH2OHCOOH <-------------> CH2OHCOO- + H+
Por lo tanto, para obtener buenos resultados, se pueden utilizar dos formas de
cromatografía reversa: el control de la ionización (supresión iónica) o apareamiento
iónico. Inicialmente se probó esta última, utilizando una fase móvil de buffer fosfato de
amonio dihidrogenado (NH4H2PO4) 10 mM, pH 6,5 , incorporándole tetrabutilamonio
yoduro a 10 mM, utilizándolo como contraión para la forma ionizada y no ionizada del
ácido glicólico (Nicoletti et al, 1999). Sin embargo, no se obtuvieron buenos resultados.
El cromatograma obtenido fue poco limpio y contenía muchas señales de ruido. Por lo
tanto se intentó controlando la ionización, ya que si no fuera de esta manera, sólo se
retendría favorablemente la especie no iónica y lo haría mal la iónica, que resulta muy
polar.
El pH, por ejemplo, modifica la retención. Si el analito se encuentra disociado, el
equilibrio debe desplazarse hacia la forma no ionizada para lograr la retención. En el
caso de los ácidos carboxílicos la solución es bastante simple. Basta utilizar un pH entre
2 y 4, que habitualmente es suficiente, para controlar la ionización (Quattrocchi et al.,
1992). Según la ecuación de Henderson – Hasselbach, se obtiene que:
pH = pKa + log (A-)/(HA)

80
El pKa del ácido glicólico es 3,83 (Merck Index, 2001).
o Al trabajar con una fase móvil pH 4, se obtendría lo siguiente:
4 = 3,83 + log (A-)/ (HA) /x antilog
(A-) / (HA) = 1,48/ 1,00
Es decir, que por cada 100 moléculas de ácido glicólico, se encontrarían 148
moléculas de glicolato.
o Al trabajar con una fase móvil pH 2, se obtendría lo siguiente:
2 = 3,83 + log (A-)/ (HA) /x antilog
(A-) / (HA) = 0,0148/ 1,00
Es decir, que por cada 100 moléculas de ácido glicólico, se encontrarían 1,48
moléculas de glicolato.
Como la idea es favorecer el equilibrio a la forma no iónica, se decidió trabajar
con una fase móvil ácida, lo más cercana a 2, aún sabiendo que se podría estar
disminuyendo la vida útil de la columna cromatográfica.

81
8.2 LINEALIDAD
La curva utilizada se preparó dentro del rango de concentraciones 20 μg/mL y
100 μg/mL de ácido glicólico. La cuantificación la realizó el equipo cromatográfico por
análisis de regresión de área de los picos contra concentración de los estándares.
La bibliografía establece que la linealidad se puede determinar con el coeficiente
de correlación r, el que debe ser mayor a 0,9900 y que para este trabajo resultó ser r =
0,9994. Además, de este valor r se puede obtener el coeficiente de determinación r2, el
que indica la proporción o porcentaje de variabilidad de los datos que se explica por la
asociación entre las dos variables. Si r = 0,9994, r2=0,9988. Por lo tanto, se puede decir
que el 99,88% de la variabilidad de las áreas se explica por la variable independiente
(Quattrocchi et al, 1992) y queda un 0,12% restante de variabilidad no explicada (Rius y
Barón, 2005)
Para obtener el grado de significación se revisó, además, una tabla de prueba de
coeficiente de correlación, para n-2 grados de libertad. En este caso 15-2 =13
suponiendo una correlación positiva con una probabilidad superior al 95% (α = 0,05
que equivale a un 5%), la correlación debe ser mayor que 0,441, valor obtenido de la
tabla de prueba de coeficiente de correlación (Anexo N° 2, Tabla N° 12). Por lo tanto el r
experimental (r = 0,9994) es mayor al r de la tabla (r=0,441) lo que nos indica que los
datos obtenidos en la curva de calibración de rangos 20 – 100 µg/mL (ppm) presenta
una correlación lineal significativa.

82
8.3 PRECISIÓN DEL SISTEMA INSTRUMENTAL
8.3.1 Repetibilidad
La A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists) incluye una tabla con
datos de precisión en función de la concentración del analito, en el manual de
verificación de rangos para métodos analíticos (Anexo N° 2, Tabla Nº 14). Para las
concentraciones utilizadas en este parámetro; 40, 60 y 80 μg/mL (ppm) el coeficiente de
variación porcentual (%CV) tiene que ser inferior a 7,3% (para 10 ppm) e incluso menor
a 5,3% (para 100 ppm). Basado en esta tabla, se puede decir que los valores de los
coeficientes de variación se encuentran dentro de los rangos aceptados, ya que para 40
ppm y 60 ppm, se obtuvo un %CV igual a 1,58%. Para 80 ppm se obtuvo un %CV de
1,21%.
8.3.2 Precisión Intermedia
Para la concentración utilizada en este parámetro, 80 ppm, que se inyectó por
triplicado cada día y que fue realizada durante cuatro días consecutivos, los % CV de
cada día son; 1,82%, 0,69%, 0,90% y 0,58%, respectivamente. Cada uno de ellos se
encuentra dentro de los rangos establecidos por la A.O.A.C, considerando como valor
límite 5,3% para 100 ppm. (Anexo N°2, Tabla Nº 14)

83
8.4 PRECISIÓN DEL MÉTODO
8.4.1 Repetibilidad
Para las concentraciones utilizadas en este parámetro; 40, 60 y 80 μg/mL (ppm)
el coeficiente de variación porcentual (%CV) tiene que ser inferior a 7,3% (para 10 ppm)
e incluso menor a 5,3% (para 100 ppm). Basado en la tabla de precisión en función de
la concentración del analito de la A.O.A.C (Anexo N° 2, Tabla Nº 14) se puede decir que
los valores de los coeficientes de variación se encuentran dentro de los rangos
aceptados, ya que para 40 ppm el % CV corresponde a 1,93. Para 60 ppm, se obtuvo
un %CV igual a 4,31% y finalmente para 80 ppm se obtuvo un %CV de 1,27%.
8.4.2 Precisión Intermedia
Para las concentraciones utilizadas en este parámetro; 40 ppm, 60 ppm y 80
ppm, en donde cada una de ellas se inyectó por triplicado cada día y que fueron
analizadas durante cuatro días consecutivos se obtuvo los siguientes % CV. Para 40
ppm: 1,68%, 0,57%, 0,58% y 0,58%, cada día. Para 60 ppm se obtuvo: 4,63%, 2,93%,
2,76% y 2,42% y finalmente, para 80 ppm los % CV fueron: 0,89%, 2,28%, 1,42% y
1,51%. Cada uno de ellos se encuentra dentro de los rangos establecidos por la
A.O.A.C, considerando como valor límite 5,3% para 100 ppm. (Anexo N° 2, Tabla Nº
14).
84
8.5 EXACTITUD
La A.O.A.C. también creó una tabla de criterios de aceptación que relaciona la
concentración del analito con el % de recuperación (Anexo N° 2, Tabla Nº 15).
El promedio de los % de recuperación de cada concentración es de 102,07%,
valor que está dentro de lo permitido por la A.O.A.C si consideramos el valor 100 ppm
que establece un rango entre 90 y 107%. Más aún para 10 ppm que establece un rango
entre 80 y 110% como permitido.
Se confirmó el resultado obtenido con el ensayo de t de Student. Según la
fórmula, se obtuvo el valor t experimental = 0,2703 y el t tabulado es de 1,796. Se aprecia que
el valor experimental es menor respecto al t tabulado, no existiendo diferencia
significativa con el 100% de recuperación (Anexo N°2, Tabla N° 13)
8.6 SELECTIVIDAD
Este parámetro se determinó, inyectando 10 veces un estándar de ácido glicólico
de 80 μg/mL en donde los tiempos de retención obtenidos no presentaron grandes
variaciones. (Tabla Nº 10).
Sin embargo, para confirmar si el método es selectivo, se le agregó una cantidad
conocida de estándar de ácido glicólico de una determinada concentración a una
muestra de secreción de caracol y se apreció un aumento del pico en cuestión donde
no hubo ensanchamiento de bandas ni aparición de hombros. (Tabla Nº 12 y Figura Nº
8), lo que confirma que el pico corresponde solamente a ácido glicólico.

85
8.7 SENSIBILIDAD
Los parámetros a definir al evaluar la sensibilidad de un método analítico son los
límites de detección y cuantificación. El Límite de detección obtenido es de 3,16 μg/mL
y el límite de cuantificación es de 8,72 μg/ mL.
El método utilizado corresponde al descrito en la metodología. No obstante, se
debe dejar en claro que son varios los métodos que se pueden utilizar para determinar
los límites antes calculados (Quattrocchi et al., 1992).
Algunos autores (Quattrocchi et al., 1992) plantean que este parámetro sólo debe
determinarse para el análisis de impurezas o trazas o cuando el rango analítico se
encuentra muy próximo al límite de detección. Sin embargo, como la validación se
realizó antes de determinar las concentraciones de ácido glicólico en las diferentes
muestras de secreción, y por lo tanto no se sabía con certeza la concentración en cada
una de ellas, se determinó el parámetro con el objetivo de establecer estos límites, y no
cometer el error de analizar muestras, que por lo visto son muy variables, sin saber si
sus concentraciones son realmente detectables y cuantificables, más aún si se trabajó
con muestras diluidas, en donde perfectamente se puede obtener un valor pequeño.

86
8.8 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SECRECIÓN DE CARACOL
8.8.1 Determinación de la presencia de ácido glicólico en secreción de
caracol Helix aspersa Müller.
Para determinar la presencia de ácido glicólico en la secreción de caracol Helix
aspersa Müller, no sólo se utilizó la coincidencia del tiempo de retención entre el
estándar y el analito de la muestra, sino que además, se agregó una cantidad
determinada de estándar de ácido glicólico de concentración conocida a la muestra,
que al inyectarla al equipo, produjo claramente un aumento en la altura del pico y no
hubo ensanchamiento de bandas ni aparición de hombros. Si embargo, se aprecia una
pequeña diferencia entre el valor de la concentración de ácido glicólico esperado de
195, 39 μg/mL y el realmente obtenido 191, 37 μg/mL. Esta variación, que por cierto es
muy pequeña, no influye en la conclusión obtenida y solamente se considera un error
experimental que puede haber ocurrido al momento de mezclar los 900 μL de muestra
con los 100 μL de estándar de ácido glicólico de 1000 μg/mL, ya que es común que al
manipular cantidades tan pequeñas de volúmenes, se produzca este fenómeno, pero
queda claramente demostrado que no es un factor que permita la duda en la
confirmación de la presencia de ácido glicólico en la secreción de caracol Helix aspersa
Müller
.
87
8.8.2 Determinación del factor K´
Se determinó el factor K´ que corresponde a 0,974, valor que se encuentra
dentro del rango establecido, por Quattrocchi et al. (1992), como normal (0,5- 20). Esta
medición es muy frecuente y no sólo permite determinar la retención del analito sino
que también, ajustar la separación si ésta no es adecuada. Cuando los valores de K´
son pequeños, la resolución es pobre. Si K´ alcanza valores mayores, el tiempo de
análisis puede ser demasiado largo. Así, los valores de K´ se pueden ajustar para dar
lugar, en el cromatograma, a un gran número de picos o viceversa. Si bien el valor de
K´ obtenido en este trabajo está dentro del rango aceptado, es pequeño. No obstante,
dicho valor, demuestra las dificultades para determinar el analito en cuestión.
8.8.3 Análisis de muestras de secreción de caracoles Helix aspersa Müller
sometidos a diferentes dietas y períodos de obtención de la secreción.
Se sabe que el ácido glicólico es un producto de la fotorrespiración, proceso que
ocurre en las plantas, y que el caracol se alimenta de ellas. Sin embargo, no existen
estudios publicados que establezcan si este molusco, por alguna ruta metabólica,
sintetiza el ácido de novo, lo produce a partir de algún intermediario metabólico o si lo
obtiene como tal de la alimentación. Cualquiera sea la manera de obtenerlo, mediante
una o varias de las posibilidades anteriormente propuestas, se confirma la presencia del
analito en cada una de las diferentes muestras analizadas y que la concentración de
ácido glicólico varía según la alimentación del caracol y el período estacional de
obtención u ordeña de la secreción.

88
El ciclo anual del caracol Helix aspersa Müller varía según las condiciones
ambientales y el lugar geográfico en donde se encuentre la población (Iglesias et al.,
1996). En este estudio, octubre fue el período de inicio de la actividad del caracol,
después de un largo período de letargo, que finalizó durante el mes de marzo, para
volver al período de hibernación.
Existen autores que han estudiado las diferencias, entre los períodos de
hibernación y actividad, en el consumo de Oxígeno (Bishop y Brand, 2000) y
metabolismo de algunos componentes en diferentes órganos (Ramos- Vasconcelos y
Hermes- Lima, 2003; Ramos- Vaconcelos et al, 2005) de Helix aspersa. Sin embargo,
no existen publicaciones que establezcan si existen variaciones en los componentes de
la secreción durante estos dos períodos.
Se ha observado que una vez que los caracoles despiertan del período de
hibernación, lo hacen con un hambre desmedido, comiendo grandes cantidades para
recuperar la energía perdida durante este período (Benito, 2004).
8.8.4 Determinación de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
Müller según período de obtención de la secreción.
En las tablas N° 13, 14, 15 y 16 y gráficos N° 3, 4, 5 y 6 se logran apreciar
claramente las diferencias en la concentración de ácido glicólico según el período
estacional, es decir, mes en que se realizó la obtención de la secreción, dentro del
período activo del caracol.
En aquellos caracoles alimentados con harina de soya y vegetales, la
concentración de ácido glicólico es menor durante el mes de diciembre, respecto al mes

89
de octubre y marzo, no así en aquellos que se alimentaron de harina de maíz, en donde
la menor concentración se obtuvo en el mes de octubre y en concentración similar al
mes de diciembre, sin encontrar diferencias significativas entre ellas.
Si bien, durante los tres períodos estudiados, los caracoles se encontraban en el
período activo, su metabolismo no es constante y varía durante él. En octubre, el
caracol recién despierta, consume grandes cantidades de alimento para recuperarse y
alcanza altas concentraciones de ácido glicólico las que van disminuyendo a medida
que el caracol se vuelve más activo; comienza a moverse, a reproducirse, a eliminar
desechos que, probablemente, influyen en la disminución de la concentración del ácido,
que ocurrió durante el mes de diciembre. Finalmente, las concentraciones se ven
aumentadas en marzo, probablemente, porque el caracol se está preparando para
hibernar y, por lo tanto, está almacenando lo que está consumiendo.
En la tabla N° 21 y en el gráfico N° 11 se analizaron los datos según período de
obtención de la secreción. Si bien el gráfico muestra un comportamiento de los datos
similar a los gráficos N° 4 y 5, no existen diferencias significativas entre los períodos, ya
que las concentraciones variaron mucho entre ellas, pues se están considerando las
tres alimentaciones por cada período.
8.8.5 Determinación de ácido glicólico en secreción de caracol Helix aspersa
En las tablas N° 17, 18, 19 y 20 y en los gráficos N° 7, 8, 9 y 10 se establecen
las diferencias obtenidas según la alimentación proporcionada a los diferentes grupos
de caracoles. Los alimentos considerados para este experimento contienen de manera

90
natural ácido glicólico, (Zelitch, 1958; Samish y Pallas Jr, 1972; Zelitch, 1973) en menor
o mayor cantidad dependiendo de la planta, la actividad fotosintética y fotorrespiración.
Si el caracol obtiene todo o parte del ácido glicólico a partir de la dieta, la concentración
de éste debiera variar según lo que consume, así como el ácido debiera hacerlo en
cada alimento. Sin embargo, no existen estudios que establezcan la cantidad de ácido
glicólico en cada uno de los alimentos utilizados para el estudio.
En cada período estudiado, octubre, diciembre y marzo, la concentración del
ácido es mayor en la secreción de aquellos caracoles que se alimentaron con vegetales
que en aquellos que lo hicieron con harina de maíz o harina de soya. Esta diferencia
que resulta ser estadísticamente significativa (p<0,001), se explica, probablemente,
porque la fotorrespiración ocurre en las hojas y por lo tanto, sería el órgano de la planta
en donde se encuentra una mayor cantidad de ácido, a diferencia de las otras dos
dietas, ya que si bien en ambas plantas, maíz y soya, ocurre el proceso de
fotorrespiración (Popov et al., 2003; Broker et al., 1997), en las harinas se encuentra el
grano, en donde el ácido glicólico pudiera encontrarse en menor concentración, que en
las hojas.
En la tabla N° 22 y en el gráfico N°12 se analizaron los datos según alimentación.
Claramente se aprecian diferencias significativas entre los vegetales frente a las harinas
de soya y maíz, reafirmándose la teoría anteriormente planteada.

91
8.8.6 Análisis general
Finalmente, todo lo anteriormente discutido, permitió establecer que si bien la
alimentación de caracoles basada en vegetales y, probablemente, obtener la secreción
en octubre o marzo, producirá una mayor concentración de ácido glicólico en la
secreción, esto no ocurrirá, necesariamente, de la misma manera con otros
componentes, como por ejemplo, la alantoína (Lira, 2008).
Además, las concentraciones aquí obtenidas corresponden a un proveedor
particular, y no necesariamente son iguales para todos los criaderos, ya que cada
helicicultor tiene una dieta determinada para sus caracoles.
Esto último hace que la estandarización de la secreción sea difícil por parte del
ISP (Instituto de Salud Pública), autoridad sanitaria de nuestro país, no existiendo aún
valores mínimos ni máximos de los componentes que debe tener la secreción o baba
del caracol, para utilizarla, por ejemplo, en productos cosméticos.
Las concentraciones de ácido glicólico obtenidas en las diferentes muestras de
secreción de caracol variaron según la alimentación del caracol y la época de
obtención de la secreción, las que se encontraron entre 77, 84 μg/mL y 258, 24 μg/mL.
La FDA establece que los efectos que produce el ácido glicólico, sobre la piel, ocurren
al utilizar soluciones de ácido glicólico a altas concentraciones, 10% y más, valores
mucho mayores a los encontrados en la secreción de caracol, por lo tanto, las
bondades que se le atribuyen a la secreción o baba de caracol y a cremas formuladas a
base de ella, se deben probablemente a la mezcla de diferentes compuestos presentes
de manera natural en la secreción y no solamente a la presencia de ácido glicólico.

92
9 CONCLUSIONES
o Se Implementó y validó una metodología por HPLC-UV para determinar y cuantificar
ácido glicólico en secreción de caracol (Helix aspersa Müller), el que cumple con los
parámetros exigidos para una técnica analítica tales como: Linealidad, Precisión,
Exactitud, Selectividad y Sensibilidad.
o Se establece la presencia de ácido glicólico en la secreción de caracol Helix aspersa
Müller, pertenecientes al criadero de Caulín, Ancud, Chile.
o El período del ciclo en donde se obtuvo la mayor concentración de ácido glicólico en
la secreción de caracoles Helix aspersa Müller alimentados con harina de maíz fue
en marzo (160 μg/mL); con harina de soya fue en octubre (187,79 μg/mL) y con
vegetales fue en marzo (258,24 μg/mL).
o La alimentación con que se obtuvo la mayor concentración de ácido glicólico en la
secreción de caracoles Helix aspersa Müller, en el inicio, mitad y término de su
período activo fue vegetales, encontrándose concentraciones promedios de 244,45
μg/mL, 204,81 μg/mL y 258,24 μg/mL, respectivamente.
o La concentración de ácido glicólico obtenida en la secreción de caracoles Helix
aspersa Müller en el inicio, mitad y término de su ciclo activo fue de 187,27 μg/mL;
139, 06 μg/mL y 189, 32 μg/mL, respectivamente.

93
o La concentración de ácido glicólico obtenida en la secreción de caracoles Helix
aspersa Müller alimentados con harina de maíz, harina de soya y vegetales fue de
141,53 μg/mL; 138,28 μg/mL y 235,84 μg/mL, respectivamente.
o Tanto, la alimentación como el período de obtención de la secreción, influyen en la
concentración de ácido glicólico en secreción de caracoles Helix aspersa Müller,
aceptándose la hipótesis planteada.

94
10 PROYECCIONES
o Esta investigación demuestra que existen probabilidades de que así como las
concentraciones de ácido glicólico varían según la alimentación del caracol y
estacionalidad, también podrían verse influenciados otros de los componentes
presentes en la secreción del caracol Helix aspersa Müller.
o Este trabajo permite contar con un método confiable para determinar ácido glicólico
en secreción de caracol Helix aspersa Müller, el que puede utilizarse por el ISP para
fiscalizar si los laboratorios, que por cierto tienen sus propios métodos y que son de
carácter confidencial, cumplen con algún rango de concentraciones de ácido
glicólico en la secreción del caracol que el ISP pudiera establecer y así tener un
mayor control de esta materia prima que está siendo cada vez más deseada por los
laboratorios cosméticos.
95
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103
12 ANEXOS
12.1 ANEXO N° 1: FIGURAS
12.1.1 Figura N° 1: Anatomía externa del caracol Helix aspersa Müller.
12.1.2 Figura N° 2: Anatomía interna del caracol Helix aspersa Müller.

104
12.1.3 Figura N° 3: Desarrollo de la actividad del caracol de acuerdo a la
temperatura y humedad.
12.1.4 Figura N° 4: Epifragma. Membrana mucosa, calcificada secretada por el
caracol durante el período de inactividad.

105
12.1.5 Figura N° 5: Estructura Química del ácido glicólico.
12.1.6 Figura N° 6: Esquema del proceso de Fotosíntesis. A la izquierda, las
reacciones luminosas donde se producen ATP y NADPH. A la derecha,
las reacciones de fijación del carbono que darán origen a los
carbohidratos.
106
12.1.7 Figura N° 7: Proceso de fotorrespiración y formación de ácido glicólico.

107
12.2 ANEXO N° 2: TABLAS
12.2.1 Tabla N° 1: Equivalencia de secreción de caracol Helix aspersa Müller,
antes y después de liofilizar.
Mililitros (mL) de Gramos(g) Gramos (g)

secreción antes obtenidos de liofilizado para
Muestra de liofilizar secreción después preparar 3mL de
de liofilizar suspensión de
secreción
Maíz/Octubre 127 3,7016 0,0874
Maíz/Diciembre 86 2,8567 0,0997
Maíz/Marzo 49 1,4755 0,0903
Soya/Octubre 100 2,9316 0,0879
Soya/Diciembre 50 1,6503 0,0990
Soya/Marzo 82 2,8687 0,1050
Vegetal/Octubre 30 0,9593 0,0959
Vegetal/Diciembre 75 1,6217 0,0649
Vegetal/Marzo 113 2,9868 0,0793

108
12.2.2 Tabla N°2: Tratamiento de muestras de secreción de caracol Helix aspersa
Müller.
Gramos realmente mL de TCA

pesados para 3 mL de pH muestra 10% agregado
Muestra suspensión de medido a la muestra
secreción (Diluida 4 con cintas hasta pH 1
veces)
Maíz / Octubre 0,0219 8-9 0,3
Maíz /Diciembre 0,0249 8-9 0,3
Maíz / Marzo 0,0226 8-9 0,3
Soya / Octubre 0,0220 9 0,4
Soya/ Diciembre 0,0248 8-9 0,3
Soya/ Marzo 0,0262 8-9 0,3
Vegetal/Octubre 0,0240 8-9 0,3
Vegetal/Diciembre 0,0162 7-8 0,2
Vegetal/ Marzo 0,0198 8-9 0,3

109
12.2.3 Tabla N° 3: Concentración de ácido glicólico obtenida en muestras de
secreción de caracoles alimentados con harina de maíz y cuya obtención se
realizó durante el mes de octubre.
Concentración Concentración
Muestras (μg/mL) de ácido Factor de dilución (μg/mL) Real de
glicólico ácido glicólico
Maíz / octubre 1 31,32 4 125,28
Maíz / octubre 2 34,70 4 138,80
Maíz / octubre 3 31,16 4 124,64
Promedio 32,39 129,57
D.S 1,9992 7,9970
% C.V 6,1717 6,1717
realizó durante el mes de diciembre.
Maíz / diciembre 1 35,15 4 140,60
Maíz / diciembre 2 33,11 4 132,44
Maíz / diciembre 3 32,63 4 130,52
Promedio 33,63 134,52
D.S 1,3381 5,3522
% C.V 3,9788 3,9788
110
realizó durante el mes de marzo.
Maíz / marzo 1 38,53 4 154,12
Maíz / marzo 2 42,78 4 171,12
Maíz / marzo 3 39,07 4 156,28
Promedio 40,13 160,51
D.S 2,3137 9,2546
% C.V 5,7659 5,7659
secreción de caracoles alimentados con harina de soya y cuya obtención se
realizó durante el mes de octubre.
Soya / octubre 1 46,23 4 184,92
Soya / octubre 2 48,78 4 195,12
Soya / octubre 3 45,83 4 183,32
Promedio 46,95 187,79
D.S 1,6003 6,4010
% C.V 3,4087 3,4087
111
realizó durante el mes de diciembre.
Soya / diciembre 1 19,14 4 76,56
Promedio 19,46 77,84
D.S 0,6428 2,5712
% C.V 3,3032 3,3032
realizó durante el mes de marzo.
Soya / marzo 1 39,14 4 156,56
Soya / marzo 2 38,56 4 154,24
Soya / marzo 3 34,22 4 136,88
Promedio 37,31 149,23
D.S 2,6888 10,7553
% C.V 7,2073 7,2073
112
secreción de caracoles alimentados con vegetales y cuya obtención se realizó
durante el mes de octubre.
Muestras (μg/mL) de ácido Factor de (μg/mL) Real de
glicólico dilución ácido glicólico
Vegetal / octubre 1 58,60 4 234,40

Promedio 61,11 244,45
S.D 2,7929 11,1715
% C.V 4,5700 4,5700
12.2.10 Tabla N° 10: Concentración de ácido glicólico obtenida en muestras
de secreción de caracoles alimentados con vegetales y cuya obtención se realizó
durante el mes de diciembre.
Muestras (μg/mL) de Factor de (μg/mL) Real de
ácido glicólico dilución ácido glicólico
Vegetal/diciembre 1 49,56 4 198,24
Promedio 51,20 204,81
D.S 1,9041 7,6164
% C.V 3,7187 3,7187
113
12.2.11 Tabla N° 11: Concentración de ácido glicólico obtenida en muestras
de secreción de caracoles alimentados con vegetales y cuya obtención se realizó
durante el mes de marzo.
Vegetal/ marzo 1 63,79 4 255,16
Vegetal/ marzo 2 66,10 4 264,40
Vegetal/ marzo 3 63,79 4 255,16
Promedio 64,56 258,24
D.S 1,3337 5,3347
% C.V 2,0658 2,0658
114
12.2.12 Tabla N° 12: Valores críticos de la r de Pearson para una prueba
unilateral según grados de libertad (N-2).

115
12.2.13 Tabla N° 13: Valores t de Student y probabilidad P asociada en
función de los grados de libertad (gl)

116
12.2.14 Tabla N° 14: Criterios de aceptación para el parámetro de precisión
en función de la concentración del analito de la A.O.A.C.

117
12.2.15 Tabla N° 15: Criterios de aceptación para el parámetro de exactitud,
relacionando el % de recuperación en función de la concentración del
analito de la A.O.A.C.
118
12.3 ANEXO N°3: CROMATOGRAMAS
12.3.1 Figura N° 1: Cromatograma obtenido al inyectar una muestra de
secreción de caracol correspondiente al mes de octubre y alimentación
harina de maíz.
26
24
22
20
18
16
14
12
O
CI
10 L
O
CI
8 L
G
_
O
6 DI
C
A
4
-2 RT [min]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
secreción de caracol correspondiente al mes de diciembre y alimentación
harina de maíz.
28
26
24
22
20
18
16
14 O
C
I
12 L
O
C
I
10 L
G
_
8 O
D
I
6 C
A
4
2
0
-2
-4
-6
-8 RT [min]
1 2 3 4 5 6 7 8 9
119
secreción de caracol correspondiente al mes de marzo y alimentación harina
de maíz.
30
28
26
24
22
20
18 O
C
I
L
16 O
C
I
14 L
G
_
12 O
D
I
10 C
A
8
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8 RT [min]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
secreción de caracol correspondiente al mes de octubre y alimentación
harina de soya.
24
22
20
18
16
14
12 O
C
I
L
10 O
C
I
L
8 G
_
O
D
I
6 C
A
4
-2
RT [min]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
120
Figura N° 5: Cromatograma obtenido al inyectar una muestra de secreción de caracol
correspondiente al mes de diciembre y alimentación harina de soya.
24
22
20
18
16
14
12
O
C
I
0
10 L
0, O
0 C
1 I
8
H L
T G
_
S O
6 D
I
C
40 A
2,
0
2W
P
S
0
-2
-4
RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
correspondiente al mes de marzo y alimentación harina de soya.
18
16
14
12
0
10
0,
0
1
8
H
T
S O
6 CI
L
O
0 CI
4 20, L
G
_
W O
2P
S DI
C
A
0
-2
-4
-6
-8 RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
121
correspondiente al mes de octubre y alimentación vegetal.
28
26
24
22
20
18
16
O
14 CI
L
12 O
CI
L
10 G
_
8 O
DI
6 C
A
4
2
0
-2
-4
-6
-8
-10 RT [min]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
correspondiente al mes de diciembre y alimentación vegetal.
50
45
40
35
30
25
2000,
0
1
O
15H
T C
S I
L
O
C
I
10 L
0 G
2, _
0 O
5W D
I
P C
S A
0
-5
RT [min]
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
122
correspondiente al mes de marzo y alimentación vegetal.
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
O
14 CI
L
O
12 CI
L
10 G
_
8 O
DI
6 C
A
4
2
0
-2
-4 RT [min]
1 2 3 4 5 6 7 8 9
123
12.4 ANEXO N° 4: EJEMPLOS DE CÁLCULOS.
12.4.1 Cálculo para determinar los gramos de secreción liofilizada que se
necesitan pesar para preparar 3 mL de suspensión.
Para las muestras correspondientes a secreción de caracoles alimentados con maíz
y al período de obtención correspondiente al mes de octubre, se ingresó 127 mL de
muestra al equipo liofilizador. Una vez finalizado el proceso, se obtuvo 3,7016g. (Ver
Tabla N° 1)
127 mL ------------------ 3, 7016 g.
3 mL ------------------ X X = 0, 0874 g.
Por lo tanto, para preparar 3 mL de suspensión de secreción de caracol, se deben
pesar 0,0874 g. En la tabla N° 2 se explica que solamente se pesó un cuarto de lo
debido para obtener suspensiones diluidas. Por lo tanto, para este caso, se pesó un
cuarto de 0,0874 g, es decir; 0,0219 g.
12.4.2 Cálculo para determinar los factores de dilución de cada muestra.
Para determinar el factor de dilución se debió considerar el factor 4 que indica haber
pesado un cuarto de lo calculado (Tablas N° 1 y 2), por lo tanto, a los valores
entregados por el equipo cromatográfico, se multiplicaron por 4.

124
12.4.3 Cálculo para determinar el % recuperación
La formula es:
Recuperación: R= (⎯x / x) x 100, donde ⎯x es el valor medio y x el valor verdadero.
Si el valor verdadero x = 40 μg/ mL, correspondiente a un estándar de ácido
glicólico, y el valor medio es el promedio de las concentraciones obtenidas al
inyectar 4 estándares de 40 μg/mL y que corresponde a ⎯x = 40,65 μg/mL, se
obtiene:
R= (⎯x / x) x 100
R = (40,65/ 40,00) x 100
R= 101,63%, que es el resultado obtenido al determinar el % de recuperación para
un estándar de ácido glicólico de 40 μg/mL. (Tabla N° 11)
12.4.4 Cálculo para determinar concentración esperada de ácido glicólico al
realizar la mezcla de muestra y estándar de ácido glicólico.
Según la Tabla N° 14:
Para 1037, 6 μg/mL
1037,6 μg 1000 μL
X 100 μL X= 103, 76 μg
Por lo tanto, si se toman 100 μL, ellos contienen 103,76 μg

125
Para 101,81 μg/mL
101,81 μg 1000 μL
X 900 μL X= 91,63 μg
Por lo tanto, si se toman 900 μL, ellos contienen 91,63 μg
Al mezclar los 100 μL de estándar con los 900 μL de muestra se obtiene
una mezcla de 1000 μL que contienen la suma de μg de ácido glicólico
anteriormente calculado.
Por lo tanto, 103, 76 μg + 91,63 μg = 195,32 μg en 1000 μL de mezcla.

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Universidad Austral de Chile

PROFESOR PATROCINANTE: Annemarie Nielsen S.

PROFESOR CO-PATROCINANTE: Alejandro Jerez M.

"IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA POR

Tesis de Grado presentada como

PAULINA DEL PILAR LAGOS MEDIAVILLA

Agradezco a todas aquellas personitas que de alguna u otra manera participaron

en mi formación y han hecho que hoy sea la persona que soy.

A mi mamá, mujer a quien admiro y respeto mucho por su honestidad y

responsabilidad frente a la vida; a mi papá, hombre de esfuerzo y perseverancia al que

por su gran sentido del humor, lealtad, sinceridad y autenticidad.

De manera especial, agradezco a todos mis amigos, a los que marcaron mi

infancia, mi adolescencia y a cada uno de mis queridos hermanos de la gran Familia

donde descubrí mi espíritu de servicio.

A las personitas con las que compartí durante mi estadía en la Universidad…a

formado tan linda amistad.

A la personita que iluminó mi corazón en el momento menos esperado. A quien

jornadas en el laboratorio sean no sólo una muestra de compañerismo sino también de

Además, quiero agradecer a los profesores que participaron en este proyecto,

me dio una manito en esos momentos en que todo parecía no resultar.

Profe Anny, gracias por entregarme su confianza y haberme dado la posibilidad

y de aprender de sus fortalezas. Gracias por todo el cariño entregado.

recordaré por su disposición y humildad. Gracias, de verdad.

Caro, por haberme dado la posibilidad de compartir muchos momentos en donde

descubrí lo parecidas que somos y por confiar en mi, de verdad, gracias.

A Joel Pardo, persona que desinteresadamente ayudó en este proyecto, no sólo

la amistad que nació durante este período.

su disposición porque sin su ayuda, todo habría sido más difícil.

Al Doctor Dölz, por sus innumerables conversaciones que indudablemente

sirvieron para mi formación personal y profesional.

A don Eduardo, gracias por su disposición y por sus palabras de aliento.

5.1 OBJETIVOS GENERALES 35

7.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO 46

8.1 MÉTODO ANALÍTICO 79

8.8.2 DETERMINACIÓN DEL FACTOR K´ 87

12.1 ANEXO N° 1: FIGURAS 103

12.2 ANEXO N° 2: TABLAS 107

DURANTE EL MES DE OCTUBRE. 109

DURANTE EL MES DE DICIEMBRE. 109

DURANTE EL MES DE MARZO. 110

DURANTE EL MES DE OCTUBRE. 110

DURANTE EL MES DE DICIEMBRE. 111

DURANTE EL MES DE MARZO. 111

DURANTE EL MES DE OCTUBRE. 112

DURANTE EL MES DE DICIEMBRE. 112

12.2.11 TABLA N° 11: CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO GLICÓLICO OBTENIDA EN MUESTRAS DE

DURANTE EL MES DE MARZO. 113

A.O.A.C : Association of Oficial Analytical Chemist.

C.V : Coeficiente de variación.

D.S : Desviación estándar

FDA : Food and Drug Administration.

GLP : Buenas prácticas de laboratorio.

GMP : Buenas prácticas de manufactura.

g / mol : Gramos por mol.

HPLC : High Performance Liquid Chromatography. (Cromatografía Líquida

ISP : Instituto de Salud Pública.

mL / Min : Mililitro por minuto.

mV x Min : Milivolt por minuto.

pKa : Índice que expresa la fortaleza de un ácido débil.