Hiv Elisa

MATERIALES
 Pipetas automáticas
 Vaso de precipitación
 Puntas: amarillas y azules
 Kit ELISA HUMAN para HIV
 Hipoclorito de sodio al 5%
REACTIVOS
 Tiras de micropocillos  Conjugado

 Buffer de dilución IgG  Solución TMB
 Solución de lavado  Buffer substrato
 Control negativo  Solucion de detención
 Control positivo
EQUIPO: Lector de ELISA y lavador de ELISA
MUESTRAS: suero
MARCO TEORICO
INMUNOENSAYOS
Método analítico basado en la reacción antígeno- anticuerpo
Clasificación
• diseño (competitivo o no competitivo)
• separación(homogéneos y heterogéneos)
• por el método de detección
EIA. Inmunoensayo enzimático.
Las enzimas más utilizadas son:

peroxidasa (horseradish peroxidase, HRP), PM 44 kdal
fosfatasa alcalina(AP), PM 80-84,5 kDal
La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno- anticuerpo. El color se genera por

la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al
anticuerpo detector. Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la
capa de detección puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM o
IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase específicos.
ANALISIS ELISA HUMNA PARA ANTICUERPOS AL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA

HUMANA
Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) son los agentes causales
del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Estos retrovirus son
transmitidos por la exposición a ciertos fluidos corporales infectados, principalmente
secreciones genitales y sangre o productos contaminados derivados de la sangre y por
pasaje a través de la placenta.
La evidencia serológica de la infección por HIV-1 y HIV-2 puede ser obtenida

determinando la presencia de antígenos y anticuerpos en el suero de individuos en los
que se sospecha que tienen la infección.
Los antígenos pueden generalmente ser detectados en la fase aguda y durante la fase
sintomática de la enfermedad. Los anticuerpos pueden ser detectados a lo largo de
toda la infección, comenzando en la fase aguda o inmediatamente después de ella.
Por ello es de fundamental importancia la utilización de una determinación de alta

sensibilidad que pueda detectar antígenos y anticuerpos. El ensayo de HIV Ag/Ac
ELISA 4ª Generación está diseñado para detectar antígeno p24 así como anticuerpos
contra HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2.
FUNDAMENTOS DEL METODO

Los pocillos de la policubeta están recubiertos con proteínas recombinantes y
péptidos sintéticos de HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) y anticuerpos monoclonales anti-
p24(*). La muestra se incuba en los pocillos, si la misma contiene antígeno p24 y/o
anticuerpos contra HIV-1 o HIV-2 se unirán a los antígenos y/o anticuerpos del
pocillo.
El material no unido es removido por lavado. En el paso siguiente se agrega el

Conjugado 1 que contiene anticuerpos y antígenos marcados con biotina que se unirán
a los antígenos/anticuerpos si están presentes en la muestra. Luego se agrega el
Conjugado 2 (peroxidasa conjugada a estreptavidina) que se unirá al Conjugado 1. El
conjugado no unido se remueve por lavado.
PRINCIPIO
Microposillos de ELISA son recubiertos con péptido sintéticos y antígeno

recombinante. Los péptidos gp41, gp36 y p24 representan regiones
inmunodominantes de los virus VIH 1 y 2. Durante la incubación, anticuerpos VIH
específicos (anti- VIH IgG e IgM) presentes en muestras de pacientes y en el control
positivo, se unen a los péptidos inmovilizados y antígenos recombinantes. Después de
una etapa de lavado los anticuerpos unidos son detectados por medio de un
conjugado, consiste en la enzima peroxidasa marcada con anticuerpo anti-
inmimoglobulina humana.
PROCEDIMIENTO / TECNICA
 Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos

 Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en
el posillo.
 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido
 Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
 Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
 Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
 Adición del sustrato
 Unión del sustrato a la enzima
 Desarrollo del color
 Agregar solución de parada HCl. O H2SO4
 Leer en el equipo de ELISA
TÉCNICA
Etapa 1
1. Lavar los micropocillos inmediatamente antes del uso

2. Agragar 400ul solución de lavado de trabajopor pocillo
3. Incubar por 30 segundos. Aspirar y eliminar cuidadosamente, remover liquido
remanente invirtiendo los micropocillos sobre papel absorbente
4. Pipetear 100ul de buffer de dilución en todo los pocillos
5. Agregar 20ul de control negativo a pocillos B1, C1,D1
6. Agregar 20ul de control positivo a pocillos E1, F1
7. Agregar 20ul de muestras de pacientes a pocillo remanentes, homogenizar y
agitar cuidadosamente
8. Incubar a 37ºC
9. Preparar solución conjugado de trabajo
10. Aspirar y eliminar el contenido de los pocillos en una solución de hipoclorito
de sodio al 5%
11. Agregar 400ul de solución de lavado de trabajo: después de 30 seg. Aspira y
eliminar repitiendo el lavado 4 veces, si se emplea un lavado auromatico
cebara el lavado con solución de lavado de trabajo y lavar los micropocillos 5
veces
Etapa 2
1. Dispensar 100ul solución conjugado de trabajo en todo los pocillos

2. Incubar 15 minutos a 37ºC
3. Prepara solución substrato de trabajo
4. Lavar los pocillos 5 veces como se describe en la etapa 1 nº 6
Etapa 3
1. Dispensar 100ul solución substrato de trabajo en todos los pocillos

2. Incubar 15min en la oscuridad a temperatura ambiente 20-30ºC
3. Dispensar 100ul solución de detención en todo los pocillos
4. Medir la absorbancia antes de 30 min a 450nm usando una longitud entre 620
y 690nm
CALCULO
PREPARACION DE REACTIVOS
Solución de lavado de trabajo( 3ª): diluir solución de lavado 1+ 10 con agua destilada
Solución conjugado de trabajo(6ª): diluir el conjugado 1+ 100 con buffer de dilución
Solución substrato de trabajo (7ª): diluir solución TMB 1+ 10 con buffer sibstrato
Calcular la absorbancia promedio de los controle negativo y positivos a 450nm
MNC= (Abs(B1)+ Abs (C1) + Abs (D1)) /3
MPC= (Abs( E1)+ Abs( F1))/2
Calculo del punto de corte o valor cut- off(COV)
COV: MNC+ 0.300
DATOS
NEGATIVOS
Abs1: 0.019 MNC= (Abs(B1)+Abs (C1)+Abs (D1))/3
Abs2: 0.025 MNC= (0.019 +0.025+0.030) /3
Abs3: 0.030 MNC= 0.024

COV: MNC+ 0.300
COV= 0.024+ 0.300=0.324
POSITIVOS
Abs1: 0.820 MPC= (Abs( E1)+ Abs( F1))/2
Abs2: 0.940 MPC= (0.820+ 0.940)/ 2
MPC= 0.88
VALIDACIÓN DE ANÁLISIS
Los resultados del análisis son validos si se cumple los siguientes criterios
 MNC< 0.150
 MPC> 1.000
INTERPRETACION DE RESULTADOS
ANEXOS
BIBLIOGRAFIA
 Ferri, FF. Human immunodeficiency virus. In: Ferri FF, ed. Ferri's Clinical
Advisor 2016. Philadelphia: PA: Elsevier Mosby; 2015:639-645.
 Simonetti FR, Dewar R, Maldarelli F. Diagnosis of human immunodeficiency
virus infection. In: Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ, eds. Mandell, Douglas, and
Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. 8th ed. Philadelphia, PA:
Elsevier Saunders; 2015:chap 122.
 U.S. Preventive Services Task Force. Final Update Summary: Human
Immunodeficiency Virus (HIV) Infection: Screening. July
2015. www.uspreventiveservicestaskforce.org/Page/Document/UpdateSumm
aryFinal/human-immunodeficiency-virus-hiv-infection-screening.

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 Tiras de micropocillos  Conjugado

EQUIPO: Lector de ELISA y lavador de ELISA

Método analítico basado en la reacción antígeno- anticuerpo

• diseño (competitivo o no competitivo)

• por el método de detección

EIA. Inmunoensayo enzimático.

Las enzimas más utilizadas son:

fosfatasa alcalina(AP), PM 80-84,5 kDal

La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno- anticuerpo. El color se genera por

ANALISIS ELISA HUMNA PARA ANTICUERPOS AL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA

La evidencia serológica de la infección por HIV-1 y HIV-2 puede ser obtenida

Por ello es de fundamental importancia la utilización de una determinación de alta

FUNDAMENTOS DEL METODO

El material no unido es removido por lavado. En el paso siguiente se agrega el

Microposillos de ELISA son recubiertos con péptido sintéticos y antígeno

 Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos

1. Lavar los micropocillos inmediatamente antes del uso

1. Dispensar 100ul solución conjugado de trabajo en todo los pocillos

1. Dispensar 100ul solución substrato de trabajo en todos los pocillos

Solución conjugado de trabajo(6ª): diluir el conjugado 1+ 100 con buffer de dilución

Calcular la absorbancia promedio de los controle negativo y positivos a 450nm

MNC= (Abs(B1)+ Abs (C1) + Abs (D1)) /3

MPC= (Abs( E1)+ Abs( F1))/2

Calculo del punto de corte o valor cut- off(COV)

COV: MNC+ 0.300

Abs1: 0.019 MNC= (Abs(B1)+Abs (C1)+Abs (D1))/3

Abs2: 0.025 MNC= (0.019 +0.025+0.030) /3

Abs3: 0.030 MNC= 0.024

COV= 0.024+ 0.300=0.324

Abs1: 0.820 MPC= (Abs( E1)+ Abs( F1))/2

Abs2: 0.940 MPC= (0.820+ 0.940)/ 2

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