Determinacion de Polifenoles

Determinacin de polifenoles
totales por el mtodo de FolinCiocalteu
Apellidos, nombre
Garca Martnez, Eva ([email protected])

Fernndez Segovia, Isabel ([email protected])
Fuentes Lpez, Ana ([email protected])
Departamento
Departamento de Tecnologa de Alimentos
Centro
ETSIAMN. Universitat Politcnica de Valncia
1 Resumen de las ideas clave

El anlisis del contenido en compuestos polifenlicos de un alimento es importante
debido a la gran variedad de actividades biolgicas que estos compuestos
presentan, considerndose uno de los fitoqumicos alimentarios ms importantes
por su contribucin al mantenimiento de la salud humana. La actividad biolgica
de los polifenoles est relacionada con su carcter antioxidante. Adems de los
efectos sobre la salud, muchos compuestos polifenlicos tienen un efecto sobre la
calidad de los alimentos que los contienen, puesto que son responsables de
algunas propiedades sensoriales.
Su determinacin puede realizarse por medio de diversos mtodos. En este artculo
se describe el ensayo Folin-Ciocalteu que se basa en que los compuestos fenlicos
reaccionan con el reactivo de Folin- Ciocalteu, a pH bsico, dando lugar a una
coloracin azul susceptible de ser determinada espectrofotomtricamente a 765
nm.
2 Introduccin
Los compuestos fenlicos constituyen una de las principales clases de metabolitos
secundarios de los vegetales, donde desempean diversas funciones fisiolgicas.
Se trata de compuestos que intervienen en el crecimiento y reproduccin de las
plantas, as como en procesos defensivos contra agentes patgenos,
depredadores o radiacin ultravioleta. Tradicionalmente se han considerado
como sustancias antinutritivas debido al efecto adverso de uno de sus
componentes principales, los taninos, en la digestibilidad de protenas. Sin
embargo, actualmente existe gran inters en estos compuestos debido a la gran
variedad de actividades biolgicas que presentan, considerndose uno de los
compuestos fitoqumicos alimentarios ms importantes por su contribucin al
mantenimiento de la salud humana. La actividad biolgica de los polifenoles est
relacionada con su carcter antioxidante, el cual es debido a su habilidad para
quelar metales, inhibir la actividad de la enzima lipooxigenasa y actuar como
atrapadores de radicales libres. De hecho, diversas organizaciones internacionales,
en el mbito de la nutricin, recomiendan un consumo diario como mnimo de
cinco raciones de fruta o verdura, para asegurar una adecuada ingesta de
antioxidantes y prevenir enfermedades relacionadas con el estrs oxidativo.
Existen numerosos estudios que proporcionan datos que apoyan la correlacin
negativa entre la ingestin de compuestos fenlicos y el riesgo de padecer ciertas
enfermedades, incluyendo las enfermedades cardiovasculares, cncer,
enfermedad de Alzheimer, cataratas y otras disfunciones relacionadas con la
edad. Adems de estos efectos beneficiosos para la salud, tambin se ha
estudiado su efecto antiinflamatorio y su efecto preventivo en el tratamiento de
asma.
La cantidad de compuestos polifenlicos y tipos presentes en un alimento vara en
funcin de la especie vegetal, variedad y parte del vegetal considerada (fruto,
semillas, brotes, hojas), horas de exposicin solar, grado de madurez, condiciones
de cultivo, procesado, condiciones de almacenamiento, etc.
Los compuestos polifenlicos presentan en su estructura qumica uno o ms anillos

de benceno y uno o ms grupos hidroxilados con algn elemento comn, como
los grupos funcionales de steres, steres de metilo, glicsidos, etc. Se trata de
molculas muy reactivas que normalmente se encuentran combinadas con
azcares, como la glucosa, galactosa, arabinosa, ramosa, xilosa o los cidos
glucornicos y galacturnicos. Tambin pueden unirse con cidos carboxlicos,
cidos orgnicos, aminocidos y lpidos. Aunque pueden encontrarse distintas
clasificaciones de polifenoles, dependiendo de su complexidad qumica, pueden
agruparse en C6, C6-Cn, C6-Cn-C6, siendo n3. La tabla 1 muestra los diferentes
grupos de polifenoles y algunos ejemplos de cada grupo y la figura 1 muestra la
estructura qumica del grupo fenol.
Tabla 1. Clasificacin de los polifenoles y ejemplos de ellos.
Estructura qumica
Tipo
Ejemplo de polifenol
C6
Fenol simple
Eugenol
C6-C1
cido fenlico
cido glico
cido benzoico
cido elgico
(C6-C1)n
Taninos hidrolizables
C6-C2
cido fenil actico
C6-C3
cido hidroxicinmico
cido cafeico
Cumarinas
cido ferlico
(C6-C3)2
Lignanos
C6-C1-C6
Benzofenonas
Xantonas
C6-C2-C6
Estilbenos
Resveratrol
C6-C3-C6
Flavonoides
Antocinaninas
Flavonoles
Flavonas
Flavanonas
Isoflavonas
Flavanoles
Chalconas
(C6-C3-C6)n
Proantocianinas
(taninos 4n11)
Figura 1. Estructura qumica del grupo fenol

Adems de los efectos sobre la salud, muchos compuestos polifenlicos tienen un
efecto sobre la calidad de los alimentos que los contienen, puesto que son
responsables de algunas propiedades sensoriales. Por ejemplo, las antocianinas
son pigmentos responsables del color rojo-azulado de muchas frutas como las
fresas, uva, ciruelas, etc., los flavonoles aportan el color amarillo caracterstico de
algunas partes externas de frutas o vegetales, las f1avanonas son responsables del
sabor amargo de algunos ctricos (por ejemplo, la naringina en el pomelo o la
neohesperidina en la naranja), el eugenol caracteriza el intenso aroma de los
plntanos o los taninos que confieren la astringencia a algunas frutas. Otros
polifenoles, como los cidos hidroxicinmicos y sus derivados, pueden ser oxidados
por enzimas presentes en los tejidos vegetales, dando lugar a productos de color
pardo.
3 Objetivos
Con este artculo se persigue que los alumnos adquieran la capacidad de:
Aplicar el mtodo de Folin-Ciocalteu para determinar el contenido en

polifenoles totales de productos vegetales.
Cuantificar los compuestos polifenlicos totales de una muestra a partir de

la construccin de una recta patrn de cido glico.
4 Desarrollo
A continuacin pasamos a describir la determinacin del contenido en polifenoles
totales empleando el mtodo espectrofotomtrico de Folin-Ciocalteu en una
muestra de zumo de naranja.
4.1 Fundamento del mtodo

El ensayo Folin-Ciocalteu se utiliza como medida del contenido en compuestos
fenlicos totales en productos vegetales. Se basa en que los compuestos fenlicos
reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH bsico, dando lugar a una
coloracin azul susceptible de ser determinada espectrofotomtricamente a 765
nm. Este reactivo contiene una mezcla de wolframato sdico y molibdato sdico
en cido fosfrico y reacciona con los compuestos fenlicos presentes en la
muestra. El cido fosfomolibdotngstico (formado por las dos sales en el medio
cido), de color amarillo, al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un
complejo de color azul intenso, cuya intensidad es la que medimos para evaluar el
contenido en polifenoles (Figura 2).
Figura 2. Mecanismo de accin del reactivo de Folin-Ciocalteu.

El mecanismo de reaccin es una reaccin redox, por lo que adems puede
considerarse tambin, como un mtodo de medida de la actividad antioxidante
total.
La oxidacin de los polifenoles presentes en la muestra, causa la aparicin de una
coloracin azulada que presenta un mximo de absorcin a 765 nm, y que se
cuantifica por espectrofotometra en base a una recta patrn de cido glico
(Figura 3). Se trata de un mtodo preciso y sensible, que puede padecer
numerosas variaciones, fundamentalmente en lo relativo a los volmenes utilizados
de la muestra a analizar, concentracin de reactivos y tiempo de reaccin.
Figura 3. cido glico

Tambin se pueden producir variaciones en el modo de expresar los resultados, sin
embargo, el patrn recomendado es el cido glico. Este ensayo de anlisis de
los polifenoles totales, se utiliza con frecuencia en el estudio de las propiedades
antioxidantes de alimentos vegetales, como zumos de fruta, al tratarse de un
parmetro que generalmente, muestra una estrecha correlacin con los
diferentes mtodos de medicin de la actividad antioxidante.
4.2 Material y Reactivos

Material e instrumentacin
-Espectrofotmetro UV-Visible
-Balanza analtica
-Centrfuga
-Agita tubos (vortex)
-Matraces aforados de 25 mL y 10 mL
-Vasos de precipitados de 50 mL
-Pipetas de 1, 5 y 10 mL
-Tubos de ensayo con tapn
-Tubos de centrfuga
-Cubetas de plstico de 3 mL para espectrofotometra visible
Reactivos qumicos
-cido Glico
-Metanol
-Agua destilada
-Reactivo de Folin-Ciocalteau
-Carbonato sdico 7,5%
-Fluoruro de sodio
4.3 Procedimiento experimental

Preparacin de disoluciones patrn de cido glico
En este ejemplo se har una disolucin de cido glico de 100 mg/L (disolucin
concentrada o madre), a partir de esta disolucin se prepararn 10 mL de
disoluciones diluidas de concentraciones crecientes de cido glico entre 0 y 16
ppm, segn se detalla en la tabla 2.
Para ello se proceder de la siguiente manera:
1. Preparar los tubos de ensayo numerados.
2. Aadir a cada tubo la cantidad correspondiente de agua destilada (tabla 2).
3. Aadir a cada tubo la cantidad correspondiente de cido glico (tabla 2).
4. Agitar en vortex y mantener en oscuridad y en refrigeracin.
Tabla 2. Preparacin de la curva patrn de cido glico a partir de una disolucin

concentrada de 100 mg/L.
Reactivos
cido glico (mL)

Agua (mL)
Concentracin (mg/L) de la curva patrn de cido glico

0
10
12
14
16
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
10
9,8
9,6
9,4
9,2
8,8
8,6
8,4
Preparacin del extracto de polifenoles de la muestra de zumo

Para la extraccin de los compuestos fenlicos de la muestra de zumo de naranja
se seguir la metodologa propuesta por Toms-Barbern et al., 2001.
1. En un tubo tomar la cantidad adecuada de muestra de zumo y aadir metanol
en relacin 1:2.
2. Adicionar NaF 2mM para inactivar la encima polifenol oxidasa y prevenir la
degradacin de los polifenoles durante el ensayo.
3. Homegeneizar el contenido de los tubos en el vortex y centrifugar a 10000 rpm
durante 15 minutos a 10C.
4. Recuperar el sobrenadante.
Determinacin de polifenoles en la muestra y en los patrones de cido glico
1. Tomar 250 L de cada disolucin patrn de cido glico o del sobrenadante
procedente de la extraccin de los compuestos polifenlicos en la muestra y
colocarlos en matraces aforados de 25 mL.
2. Aadir 15 mL de agua destilada y 1,25 mL de reactivo de Folin-Ciocalteau.
3. Homogeneizar el contenido de los matraces y dejar reposar 8 minutos en
oscuridad.
4. Transcurrido este tiempo, adicionar a cada matraz 3,75 mL de la disolucin de
carbonato sdico al 7,5 % y llevar a un volumen de 25 mL con agua destilada.
5. Homogeneizar los matraces y mantener en oscuridad a temperatura ambiente
durante 2 horas.
5. Medir la absorbancia a 765 nm.
4.4 Cuantificacin e interpretacin de los resultados

A partir de los valores de absorbancia obtenidos de cada concentracin de
cido glico se construir la correspondiente recta de calibrado.
Absorbancia
As, siguiendo con el ejemplo anterior, supongamos que se ha obtenido la recta

de calibrado que aparece en la Figura 4.
y = 0,04651x + 0,0328
R = 0,9964
mg/L cido glico
Figura 4. Ejemplo de recta de calibrado de cido glico

Cmo se pueden cuantificar los polifenoles en la muestra de zumo con los datos
de la recta patrn?
Para ello hay que sustituir el valor de la absorbancia obtenida para la muestra de
zumo en la ecuacin de la recta de calibrado (valor de la ordenada, y) y
despejar x que corresponde a la concentracin de cido glico en el zumo.
Vemoslo con un ejemplo: si hemos obtenido un valor de absorbancia de 0,3
x=(0,3-0,0328)/0,04651 = 5,74 mg/L de cido glico en el extracto de zumo.
Para poder expresar los resultados en mg de cido glico por 100 mL de zumo,
hemos de tener en cuenta la cantidad de disolvente empleado en la extraccin y
la cantidad de muestra que hemos tomado para realizar el anlisis.
As, en nuestro ejemplo: si se tomaron 5 mL de zumo y se emplearon 10 mL de
metanol en la extraccin, se procedera de la siguiente manera:
mg cido glico
100 mL zumo
5,74 mg
= 1000 mL x
10 mL disolvente
5 mL zumo
x 100= 1,15
5 Cierre
En este objeto de aprendizaje se ha descrito el fundamento y el procedimiento
experimental del anlisis de compuestos polifenlicos empleando el mtodo
espectrofotomtrico de Folin-Ciucalteu. Con ayuda de un ejemplo se ha
determinado la concentracin de estos compuestos en una muestra de zumo de
naranja.
6 Bibliografa
[1] Andrs-Lacueva, C; Medina-Remon, A; L1orach, R; Urpi-Sarda, M; Khan, N; ChivaBlanch, G; Zamora-Ros, R; Rotches-Ribalta, M; Larnuela-Ravents, R. M. (2010).
Phenolic Compounds: Chemistry and Occurrence in Fruits and Vegelables, en L. A
De la Rosa; E. Alvarez-Parrilla,; G. A Gonzlez-Aguilar Eds. Fruit and Vegetable
Phytochemicals: Chemistry, Nutritional Value and Stability (first edition), Blackwell
Publishing lowa, USA.
[2] Kaur, C. y Kapoor, H. C. (2001). Antioxidants in fruits and vegetables-The
millennium's health. International Journal of Food Science and Technology, vol. 36,
n. 7, pp. 703725,
[3] Klein, P. y Kurilich, A. C. (2000). Processing Effects on Dietary Antioxidants from
Plant Foods. HortScience, vol. 35, n4, p.580.
[4] Pandey, K. B. y Rizvi, S. I. (2009). Plant polyphenols as dietary antioxidants in
human health and disease. Oxididative Medicine Cellular Longevity. vol.2, n5,
p.270.
[5] Toms-Barbern, FA.; Gil, M.I.; Paedar Cremin, A L.; Waterhouse, B.; Hess-Pierce,
L.; Kader. A. (2001). HPLC-DAD-ESIMS Analysis of Phenolic Compounds in Nectarines,
Peaches, and Plums. Journal of Agriculture and Food Chemistry, vol.49, pp.47484760.

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1 Resumen de las ideas clave

Los compuestos polifenlicos presentan en su estructura qumica uno o ms anillos

cido fenil actico

Figura 1. Estructura qumica del grupo fenol

Aplicar el mtodo de Folin-Ciocalteu para determinar el contenido en

Cuantificar los compuestos polifenlicos totales de una muestra a partir de

4.1 Fundamento del mtodo

Figura 2. Mecanismo de accin del reactivo de Folin-Ciocalteu.

Figura 3. cido glico

4.2 Material y Reactivos

4.3 Procedimiento experimental

Tabla 2. Preparacin de la curva patrn de cido glico a partir de una disolucin

cido glico (mL)

Concentracin (mg/L) de la curva patrn de cido glico

Preparacin del extracto de polifenoles de la muestra de zumo

4.4 Cuantificacin e interpretacin de los resultados

As, siguiendo con el ejemplo anterior, supongamos que se ha obtenido la recta

mg/L cido glico

Figura 4. Ejemplo de recta de calibrado de cido glico

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